Nhân giống và định tính alkaloid từ lá và mô sẹo cây cà gai leo solanum hainanense hance trong nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

NHÂN GIỐNG VÀ ĐỊNH TÍNH ALKALOID
TỪ LÁ VÀ MÔ SẸO CÂY CÀ GAI LEO
SOLANUM HAINANENSE HANCE TRONG
NUÔI CẤY IN VITRO
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP
CBHD: ThS. Nguyễn Trần Đông Phương
SVTH: Nguyễn Thị Ngọc Hạnh
MSSV: 1153010214
Khóa: 2011-2015
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 1 năm 2015


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu nhà trường, Ban chủ
nhiệm khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Mở Tp.HCM đã tạo điều kiện cho
em được học tập và rèn luyện trong môi trường học tập tốt nhất.
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến các thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học
đã tận tình truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình học tập.
Em xin chân thành gửi lời cám ơn thật sâu sắc đến cô Nguyễn Trần Đông
Phương đã tận tình hướng dẫn em trong quá trình học việc tại phòng Công Nghệ Tế
Bào và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em có thể thực hiện đề tài.
Em xin chân thành gửi lời cám ơn đến các bạn, các em học việc tại phòng thí
nghiệm Công Nghệ Tế Bào đã giúp đỡ em trong công việc.

Cuối cùng, con xin gửi lời cám ơn đến ba mẹ, anh chị đã luôn bên cạnh và
động viên con trong cuộc sống.
Tháng 5 năm 2015

Nguyễn Thị Ngọc Hạnh

Trang I


CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BA

6-Benzylaminopurin

cs

Cộng sự

ĐC

Đối chứng

Kin

Kinetin

MS

Murashige & Skoog

NAA

α-naphthalen acetic acid

Trang II


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình I. 1. Cây Cà gai leo ............................................................................................ 6
Hình I. 2. Cấu trúc hóa học của Auxin ..................................................................... 11
Hình I. 3. Cấu trúc hóa học của Cytokinin ............................................................... 12
Hình III. 1. Chồi được tạo thành từ lá cây Cà gai leo in vitro trong môi trường MS
bổ sung BA với các nồng độ khác nhau (5 tuần tuổi)………………………………31
Hình III. 2. Chồi được tạo thành từ lá cây Cà gai leo in vitro trong môi trường MS
bổ sung kinetin với các nồng độ khác nhau (5 tuần tuổi) ......................................... 34
Hình III. 3. Chồi được tạo thành từ đoạn thân cây Cà gai leo in vitro trong môi
trường MS bổ sung BA với các nồng độ khác nhau (5 tuần tuổi) ............................ 37
Hình III. 4. Chồi được tạo thành từ đoạn thân cây Cà gai leo in vitro trong môi
trường MS bổ sung kinetin với các nồng độ khác nhau (5 tuần tuổi) ....................... 40
Hình III. 5. Mô sẹo từ lá cây Cà gai leo in vitro trong môi trường MS bổ sung
NAA với các nồng độ khác nhau (5 tuần tuổi) ......................................................... 42
Hình III. 6. Mô sẹo từ lá cây Cà gai leo in vitro trong môi trường MS bổ sung 2
mg/l NAA và BA với các nồng độ thay đổi (5 tuần tuổi) ......................................... 45
Hình III. 7. Chồi từ mô sẹo lá cây Cà gai leo in vitro trong môi trường MS bổ sung
kinetin với các nồng độ thay đổi (7 tuần tuổi) .......................................................... 47
Hình III. 8. Dịch chiết từ lá cây Cà gai leo in vitro sau khi thêm 1 giọt thuốc thử
Wagner, Dragendorff, Mayer .................................................................................... 48
Hình III. 9. Dịch chiết mô sẹo từ lá cây Cà gai leo in vitro sau khi thêm 1 giọt
thuốc thử Wagner, Dragendorff, Mayer .................................................................... 48

Trang III


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng II. 1. Ảnh hưởng của nồng độ BA trong quá trình tạo chồi từ lá cây Cà gai leo
in vitro ....................................................................................................................... 20
Bảng II. 2. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin trong quá trình tạo chồi từ lá cây Cà gai
leo in vitro ................................................................................................................. 21
Bảng II. 3. Ảnh hưởng của nồng độ BA trong quá trình tạo chồi từ đoạn thân cây
Cà gai leo in vitro ...................................................................................................... 22
Bảng II. 4. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin trong quá trình tạo chồi từ đoạn thân
cây Cà gai leo in vitro ............................................................................................... 23
Bảng II. 5. Ảnh hưởng của nồng độ NAA trong quá trình tạo mô sẹo từ lá cây Cà
gai leo in vitro ........................................................................................................... 24
Bảng II. 6. Ảnh hưởng của nồng độ BA, NAA trong quá trình tạo mô sẹo từ lá cây
Cà gai leo in vitro ...................................................................................................... 25
Bảng II. 7. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin trong quá trình tạo chồi từ mô sẹo lá
cây Cà gai leo in vitro ............................................................................................... 26
Bảng III. 1. Ảnh hưởng nồng độ BA lên sự tạo chồi từ lá cây Cà gai leo in
vitro………………………………………………………………………………...30
Bảng III. 2. Ảnh hưởng nồng độ kinetin lên sự tạo chồi lá cây Cà gai leo in vitro . 33
Bảng III. 3. Ảnh hưởng nồng độ BA lên sự tạo chồi từ đoạn thân cây Cà gai leo in
vitro ........................................................................................................................... 36
Bảng III. 4. Ảnh hưởng nồng độ kinetin lên sự tạo chồi từ đoạn thân cây Cà gai leo
in vitro ....................................................................................................................... 39
Bảng III. 5. Ảnh hưởng nồng độ NAA lên sự tạo mô sẹo từ lá cây Cà gai leo in
vitro ........................................................................................................................... 41
Bảng III. 6. Ảnh hưởng của nồng độ NAA, BA lên sự tạo mô sẹo từ lá cây Cà gai
leo in vitro. ................................................................................................................ 44

