Nghiên cứu chiết tách một số hoạt chất trong củ tam thất trồng ở sapa, việt nam và khả năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm (tt)

MỞ ĐẦU
Ở nước ta, tam thất được trồng và mọc tự nhiên ở: Hà Giang, Cao
Bằng, Lào Cai, Kon Tum, Quảng Nam… Tuy nhiên việc khai thác và sử
dụng tam thất trong nước còn hạn chế vì chưa có nhiều nghiên cứu khoa học
so sánh về thành phần hoá học các hoạt chất và tác dụng sinh học của chúng
với loài tam thất khác, đặc biệt là loài tam thất trồng của Trung quốc. Tam
thất Việt Nam chủ yếu được khai thác để xuất khẩu tiểu ngạch sang Trung
Quốc làm thuốc chữa bệnh. Nước ta chủ yếu nhập khẩu Tam thất trồng ở
Trung Quốc (tên khoa học Panax notoginseng) về làm thuốc chữa bệnh, pha
chế mỹ phẩm và làm thực phẩm bổ dưỡng cơ thể. Cho tới ngày nay, việc
khai thác hoạt chất saponin và polyacetylen trong củ tam thất đã và đang
được nghiên cứu theo các phương pháp chiết tách khác nhau, phương pháp
nghiên cứu chiết tách với sự hỗ trợ của thiết bị siêu âm cho lượng chất tổng
số lớn với đầy đủ các hoạt chất. Phương pháp sắc ký hiện đại tinh sạch được
các chất có độ tinh sạch cao, từ đó nghiên cứu được những hoạt tính sinh học
của chúng, mở ra khả năng ứng dụng công nghệ để sản xuất sản phẩm tốt
hơn, với chất lượng cao hơn. Xuất phát từ thực tế và sự cấp thiết trên, đề tài:
“Nghiên cứu chiết tách một số hoạt chất trong củ tam thất trồng ở Sapa,
Việt Nam và khả năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm” đã được lựa
chọn để nghiên cứu với mục tiêu và nội dung sau:
* Mục tiêu nghiên cứu
- Nghiên cứu, xác định các loài tam thất trồng ở Sapa, Việt Nam.
- Nghiên cứu thu nhận cao chiết từ tam thất, thành phần dinh dưỡng,
đồng thời đánh giá các hoạt chất có hoạt tính sinh học của cao chiết từ tam
thất trồng ở Sapa, Lào Cai.
- Đánh giá khả năng ứng dụng củ tam thất trong một số sản phẩm
công nghệ thực phẩm.
* Nội dung nghiên cứu
- Xác định tên khoa học ba loài tam thất trồng tại Sapa, Lào Cai, Việt
Nam là: Panax stipuleanatus, Panax bipinnatifidus, Panax notoginseng.
- Nghiên cứu thành phần hoá học của ba loại củ tam thất trồng ở

Sapa, Lào Cai, Việt Nam: protein, lipid, carbohydrate, amino axit, axit béo,
các nguyên tố đa lượng và vi lượng, phenol tổng, flavonoid tổng và
saponin. Từ đó đánh giá chất lượng cây tam thất hoang của Việt Nam
(Panax stipuleanatus).
1


- Xác lập qui trình thu nhận cao tam thất từ củ tam thất hoang bằng
phương pháp chiết tách với ethanol, xác định cấu trúc các hoạt chất và hoạt
tính sinh học các chất trong cao tam thất hoang (Panax stipuleanatus).
- Nghiên cứu ứng dụng tam thất hoang trong ngành công nghệ
thực phẩm.
* Tính mới của luận án
- Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần dinh dưỡng của ba cây tam
thất ở Sapa, Lào Cai (Việt Nam). Từ đó đánh giá được chất lượng cây tam
thất hoang (Panax stipuleanatus) so với hai loài tam thất khác (Panax
bipinnatifidus, Panax notoginseng).
- Tối ưu hóa qui trình chiết tách cao chiết tổng trong củ tam thất hoang,
lượng cao thu được là 15,00 ± 0,02%. Đồng thời tinh sạch và xác định cấu trúc
của 6 hợp chất trong củ tam thất hoang là stigmasterol (T1), axit 5-dodecenoic
(T2), stipudiol (T4) 5-hydroxymetylfurfural (T5), panaxytriol (T6) và đặc biệt
có một chất mới là Heptadeca-8-en-4,6-diyne-3,10-diol (T3). Trong đó, T3, T4
và T6 có hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào KB.
- Từ bột, cao chiết tổng chiết tách từ củ tam thất hoang đã tạo ra
được một số sản phẩm như: kẹo cứng tam thất, bánh cookie tam thất, nước
tam thất mật ong và trà tam thất hoa cúc có tính chất cảm quan hấp dẫn
người tiêu dùng.
Bố cục của luận án
Luận án gồm 145 trang, trong đó mở đầu: 3 trang, chương 1: 37
trang, chương 2: 21 trang, chương 3: 67 trang, kết luận và kiến nghị 3

trang, danh mục công trình công bố 1 trang, tài liệu tham khảo 13 trang.
Luận án có 50 bảng, 44 hình, 160 tài liệu tham khảo.
1.TỔNG QUAN
2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Đối tượng nghiên cứu của luận án là 3 loài tam thất thu hái tại Sapa - Lào Cai.
Mẫu tam thất được giám định tên khoa học bằng hình thái là Panax notoginseng F. H.
Chen ex C. Y. Wu et K. M. Feng (tam thất Trung Quốc), Panax bipinnatifidus Seem.
(sâm Vũ diệp) và Panax stipuleanatus H. Tsai et K. M. Feng (tam thất hoang), thuộc họ
Ngũ gia bì (Nhân Sâm) (Araliaceae).
- Luận án sử dụng các phương pháp và thiết bị nghiên cứu sau:
+ Phân tích định lượng saponin bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao
HPLC; thành phần axit béo xác định bằng GC-MS; amino axit được xác
định bằng HPLC với detector huỳnh quang; hàm lượng nguyên tố đa lượng
2


