Nghiên cứu đa dạng di truyền và hàm lượng huperzin a của loài thạch tùng răng cưa thu từ sapa và đà lạt
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.57 MB, 62 trang )
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Hoàng Đình Hòa Bộ môn công nghệ sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội và TS. Lê Thị Bích Thủy - Phòng Di truyền Tế
bào thực vật - Viện công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn cho tôi trong quá trình nghiên cứu suốt thời gian
qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị, các bạn sinh viên
phòng Di truyền Tế bào thực vật - Viện công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Namđã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá
trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và ngƣời thân đã động
viên, khuyến khích giúp tôi vƣợt qua những khó khăn trong suốt thời gian nghiên cứu
và thực hiện đề tài.
Hà Nội, ngày 22 tháng 03 năm 2016
Phạm Thị Hạnh
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Kết quả của luận văn này là kết quả nghiên cứu của tôi đƣợc
thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của GS.TS Hoàng Đình Hòa Trƣờng Đại học
Bách khoa Hà Nội và TS. Lê Thị Bích Thủy Trƣởng phòng Di truyền Tế bào thực vật
– Viện công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với sự
giúp đỡ của các cán bộ và sinh viên làm việc tại phòng Di truyền Tế bào thực vật Viện công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin đƣợc đăng tải
trên các tác phẩm, tạp chí và trang web theo danh mục tài liệu kham khảo.
Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên.
Hà Nội, ngày 22 tháng 03 năm 2016
Phạm Thị Hạnh
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 3
1.1.
Cây Thạch tùng răng cƣa và hoạt chất Huperzin A ......................................... 3
1.1.1.
Cây Thạch tùng răng cƣa ......................................................................... 3
1.1.1.1.
Giới thiệu chung về cây Thạch tùng răng cƣa .................................... 3
1.1.1.2.
Thành phần hoạt chất có trong cây Thạch tùng răng cƣa ................... 4
1.1.2.
Hoạt chất Huperzin A .............................................................................. 5
1.1.2.1.
Tính chất hóa học và các thuộc tính hóa lý của Huperzin A ............... 6
1.1.2.2.
Dƣợc động học của Huperzin A ........................................................ 7
1.1.2.3.
Đặc tính chữa bệnh Alzheimer của Huperzin A ................................. 8
1.2.
Chỉ thị phân tử RAPD .................................................................................. 10
1.3.
Tình hình nghiên cứu về Thạch tùng răng cƣa và Huperzin A ...................... 11
1.3.1. Các nghiên cứu về Thạch tùng răng cƣa .................................................... 11
1.3.2. Các nghiên cứu về Huperzin A .................................................................. 14
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................... 16
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc ............................................................. 16
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................ 16
2.1.2. Hóa chất và thiết bị ................................................................................... 18
2.1.2.1. Hóa chất.............................................................................................. 18
2.1.2.2. Thiết bị ............................................................................................... 18
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................. 18
2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số Thạch tùng răng cƣa ....................... 18
2.2.2. Kỹ thuật PCR với các mồi RAPD .............................................................. 20
2.2.3. Phân tích số liệu đa dạng di truyền ............................................................ 22
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
2.2.4. Phƣơng pháp tách chiết Huperzin A ......................................................... 24
2.2.5. Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng ................................................................. 25
2.2.6. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ....................................... 25
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 27
3.1. Kết quả tách DNA tổng số ............................................................................... 27
3.2. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền các mẫu Thạch tùng răng cƣa ................... 29
3.2.1. Kết quả đánh giá mức độ đa hình .............................................................. 29
3.2.2. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền ................................................... 33
3.3. Kết quả định tính và định lƣợng Huperzin A ................................................... 35
3.3.1. Kết quả định tính Huperzin A ở các mẫu Thạch tùng răng cƣa thu từ 8 địa
điểm lấy mẫu ...................................................................................................... 36
3.3.2. Kết quả định lƣợng Huperzin A ở các mẫu Thạch tùng răng cƣa thu từ 8 địa
điểm lấy mẫu ...................................................................................................... 37
3.3.3. Kết quả định tính Huperzin A từ các bộ phận và thời điểm lấy mẫu Thạch
tùng răng cƣa khác nhau. .................................................................................... 39
3.3.4. Kết quả định lƣợng Huperzin A từ 4 mẫu lá Thạch tùng răng cƣa ............. 41
CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN ....................................................................................... 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 46
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DNA
: Deoxyribonucleic acid
RNA
: Axit ribonucleotide
CTAB
: Cetyltrimethyl amoniumbromide
dNTP
: Deoxynucleosid triphosphat
EDTA
: Ethylene diamin tetra acetate
Kb
: Kilo base
PCR
: Phản ứng chuỗi polymerase
(Polymerase chain reaction)
RAPD
: DNA đa hình đƣợc nhân bản ngẫu nhiên
( Random Amplyfied Polymorphic DNA)
SSR
: Các trình tự lặp lại đơn giản
(Simple Sequence Repeats)
AFLP:
: Đa hình đọ dài nhân bản chọn lọc
(Amplified Fragment Length Polymorphism)
RFLP
: Đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế
(Restriction Fragment Length Polymorphism
UPLC - MS
: Sắc ký lỏng siêu cao áp ghép đầu dò khối phổ
(Ultra Performance Liquid Chromatography -mass spectrometry )
MMSE
: Mini – mental state examination
Taq Polymerase
: Thermus aquaticus Polymerase
TBE
: Tris base, Boric acid, EDTA.