Bảng III. 7. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin lên sự tạo chồi từ mô sẹo lá cây Cà gai
leo in vitro ................................................................................................................. 46

Trang IV


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 4

I.1. Hợp chất tự nhiên trong cây ................................................................. 4
I.1.1. Tầm quan trọng của hợp chất thứ cấp ............................................... 4
I.1.2. Sự phân loại hợp chất thứ cấp ........................................................... 4
I.2. Alkaloid .................................................................................................. 4
I.3. Giới thiệu cây Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) .................... 5
I.3.1. Họ Cà (Solanaceae) ........................................................................... 5
I.3.2. Mô tả cây Cà gai leo .......................................................................... 6
I.3.3. Đặc điểm cây Cà gai leo .................................................................... 6
I.3.4. Phân bố, sinh thái .............................................................................. 6
I.3.5. Thành phần hóa học........................................................................... 7
I.4. Tác dụng dược tính của Cà gai leo ...................................................... 7
I.5. Các nghiên cứu về cây Cà gai leo ......................................................... 7
I.6. Nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................................. 7
I.6.1. Lịch sử phát triển ............................................................................... 7
I.6.2. Khái niệm nuôi cấy mô...................................................................... 9
I.6.3. Cơ cở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật................ 9
I.6.4. Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy mô . 10
I.6.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô ........................... 13
I.7. Mô sẹo ................................................................................................... 15

I.8. Phát sinh hình thái chồi bất định ....................................................... 15
Chương II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...................................................... 18

Trang V


II.1. Vật liệu ................................................................................................ 18
II.1.1. Địa điểm và thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp ................... 18
II.1.2. Đối tượng nghiên cứu..................................................................... 18
II.2. Điều kiện nuôi cấy in vitro cây Cà gai leo ........................................ 18
II.2.1. Thiết bị và dụng cụ......................................................................... 18
II.2.2. Môi trường nuôi cấy ....................................................................... 18
II.2.3. Điều kiện nuôi cấy ......................................................................... 19
II.2.4. Các hoá chất pha môi trường nuôi cấy thực vật............................. 19
II.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................. 19
II.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng tạo chồi từ lá cây Cà gai leo in
vitro trên môi trường MS có bổ sung BA với các nồng độ khác nhau. .... 19
II.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng tạo chồi từ lá cây Cà gai leo in
vitro trên môi trường MS có bổ sung kinetin với các nồng độ khác nhau 20
II.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tạo chồi từ đoạn thân cây Cà gai
leo in vitro trên môi trường MS có bổ sung BA với các nồng độ khác nhau
................................................................................................................... 21
II.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng tạo chồi từ đoạn thân cây Cà gai
leo in vitro trên môi trường MS có bổ sung kinetin với các nồng độ khác
nhau ........................................................................................................... 22
II.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ lá cây Cà gai leo in
vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau.. 23
II.3.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ lá cây Cà gai leo in
vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA, BA với các nồng độ khác nhau.
................................................................................................................... 24

Trang VI


II.3.7. Thí nghiệm 7. Khảo sát khả năng tạo chồi từ mô sẹo lá cây Cà gai
leo in vitro trong môi trường nuôi cấy bổ sung kinetin. ........................... 25
II.3.8. Thí nghiệm 8: Định tính alkaloid từ lá, mô sẹo cây Cà gai leo in
vitro ........................................................................................................... 26
Chương 3.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 28

III.1. Kết quả .............................................................................................. 29
III.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng tạo chồi từ lá cây Cà gai leo in
vitro trên môi trường MS có bổ sung BA với các nồng độ khác nhau ..... 29
III.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng tạo chồi từ lá cây Cà gai leo in
vitro trên môi trường MS có bổ sung kinetin với các nồng độ khác nhau 32
III.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tạo chồi từ đoạn thân cây Cà gai
leo in vitro trên môi trường MS có bổ sung BA với các nồng độ khác nhau
................................................................................................................... 35
II.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng tạo chồi từ đoạn cây Cà gai leo in
vitro trên môi trường MS có bổ sung kinetin với các nồng độ khác nhau 38
III.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ lá cây Cà gai leo
in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA với các nồng độ khác
nhau ........................................................................................................... 41
III.1.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ lá cây Cà gai leo
in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA, BA với các nồng độ khác
nhau. .......................................................................................................... 43
III.1.7. Thí nghiệm 7. Khảo sát khả năng tạo chồi từ mô sẹo lá cây Cà gai
leo in vitro trong môi trường nuôi cấy bổ sung kinetin ............................ 46