và vi lượng xác định bằng thiết bị quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS).
Hàm lượng flanonoid, phenol tổng… được xác định bằng phương pháp
quang phổ (UV-Vis).
+ Các chất được tinh sạch bằng sắc kí bản mỏng (TLC), sắc kí cột nhồi
silica gel, sephadex LH-20, sắc kí lỏng điều chế (Prep. HPLC) với cột pha
thường và pha đảo (RP-18). Cấu trúc của chúng được xác định bằng các phương
pháp phổ HR-ESI-MS và 1D, 2D NMR.
+ Hoạt tính kháng vi sinh vật xác định theo hai phương pháp là phương
pháp khuếch tán lỗ thạch và phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật trên
môi trường lỏng. Hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp môi trường thạch
(MTT).
+ Nghiên cứu ứng dụng sản phẩm tam thất trong ngành công nghệ
thực phẩm bằng phương pháp phân tích cảm quan sản phẩm, phân tích
phương sai (ANOVA). Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê.

3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu đặc tính của nguyên liệu tam thất
3.1.1. Hàm lƣợng protein
Bằng phương pháp Kjeldahl, chúng tôi đã xác định được hàm lượng
protein có trong mẫu bột khô của tam thất hoang P. stipuleanatus là 7,04 ±
0,29% khối lượng khô; sâm vũ diệp P. bipinnatifidus 8,02 ± 0,15%; tam
thất Trung Quốc P. notoginseng 10,16 ± 0,24%.
3.1.2. Hàm lƣợng lipid
Bằng phương pháp Soxhlet đã xác định được hàm lượng lipid có
trong mẫu bột khô của tam thất tính theo khối lượng khô. Hàm lượng lipid
có trong tam thất hoang là 10,35 ± 0,80%; sâm vũ diệp 9,12 ± 0,3% và tam
thất Trung Quốc 6,72 ± 0,5%.
3.1.3. Hàm lƣợng carbohydrate
Từ đồ thị đường chuẩn D-glucose, chúng tôi xác định được hàm
lượng carbohydrate có trong mẫu bột khô tam thất hoang là 50,62 ± 3,74%;
sâm vũ diệp 43,28 ± 0,23% và tam thất Trung Quốc 48,15 ± 0,42%.
3.1.4. Hàm lƣợng các amino axit
Bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng HPLC
Alliance của hãng Water, Mỹ với quy trình xử lý mẫu phân tích, xác định
amino axit thực hiện tại Phòng thí nghiệm của Khoa Hóa Thực phẩm, Viện
Dinh dưỡng Quốc gia, đã phân tích được thành phần amino axit trong ba
loại củ tam thất như sau:
3


Bảng 3.4. Thành phần các amino axit trong ba loài tam thất
(mg/100g mẫu khô).
P.

P.

P.

stipuleanatus

notoginseng

bipinnatifidus

Aspartic

437,5

394,6

414,7

2

Serine

309,9

284,5

299,5

3

Glutamic

304,6

282,0

311,4

4

Glycine

67,9

60,1

63,6

5

Histidine

856,8

804,2

1132,3

6

Arginine

346,4

312,4

343,6

7

Alanine

142,3

132,5

139,4

8

Proline

31,4

27,9

30,2

9

Tyrosine

225,8

194,8

206,2

10

Valine

191,0

185,8

201,9

11

Methionine

46,2

41,0

35,9

12

Lysine

292,8

272,0

287,5

13

Isoleucine

128,3

132,4

131,9

14

Leucine

327,7

309,2

328,7

15

Phenylalanine

276,3

257,3

284,5

No

Amino axit

1

3.1.5. Thành phần axit béo
Từ kết quả phân tích trên GC-MS (7000B) của hãng Agilent, Mỹ với
quy trình xử lý mẫu phân tích tại Phòng thí nghiệm của Khoa Hóa Thực
phẩm, Viện Dinh dưỡng Quốc gia, 14 loại axit béo được phát hiện từ ba
loài tam thất.

4


Bảng 3.5. Thành phần các axit béo có trong ba loài tam thất
(mg/100g mẫu khô).
No

Axit béo

P.

P.

P.

stipuleanatus

notoginseng

bipinnatifidus

1

C12:0 (decanoic)

3,4

13,6

32,6

2

C14:0 (myristic)

11,7

30,5

30,3

3

C16:1 (palmitoleic)

31,5

29,9

20,7

4

C16:0 (palmitic)

236,5

407,0

621,4

5

C17:0 (margaric)

19,6

14,8

9,9

6

C18:2 (linoleic)

783,9

587,0

743,5

7

C18:1 (oleic)

251,3

350,2

354,3

8

C18:0 (stearic)

82,6

98,4

98,3

9

C20:1 (eicosenoic)

17,7

10,1

-

10

C20:0 (arachidic)

14,6

7,6

5,5

11

C21:0 (henecosanoic)

1,5

0,0

-

12

C22:0 (behenic)

8,3

4,6

-

13

C23:0 (tricosanoic)

0,9

-

-

14

C24:0 (lignoceric)

2,2

2,2

-

[(-) không xác định được]
Từ bảng 3.5 cho thấy, trong thành phần axit béo của cả hai loài P.
notoginseng và P. stipuleanatus đều thấy có axit linoleic, axit oleic, axit
paltamic, là các axit béo phổ biến nhất trong thành phần axit béo của P.
ginseng, P. notoginseng và P. quinqueflolius từ Trung Quốc
3.1.6. Nghiên cứu về thành phần các nguyên tố đa lƣợng và vi lƣợng
Bằng thiết bị Quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS-6300), sử dụng kỹ
thuật nguyên tử hóa mẫu không ngọn lửa trên lò Graphit phân tích, xác
định một số nguyên tố đa lượng và vi lượng trong 3 loài tam thất.
5