TE
: Tris EDTA
H. serrata
: Huperzia serata
ACh
: Acetylcholine
BuChE
: Butyrylcholinesterase
AChE
: Acetylcholinesterase
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
TLC
: Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng)
HPLC
: High performance liquid chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
ACN
: Acetonitrile
LC/MS
: Sắc ký lỏng khối phổ
MeOH
: Methanol
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cây thạch tùng răng cƣa ............................................................................... 3
Hình 1.2. Đại diện cho 4 nhóm hợp chất chính của Lycopodium alkaloids thu từ H.
serrata: Fawcettimine (A), lycodine (B),Lycopodine (C),phlegmarine (D). ................. 4
Hình 1.3. Hai dạng đồng phân quang học của Huperzin A ........................................... 7
Hình 1.4. Cấu trúc tƣơng tự nhau của Huperzin A và ACh .......................................... 9
Hình 2.1. Bản đồ 5 vị trí lấy mẫu ở Sa Pa .................................................................. 17
Hình 2.2. Bản đồ 3 vị trí lấy mẫu ở Đà Lạt ................................................................ 17
Hình 3.1. Kết quả điện di tách chiết DNA tổng số từ 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa ...... 27
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi OPC1 ................................ 30
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi OPC8 ................................ 30
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi OPC18 .............................. 31
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi OPC20 .............................. 31
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi OPB6 ................................ 31
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi OPB10 .............................. 32
Hình 3.6. Quan hệ di truyền giữa 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa nghiên cứu ................. 35
Hình 3.7. Hình ảnh chạy sắc ký bản mỏng Huperzin A từ 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa.
.................................................................................................................................. 36
Hình 3.8. Đƣờng chuẩn định lƣợng Huperzin A ........................................................ 38
Hình 3.9. Hình ảnh chạy sắc ký bản mỏng Huperzin A từ Thạch tùng răng cƣa thu tại
DL1. .......................................................................................................................... 40
Hình 3.10. Hình ảnh chạy sắc ký bản mỏng Huperzin A từ Thạch tùng răng cƣa thu tại
SP1. ........................................................................................................................... 41
Hình 3.11. Sắc kí đồ HPLC (UV 310 nm) phát hiện Huperzin A ............................... 42
Hình 3.12. Phổ ESI- MS positive và pic ion phân tử 243,0 [M+H]+ của Huperzin A . 42
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Địa điểm lấy mẫu sử dụng trong nghiên cứu .............................................. 16
Bảng 2.2 Trình tự nucleotide của 8 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu ................. 22
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR-RAPD ............................................................ 22
Bảng 2.4. Bảng gradient nồng độ rửa giải .................................................................. 26
Bảng 3.1. Kết quả đo độ hấp thụ bƣớc sóng 260 nm, 280 nm và nồng độ DNA tổng số
của 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa nghiên cứu ............................................................... 28
Bảng 3.2. Tổng hợp kết quả phân tích 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa với 8 mồi RAPD
cho đa hình. ............................................................................................................... 33
Bảng 3.3. Hệ số tƣơng đồng di truyền của 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa ...................... 34
Bảng 3.4. Các thang nồng độ trong đƣờng chuẩn định lƣợng Huperzin A .................. 37
Bảng 3.5. Kết quả phân tích định lƣợng 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa ......................... 39
Bảng 3.6. Kết quả phân tích định lƣợng Huperzin A trong mẫu Thạch tùng răng cƣa ở
Sa Pa ......................................................................................................................... 43
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
MỞ ĐẦU
Ngày nay, cùng với sự phát triển của kinh tế, con ngƣời có xu hƣớng ăn uống
và sinh hoạt không điều độ dẫn tới khả năng dễ mắc một số bệnh khi về già làm
giảm tuổi thọ. Có rất nhiều bệnh nguy hiểm gây tử vong ở ngƣời già và Alzeimer là
chứng bệnh gây tử vong ở ngƣời cao tuổi đứng hàng thứ 4 hiện nay. Đây là bệnh
thoái hóa cả não bộ không hồi phục, gây chứng sa sút trí tuệ ở ngƣời cao tuổi. Tổn
thƣơng tế bào thần kinh ở vỏ não và những cấu trúc xung quanh làm sa sút trí nhớ,
giảm phối hợp vận động, giảm cảm giác, nhận cảm sai…, cuối cùng là mất trí nhớ
và chức năng tâm thần, khó khăn trong đi đứng. Xuất phát từ những ảnh hƣởng tiêu
cực của bệnh Alzeimer, có rất nhiều công trình nghiên cứu đƣợc tiến hành nhằm tìm
ra nguyên nhân và cách chữa trị chứng bệnh này. Các nhà khoa học Mỹ đã mở ra tia
hy vọng mới cho các bệnh nhân Alzheimer với công trình khoa học khẳng định việc
"bắt chết" một enzym liên quan đến bệnh Alzheimer. Huperzin A một chất thuộc
nhóm Alkaloide có trong cây Thạch tùng răng cƣa có khả năng xuyên qua hàng rào
mạch máu não và tác động trực tiếp lên não bộ với liều lƣợng rất thấp tính bằng
microgram. Chính vì vậy, theo các nhà khoa học, cây Thạch tùng răng cƣa cần đƣợc
quan tâm nghiên cứu và khai thác ứng dụng trong điều trị các bệnh rối loạn về trí
nhớ, nhất là Alzheimer. Đối với nƣớc Việt Nam chúng ta, hiện nay tỷ lệ ngƣời cao
tuổi ngày càng gia tăng và các rối loạn về trí nhớ cũng phát triển, dẫn đến nhu cầu
về chữa bệnh cũng tăng lên. Trong khi các nhà khoa học trên thế giới phát hiện ra
công dụng đặc biệt của loài cây Thạch tùng răng cƣa và có nhu cầu rất lớn về cây
này để tách chiết các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên nhằm giảm thiểu tác dụng
phụ, thì ở Việt Nam Thạch tùng răng cƣa đã phát hiện đƣợc ở Sa Pa (Lào Cai) và Đà
Lạt (Lâm Đồng). Ở Lào Cai hiện nay loài cây này chỉ còn lại ở một số nơi trong
rừng tự nhiên. Ở Đà Lạt một số cơ sở nhân giống nhà nƣớc cũng nhƣ tƣ nhân đã tạo
đƣợc vài vƣờn giống loài cây này với mục đích thƣơng mại, các vƣờn này chƣa
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
1
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
nhiều và bố trí chƣa bài bản. Tại một số Viện, Trung tâm nghiên cứu nuôi cấy mô ở
Việt Nam hiện nay cũng đã lƣu giữ đƣợc trong điều kiện nuôi cấy invitro loài Thạch
tùng răng cƣa Huperzia serrata, tuy nhiên cũng chỉ mới dừng lại ở mức độ nghiên
cứu lƣu giữ và nhân cây trong phòng thí nghiệm. Hoàn toàn chƣa có một công bố
nào nghiên cứu về Thạch tùng răng cƣa trong nƣớc.
Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền và
hàm lượng Huperzin A của loài Thạch tùng răng cưa thu từ Sa Pa và Đà Lạt”
nhằm phục vụ cho việc khai thác và phát triển nguồn gen Thạch tùng răng cƣa ở
Việt Nam.
Mục tiêu của đề tài :
- Đánh giá đƣợc mức độ đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử của loài
Thạch tùng răng cƣa sinh trƣởng tại Sa Pa và Đà Lạt, Việt Nam.
- Nghiên cứu định tính và định lƣợng Huperzin A của Thạch tùng răng cƣa
Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu:
- Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử RAPD với các xuất xứ
Thạch tùng răng cƣa.
- Xác định hàm lƣợng Huperzin A của Thạch tùng răng cƣa ở các thời điểm
và ở các vùng sinh thái khác nhau.
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
2
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.
Cây Thạch tùng răng cƣa và hoạt chất Huperzin A [6] [21]
1.1.1. Cây Thạch tùng răng cƣa
1.1.1.1. Giới thiệu chung về cây Thạch tùng răng cưa
Cây Thạch tùng răng cƣa có tên khoa học là Huperzia serrata (H. serrata) là
một thành viên của gia đình Thông đất (Huperziaceae) và thuộc chi Huperzia.
Huperzia serrata lần đầu tiên đƣợc biết đến nhờ các nhà y học Trung Quốc với tên
gọi Quian Ceng Ta [17][21]. Cây mọc ở đất, thân cao 15-40cm, đƣờng kính khoảng
2mm, hình trụ. Lá hình bầu dục, mũi mác, dài 15mm rộng 3mm, tƣơng đối mỏng,
gân giữa rõ, có mép răng. Túi bào tử ở nách nhánh lá, có hình thận, màu vàng tƣơi
[36]. Huperzia serrata phân bố trên toàn thế giới nhƣng tập trung nhiều nhất ở phía
Đông, Nam và Đông Nam khu vực Châu Á, Châu Đại Dƣơng và Trung Mỹ. Phân
bố ở độ cao 230-2200m so với mực nƣớc biển dƣới tán rừng ẩm. Ở nƣớc ta
Huperzia serrata chỉ gặp ở vùng núi cao 1000m nhƣ Lào Cai, Lâm Đồng [37].
Huperzia serrata đƣợc sử dụng rộng rãi cho các bệnh có liên quan đến hệ tim
mạch, các cơ thần kinh hoặc những ngƣời liên quan đến hoạt động cholinesterase
bao gồm sốt, tụ máu, căng thẳng, tiểu máu và tâm thần phân liệt. Huperzia serrata
cũng đƣợc biết đến nhƣ một loại thuốc chống viêm, giải độc cho ngộ độc
organophosphat. Những đặc tính chữa bệnh của H. serrata chủ yếu là do hoạt tính
sinh học của hợp chất Lycopodium alkaloid trong loài cây này [21].
Hình 1.1. Cây thạch tùng răng cƣa
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
3
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
1.1.1.2. Thành phần hoạt chất có trong cây Thạch tùng răng cưa
Trong Thạch tùng răng cƣa nhóm chất chính có hoạt tính sinh học làm nên
đặc tính chữa bệnh của cây này là Lycopodium alkaloids. Một số Lycopodium
alkaloids với cấu trúc hóa học đa dạng đƣợc phân lập từ cây Thạch tùng răng cƣa
vẫn đang đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu để xây dựng nên cấu trúc các hợp chất
alkaloids mới. Tuy nhiên, có rất ít công bố khoa học về hoạt tính sinh học của các
hợp chất alkaloid này. Đa số các Lycopodium alkaloids là liposoluble và chúng
đƣợc phân thành bốn loại cấu trúc chính. Bốn loại cấu trúc chính đó đƣợc trình bày
trong hình 1.2 bao gồm các nhóm: Fawcettimine, lycodine,lycopodine, phlegmarine.
[21][32][33].
Hình 1.2. Đại diện cho 4 nhóm hợp chất chính của Lycopodium alkaloids thu từ H.
serrata: Fawcettimine (A), lycodine (B),Lycopodine (C),phlegmarine (D).
