Tiểu luận sinh học phân tử

- 1 -
1/ Đặ t v ấ n đề :
Di truyền học phân phân tử nghiên cứu cấu trúc các gen và sự vận
hành các sản phẩm của chúng trong một tế bào. Lãnh vực này không
ngừng được phát triển là nhờ kỹ thuật liên quan đến sự thao tác ADN,
ARN và protein thay đổi mau lẹ và mạnh mẽ mà các kỹ thuật đó ngày nay
được gọi là công nghệ gen hay công nghệ tái tổ hợp ADN.
Công nghệ tái tổ hợp ADN là những kỹ thuật tách và tái tổ hợp lại
các gen invitro. ADN tái tổ hợp là phân tử ADN lai từ ADN của hai loài
khác nhau. Ví dụ một gen cần nghiên cứu được gắn vào ADN của virus
tạo ADN tái tổ hợp. Quá trình tách gen cần nghiên cứu, sử dụng rồi gắn
vào ADN khác (như ADN virus, ADN plasmid…) tạo ra ADN tái tổ hợp rồi
chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào cần thiết là các kỹ thuật cơ bản củ
công nghệ tái tổ hợp ADN.
Các enzym cắt hạn chế RE và các vector là các công cụ sử dụng
trong công nghệ tái tổ hợp ADN. Đề tài: “ Vai trò của enzyme
restriction và plasmid trong ứng dụng của sinh học phân tử”
giúp người viết hiểu hơn về vai trò của sinh học phân tử trong nhiều lónh
vực khoa học.
2/ Đối tượng và phạm vi nghiên cứu :
Đối tượng nghiên cứu: là vi khuẩn, nấm, thực vật, động vật và các
enzym.
Phạm vi nghiên cứu: chỉ tập trung nghiên cứu vai trò của enzyme
restriction và plasmid thông qua kỹ thuật tái tổ hợp ADN.
3/ Phương pháp nghiên cứu:
Phương pháp nghiên cứu đề tài là phương pháp tổng hợp các tài liệu
được lấy từ các nguồn thông tin như thư viện, báo đài, internet. Dựa vào sự
phân tích, tổng hợp, so sánh, đối chiếu các tài liệu để thực hiện đề tài.
Mặc dù đề tài được chuẩn bò khá công phu, nhưng chắc chắn vẫn còn
sơ suất, rất mong được sự góp ý của q thầy hướng dẫn và các bạn đồng
nghiệp. Tác giả chân thành biết ơn.

4/ Cấu trúc tiểu luận:
Phần 1: Kỹ thuật tái tổ hợp ADN.
Phần 2: Một số ứng dụng của kỹ thuật di truyền.
PHẦN MỞ ĐẦU
DUNG
- 2 -
MỤC LỤC
Trang
Phần mở đầu..................................................................................................1
Phần nội dung................................................................................................3
Phần I- Kỹ thuật tái tổ hợp ADN
I/ Các enzyme hạn chế...........................................................3
II/ Thu nhận gen.....................................................................5
1/Tạo các đoạn ADN có chứa gen từ bộ gen.....................5
2/Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học......................6
3/Sinh tổng hợp gen từ mARN của gen tương ứng..............6
III/ Các vector chuyển gen.....................................................6
1/ Các vector chuyển gen plasmid.....................................7
2/ Các vector chuyển gen là phage lamdaˆ
3/ Các vector chuyển gen dự trên cosmid.........................9
4/ Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men........................10
IV/ Tạo ADN tái tổ hợp.........................................................11
V/ Tạo dòng phân tử.............................................................13
Phần II- Một số ứng dụng của kỹ thuật di truyền…………………….16
KẾT LUẬN...........................................................................................19
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................20
- 3 -
Phần 1: KỸ THUẬT TÁI TỔ HP ADN.
Kỹ thuật tái tổ hợp ADN được thực hiện qua nhiều giai đoạn nhờ các
công cụ enzyme cắt, nối và sao chép nucleic acid.