Bảng 3.6. Thành phần các nguyên tố đa lượng và vi lượng trong tam thất
(mg/kg trọng lượng khô).
STT

Nguyên tố

1
2
3
4
5
6
7
8

Fe
Cu
Zn

Pb
Cr
Ni
Mn
Cd

P.
bipinnatifidus
12,6933
1,3543
4,7186
6,2865
7,4905
1,0769
10,4556
0,0487

P.
stipuleanatus
14,0271
1,2716
4,0570
7,0323
7,4484
0,5786
9,3159
0,0382

P.
notoginseng

12,0173
1,1169
4,3572
7,1158
7,2480
0,7321
8,3516
0,0422

3.1.7. Hàm lƣợng phenol tổng
Kết quả nghiên cứu thu được cho thấy hàm lượng phenol tổng trong
cao chiết củ tam thất hoang là 12,04 ± 0,08 mg/g cao hơn so với các loài
tam thất khác trong sâm vũ diệp 11,00 ± 0,17 mg/g và tam thất Trung Quốc
11,29 ± 0,11 mg/g.
3.1.8. Hàm lƣợng flavonoid tổng
Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng flavonoid tổng trong 1g
mẫu cao ethanol của 3 loài tam thất so với chất chuẩn mg Quercetin (QE),
tam thất hoang có hàm lượng flavonoid thấp nhất là 1,03 ± 0,12 mg/g.
Trong đó, flavonoid trong củ tam thất Trung Quốc 1,29 ± 0,10 mg/g và
flavonoid trong sâm vũ diệp 1,19 ± 0,07 mg/g.
3.1.9. Phát hiện saponin bằng các phản ứng định tính đặc trƣng
Kết quả tiến hành phân tích định tính bằng phản ứng đặc trưng trong
ống nghiệm, phản ứng giọt và sắc kí cho thấy sự có mặt của nhóm chất
saponin trong bột củ tam thất. Các saponin trong phép thử thuộc cả 2 nhóm
saponin triterpen và steroid. Phép thử định tính cho thấy trong củ chứa chủ
yếu nhóm saponin triterpen.
3.1.10. Xác định saponin trong tam thất bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao
(HPLC)
Bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) áp dụng quy trình
phân tích dược điển của Trung Quốc, thực hiện tại Phòng thí nghiệm Dược,

6


Viện Kiểm nghiệm, Bộ Y tế, kết quả ở bảng sau:
Bảng 3.10. Định lượng saponin trong bột củ ba loài tam thất.
Mẫu
Bột TTH
Bột SVD
Bột NOTO

Khối
lượng (g)
0,6
0,6
0,6

Thể tích
(ml)
50
50
50

R1 (%)

Rb1 (%)

Rg1 (%)

0,015
0,008

1,140

0,062
0,034
4,230

0,057
0,038
4,750

R1: Notoginsenosid R1 Rb1: Ginsenosid Rb1

Saponin
tổng (%)
0,080
0,134
10,12

Rg1: Ginsenosid Rg1

Nhận xét: Qua việc nghiên cứu khảo sát đặc tính nguyên liệu của 3 loài
tam thất phổ biến ở Sapa, Lào Cai. Chúng tôi thấy cây tam thất hoang là loài
cây dược liệu quí, vùng phân bố rộng, là cây tam thất đặc thù của Việt Nam.
Do vậy để làm rõ hơn các hoạt chất có hoạt tính sinh học của loài cây này.
Chúng tôi tập trung nghiên cứu xác định thành phần hoạt chất trong củ để làm
cơ sở khoa học cho việc ứng dụng tam thất vào sản phẩm thực phẩm.
3.2. Xây dựng quy trình chiết tách cao tổng từ củ tam thất hoang
3.2.1. Nghiên cứu khảo sát các phƣơng pháp chiết tách thu cao tổng .
Nghiên cứu chọn ethanol làm dung môi chiết vì ethanol dễ hòa tan hầu
hết các hợp chất thiên nhiên, không độc hại đến sản phẩm, có thể cất và thu hồi

lại dung môi.
Các thí nghiệm được tiến hành như sau: cho khoảng 2 gam bột mẫu
tam thất và lượng dung môi theo tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 50/1(thể
tích/khối lượng; v/m). Các phương pháp chiết sau:
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát các phương pháp chiết tách và nồng độ
dung môi chiết
Phƣơng pháp
tách

Chiết Soxhlet
Trong 3 giờ

Nồng độ
ethanol
(% V)
99,6
95
90
85
80
75
70
65
60

Khối lƣợng mẫu
(g)

Cao chiết tổng
(% chất khô)

2,0685
2,0674
2,0787
2,0769
2,0776
2,0916
2,0702
2,0794
2,0694

9,78
12,51
12,08
12,99
11,80
8,49
8,91
8,91
8,91

7

(DPPH)
IC50
(mg/ml)
25,82
26,41
26,21
26,30

25,86
25,75
25,91
25,78
25,95


Ngâm ở nhiệt
độ thường
Trong 48 giờ

Siêu âm 30
phút

Siêu âm 1 giờ

99,6
90
80
70
60
50
40
30
90
80
70
60
50
40

90
80
70
60
50
40

2,0069
2,0214
2,0409
2,0219
2,0066
2,0703
2,0591
2,0675
2,0311
2,0465
2,0286
2,0436
2,0632
2,0568
2,078
2,0413
2,0638
2,0048
2,0532
2,0732

6,93
9,15

10,608
11,49
14,04
13,59
13,08
13,07
7,60
9,25
10,36
10,34
10,01
10,13
9,06
11,07
14,17
13,19
12,36
12,32

25,92
26,02
26,61
26,28
26,65
26,08
26,41
26,51
26,56
25,89
26,35

26,13
26,46
26,53
26,24
26,60
26,67
26,48
26,18
26,24

Nồng độ ethanol (%V)