Hầu hết các hợp chất alkaloid có khả năng ức chế enzyme
Acetylcholinesterase (AchE) thuộc về lớp lycodine (B) gồm có: Huperzin A, 6βhydroxyHuperzin A, Huperzin B, N-methylHuperzin B và Huperzinine. Trong số
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
4
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
đó, đối với vấn đề ức chế AchE thì Huperzin A là hợp chất quan trọng có khả năng
ức chế mạnh nhất. Một số nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng một vài Lycopodium
alkaloids thuộc nhóm fawcettimine cũng có khả năng ức chế AchE nhƣ Huperzin P
và Huperzin R nhƣng khả năng ức chế của chúng thấp hơn Huperzin A. Ngƣợc lại,
11α-hydroperoxyphlegmariurine
B,
7-hydroperoxyphlegmariurine
B
và
phlegmariurine B cũng thuộc nhóm fawcettimine lại không có khả năng ức chế hoạt
động của AchE.
Ngoài các hợp chất Lycopodium alkaloids đã đƣợc khảo sát rộng rãi, còn có
các hợp chất có hoạt tính sinh học tự nhiên khác thƣờng tìm đƣợc trong cây Thạch
tùng răng cƣa nhƣ nhóm triterpenes: Serrat-14-en-3b, 21a, 29-triol; Flavon: 5,50dihydroxy-20,40-dimethoxyflavone-7-ObD-(600-O-Z-P-coumaroyl)glucopyranoside nhóm chất này cũng đƣợc xác định là một axit phenolic [34].
1.1.2. Hoạt chất Huperzin A
Hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cƣa là Huperzin A (Huperzine
A). Chất này đƣợc các nhà khoa học Trung Quốc phát hiện lần đầu tiên vào năm
1948. Sau đó, Huperzin A đƣợc các nhà khoa học phƣơng tây phân lập, tinh sạch và
nghiên cứu sử dụng vào năm 1986 [20].Trong những năm qua, Huperzin A đã đƣợc
nghiên cứu rộng rãi bởi nhiều nhà khoa học Trung Quốc, đặc biệt là việc sử dụng
Thạch tùng răng cƣa trong y học cổ truyền Trung Quốc để điều trị và chữa bệnh mất
trí nhớ.
Đến nay, rất nhiều nhà khoa học đã chứng minh Huperzin A là chất kháng
AchE mạnh. Hơn nữa, Huperzin A cũng là một chất đối kháng thụ thể N-methyl-Daspartate của não. Do đó, Huperzin A cũng đƣợc dự đoán rằng nó có thể đƣợc dùng
để chữa cho các đối tƣợng bị bệnh động kinh. Huperzin A có khả năng cải thiện
hiệu quả chứng suy giảm trí nhớ ở cả động vật và con ngƣời, và nó cũng có tiềm
năng trong điều trị chứng mất trí nhớ acetylcholine (ACh) bao gồm cả bệnh
Alzheimer. Thuốc ''Shuangyiping '', một dạng viên của Huperzin A sản xuất từ chiết
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
5
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
xuất của Thạch tùng răng cƣa, đƣợc phát triển vào năm 1996 và nó đã đƣợc chấp
nhận nhƣ là một loại thuốc mới để điều trị triệu chứng của Alzheimer ở Trung
Quốc. Năm 1997, Huperzin A đƣợc cơ quan quản lý thực phẩm và Dƣợc phẩm công
nhận là thực phẩm bổ sung dinh dƣỡng và nó đƣợc bán trên thị trƣờng Hoa Kỳ dƣới
nhiều dạng chế phẩm khác nhau nhƣ: dạng bột, dạng bánh, dạng viên cho những
ngƣời mắc chứng suy giảm trí nhớ. Kết quả là, Huperzin A nhanh chóng trở thành
một mặt hàng đắt khách trong thị trƣờng thuốc. Huperzin A đƣợc sử dụng rộng rãi
mà không cần có sự kê đơn của bác sĩ và Huperzin A cho thấy là chất không có tác
dụng phụ khi sử dụng hoặc nếu có thì cƣờng độ rất nhẹ.
Mặc dù Huperzin A có nguồn gốc từ Thạch tùng răng cƣa nhƣng hợp chất
này còn đƣợc tìm thấy ở nhiều loài khác có mối quan hệ phân loài gần gũi với loài
Thạch tùng răng cƣa thuộc gia đình Huperziaceae. Bên cạnh đó Huperzin A còn
đƣợc tìm thấy trong nhiều gia đình thực vật khác nhau thuộc họ Lycopodiaceae và
Selaginella.
Trong cây Thạch tùng răng cƣa có chứa Huperzin A ít hơn 0,02% trọng
lƣợng tƣơi [6] [7] và 0,0047-0,025% trọng lƣợng khô, phụ thuộc vào mùa, vùng
sinh sống, quá trình thu và công nghệ tách chiết [5] [12]. Do đó muốn tách chiết
đƣợc nhiều Huperzin A cần phải có một số lƣợng lớn cây Thạch tùng răng cƣa.
Trong chi Huperzia thì H.serrata, H. herteriana và H.ovatifolia có chứa Huperzin A
cao hơn các loài khác. Mặc dù có một số loài khác trong gia đình Huperziaceae có
chứa lƣợng Huperzin A cao nhƣng ít đƣợc đề cử hơn H. serratavì những loài đó khó
tìm và ngày càng khan hiếm hơn so với H. serrata [28].