III.1.8. Thí nghiệm 8: Định tính alkaloid từ lá, mô sẹo cây Cà gai leo in
vitro ........................................................................................................... 47
III.2. Thảo luận........................................................................................... 48
Trang VII


Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 53

IV.1. Kết luận ............................................................................................. 53
IV.2. Đề nghị ............................................................................................... 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 55
PHỤ LỤC .................................................................................................................... i

Trang VIII


ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiều thế kỷ qua, loài người đã biết sử dụng thực vật để cung cấp nguồn
carbohydrate, protein, chất béo trong bữa ăn hằng ngày. Hơn thế nữa, chúng ta đã biết
sử dụng các hợp chất tự nhiên trong cây để điều chế thuốc chữa bệnh, thuốc trừ sâu
sinh học và chất phụ gia thực phẩm có giá trị. Các hợp chất tự nhiên đó được hình
thành với một lượng rất nhỏ trong cây (nhỏ hơn 1% khối lượng khô). Chúng được
xem là sản phẩm hóa học của thực vật với môi trường hay sự bảo vệ chống lại vi sinh
vật và động vật [21]. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có đến 80% dân số sử dụng
thực vật làm thuốc, để chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe. Tuy nhiên, những tác động
từ việc khai thác cây thuốc bừa bãi của con người và sự biến đổi của khí hậu đã đe
dọa đến nguồn dược liệu sẵn có trong tự nhiên. Vì vậy, vấn đề đặt ra là chúng ta cần
tìm một phương pháp mới để bảo về và đáp ứng đầy đủ nguồn dược liệu ngày càng
gia tăng trong tương lai [22]. Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật như một con
đường tiềm năng để cung cấp nguyên liệu cần thiết. Việc áp dụng nuôi cấy tế bào và

mô thực vật có những ưu điểm nổi bật như:
Kiểm soát được dịch bệnh cây trồng, có thể loại được những cá thể nhiễm bệnh
hay mang mầm bệnh. Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen
của giống đem vào sản xuất. Kiểm soát được toàn bộ kỹ thuật từ khâu nhân giống đến
khâu thu hoạch. Tạo ra sự đồng loạt về giống và sản phẩm cuối. Sự đồng loạt này
giúp cho cơ giới hóa được khâu trồng trọt và thu hoạch. Do đó năng suất lao động sẽ
tăng lên, chất lượng sản phẩm đồng nhất, tạo điều kiện thuận lợi cho khâu tiêu thụ và
chế biến [9].
Có thể sản xuất các hợp chất thứ cấp theo yêu cầu với số lượng thấp hoặc với
số lượng rất lớn mà những phương pháp công nghiệp và thương mại không thể sản
xuất được. Có thể sản xuất hợp chất khác ngoài những hợp chất yêu cầu chính [2].
Cà gai leo Solanum hainanense Hance, thuộc họ Cà Solanaceae, còn có tên
gọi là Solanum procumbens Lour, cà gai dây, cà vạnh, cà quýnh, cà quánh, cà lù, gai
cườm, chẻ nam (Tày), Trap khar (Campuchia), Blou xit (Lào), B’rongoon (Ba Na)
[1]. Ở rễ và lá cây Cà gai leo có cholesterol, β-sitosterol, lanosterol, dihydro-

Trang 1


lanosterol, solasodine, alkaloid, glycoalcaloid, saponin, flavonoid, acid amin và
sterol. Cây có tác dụng chữa phong thấp, tê thấp, bàn chân tê buốt, sợ nước, sợ lạnh,
khớp xương đau buốt, sưng mộng răng, dị ứng, ức chế xơ gan, rễ và trái trị mụn nhọt
[1,5]. Cà gai leo có thể được nhân giống bằng hạt, giâm cành hoặc nuôi cấy in vitro.
Hạt Cà gai leo tuy dễ nảy mầm, nhưng hệ số nhân giống không cao do cây ít quả, quả
nhỏ và ít hạt. Nhân giống bằng giâm cành cho hệ số nhân thấp và lại phải sử dụng
chính nguyên liệu để nhân giống. Cây nhân giống bằng nuôi cấy in vitro có hệ số
nhân cao hơn, chất lượng dược liệu đồng đều [1]. Mặt khác các tác động từ thiên
nhiên có thể ảnh hưởng sự phát triển của cây, năng suất, hợp chất trong cây.
Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nhân giống và định tính
alkaloid từ lá và mô sẹo cây Cà gai leo Solanum hainanense Hance trong nuôi cấy in

vitro’’ nhằm đáp ứng nhanh và bền vững nguồn giống có chất lượng tốt.

Trang 2


TỔNG QUAN

TÀI LIỆU

Trang 3


Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I.1. Hợp chất tự nhiên trong cây
Sinh vật trong quá trình sinh trưởng và phát triển luôn thực hiện quá trình trao
đổi chất, tạo nên các sản phẩm. Trong thực vật các sản phẩm này được chia làm hai
nhóm:
-

Chất trao đổi bậc một hay hợp chất sơ cấp là các chất cơ bản cần cho
sự sống của cây và có ở tất cả các loại cây trồng, bao gồm các
cacbonhydrate, lipid và acid amin. Đó là những thành phần không thể
thiếu trong cây.