Hình 3.1: Khảo sát các phương pháp chiết tách cao chiết tổng

8


Kết quả bảng 3.11 cho thấy khi thay đổi các phương pháp chiết và
thay đổi nồng độ % ethanol, kiểm tra hoạt tính quét gốc tự do của cao chiết
thu được (% chất khô), kết quả quét DPPH không thay đổi nhiều (ở nồng
độ IC50 chất đối chứng axit ascorbic IC50 = 0,030 mg/ml; DPPH thấp nhất
của cao chiết Soxhlet IC50 = 25,75 và cao nhất ở cao chiết có hỗ trợ siêu âm
1 giờ là IC50 = 26,67 mg/ml). Từ kết quả này cho ta cơ sở để tiến hành các
nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2. Kết quả khảo sát điều kiện tối ƣu hoá phƣơng pháp chiết siêu âm
Từ nghiên cứu khảo sát ở trên, nhận thấy các phương pháp chiết
đều cho cao chiết tổng có hoạt tính chống oxy hóa (IC50) hầu như không
thay đổi, đối với phương pháp chiết sử dụng siêu âm sẽ thu được lượng
cao chiết tổng lớn. Do đó, chỉ tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh
hưởng như: tỉ lệ dung môi/nguyên liệu, nồng độ cồn, thời gian chiết

siêu âm và nhiệt độ chiết đến lượng cao chiết tổng thu được.

Hình 3.2: Khảo sát tỉ lệ dung môi/nguyên liệu (v/m).

9


Hình 3.3: Khảo sát nồng độ dung môi ethanol (%)
c, Khảo sát thời gian ngâm mẫu chiết (hỗ trợ rung siêu âm)
Ngâm khoảng 2 gam mẫu trong 100 ml dung môi ethanol có nồng độ
cồn 65% rồi rung siêu âm duy trì nhiệt độ trong khoảng từ 350C đến 400C.
Khảo sát thời gian ngâm mẫu chiết hỗ trợ siêu âm trên máy Powersonic 405
- Hàn Quốc (tần số 33 - 40 kHz) ở các mức thời gian từ 30 phút đến 90
phút. Kết quả thu được tại hình 3.4 như sau:

Hình 3.4: Khảo sát thời gian chiết (thời gian rung siêu âm)

10


Kết quả: nồng độ dung môi 65%, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 55/1 (v/m)
và thời gian siêu âm 75 phút. Với điều kiện tối ưu này thì mục tiêu về lượng
cao chiết tổng đạt được cao nhất là: 15,00 ± 0,02%. Đạt tỷ lệ lượng cao chiết
lớn nhất cho mục đích chiết tách cao tam thất.
Mẫu tam thất
2,0419g (qui khô)

- Nghiền thành bột ø 0,2-1mm
- Nồng độ dung môi 65%
- Tỷ lệ dm/bột (55/1)

- Chiết siêu âm t0≤ 450C bằng EtOH
Dịch EtOH
- Lọc lấy dịch chiết
- Cô chân không đến cặn, t0≤ 500C
- Pck = 550 mmHg
Sấy chân không loại EtOH
(Pck =550 mmHg, 500C, 5 giờ)

Lượng cao chiết tổng
0,3065g

Hình 3.9: Qui trình công nghệ chiết tách cao chiết tổng từ tam thất
Từ sản phẩm cao chiết tổng thu được chúng tôi đi phân tích xác định
hàm lượng saponin thành phần bằng phương pháp phân tích trên (HPLC)
của hãng Hitachi (Nhật Bản) thu được kết quả bảng 3.20 dưới đây:
11


Bảng 3.20. Định lượng saponin thu được trong cao chiết ethanol
của tam thất hoang.
Mẫu
Cao TTH

Khối
lượng (g)

Thể tích
(ml)

R1 (%)

Rb1 (%)

Rg1 (%)

Saponin
tổng (%)

0,6

50

0,046

0,190

0,187

0,423

R1: Notoginsenosid R1 Rb1: Ginsenosid Rb1 Rg1: Ginsenosid Rg1

3.3. Hoạt tính sinh học của các phân đoạn chiết xuất từ củ tam thất hoang
3.1.1. Hoạt tính chống oxy hóa – quét gốc tự do DPPH
Bảng 3.21: Hoạt tính chống oxy hóa của các cao phân đoạn
từ củ tam thất hoang

Mẫu
n-hexane
Ethyl acetat

n-butanol
Axit
ascorbic

Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH ở các nồng độ khác
nhau của mẫu (%)
0,1
0,5
1,0
2,0
(mg/ml)
(mg/ml)
(mg/ml)
(mg/ml)
0
0,99
2,48
4,09
1,4
4,45
5,17
7,11
0,65
4,09
7,65
11,53
0,005
0,01
0,05

0,1
0,5
(mg/ml)
(mg/ml) (mg/ml) (mg/ml)
(mg/ml)
0,32
1,61
37,07
80,92
88,15

Từ kết quả bảng 3.21 cho thấy hoạt tính chống oxy hóa các phân đoạn
của củ tam thất hoang là rất thấp. Hoạt tính chống oxy hóa cao nhất ở phân
đoạn n-butanol là 11,53% với 2 mg/ml mẫu thử. Trong khi đó ở chất đối chứng
axit ascorbic ở 0,05 mg/ml đã đạt 37,07%.
3.3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật
Chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của các
cao phân đoạn củ tam thất hoang theo hai phương pháp là phương
pháp khuếch tán lỗ thạch và phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh
vật trên môi trường lỏng.
12


Bảng 3.22: Hoạt tính kháng vi sinh vật của các cao phân đoạn
từ củ tam thất hoang trên môi trường thạch.
Kích thƣớc vòng kháng khuẩn (mm)
Tên vi khuẩn

n-hexane

Nƣớc

n-butanol

(10mg/ml)