Do nhu cầu sử dụng cây này để chữa bệnh ngày càng tăng cao và đặc tính
sinh trƣởng rất chậm nên cây H. serrata tự nhiên đang bị khan hiếm. Do vậy, nhiều
nhóm nghiên cứu đã nỗ lực trong việc phát triển các phƣơng pháp hóa học hoặc nuôi
cấy in vitro loài cây này để tổng hợp Huperzin A với số lƣợng lớn.
1.1.2.1. Tính chất hóa học và các thuộc tính hóa lý của Huperzin A
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
6
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
Huperzin A có 2 dạng đồng phân quang học là (+)-Huperzin A và (-)Huperzin A [9] [14].
Hình 1.3. Hai dạng đồng phân quang học của Huperzin A
Huperzin A có cấu trúc phân tử khá độc đáo, bộ khung của nó nhỏ gọn chắc
chắn có chứa một nhóm ethylidene và pyridone thơm kết hợp với một vòng mang
nhóm amino. Công thức thực nghiệm của Huperzin A là C15H18N2O và trọng lƣợng
phân tử là 242,32g/mol. Trong tự nhiên Huperzin A tồn tại ở dạng (-)-Huperzin A
(L-Huperzin A) và dạng này hoạt động mạnh hơn dạng (+)-Huperzin A (D-Huperzin
A). Huperzin A bền, tinh thể có màu trắng, dễ dàng hòa tan trong dung dịch axit,
MeOH và chloroform. Huperzin A không bị thay đổi cấu trúc hóa học khi ủ kéo dài
ở nhiệt độ 24ºC với AchE hoặc butyrylcholinesterase (BuChE) hoặc ủ 96h với 0,1N
hydrochloric acid.
1.1.2.2. Dược động học của Huperzin A
Dƣợc động học của Huperzin A không chỉ đƣợc nghiên cứu trên các loài
động vật khác nhau mà còn đƣợc nghiên cứu trên những ngƣời tình nguyện khỏe
mạnh.
Thí nghiệm ở trên chuột cho thấy, sau khi tiêm tĩnh mạch Huperzin A vào
chuột dùng các kỹ thuật kiểm tra ngƣời ta thấy rằng Huperzin A có mặt ở tất cả các
vùng ở não bộ, nó đặc biệt tập trung ở vỏ não trƣớc, vân não, vùng hippocampus, và
vùng nhân não. Các thí nghiệm cũng chỉ ra rằng mức độ gắn kết của Huperzin Avới
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
7
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
huyết tƣơng chỉ 17% và phần lớn Huperzin A đƣợc bài tiết ngoài qua đƣờng nƣớc
tiểu trong 24h còn 2,4% thu đƣợc trong phân [30].
Sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ Wang và cộng sự (2004) đã xây
dựng đƣờng cong nồng độ Huperzin A theo thời gian ở trong huyết tƣơng chó sau
khi tiêm bắp với cùng 1 công thức 10 Ig/kg/15 ngày. Nồng độ cao nhất (Cmax) đạt
đƣợc 48h sau khi tiêm là 0,36 ng/ml. Nồng độ Huperzin A trong huyết tƣơng giảm
còn một nửa sau 54,8h [29].
Cho đến nay, các công bố về dƣợc động học của Huperzin A trên ngƣời còn
nhiều hạn chế do việc khó khăn định lƣợng các hợp chất trong hệ tuần hoàn của sau
khi dùng các liều điều trị. Qian và cộng sự (1995) đã nghiên cứu dƣợc động học của
Huperzin A trên 6 tình nguyện viên ngƣời Trung Quốc sau khi cho họ uống 1 liều
duy nhất có chứa 0,99 mg Huperzin A. Các giá trị Cmax và thời gian để đạt Cmax
Huperzin A trong huyết tƣơng lần lƣợt là 8,4Ig/l ở 79,6 phút sau khi uống thuốc.
Nồng độ Huperzin A thải ra ngoài một nửa sau 288,5 phút. Tóm lại Huperzin A
đƣợc hấp thu nhanh qua đƣờng tiêu hóa và phân bố nhanh vào cơ thể và bị thải ra
ngoài một cách từ từ [25].
1.1.2.3. Đặc tính chữa bệnh Alzheimer của Huperzin A
Theo các nghiên cứu về bộ nhớ và nhận thức các nhà khoa học đã chỉ ra rằng
có sự tƣơng quan giữa thoái hóa thần kinh cholinergic trong thần kinh trung ƣơng và
sự thiếu hụt nhận thức ở các bệnh nhân Alzheimer. Trong cơ thể ngƣời bình thƣờng,
enzyme acetylcholineterase (AChE) đƣợc tiết ra vừa đủ cho các hoạt động dẫn
truyền xung thần kinh bằng cách phá vỡ acetylcholine thành acetyl và choline. Tuy
nhiên, đối với ngƣời mắc bệnh Alzheimer enzyme AChE đƣợc tiết ra quá nhiều làm
suy giảm acetylcholine trong não. Nhƣ đã trình bày ở trên, Huperzin A có khả năng
ức chế AChE nên sự có mặt của Huperzin A làm giảm enzyme AChE có trong não.
Nhờ đó, hàm lƣợng ACh tăng lên làm cải thiện trí nhớ cho bệnh nhân Alzheimer.
Bệnh lý bệnh này đƣợc đặc trƣng bởi sự tích tụ quá nhiều β-amyloid peptid do tuổi
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
8
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
già và đám rối các sợi thần kinh nội bào. Do thiếu các chiến lƣợc điều trị các triệu
chứng và phòng ngừa hiệu quả mà ngày càng có nhiều ngƣời mắc bệnh Alzheimer.