-

Chất trao đổi bậc hai hay hợp chất thứ cấp là những hợp chất được sinh
tổng hợp từ chất trao đổi sơ cấp nhưng có sự phân bố giới hạn trong
thực vật. Đặc trưng cho loài cây trồng, đóng vai trò trong sự sống và
sinh sản của thực vật [10].

I.1.1. Tầm quan trọng của hợp chất thứ cấp
Hợp chất thứ cấp góp phần tạo màu sắc cho cây, quyến rũ ong bướm giúp quá
trình thụ phấn của cây được diễn ra, cây thích nghi được với những điều kiện khắc
nghiệt của môi trường hay bảo vệ cây trồng chống lại côn trùng [18]. Một số chất thứ
cấp như glucosinolate, alkaloid gây độc có chọn lọc đối với tế bào tiền ung thư được
dùng để bào chế thuốc ung thư hoặc một số chất có tác dụng trên tim như ajmalin,
quinidine được dùng làm thuốc chữa loạn nhịp tim.

I.1.2. Sự phân loại hợp chất thứ cấp
Các hợp chất thứ cấp ở thực vật được phân loại theo con đường sinh tổng hợp
của chúng. Gồm có ba nhóm chủ yếu: terpene và steroid, alkaloid [18].

I.2. Alkaloid
Trên 100000 loại alkaloid đã được biết, khoảng 10-15% alkaloid ở trong mạch
nhựa cây có hoa, loại hai lá mầm nhưng đôi khi cũng được tìm thấy ở nấm, sinh vật
biển, một số loài động vật và côn trùng [22].
Tính chất vật lý: hầu hết alkaloid là không màu ở dạng tinh thể rắn, độ nóng
chảy cao, một vài alkaloid ở dạng nhựa vô định hình và dạng lỏng.

Trang 4


Tính tan: phần lớn alkaloid ở dạng bazơ tự do nên tan được trong dung môi
hữu cơ và không tan trong nước ở pH cao, các muối của alkaloid thì tan trong nước,
alcol.
Tính chất hóa học: alkaloid với những nhóm chức liền kề cho điện tử. Những
hợp chất thu điện tử (như nhóm amide carbonyl) là trung tính hay mang tính acid yếu.
Những alkaloid ở dạng bazơ tự do không ổn định như ở dạng muối [22].
Các alkaloid cho một số phản ứng chung thường dùng để xác định chúng:

alkaloid tạo tủa với kim loại nặng hay acid hữu cơ. Có nhiều loại thuốc thử tạo tủa
với alkaloid như thuốc thử Mayer, thuốc thử Dragendoff [22].

I.3. Giới thiệu cây Cà gai leo (Solanum hainanense Hance)
I.3.1. Họ Cà (Solanaceae)
Họ Cà là một trong những họ nguyên thủy hơn cả của bộ Hoa mõm sói. Cây
thân cỏ, cây bụi, đôi khi cây leo hoặc cây gỗ nhỏ. Lá mọc cách, không lá kèm, lá đơn
nguyên hoặc chia thùy. Thân và cuống lá có vòng libe trong, một số cây có ống tiết
chất nhầy. Trong thân và quả có các chất alkaloid (solanin, nicotin, atropine,
hioxiamin, scopalamin…), do đó nhiều cây độc và một số cũng được dùng làm thuốc
[11].
Cụm hoa thường hình xim mọc ở nách lá. Hoa lưỡng tính, đều. Đài 5, hợp,
thường tồn tại ở quả. Tràng hình bánh xe hoặc hình ống, 5 thùy bằng nhau. Nhị 5,
xếp xen kẽ với các thùy của tràng, chỉ nhị đính trên ống tràng. Một số trường hợp bao
phấn xếp sát cạnh nhau thành một ống bao quanh vòi nhụy (ví dụ chi Solanum). Bao
phấn mở lỗ ở đỉnh hay bằng kẻ nứt dọc. Bầu trên, 2 ô, nhưng cũng có khi 3-5 ô hoặc
nhiều hơn (ví dụ cà chua), mỗi ô chứa nhiều noãn, giá noãn trụ giữa phát triển lớn.
Quả mọng hoặc quả khô mở. Hạt có nội nhũ nạc.
Họ Cà có khoảng 85 chi và gần 2300 loài, phân bố ở vùng nhiệt đới và cận
nhiệt đới và cả ở vùng ôn đới chủ yếu là ở vùng Nam Mỹ. Ở Việt Nam hiện biết có
khoảng 16 chi và gần 50 loài [11].

Trang 5


I.3.2. Mô tả cây Cà gai leo
Vị trí phân loại:
Giới:

Plantae

Ngành:

Magnoliophyta

Lớp:

Magnoliopsida

Bộ:

Solanales

Họ:

Solanaceae

Chi:

Solanum

Loài:

Solanum hainanense Hance
Hình I. 1. Cây Cà gai leo

I.3.3. Đặc điểm cây Cà gai leo
Cà gai leo là cây nhỡ leo, sống nhiều năm, dài khoảng 1m hay hơn. Thân hóa
gỗ ở gốc, nhẫn, phân cành nhiều; cành non tỏa rộng, phủ rộng hình sao và rất nhiều
gai cong màu vàng. Lá mọc so le, hình bầu dục hay thuôn, gốc tròn, đầu tù; phiến lá

có thùy nông không đều, mặt sẫm, mặt dưới đầy lông màu trắng, hai mặt đều có gai
ở gân chính nhất là mặt trên; cuống lá cũng có gai.
Hoa màu tím mọc thành xim 2-5 hoa ở kẽ lá, ít khi 7-9; dài có lông, xẻ thành
4 thùy tam giác nhọn, không gai; tràng có 4 thùy hình trái xoan nhọn, nhị 4 màu vàng,
chỉ nhị phình ở gốc. Quả mọng, có cuống dài, màu vàng sau đỏ, đường kính 5-7mm;
hạt hình thận màu vàng, có mạng [1].
I.3.4. Phân bố, sinh thái
Cà gai leo phân bố chủ yếu ở vùng đồng bằng và trung du, không thấy ở miền
núi. Vùng phân bố tương đối phong phú ở Việt Nam bao gồm các tỉnh ven biển từ
Hải Phòng đến Bình Thuận. Cà gai leo còn thấy ở một vài nước nhiệt đới châu Á như
Campuchia, Thái Lan, đảo Hải Nam-Trung Quốc. Nguồn Cà gai leo ở Việt Nam
tương đối phong phú. Các tỉnh ven biển miền trung, từ Thanh Hóa trở vào có thể khai
thác mỗi năm vài chục tấn nguyên liệu để làm thuốc [1].

Trang 6


I.3.5. Thành phần hóa học
Ở rễ và lá cây Cà gai leo mọc ở Việt Nam có cholesterol, β-sitosterol,
lanosterol,

dihydro-lanosterol,

solasodine,

alkaloid,

glycoalcaloid,

saponin,

flavonoid, acid amin và sterol. Tuy nhiên, còn ít nghiên cứu về khả năng tạo hợp chất
thứ cấp và định tính glycoalkaloid từ các bộ phận của cây Cà gai leo trong in vitro
[1].

I.4. Tác dụng dược tính của Cà gai leo
Cà gai leo có vị hơi the, đắng, tính ấm, với tác dụng trị phong thấp, bàn chân
tê buốt, đau nhức các đầu gân xương, tiêu độc, trừ ho, giảm ho, giảm đau cầm máu,
trị rắn cắn, dị ứng, sợ nước, sợ lạnh, sưng mộng răng, ức chế xơ gan, rễ và trái trị mụn
nhọt [1,5].

I.5. Các nghiên cứu về cây Cà gai leo
Từ năm 1987 đến 2000:
-

Nguyễn Thị Bích Thu và cộng sự nghiên cứu thành phần hóa học cây Cà gai

leo.
-

Nguyễn Bích Thu và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của Cà

gai leo.
Năm 2010, Nguyễn Hoàng Lộc và cộng sự tham gia nghiên cứu hợp chất
glycoalkaloid từ cây Cà gai leo nuôi cấy in vitro.

I.6. Nuôi cấy mô tế bào thực vật
I.6.1. Lịch sử phát triển
Năm 1902 nhà khoa học Haberlandt lần đầu tiên đưa ra các giả thiết của
Scleiden và Schwann vào thực nghiệm. Haberlandt cho rằng: có thể tạo cá thể hoàn

chỉnh từ nuôi cấy tế bào. Tuy nhiên, Haberlandt đã không thành công trong việc nuôi
cấy tế bào thực vật. Những hạn chế về phương tiện kỹ thuật, kiến thức khoa học thời
bấy giờ đã không đưa ông đến thành công như mong đợi.
Năm 1922, Kotte nhà khoa học Mỹ lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh
sinh trưởng tách từ đầu rễ loài cây họ hòa thảo. Trong môi trường lỏng có chứa dinh
dưỡng khoáng và đường glucose, đầu rễ sinh trưởng rất mạnh tạo thành một hệ rễ bao

Trang 7


gồm cả rễ phụ. Tuy vậy, sinh trưởng của mẫu tồn tại một thời gian, sau đó chậm dần
và ngừng lại, mặc dù tác giả đã chuyển qua môi trường mới [2].
Năm 1934, giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô thực vật, White đã nuôi
cấy thành công trên cây cà chua với môi trường lỏng chứa dinh dưỡng khoáng, đường
và dịch chiết nấm men. Sau đó, White chứng minh có thể thay thế nước chiết nấm
men bằng hỗn hợp ba loại vitamin nhóm B: B1, B6 và nicotinic acid. Từ đây, việc
nuôi đã được tiến hành ở nhiều cây trồng khác nhau. Đồng thời, Gautheret tiến hành
các nghiên cứu và thành công nuôi cấy mô phân sinh (tượng tầng) một số thân gỗ.
Went và Thimann phát hiện chất điều hòa sinh trưởng (hormone) đầu tiên IAA.
Gautheret xác nhận tác dụng của chất kích thích sinh trưởng trên mô sẹo của IAA và
nhóm 3 vitamin do White khởi xướng. Cùng với Nobercourrt, Gautheret thành công
trong việc duy trì sinh trưởng của mô sẹo cà rốt trên môi trường rắn có chứa thạch
agar [2].
Năm 1941, nhà khoa học Overbeck chứng minh tác dụng kích thích sinh
trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi từ mẫu cây họ Cà.
Năm 1955, nhà khoa học Hoch Skoog phát hiện thấy vai trò của một hợp chất
có tác dụng kích thích phân bào, và đặt tên là kinetin. Sau này, các nhà khoa học
nghiên cứu tỷ mỷ hơn vai trò của kinetin và xếp vào nhóm cytokinin.
Năm 1957, Skoog và Miller công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của
tỷ lệ kinetin/auxin đối với sự hình thành mô sẹo cây thuốc lá. Khi giảm thấp tỉ lệ