(20mg/ml)

(20mg/ml)

-

10,7 ± 1,2

-

10,4 ± 1,1

24,6 ± 0,5

-

-

-

11,4 ± 1,2

S. typhimurium

22,8 ± 1,6

-

-

-

14,4 ± 0,5

E. coli

23,4 ± 1,6

-

16,3 ± 4,0

-

12,0 ± 2,2

P. aeruginosa

21,4 ± 1,6

-

19,0 ± 1,4

2,5 ± 0,58

9,2 ± 1,3

S. enterica

18,7 ± 1,5

-

-

-

-

ĐC (+)

ĐC (-)

B. subtilis

21,8 ± 1,7

S. aureus

ĐC (+) : kanamycine, ĐC (-) : methanol, "-" : không xác định
(Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n =3)

Bảng 3.23: Hoạt tính kháng một số vi sinh vật của các cao phân đoạn

củ tam thất hoang trên môi trường lỏng.
Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của vi sinh vật
IC50 (g/ml)
Mẫu

Gram (+)

Gram (-)

Nấm

S.

B.

L.

S.

E.

P.

C.

aureus

subtilis

fermentum

enterica

coli

aeruginosa

albican

n-hexane

5,03

5,00

> 128

> 128

> 128

> 128

> 128

n-butanol

8,00

> 128

> 128

> 128

> 128

> 128

> 128

3.3.3. Hoạt tính ức chế sinh tổng hợp melanin
Tyrosinase là enzyme có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng
hợp melanin. Tyrosinase là enzyme đầu tiên xúc tác cho quá trình phân giải
tyrosine và dopaquinon tạo ra melanin.
13


Bảng 3.25: Nồng độ ức chế 50% hoạt tính tyrosinase (IC50) của các
cao phân đoạn từ củ tam thất hoang.
Mẫu và chất chuẩn

IC50 (mg/ml)

n- hexane

0,4312 ± 0,0332

n-butanol

0,3231 ± 0,0787

Nước

0,4151 ± 0,0919

Axit kojic

0,0044 ± 0,0005

(Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n =3)

Từ kết quả ở hai bảng 3.25 trên, chúng ta thấy hoạt tính ức chế
tyrosinase tăng tuyến tính theo dãy nồng độ của các cao phân đoạn. Và cả
ba cao phân đoạn đều thể hiện khả năng ức chế tyrosinase thấp hơn so với
chất đối chứng là axit kojic.
3.3.4. Hoạt tính kháng tế bào ung thƣ
Bảng 3.26: Hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư của các
cao phân đoạn từ củ tam thất hoang (IC50, µg/ml).
Hoạt tính gây độc tế bào trên dòng ung thư - IC50 (µg/ml)
Cao

LU

HepG2

1

n-hexane

0,26

0,26

2

n-butanol

39,34

Ellipticin

0,45

Đối
chứng

SK-

MCF-7

KB

0,21

0,51

0,86

54,03

67,79

48,24

63,37

0,35

0,56

0,53

0,31

MEL 2

Theo kết quả từ bảng 3.26, ta thấy các cao phân đoạn n-butanol và nhexane của củ tam thất hoang đều có hoạt tính gây độc tế bào trên cả năm
dòng tế bào thử nghiệm.
3.4. Phân lập, xác định cấu trúc và hoạt tính của một số thành phần hóa học
trong cao chiết tam thất hoang
3.4.1. Chiết các phân đoạn từ cao chiết tổng củ tam thất hoang
14


* Quy trình chiết xuất các phân đoạn từ cao chiết TTH được trình bày như sau
Cao chiết tổng (200,0g)
1.Hòa nước
2.Chiết lần lượt với các dung môi
có độ phân cực khác nhau

3.Thu hồi dung môi dưới áp suất
giảm 5 - 10 mbar

n- hexane (15,0g)

n-butanol (48,98g)

Nước (135,01g)

Hình 3.10: Quy trình chiết xuất phân đoạn từ cao chiết tổng
củ tam thất hoang
3.4.2. Xác định cấu trúc các hợp chất tinh sạch từ cao phân đoạn
3.4.2.1. Hợp chất H3C2 (T1)
Cấu trúc của T1 được xác định bằng phổ 1H NMR và so sánh với tài
liệu, chúng tôi kết luận T1 là stigmasterol (Hình 3.15).

Hình 3.15: Cấu trúc của hợp chất T1 (stigmasterol)
3.4.2.2. Hợp chất H5A1 (T2)
Hợp chất T2 được xác định bằng phổ 1H NMR và GC-MS. Kết quả
T2 là axit 5-dodecenoic.
O

HO

5

Hình 3.17: Cấu trúc của hợp chất T2 (axit 5-dodecenoic)
15

3.4.2.3. Hợp chất H6A1 (T3)
Hợp chất T3 (4 mg) dạng dầu, màu vàng, được chiết tách từ phân
đoạn H6A qua hệ thống sắc kí lỏng điều chế (prep. HPLC) với hệ dung môi
H:E=3:1, detector UV 254 nm.
Phổ ESI-FTICR-MS cho pic ion giả phân tử ở m/z 263,2006 [M+H]+
từ đó xác định công thức phân tử của T3 là C17H26O2.
Phổ 1H NMR trên hình 3.18 cho thấy:
- Ở vùng trường thấp có 2 olefinic ptoron tại 5,76 ppm (d, J = 16 Hz)
và 6,32 ppm (dd, J = 5,5, 16,0 Hz). Chúng có J lớn là 16 Hz chứng tỏ
chúng gắn với cacbon mang liên kết đôi với cấu hình trans.
- Có hai vân ở 4,19 ppm và 4,42 ppm đặc trưng cho cộng hưởng của
proton thuộc nhóm carbinol CH-OH.
- Ở vùng trường mạnh, δ từ 0,68 đến 2,31 ppm là cộng hưởng của
CH3, CH2, trong đó hai tín hiệu ở 0,88 ppm và 1,03 ppm được gán cho
proton nhóm metyl (-CH3); ba tín hiệu ở 1,29 ppm; 1,57 ppm và 1,75
ppm được gán cho proton các nhóm metylen (-CH2-).