Việc tăng cƣờng dẫn truyền thần kinh cholinergic đã trở thành chiến lƣợc chính sử
dụng để làm giảm bớt các triệu chứng về nhận thức. Nhiều loại thuốc đƣợc nghiên
cứu và sử dụng tuy nhiên các chất ức chế AchE để tăng cƣờng hệ thống cholinergic
ngoại vi thƣờng có tác dụng phụ quá mức liên quan đến dạ dày và nhiễm độc gan.
Ngƣợc lại, Huperzin A là chất ức chế chọn lọc, có khả năng cải thiện các triệu
chứng của bệnh nhân mắc Alzheimer và ít có tác dụng phụ. Huperzin A có thể đƣợc
sử dụng nhƣ là tác nhân phòng ngừa để làm chậm hoặc ngăn chặn quá trình sinh
bệnh ở giai đoạn đầu mắc Alzheimer.
Hình 1.4. Cấu trúc tƣơng tự nhau của Huperzin A và ACh
Huperzin A có khả năng ức chế AChE do có cấu tạo tƣơng tự ACh. Thực vậy,
các nhà khoa học đã nghiên cứu và chỉ ra rằng Huperzin A sở hữu các đặc điểm cấu
trúc cơ bản của ACh. Nhìn vào hình 1.4 có thể thấy có sự tƣơng đồng giữa nito, oxy
và nhóm cacbonyl của ACh và nhóm amino-nito, nito và cacbonyl tƣơng ứng của
Huperzin A [4].
Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng Huperzin A có thể làm đảo ngƣợc hoặc giảm
bớt chứng thiếu hụt nhận thức trên một số động vật thí nghiệm. Ngoài ra, thử
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
9
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
nghiệm lâm sàng cũng chứng minh rằng Huperzin A làm giảm đáng kể chứng giảm
trí nhớ ở ngƣời già, ngƣời bị đãng trí, sa sút trí tuệ. Hơn nữa, một số nghiên cứu chỉ
ra rằng loại thuốc này có thể có hiệu quả chống lại các mức giảm ACh trong não và
sự chết của các tế bào thần kinh glutamate, đây là hai trong số các rối loạn thần kinh
thƣờng gặp trong bệnh Alzheimer. Nhƣ vậy, Huperzin A là thuốc có tác dụng điều
trị kép với bệnh Alzheimer.
Huperzin A có tác dụng điều trị hiệu quả, thuận nghịch, chính xác, tập trung
và chọn lọc.
1.2.
Chỉ thị phân tử RAPD
Để đánh giá mức độ đa dạng di truyền của các mẫu Thạch tùng răng cƣa thu
đƣợc ngoài sử dụng đặc điểm hình thái thì việc áp dụng chỉ thị phân tử DNA đƣợc
coi là phƣơng pháp hữu hiệu nhất. Kỹ thuật chỉ thị phân tử RAPD là 1 trong số các
chỉ thị DNA thƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền.Chỉ thị DNA
đƣợc hình thành từ các loại đột biến DNA khác nhau nhƣ thay thế (đột biến điểm),
sắp xếp lại (thêm vào hoặc bớt đi nucleotide) hoặc các sai sót trong sao chép các
đoạn DNA lặp lại liền kề.Các chỉ thị DNA thƣờng nằm ở các vùng khôngphiên
mã.Khác với các chỉ thị hình thái và sinh hóa, chỉ thị DNA không giới hạn về số
lƣợng, không ảnh hƣởng bởi yếu tố môi trƣờng và giai đoạn phát triển của cây. Chỉ
thị DNA đƣợc sử dụng nhiều trong nghiên cứu quan hệ di truyền, phát sinh chủng
loại và phân loại phân tử; trong lập bản đồ liên kết di truyền, nhận biết gen; vàtrong
chọn giống bao gồm đánh giá đa dạng di truyền, nhận biết giống, chọn lọc các tính
trạng kháng bệnh, chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trƣờng, năng suất và
phẩm chất giống [2].
Mỗi loại chỉ thị DNA đƣợc phát triển bằng một kỹ thuật tƣơng ứng. Kỹ thuật
chỉ thị DNA lý tƣởng cần phải có các tiêu chí sau: cho đa hình cao và phân bố đều
trong genome; cho sự phân biệt rõ sự khác nhau về di truyền, tạo nhiều chỉ thị độc
lập và chính xác; đơn giản, nhanh và ít tốn kém; cần ít mẫu và DNA; liên kết với
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
10
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
kiểu hình nhất định; có thể lặp lại trong các nghiêncứu, mức độ sai sót thấp nhất, ghi
số liệu dễ và chính xác, có nhiều allen (hàm lƣợng thông tin cao), không cần biết
trƣớc thông tin về genome và cơ thể [2].
Cơ sở của kỹ thuật RAPD là sự nhân bản DNA genome bằng phản ứng PCR
với các mồingẫu nhiên để tạo ra sự đa hình DNA do sự tái sắp xếp hoặc mất
nucleotide ở vị trí bắt mồi. Mồi sử dụng cho kỹ thuật RAPD là các mồi ngẫu nhiên,
thƣờng là 10 nucleotide và có nhiệt độ kéo dài mồi thấp (34-37ºC). Sản phẩm PCRRAPD thƣờng đƣợc phân tách trên gel agarose 1,5-2,0% để nhận biết các đoạn đƣợc
nhân. Kỹ thuật RAPD không cần thông tin về genome của đối tƣợng nghiên cứu và
có thể ứng dụng cho các loài khác nhau với các mồi chung. RAPD đƣợc coi là một
phƣơng pháp tạo ra sự đa hình nhanh và hữu hiệu.