kinetin/auxin, mô sẹo có xu hướng tạo rễ, ngược lại nếu tỉ lệ kinetin/auxin tăng lên,
mô sẽ phát sinh chồi. Hiện tượng này xác nhận có kết quả giống nhau trên nhiều loại
cây trồng. Kết quả nghiên cứu góp phần quan trọng trong việc sử dụng chất điều hòa
sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro [2].
Năm 1958, Kerint và Sterward tạo được phôi và cây hoàn chỉnh từ tế bào tượng
tầng cây cà rốt.
Năm 1960, Morelddax thành công trong nhân giống in vitro loài lan.
Cymbidium từ mẫu nuôi cấy là đỉnh sinh trưởng. Nuôi cấy, các đỉnh sinh trưởng hình
thành dạng cụm chồi gọi là các protocorm. Khi tách các protocorm tiếp tục nuôi cấy

Trang 8


trên môi trường phù hợp, mẫu sẽ hình thành các protocorm mới. Điều chỉnh môi
trường phù hợp, mẫu nuôi cấy có thể phát triển thành cây hoàn chỉnh.
Năm 1966, Guha và cộng sự thành công trong nuôi cấy tạo cây đơn bội ở cà
độc dược từ bao phấn.
Năm 1967-1968, lần lượt Nichko Nakato và cộng sự tạo được cây đơn bội từ
bao phấn thuốc lá [2].
I.6.2. Khái niệm nuôi cấy mô
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật: là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại
nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh
dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng.
Bao gồm:
-

Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành.

-

Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh.

-

Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành.

-

Nuôi cấy mô sẹo (callus).

-

Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào).

-

Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trong của tế bào thực vật sau khi tách
vỏ, còn gọi là nuôi cấy tế bào trần [12].

I.6.3. Cơ cở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính toàn
năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902. Theo quan điểm của sinh học
hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa, sẽ mang toàn
bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể hoàn chỉnh.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kết quả
của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Như vậy, kĩ thuật nuôi cấy mô và tế
bào thực vật là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi
cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng. Đây là một
điểm rất quan trọng bởi vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực
hiện những kĩ thuật tiên tiến cho việc lựa chọn, cải thiện và lai tạo giống cây trồng

[2].
Trang 9


Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật so với phương pháp
truyền thống:
-

Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau cây như:
trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa…mà ngoài tự nhiên không làm
được.

-

Có thể sản xuất được một số lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn,
trên một diện tích nhỏ nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại.

-

Cây con tạo ra đồng nhất về mặt di truyền.

-

Tạo cây sạch virus thông qua xử lí nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.

-

Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như
nhiệt độ, ánh sáng…

-

Bảo quản nguồn giống cây in vitro với số lượng lớn nhưng lại chiếm diện tích
rất nhỏ.

-

Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm.

-

Tạo dòng toàn cây cái hoặc toàn cây đực theo mong muốn.

-

Dễ dàng tạo giống bằng phương pháp chuyển gen [2].

I.6.4. Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy mô
Trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành phần phụ gia quan
trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy mô là các chất hòa sinh trưởng. Chất điều hòa
sinh trưởng cần thiết cho nuôi cấy tế bào; ảnh hưởng đến quá trình hình thành cơ quan
như chồi, thân lá, rễ; ảnh hưởng đến sự tổng hợp các chất thứ cấp và cấu trúc tế bào.
Các chất điều hòa sinh trưởng thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy: auxin,
cytokinin.
Auxin
Auxin kích thích sự dãn của tế bào, sự hình thành mô sẹo và rễ bất định.
Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật các auxin thường dùng là: 3 indole acetic
acid (IAA), 3 indol-butyric acid (IBA), α-naphtyl acetic acid (α-NAA), 2,4diclorophenoxy acetic acid (2,4-D). Hoạt tính của các chất điều tiết sinh trưởng này
được xếp theo thứ tự yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA và 2,4-D [10].

Trang 10


Riêng IAA là auxin tự nhiên, NAA, IBA và 2, 4- D là các auxin nhân tạo. Các
auxin nhân tạo thường có hoạt tính mạnh hơn, do cấu trúc phân tử khá bền vững nên
auxin nhân tạo ít bị oxy hóa bởi các enzyme [2].