I.CÁC ENZYME HẠN CHẾ:
Kỹ thuật tái tổ hợp ADN sử dụng hàng loạt các công cụ phân tử, đó là
các enzym nuclease, ADN-polymerase, ligase, reverse transcriptase,
terminal transferase, trong đó vai trò hàng đầu là các enzyme restriction.
Vào năm 1962, V.Arber lần đầu tiên chứng minh rằng có những
enzyme đặc biệt hoạt động trong tế bào vi khuẩn, chúng có khả năng phân
biệt ADN của mình với ADN lạ của phage. Các enzym này hạn chế khả
năng sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn bằng cách phân hủy chúng
một cách đặc hiệu do đó gọi theo tiếng Anh là Restriction enzyme. Chữ
restriction có nghóa là hạn chế có nguồn gốc lòch sử từ đó và được dùng
đến nay.
Các enzyme phân cắt ADN được gọi là nuclease gồm 2 loại là
exonuclease và endonuclease. Exonuclease cắt ADN từ 2 đầu mút, còn
endonuclease cắt ADN ở giữa phân tử. Các restriction enzyme cắt phân tử
AND ở giữa một cách đặc hiệu nên được gọi là restriction endonuclease.
Năm 1970, H.Smith và các cộng tác viên đã tách được restriction
endonuclease đầu tiên từ vi khuẩn Haemophilus influenzae Rd được gọi là
HindII. Các enzyme restriction endonuclease nằm trong hệ thống chuyên
biệt hạn chế- biến đổi ( restrictio-modification system) để bảo vệ tế bào
khỏi sự xâm nhập của ADN lạ.
Các restriction enzyme nhận biết ADN mạch kép ở những trình tự
nhất đònh thường được gọi là điểm nhận biết (recognition sites) và cắt
ADN ở ngay điểm này hay kế cận. Các điểm nhận biết này thường có
trình tự 4-8 cặp nucleotide đối xứng đảo ngược nhau, được gọi là các
palyndrom. Sự cắt ADN như vậy có thể tạo đầu tù hay đầu bằng (HpaI)
hoặc đầu dính (BamHI) phụ thuộc vào cơ chế cắt của enzyme. Đầu dính
đặc biệt được sử dụng trong cấu trúc phân tử ADN lai hay khảm.
Ngày nay hơn 500 loại restriction endonuclease đã được phát hiện,
chúng có khả năng cắt ADN tổng cộng với hơn 120 trình tự nhận biết khác
nhau. Hàng trăm loại restriction endonuclease được bán ở thò trường. Mỗi

restriction endonuclease có trình tự nhận biết đặc trưng.
PHẦN NỘI DUNG
- 4 -
Ví dụ:
*Restriction endonuclease EcoRI (từ E.coli) có trình tự
Eco RI cắt
---G-A-A-T-T-C--- ---G A-A-T-T-C
---C-T-T-A-A-G--- ---G-T-T-A-A G---
*Enzyme Bam HI (từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens)
Bam HI
--- G-G-A-T-C-C --- ---G G-A-T-C-
C---
---C-C-T-A-G-G--- ---C-C-T-A-G
G---
*Enzyme Hae III (từ vi khuẩn Haemophilus aegyptium)
Hae III
---G-G-C-C--- ---G-G C-C---
---C-C-G-G--- ---C-C G-G---
Các enzym Eco RI và Bam HI khi cắt ADN mạch kép tạo ra các đầu
lệch dính (cohesive ends) vì các base bổ sung dễ bắt cặp để gắn lại với
nhau như lúc chưa bò cắt rời. Nếu có một đoạn ADN lạ khác cùng bò cắt
bởi một loại enzym hạn chế, ví dụ Eco RI thì nhờ các đầu dính đoạn ADN
lạ có thể xen vào giữa như sau :
Đoạn ADN1 Đoạn ADN lạ 2
---G-A-A-T-T-C--- ~G-A-A-T-T-C~~~~~~G-G-A-T-C-C~
---C-T-T-A-A-G--- ~C-T-T-A-A-G~~~~~~C-T-T-A-A-G~
Eco RI
« Đầu dính » « Đầu dính »
---G A-A-T-T-C--- A-A-T-T-C~~~~~~G
---C-T-T-A-A G--- G~~~~~~C-T-T-A-A

« Đầu dính » « Đầu dính »
---G-A-A-T-T-C~~~~~~G-G-A-T-C-C---
---C-T-T-A-A-G~~~~~~G-T-T-A-A-G---
- 5 -
Đoạn ADN lạ xen giữa
Tính chất quan trọng này được sử dụng để cắt và ghép các gen.
Các enzyme endonucleaza hạn chế và những đoạn cắt của chúng
Enzyme hạn chế Các đoạn cắt Có nguồn gốc từ vi khuẩn
Bam III G G A T C C
C C T A G G
Bacillus amylolique faciens H
Bgl II A G A T C T
T C T A G A
Bacillus globigi
Hind III A A G C T T
T T C G A A
Haemophilus influenzeae R
d
Eco RII C C T G G
G G A C C
Escherichia coli R245
Hpa I G T T A A C
C A A T T G
Haemophilus parainfluenzea
Hha I G C G C
C G C G
Haemophilus haemolyticus
Taq I T C G A
A G C T
Thermus aquaticus YTI