Trong bộ genome có một số đoạn có xu hƣớng đƣợc bảo tồn bên cạnh đó có
một số đoạn có xu hƣớng dễ thay đổi giữa các cá thể trong loài, giữa các loài khác
nhau. Bản chất của phân tích PCR-RAPD là tìm thấy những chuỗi DNA có sự biến
đổi vừa đủ cho phép chúng ta phát hiện ra sự khác biệt giữa các sinh vật mà chúng
ta nghiên cứu. Việc tìm đúng mồi sẽ cho phép chúng ta phát hiện ra sự khác biệt
giữa các chuỗi DNA.
Bên cạnh tính ƣu việt, kỹ thuật RADP còn có hạn chế là sản phẩm PCR
không ổn định do mồi ngắn, nhiệt độ bắt mồi thấp; ngoài ra, kỹ thuật này tạo ra các
chỉ thị trội do đó không phân biệt đƣợc các cá thể dị hợp tử với các cá thể đồng hợp
tử. RADP sử dụng nhiều trong nghiên cứu đa dạng di truyền giữa các loài thực vật,
trong nghiên cứu đặc điểm của giống và đánh giá biến đổi di truyền, trong xác định
loài, và xác định con lai.
1.3.
Tình hình nghiên cứu về Thạch tùng răng cƣa và Huperzin A
1.3.1. Các nghiên cứu về Thạch tùng răng cƣa
Từ xa xƣa y học cổ truyền Trung Quốc đã sử dụng cây Thạch tùng răng cƣa
trong các bài thuốc chữa nhiều bệnh liên quan đến chứng suy giảm trí nhớ, tâm thần
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
11
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
phân liệt, chống viêm...Nhƣng chỉ đến năm 1986, sau khi Liu và cộng sự phân lập
thàch công Huperzin A chất chính làm nên dƣợc tính của của cây Thạch tùng răng
cƣa thì nhiều nhà khoa học trên thế giới bắt đầu đặc biệt quan tâm nghiên cứu về
loài cây này [20].
Công bố của Liang năm 2010 đã thiết lập đƣợc hệ thống nuôi cấy mô H.
serrata và nghiên cứu đƣợc ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng nhằm tạo
H. serrata sinh trƣởng đa chồi và tích lũy Huperzin A cao. Môi trƣờng nuôi cấy H.
serata invitro thƣờng dùng là môi trƣờng nền MS (Murashige và Skoog), bổ sung
các nguyên tố đa, vi lƣợng, thành phần hữu cơ và 2% đƣờng. Có 4 loại hình thái
chồi là: chồi đơn (green global body), chồi phân đôi (shoot with dichotomy), chồi đa
nhánh (shoot with multi-branch) và chồi không phân đôi (shoot without dichotomy).
Đa chồi (multiple shoots) sẽ tích lũy Huperzin A cao. Đa chồi phát triển và tích lũy
Huperzin A khi bổ sung Indole-3-acetic acid và Indole-3-butyric acid và bị ức chế
khi tăng 6-Benzylaminopurine (> 2µM) và Kinetin (> 5 µM). Bổ sung Indole-3butyric acid hàm lƣợng 10 µM tăng cƣờng sự phát triển của đa chồi với sự tăng
trƣởng 9,4mm/ tháng, mỗi tháng 4 lá mới và tăng sinh khối 5,1 lần sau 60 ngày nuôi
cấy [18].
Tại Ba Lan cũng đã nuôi cấy invitro thể bào tử và phôi của H. serrata cùng
với phân tích lý hóa để xác định Huperzin A. H. serrata sinh trƣởng mạnh nhất ở
môi trƣờng ½ MS. Các tế bào của mô sẹo, mà phát triển từ mô phân sinh đỉnh sau 3
tháng nuôi cấy chuyển thành phôi soma. Phân tích HPLC-UV chứng minh Huperzin
A cao nhất (3,33mg g-1d.w) trong các chồi của cây phát triển từ phôi soma. Sản
lƣợng Huperzin A từ cây thu đƣợc từ môi trƣờng sống tự nhiên khác nhau từ 0,54
mg g-1d.w (chồi thu hoạch vào mùa xuân) đến 1.27 mg g-1d.w (chồi thu hoạch vào
mùa thu [28].
Rishuang và cộng sự (2012) cũng đã nghiên cứu ảnh hƣởng của các loại giá
thể khác nhau nuôi cấy H. serata. H. serata tự nhiên đƣợc nuôi cấy trong rong rêu,
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
12
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
đất cát sói mòn, đất vƣờn thí nghiệm. Tỷ lệ sống sót cao nhất (90%) trong giá thể
rong rêu, tỷ lệ cao thứ 2 (53,3%) trong đất cát sói mòn và thấp nhất trong môi
trƣờng đất vƣờn thí nghiệm. Các chỉ số sinh lý của H. serata cũng đƣợc xác định khi
nuôi cấy trên các loại giá thể trên. Tỷ lệ khô/ƣớt của H. serata tỉ lệ nghịch với tỉ lệ
sống của chúng trên các môi trƣờng. Trong đó thành phần diệp lục và hoạt động của
rễ lại tỉ lệ thuận với nó. Điều này cho thấy rong rêu là giá thể tối ƣu nhất trong nuôi
cấy H. serata [26].
M. Maridass và cộng sự (2011) đã nghiên cứu về sự phát triển của túi bào tử,
bào tử nảy mầm, giai đoạn đầu của thể giao tử và tái sinh của Huperzia hilliana
(Spring) R.D.Dixit trong điều kiện tự nhiên của vùng Kodaiyar, miền Nam Ấn Độ.