Acid indoleacetic (IAA)

Acid indollebutyric (IBA)

α-naphtyl acetic acid(NAA)

2, 4 dichlorophenoxyacetic acid (2,4D

Hình I. 2. Cấu trúc hóa học của Auxin
Cytokinin
Hiệu quả sinh lý đặc trưng nhất của cytokinin đối với thực vật là kích thích sự
phân chia tế bào mạnh mẽ. Vì vậy, người ta xem chúng như là các chất hoạt hóa phân
chia tế bào. Có được hiệu quả này là do cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ tổng hợp axit
nucleic và protein.
Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của thực
vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi. Từ lâu người ta đã chứng minh rằng sự cân bằng tỷ
lệ giữa auxin (phân hóa rễ) và cytokinin (phân hóa chồi) có ý nghĩa quyết định trong
quá trình phát sinh hình thái của cây nuôi cấy mô in vitro cũng như trên cây nguyên
vẹn. Nếu tỷ lệ auxin cao hơn cytokinin thì kích thích sự ra rễ, còn tỷ lệ cytokinin cao
hơn auxin sẽ xuất hiện và phát triển của chồi. Để tăng hệ số nhân giống người ta tăng
nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro [2].
Ngoài ra trong mối tương tác với auxin, cytokinin có ảnh hưởng tới ưu thế
ngọn của cây. Cytokinin làm yếu hiện tượng ưu thế ngọn, làm phân hóa cành nhiều.

Trang 11


Chính vì vậy mà từ rễ (cơ quan tổng hợp cytokinin) lên chồi ngọn (cơ quan tổng hợp
auxin) thì hiện tượng ưu thế ngọn ngày càng tăng dần tương ứng với sự tăng hàm
lượng auxin và giảm hàm lượng cytokinin.
Việc sử dụng hàm lượng auxin và tỉ lệ auxin/cytokinin trong môi trường nuôi
cấy quyết định sự phân hóa của tế bào theo hướng tạo mô sẹo, tạo rễ, tạo chồi.
Có 3 loại cytokinin chính thường được dùng trong nuôi cấy mô:
-

Kinetin là sản phẩm được phát hiện đầu tiên, có cấu trúc phân tử: 6-(2-furfuryl)
- aminopurin. Trong cơ thể sống có thể không có kinetin tồn tại. Sản phẩm này
kích thích sự phát sinh chồi mô nuôi cấy.

-

Zeatin cũng là một dẫn xuất của adenine. Công thức hóa học của zeatin là 6(4-hydoxy-3-methylbut-2enyl) aminopurin. Tác dụng của zeatin tương tự như
kinetin, trong thực tiễn nuôi cấy mô, zeatin chỉ dùng trong những trường hợp
đặc biệt vì quá đắt, thông thường sử dụng kinetin và sản phẩm khác.

-

6- Bezylaminopurin (BAP): Tác dụng của BAP tương tự như hai trường hợp
chất trên nhưng hoạt tính của BAP cao hơn nhiều so với kinetin và bền vững
hơn zeatin

dưới tác động nhiệt độ cao [2].

Kinetin

BA (N6- benzyladenine)

Hình I. 3. Cấu trúc hóa học của Cytokinin

Trang 12


I.6.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô
Ánh sáng
Ánh sáng có tác động đến sự tăng trưởng và khả năng phát sinh hình thái của
tế bào trong nuôi cấy in vitro. Mỗi loài thực vật khác nhau có những đáp ứng khác
nhau với từng loại ánh sáng, cường độ và thời gian chiếu sáng khác nhau.
Cường độ chiếu sáng cao làm tăng sự thoát hơi nước, môi trường nuôi cấy bị
khô và nước trong tế bào sẽ giảm xuống gây ảnh hưởng đến sự phân chia và tăng
trưởng của chúng.
Cường độ chiếu sáng yếu làm ảnh hưởng đến sự dự trữ chất dinh dưỡng của
cây vì sự quang hợp kém hơn sự hô hấp [9].
Nhiệt độ
Nhiệt độ trong khoảng 17 - 250C thường được áp dụng để cảm ứng sự tạo mô
sẹo và sự tăng trưởng của tế bào nuôi cấy. Nhưng mỗi loài thực vật sẽ thích hợp với
một nhiệt độ khác nhau [9].
pH
Trị số độ pH của môi trường nuôi cấy thay đổi ảnh hưởng đến sự hấp thu
nguyên tố dinh dưỡng của mô nuôi cấy, các hoạt động sinh lí khác ảnh hưởng trực
tiếp hoặc gián tiếp đến sự sinh trưởng mô sẹo và sự phát sinh tế bào phôi của mô sẹo
đều yêu cầu một trị số pH tương đối thích hợp.
Người ta thường chỉnh pH khoảng 5.7-5.8, đây là mức tốt để cây có thể hấp
thụ muối khoáng [12].

Sự thoáng khí
Thông thoáng khí giúp cây trong nuôi cấy mô hô hấp và quang hợp tốt [9].
Muối khoáng
Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với nhu
cầu của cây ngoài tự nhiên. Vì vậy, việc bổ sung đầy đủ các khoáng đa lượng và vi
lượng là điều cần thiết [9].
Nguồn Carbon

Trang 13


Sucrose là nguồn cacbon và năng lượng chủ yếu được sử dụng. Đôi khi phụ
thuộc vào các loại cây trồng mà có sử dụng mantose, galactose hay glucose. Loại
đường và hàm lượng đường ảnh hưởng đến hàm lượng các chất thu nhận được [12].
Vitamin
Đại đa số tế bào thực vật nuôi cấy đều có thể tự tổng hợp vitamin cần thiết,
nhưng số lượng thấp, không đủ duy trì sự sinh trưởng của nó. Vitamin sử dụng rộng
rãi là inositol, vitamin B1, acid nicotinic và vitamin B6. Tần suất sử dụng chúng đều
vượt quá 70%.
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, chỉ cần có vitamin B1 và inositol là có thể
duy trì được sự sinh trưởng của mô nuôi cấy không cần đến các loại vitamin khác.
-

Inositol: tham gia vào nhiều quá trình trao đổi chất, đặc biệt các chất cấu thành
thành tế bào như hemixenlulose, pectin. Inositol thúc đẩy sự phân chia tế bào
mẫu nuôi cấy, sự sinh trưởng và phân hóa tế bào. Trong các môi trường nuôi
cấy tế bào, nuôi cấy mô sẹo và môi trường phân hóa mô sẹo nhất thiết phải có
inositol. Có thể thiếu inositol trong trường hợp nuôi cấy cơ quan đã phân hóa
như rễ hoặc đỉnh chồi.