Hình 3.18: Phổ 1H NMR của hợp chất T3.
16


Hình 3.19: Phổ 13C NMR của hợp chất T3.
Phổ 13C NMR của hợp chất T3 có tín hiệu của 18 cacbon, trong đó
có 16 pic ở vùng trường mạnh (0 - 100 ppm) và 2 pic ở vùng trường trung
bình (100 - 160 ppm). Kết hợp với phổ HSQC chúng tôi quy kết được 18
cacbon này bao gồm:
- 2 nguyên tử cacbon bậc 1 (-CH3 ) cộng hưởng ở 9,33 ppm và 14,1 ppm.
- 8 nguyên tử cacbon bậc 2 (-CH2 ) cộng hưởng ở 22,6 ppm; 25,2
ppm. 29,2 ppm; 29,4 ppm; 29,8 ppm; 30,7 ppm; 31,8 ppm và 36,9 ppm
(nằm trong vùng từ 22 - 45 ppm).

- 4 nguyên tử cacbon của nối ba (-C≡C-) cộng hưởng ở 71,0 ppm; 73,7
ppm; 77,3 ppm và 83,0 ppm (nằm trong vùng từ 70 - 100 ppm).
- 2 nguyên tử cabon của nối đôi (-CH=CH-) cộng hưởng ở 108,2
ppm; 149,7 ppm (nằm trong vùng từ 110 - 150 ppm).
- 2 nguyên tử cacbon đính với nhóm OH cộng hưởng ở 64,3 ppm và 72,1 ppm.
→ có 2 nhóm CH3, 8 nhóm CH2, 4 nhóm CH và 4 nguyên tử C.

17


Hình 3.20: Phổ HMBC của hợp chất T3.
Phổ HMBC trên hình 3.20 cho thấy các tương tác xa C-H trong
phân tử:
Proton của 1 nhóm metyl (-CH3) (0,88 ppm) có tương tác với 2C của 2
nhóm metylen (-CH2-) (22,6 ppm và 31,8 ppm). Proton của nhóm metyl (CH3) còn lại (1,03 ppm) có tương tác với C của nhóm metylen (-CH2-) (30,72
ppm) và tương tác với C của nhóm CH-OH (64,3 ppm).
Proton nhóm metylen (-CH2-) (1,29 ppm) có tương tác với C của
nhóm metyl (-CH3) (14,1 ppm), C nhóm metylen (-CH2-) (31,8 ppm).
Proton nhóm metylen (-CH2-) (1,57 ppm) có tương tác với C của nhóm
metylen (-CH2-) (29,4 ppm) và C nhóm CH-OH (72,1 ppm). Proton nhóm
metylen (-CH2-) (1,75 ppm) có tương tác với C của nhóm metyl (-CH3)
(9,33 ppm), C nhóm CH-OH (64,3 ppm) và 2 nhóm -C≡C- (77,3 ppm và
83,0 ppm).
Proton của 1 nhóm CH-OH (4,19 ppm) có tương tác với C của nhóm
olefin –CH=CH- (108,2 ppm).
Proton của nhóm –CH=CH- có tương tác với C của nhóm CH-OH và -C≡C-.
Từ sự phân tích trên đây, chúng tôi xác định cấu tạo của T3 là Heptadeca8-en-4,6-diyne-3,10-diol, đây là một chất mới và tiến hành quy kết các giá trị
phổ bảng 3.30. Chúng tôi chưa xác định được cấu hình của hai trung tâm bất đối
ở C-3 và C-10. Mặc dù đã cố gắng sử dụng phương pháp Mosher cải tiến nhưng
không thể tinh sạch được sản phẩm este mong muốn.

18


OH
4

5

6

7

3

8

1

9

12

10

16

13

17

OH

Hình 3.21: Heptadeca-8-en-4,6-diyne-3,10-diol
Bảng 3.30: Các giá trị phổ của hợp chất T3.
1

13

H NMR (H, J in Hz)
1,05, t, 6,0
1,57, m; 1,74, m
4,42, t, 6,5
5,76, d, 16,0
6,32, dd, 5,5, 16,0
4,19, d, 6,5
1,57, m
1,29, m
1,29, m
1,29, m
1,29, m
1,29, m
0,88, t, 7,0

1
2
3
4
5
6
7

8
9
10
11
12
13
14
15
16
17

C NMR (C)
9,33
30,7
64,3
82,9
71,0
73,7
77,3
108,2
149,7
72,1
37,0
25,2
29,4
29,8
31,8
22,6
14,1

3.4.2.4. Hợp chất H6A2 (T4)
Hợp chất T4 được xác định là 1,8-octadecadiene-4,6-diyn-3,10-diol
(stipudiol) bằng phổ 1D và 2D NMR với cấu trúc sau.
OH
Ha

1
2

Hb

3

12
4

5

6

7

8

10
9

11

13

14
15

16

18
17

OH

Hình 3.25: Cấu trúc của stipudiol (T4)
3.4.2.5. Hợp chất HAB2A3 (T5)
Từ kết quả phân tích phổ và kết hợp so sánh với tài liệu chúng tôi kết luận
hợp chất T5 là 5-hydroxymetylfurfural có công thức hình 3.30 như sau:
19


Hình 3.30: Cấu trúc 5-hydroxymetylfurfural
3.4.2.6. Hợp chất HAB2C3 (T6)
Từ kết quả phân tích phổ 1D và 2D NMR và kết hợp với tài liệu
tham khảo, chúng tôi kết luận hợp chất T6 là hợp chất Panaxytriol có công
thức trên hình 3.35 như sau:
OH
4