II.THU NHẬN GEN :
Có thể thu nhậân gen cho việc thực hiện kỹ thuật di truyền bằng ba
phương pháp : tách trực tiếp từ ADN bộ gen, tổng hợp hóa học và sinh
tổng hợp gen từ mARN tương ứng.
1.Tạo các đoạn ADN có chứa gen từ bộ gen :
Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong buổi đầu của sự
phát triển kỹ thuật di truyền. Toàn bộ ADN của một sinh vật được cắt
- 6 -
đoạn nhỏ khoảng 15-20.000 cặp base bằng lắc cơ học hay bởi các
restriction endonuclease rồi gắn vào các vật mang gen tạo plasmid tái tổ
hợp. Các plasmid tái tổ hợp được đưa vào tế bào để tạo dòng đoạn ADN
hoặc theo dõi sự biểu hiện của gen.
Phương pháp này mang nhiều tính chất mò mẫm vì nguyên bộ gen
tức toàn bộ ADN của các sinh vật khác nhau chứa rất nhiều gen. Phương
pháp này được gọi bằng tiếng Anh là Shotgun ( bắn đạn chài). Tuy nhiên
hiện nay nó vẫn được sử dụng có hiệu quả trong việc lập ngân hàng gen
hay thư viện gen của các sinh vật, được gọi là ngân hàng gen nhiễm sắc
thể (Bank of genomic ADN) hay thư viện gen (genomic ADN libraries).
2.Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học :
Lần đầu tiên vào năm 1977, KaItakura và Boyer đã thành công
trong việc cho gen tổng hợp nhân tạo mã hóa hormone somatostatin của
động vật có vú biểu hiện trong tế bào E.coli. Gen somatostatin đã nhận
được nhờ biết cấu trúc peptid của hormone chỉ gồm có 14 amino acid. Sau
đó, các nòi E.coli mang gen tổng hợp được tạo ra, chúng sản sinh hormone
tăng trưởng ở người Somatotripin) và các hormone peptid khác. Gen
hormone tăng trưởng ở người dài 584 cặp nucleotide là gen dài nhất được
tổng hợp nhân tạo vào cuối những năm 70.
3.Sinh tổng hợp gen từ mARN của gen tương ứng :
Trong thực tiễn của kỹ thuật di truyền người ta sử dụng rộng rãi
phương pháp thứ ba tạo gen từ các ARN thông tin của chúng. Phương pháp

này được vào quá trình phiên mã ngược nhờ sử dụng enzyme phiên mã
ngược reverse transcriptase. Enzyme gọi đúng nghóa là ADN-polymerase
phụ thuuộc ARN (ARN- dependent ADN-polymerase). Enzym có khả
năng tổng hợp nên ADN một mạch là c-ADN (complementary ADN) từ
khuôn mARN hoặc từ một đoạn polyribonucleotide tổng hợp hóa học. Nhờ
enzyme này có thể tổng hợp hầu như bất cứ gen riêng biệt nào miễn có
mặt mARN của gen đó.
III.CÁC VECTOR CHUYỂN GEN:
Vật chuyển gen là phân tử ADN có khả năng tự tái sinh, tồn tại độc
lập trong tế bào và mang được đoạn gen cần thiết . Các vật chuyển gen
phải thỏa mãn các yêu cấu tối thiểu :
*Có các trình tự xuất phát sao chép (ori) để có thể tồn tại độc lập.
*Có các trình tự nhận biết (ricognition site) mà các restriction
endonuclease nhận biết để cắt.
- 7 -
*Các trình tự điều hòa tạo thuận lợi cho sự phiên mã gen lạ.
*Đảm bảo sự di truyền bền vững của ADN tái tổ hợp ở dạng độc lập
hay gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ.
*Có các gen đánh dấu để dễ phát hiện vector hoặc các gen gắn vào.
1.Các vector chuyển gen plasmid :
a.Vector pBR322.
Các vector thông dụng được sử dụng với E.coli trước tiên phải kể
đến là pBR322 (chữ p là chữ viết tắt của cụm từ plasmid ; BR là tên viết
tắt của hai nhà khoa học ở phòng thí nghiệm đầu tiên tìm ra vector này là :
F.Bolivar và R.Rodrigues ; 322 là danh số của plasmid này để phân biệt
với các plasmid khác trong khi nghiên cứu cũng do phòng thí nghiệm này
tìm ra như pBR325, pBR327...).
Plasmid có kích thước nhỏ hơn 10kb nên dễ loại trừ vấn đề ADN bò
gãy khi làm sạch : pBR322 có 4361 cặp base. Kích thước đó nói lên rằng,
không chỉ vector có thể làm sạch một cách dễ dàng mà còn có thể cả phân