-

Vitamin B1: cùng với các chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng tương hỗ, duy
trì sự sinh trưởng và phát sinh hình thái mẫu nuôi cấy.

-

Vitamin C: đóng vai trò là chất chống oxy hóa [12].
Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau, các

vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: vitamin B1, vitamin
B6, acid nicotinic, inositol [8].
Agar
Agar là một loại polysacharid của tảo: agar là chất keo đông thường được sử
dụng nhất, nguồn gốc chủ yếu của nó là rong biển đỏ, là một phức chất polysacharid
do đường saccarose và galactose cấu thành. Nồng độ của agar dùng trong nuôi cấy
dao động tùy thuộc vào độ tinh khiết của hóa chất và mục tiêu nuôi cấy.
Có tác dụng làm giá thể giúp mô nuôi cấy không bị ngập trong môi trường gây
chết mô do thiếu oxi [12].

Trang 14


I.7. Mô sẹo
Mô sẹo là đám tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường
được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo rễ. Do
đó, cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành dễ cho mô sẹo trong điều
kiện nuôi cấy in vitro, dưới tác động của một auxin mạnh được áp dụng riêng rẽ hay
phối hợp với cytokinin.
Sự tạo mô sẹo nhờ auxin thuộc một trong ba quá trình:

-

Sự phản phân hóa của các tế bào nhu mô (ít nhiều ở sâu bên trong cơ quan).

-

Sự phân chia của các tế bào tượng tầng.

-

Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ). Quá trình này được
ưu tiên áp dụng ở cây một lá mầm, vì các cây này không có các tượng tầng
điển hình, và các tế bào nhu mô khó phản phân hóa (so với cây hai lá mầm).
Sự tạo mô sẹo cần phải chú ý đến tình trạng sinh lý của mô cấy, sử dụng auxin

riêng lẽ hay phối hợp với cytokinin, bản chất và nồng độ của auxin [14].

I.8. Phát sinh hình thái chồi bất định
Sự phát sinh hình thái ở thực vật là sự phát triển của tế bào, mô hay cơ quan ở
thực vật. Sự phát sinh hình thái ở thực vật phụ thuộc vào hai quá trình căn bản: sự
điều hòa hướng kéo dài tế bào, sự kiểm soát hướng phân chia của tế bào.
Chồi bất định xuất hiện không chỉ liên hệ với mô chóp mà còn xuất hiện gần
vết thương, gần chỗ vết cắt, vì vậy chồi có thể có nguồn gốc nội sinh hoặc ngoại sinh
do một sự khử phân hóa các tế bào trưởng thành. Chồi phân sinh ngọn có thể từ các
tế bào biểu bì, mô rào, mô khuyết hay mô bao quanh mạch của mô cấy. Trước khi
phân hóa để hình thành tầng phát sinh của chồi được tạo mới, tế bào đã phân hóa phải
trải qua quá trình tái hoạt động.
Trong giai đoạn khử phân hóa, tế bào đã phân hóa bắt đầu phân chia, các cơ
quan bên trong tế bào biến đổi để trở về trạng thái của các tế bào mô phân sinh thứ
cấp (hạch nhân, không bào lớn dần và ti thể, lạp thể phân chia thành các bóng nhỏ).

Một vài biến đổi khác có thể xảy ra trước khi bắt đầu giai đoạn khử phân hóa: Mất
dần tinh bột dự trữ trong các lạp hoặc tích lũy tinh bột dự trữ và một số chất khác,
nhưng sự tích lũy như vậy có thể làm chậm sự tạo mô phân sinh.
Trang 15


Sau đó là bước chuyển tiếp từ tế bào ở trạng thái mô phân sinh thứ cấp sang
trạng thái mô phân sinh sơ cấp có khả năng sinh cơ quan. Có sự phân chia không bào
thành những không bào nhỏ [9].
Tiếp theo là giai đoạn tái phân hóa của mô phân sinh sơ cấp. Tế bào trở lại
trạng thái mô phân sinh thứ cấp. Sự tái phân hóa cũng trải qua hai bước: bước một,
tế bào trở về trạng thái mô phân sinh hoạt động, các không bào trương nước và hợp
thành không bào trung tâm, kích thước tế bào gia tăng, ti thể dần trở về hình dạng đặc
trưng; bước hai, các lạp phân hóa, các chất sống căn bản (hạch nhân, tế bào chất…),
chất dự trữ, các chất tiết (tanin, tinh dầu…) được tổng hợp. Sau đó, các tế bào này có
thể trở lại giai đoạn phân chia tế bào mới hay trực tiếp phân hóa mà không qua sự
phân chia tế bào [11].

Trang 16