2
1

5

6

7

8

14

12

3

9

OH

OH

16

10
11

13

15

17

Hình 3.35: Cấu trúc hợp chất Panaxytriol
Kết luận: Đã xác định được cấu trúc 6 hợp chất tinh sạch từ cao
phân đoạn trong củ tam thất hoang (Panax stipuleanatus).
3.4.5. Hoạt tính kháng khuẩn và độc tính tế bào của chất tinh sạch
Bảng 3.34. Hoạt tính kháng một số vi sinh vật của chất tinh sạch trong các
cao phân đoạn củ tam thất hoang trên môi trường lỏng
Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của vi sinh vật - IC50 ( g/ml)
Gram (+)
Gram (-)
Nấm
S.
B.
L.
S.
E.
P.
C.
aureus subtilis fermentum enterica coli aeruginosa albican
T3
25,6
128
>128
>128 >128
>128
>128
T4
128
128
>128
>128 >128

>128
>128
T5
25,6
>128
>128
>128 >128
>128
>128
T6
>128
128
>128
>128 >128
>128
>128
Bảng 3.35. Kết quả kháng dòng tế bào KB của các chất tinh sạch trong
củ tam thất hoang

Mẫu

STT
1
2
3
4
5

Tên mẫu
T3

T4
T5
T6
Ellipticin

Giá trị IC50 (µg/ml); KB
10,05
8,11
101,97
14,57
0,31
20


Từ việc thử hai hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính kháng ung thư
trên cả chất tinh sạch và cao chiết xuất từ củ tam thất hoang cho thấy cao
phân đoạn n-hexane và các chất tinh sạch được phân lập từ cao phân đoạn
này có tác dụng tốt hơn so với cao phân đoạn n-butanol và các chất tinh
sạch được phân tách từ cao phân đoạn này.
3.5. Độc tính trên chuột thí nghiệm - liều an toàn
Bảng 3.36: Kết quả thử độc tính trên chuột thí nghiệm của mẫu bột
củ tam thất hoang.
Stt
1
2
3
4

Liều dùng( g/kg thể trọng)
0,5

1,0
2,5
5,0

(%) chuột chết
6,7
30,0
56,7
100

Từ kết quả bảng trên xác định được LD50 của mẫu thử là 1,65g/kg
thể trọng. Khi xác định được LD50 thì liều an toàn để thử nghiệm dược lý sẽ
là 1/10 LD50 ở cùng một loại động vật và cùng một đường dùng thuốc. Vậy
ta xác định được liều tương đối an toàn dùng cho thử nghiệm dược lý ban
đầu là 0,16g/kg thể trọng. Liều dùng an toàn đưa ra là 0,16g/kg/ngày.
3.6. Ứng dụng tam thất hoang trong sản xuất thực phẩm
Từ bột và cao chiết tổng trong củ tam thất hoang đưa vào ứng dụng
sản xuất thử nghiệm 04 sản phẩm: bánh cookie tam thất, nước tam thất mật
ong, kẹo cứng tam thất và trà tam thất hoa cúc. Kết quả thu thập được xử lý
bằng thuật toán ANOVA phân tích phương sai cho hai yếu tố để kiểm tra
thị hiếu và chọn ra công thức tối ưu cho sản phẩm.
*Nghiên cứu bổ sung chế phẩm cao tam thất vào sản phẩm
kẹo cứng
Sử dụng công thức làm kẹo cứng để tiến hành bổ sung cao tam thất
vào sản phẩm. Tiến hành đánh giá cảm quan so sánh cặp để tìm, xác định
ngưỡng phân biệt cũng như lượng cao tối thiểu bổ sung vào sản phẩm kẹo
để người thử cảm nhận được mùi cũng như vị đặc trưng nhất. Đánh giá cảm
quan trên 10 người cho bảng tổng hợp xử lý kết quả bảng 3.45.
21

Bảng 3.45. Kết quả phép thử so sánh cặp đôi với sản phẩm
kẹo cứng tam thất.
Lượng cao
(g)
bổ sung
0 - 0,3g
0 - 0,45g
0,3 - 0,5g
0,5 - 1,0g

Kí hiệu
E = ít hơn
F = nhiều
hơn
E
F
E
F
E
F
E
F

Số câu trả lời
Đắng
hơn

Nhạt
hơn

7
13
5
15
8
12
5
15

13
7
15
5
12
8
15
5

Giá
Giá trị
trị
χ2tc
χ2

Kết luận

3,6

Không phân

biệt

10

Phân biệt
3,81

1,6

Không phân
biệt

10

Phân biệt

*Nghiên cứu thị hiếu ngƣời tiêu dùng đối với sản phẩm kẹo cứng tam thất

Sau khi làm kẹo cứng bổ sung tam thất theo các tỉ lệ xác định (0,5;
1,0; 1,5 và 2,0g/100g kẹo), tiến hành đánh giá cảm quan thị hiếu người tiêu
dùng về các sản phẩm kẹo. Tổng hợp số liệu thu được xử lý bằng phân tích
phương sai (ANOVA) cho hai yếu tố thu được kết quả bảng 3.46.
Bảng 3.46. Kết quả phân tích thị hiếu với sản phẩm kẹo cứng tam thất
Sản phẩm
Tính chất

1,0g

1,5g

2,0g

Giá trị (p)

Vị đắng

3,82a 5,32b

6,20c

4,42a

3,17.10-12

Vị ngọt

4,72a 5,70c 6,17b 6,32b

8,34.10-12

Trạng thái

3,75a 4,18a 4,77b 4,77b

7,66.10-9

4,12a 5,67b

6,80c 7,65d

1,81.10-30

6,48c

3,60.10-16

Màu sắc

0,5g

Điểm thị hiếu chung 4,32a 5,45b

5,38c

(Chú thích: Các mẫu khác nhau nếu chỉ số mũ khác nhau với p<0,05)