tử ADN được cấu trúc với nó. Thậm chí thêm vào 6 kb ADN, phân tử
pBR322 tái tổ hợp vẫn còn là kích thước có thể điều khiển được.
Plasmid này có hai bộ gen kháng kháng sinh là gen kháng ampicilin
hoặc gen kháng tetracyclin được dùng làm marker chọn lựa đối với tế bào
chứa plasmid này. Mỗi gen marker gồm những vò trí cắt gen hạn chế duy
nhất, mà chúng được dùng trong các thí nghiệm chọn dòng.
Việc gài ADN mới vào pBR322 đã được cắt với PstI, PvuI hoặc
ScaI sẽ làm ức chế gen amp
R
và khi dùng gài một trong 8 emzyme cắt hạn
chế làm ức chế tetracyclin. Sự thay các vò trí cắt hạn chế –mà chỗ đó có
thể dùng để ức chế gài- pBR322 có thể được dùng để chọn dòng các đoạn
ADN có đầu dính.
- 8 -
Một sự tiến bộ thứ ba của pBR322 là cơ số bản sao cao. Có khoảng
15 phân tử có mặt trong E.coli bò biến nạp nhưng số lượng này có thể tăng
từ 1.000 tới 3.000 phân tử bởi sự phóng đại plasmid với sự có mặt của chất
ứu chế tổng hợp như chloramphenicol. Do đó sự nuôi cấy E.coli đã cung
cấp một sự sản sinh lớn phân tử pBR322 tái tổ hợp.
b. Vector pBR325 chứa ba marker chọn lựa.
pBR325 là plasmid pBR222 có thêm đoạn ADN. Đoạn này mang
gen acetylcholintransferaza của chloramphenicol (CAT) một enzyme ức
chế hoạt động của chloramphenicol và như vậy kháng kháng sinh này.
Gen CAT chỉ chứa vò trí enzyme cắt hạn chế E.coRI trên plasmid. Như vậy
vò trí này có thể được dùng để chọn dòng những tái tổ hợp được phát hiện
bởi ức chế gài của kháng chloramphenicol, pBR325 có tiến bộ hơn
pBR222 là thêm một vò trí chọn dòng và thêm một marker chọn lựa.
c.Vector pATI 53-plasmid có số bản sao cao.
Vector pATI 53 là một dẫn suất khác của pBR322 nhưng trong
trường hợp này sự thay đổi không bao gồm sự cộng thêm marker chọn

dòng mới hay những vò trí chọn dòng bên ngoài. Ngược lại, vector pATI 53
đã được cấu trúc bởi sự tách ra một đoạn 700 đôi base của pBR322, trong
đó có cả gen amp
R
và tet
R
nhưng làm thay đổi sự tái bản và tiếp tục tạo ra
plasmid. pATI 53 khác với pBR322 ở hai phương diện:
- pARI 53 có số lượng bản sao cao hơn pBR322, thường có mặt
khoảng 30-45 phân tử trên một E.coli. Với số lượng copy này thì dễ dàng
được phát hiện khi nghiên cứu hiệu quả của gen được chọn dòng trong tế
bào chủ.
- pARI 53 là một plasmid không liên tục, không trực tiếp vận
chuyển được tới tế bào E.coli khác do sự phát đi 700 đôi base đã làm phá
hủy khả năng liên tục của pBR322. Điều này quan trọng đối với sự kiềm
chế sinh học để tránh đi khả năng làm tẩu thoát phân tử pATK- 53 tái tổ
hợp từ trong các ống nghiệm.
d.Vector pUC8-sự chọn dòng gen lacZ.
Vector pUC8 đã được dẫn ra từ pBR322, mặc dù trong trường hợp
này sự tái bản và gen amp
R
vẫn còn nguyên vẹn. Một đoạn nucleotide của
gen này đã bò thay đổi. Tất cả những vò trí chọn dòng bây giờ đã được tụ
tập lại trong một đoạn ngắn của gen lacz
1
. Sự chọn dòng bằng gen lacz
1