Sau khi phân tích kết quả phép thử so sánh cặp và phân tích số liệu
thu được trong phép phân tích phương sai. Kết quả chọn được sản phẩm
với công thức bổ sung 1,5g cao/100g kẹo.
22


Nhận xét: Bốn sản phẩm (bánh cookie tam thất, nước tam thất mật
ong, kẹo cứng tam thất và trà tam thất hoa cúc) được sản xuất thử theo mô
hình đánh giá và kiểm tra đã được người sử dụng lựa chọn và ưa thích.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Trong quá trình thực hiện luận án này chúng tôi đã thu được các kết
quả nghiên cứu sau về cây tam thất trồng ở Sapa, Việt Nam thuộc họ Ngũ
gia bì (Araliaceae) chi Panax L.
1. Lần đầu tiên xác định hàm lượng các hoạt chất trong củ ba loài

tam thất ở Sapa, Lào Cai là tam thất hoang (Panax stipuleanatus, TTH),
tam thất Trung Quốc (Panax notoginseng, NOTO) và Sâm vũ diệp (Panax
bipinnatifidus, SVD) như sau:
- Hàm lượng protein trong nguyên liệu tam thất, TTH là: 7,04 ± 0,29%;
SVD 8,02 ± 0,15%; NOTO 10,16 ± 0,24%. Hàm lượng lipid trong TTH
10,35 ± 0,80%; SVD 9,12 ± 0,3%; NOTO 6,72 ± 0,5%. Hàm lượng
carbohydrate TTH 50,62 ± 3,74%; SVD 43,28 ± 0,23%; NOTO 48,15 ±
0,42%.
- Trong củ của 3 loài tam thất đều chứa đầy đủ 15 axit amin (trong đó có
8 loại axit amin thiết yếu) và 14 axit béo. Đặc biệt TTH có chứa hàm
lượng axit béo không no là 73,98%.
- Hàm lượng 8 nguyên tố đa lượng và vi lượng trong 3 loài tam thất
SVD, TTH và NOTO cho thấy sắt là nguyên tố có hàm lượng lớn nhất
lần lượt 12,6933 mg/kg; 14,0271 mg/kg và 12,0173 mg/kg. Hàm lượng
nhỏ nhất là cadimi 0,0487 mg/kg; 0,0382 mg/kg và 0,0422 mg/kg.
- Hàm lượng phenol tổng trong cao chiết của 3 loài tam thất là: TTH
12,04 ± 0,08 mg/g; SVD 11,00 ± 0,17 mg/g và NOTO 11,29 ± 0,11
mg/g. Hàm lượng flavonoid trong cao chiết của 3 loài tam thất nghiên
cứu là: TTH 1,03 ± 0,12 mg/g; SVD 1,19 ± 0,07 mg/g và NOTO 1,29 ±
0,10 mg/g.
- Củ 3 loài tam thất đều chứa saponin. Các saponin thuộc cả hai nhóm
saponin triterpen và saponin steroid. Kết quả định lượng 3 saponin
thành phần Notoginsenosid (R1); Ginsengnosid (Rg1); Ginsengnosid
(Rb1), cho thấy cao ethanol của TTH chứa 0,423%; bột TTH chứa
0,134%, bột SVD chứa 0,080% và bột NOTO chứa 10,12%.

23


2. Lần đầu tiên xây dựng qui trình chiết tách cao chiết tổng trong củ

tam thất hoang với dung môi ethanol. Điều kiện tối ưu chiết cao tổng: nồng
độ ethanol 65%, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 55/1 (v/m), thời gian chiết hỗ
trợ siêu âm 75 phút. Lượng cao chiết tổng thu được đạt 15,00 ± 0,02%.
3. Lần đầu tiên nghiên cứu hoạt tính sinh học của các cao chiết củ tam
thất hoang. Cụ thể các cao chiết có hoạt tính chống oxy hóa tốt, kháng mạnh
các vi sinh vật kiểm định, ức chế trung bình tyrosinase và có hoạt tính gây độc
tế bào ung thư mạnh trên cả 5 dòng tế bào ung thư.
4. Đã tinh sạch và xác định được cấu trúc của sáu hợp chất trong cao
tam thất hoang (TTH) là stigmasterol (T1), axit 5-dodecenoic (T2),
stipudiol (T4), 5-hydroxymetylfurfural (T5), panaxytriol (T6), đặc biệt
phát hiện polyacetylen mới là Heptadeca-8-en-4,6-diyne-3,10-diol (T3).
Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư KB cho thấy, T3, T4 và T6 có hoạt
tính tốt.
5. Đã kiểm tra độc tính cấp của bột tam thất hoang trên chuột thí
nghiệm và đưa ra ngưỡng khuyến cáo sử dụng hợp lý 0,16g/kg/ngày.
6. Bước đầu nghiên cứu ứng dụng bột và cao chiết tổng từ củ tam
thất hoang trong sản xuất thử nghiệm các sản phẩm: bánh cookie tam thất,
kẹo cứng tam thất, nước tam thất mật ong và trà tam thất hoa cúc được
người sử dụng ưa thích và lựa chọn.
* Đề xuất hƣớng nghiên cứu tiếp theo
1. Triển khai ứng dụng rộng rãi qui trình sản xuất cao chiết tổng từ củ
tam thất nhằm tăng hiệu quả kinh tế cho các vùng trồng tam thất trên cả nước.
2. Nghiên cứu chiết tách saponin và polyacetylen có độ tinh khiết
cao để ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm, y dược và mỹ phẩm,
giá cạnh tranh với các sản phẩm cùng loại trên thị trường đặc biệt là các
polyacetylen và saponin trong tam thất.
3. Tiếp tục nghiên cứu các yếu tố công nghệ ảnh hưởng đến sự chuyển
hóa saponin và các chất chứa trong cao chiết tổng của củ tam thất trong quá
trình công nghệ sản xuất sản phẩm thực phẩm.

24