Kết quả quan sát túi bào tử trƣởng thành dƣới kính hiển vi của H. hilliana cho thấy
bào tử nảy mầm trong vòng một tháng. Sự nảy mầm của bào tử và các giai đoạn
phát triển của của thể giao tử đƣợc quan sát ở điều kiện tự nhiên. Giai đoạn đầu của
thể giao tử tăng trƣởng mạnh mẽ. Chu kì sống của H. hilliana trong điều kiện tự
nhiên ngắn, trong vòng 6 tháng (trong nghiên cứu này từ tháng 2/2011- tháng
7/2011) và bị ảnh hƣởng bởi yếu tố môi trƣờng[23].
Sự đa dạng di truyền và cấu trúc di truyền của 7 quần thể và 112 cá thể H.
serrata từ dãy núi Wuyi đã đƣợc phân tích bằng kỹ thuật AFLP. Kết quả phân
tíchcho thấy các quần thể Taining và Jianning nằm ở trung gian của dãy núi Wuyi
đa dạng cao nhất, trong khi đó quần thể Guangze phân bố ở phần phía bác dãy núi
có sự đa dạng thấp nhất. Tổng đa dạng di truyền (Ht) là 0,3273 và sự đa dạng gen
của quần thể (Hs) là 0,2722 [31].
De-li Wang và cộng sự (2011) cũng đã nghiên cứu quần thể tự nhiên của H.
serrata ở khu bảo tồn thiên nhiên của tỉnh Hải Nam, miền Nam Trung Quốc. Họ đã
kiểm tra số lƣợng cây trƣởng thành, bào tử cũng nhƣ số lƣợng mầm của cây ở các
độ tuổi khác nhau. Kết quả cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa số lƣợng của mầm và
bào tử. Hầu hết các cây giống có nguồn gốc từ mầm. Từ năm thứ 4 khi mầm phát
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
13
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
triển, mầm có khả năng sinh sản mạnh. Bố trí thí nghiệm nuôi cấy mầm trên các môi
trƣờng khác nhau: ví dụ nhƣ đất, cát và mùn, kết quả không có sự khác biệt đáng kể
về tỉ lệ mầm mọc trên cả 3 môi trƣờng, nhƣng tỉ lệ sống trong cát là thấp hơn so với
2 môi trƣờng còn lại. Nghiên cứu hình thái học của mầm và mô hình tăng trƣởng
mầm của H. serrata cho thấy mầm đóng góp vai trò quan trọng trong sinh sản, bảo
vệ tài nguyên và nuôi trồng H. serrata [8].
1.3.2. Các nghiên cứu về Huperzin A
Huang và cộng sự năm 2010 đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng để định
lƣợng Huperzin A. Sự thay đổi lƣợng Huperzin A ở cả giữa và trong quần thể. Sự
thay đổi hoạt động của alkaloid này xảy ra trong quần thể giống nhau sau mỗi năm
đƣợc phân tích bằng phần mềm SPSS 13.0 (Coefficient of variation, One-way
ANOVA analysis, Paired-samples T tests). Kết quả cho thấy lƣợng Huperzin A khác
nhau đáng kể bởi các vị trí địa lý, đặc biệt là thay đổi theo kinh độ. Kết quả trình
bày trong nghiên cứu này có thể cung cấp bằng chứng cho thấy lƣợng Huperzin A
biến đổi trong H. serrata là kết quả của sự tƣơng tác giữa gen và môi trƣờng, bằng
cách so sánh, chủ yếu đƣợc kiểm soát bởi yếu tố di truyền [15].
Phƣơng pháp phổ biến để định lƣợng Huperzin A là UPLC-MS. Trong 11 loài
Huperzia, hàm lƣợng cao nhất của Huperzin A đƣợc tìm thấy ở Huperzia pinifolia.
Sự tích tụ các Lycopodium alkaloids khác nhau đƣợc theo dõi bằng sử dụng phân
tích Q-IMS-TOFMS. Nuôi cấy mô các loài Huperzia khác nhau đã đƣợc thực hiện
để sản xuất Huperzin A, đặc biệt trong các mô sẹo của Huperzia pinifolia. Các
alkaloid chủ yếu sản xuất bởi cây phát triển tự nhiên, mô sẹo của Huperzin pinifolia
thay đổi đáng kể từ Huperzin A đến Nankakurine B [16].
Zhang Jingcai và cộng sự năm 2013 đã tách Huperzin A từ Huperzia serrata
bằng methanol/nƣớc/axit formic (10/90/0,2; v/v/v), mẫu thu đƣợc đƣợc lọc rồi sử
dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định Huperzin A tách từ Huperzia
serrata. Việc tách đƣợc thực hiện trên cột Xcharge C18(150mm x 4,6mm, 5µm),
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
14
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
dung dịch rửa giải là nƣớc (có chứa 0,1% (v/v) trifluoroacetic acid) và acetonnitrile
(chứa 0.09% (v/v) trifluoroacetic acid) là pha động. Kết quả tách nhanh chóng đạt
đƣợc sau 10 phút, tốc độ dòng chảy là 2ml/phút, UV 310 nm. Theo các điều kiện tối
ƣu, đƣờng tuyến tính tốt thu đƣợc trong khoảng 2,12 – 106 mg/l với hệ số tƣơng
quan R2 khoảng 0,9999. Giá trị thu hồi trung bình khoảng 102,34% với độ lệch
chuẩn tƣơng đối (RSD) 0,46%. Kết quả chứng minh rằng phƣơng pháp định tính
định lƣợng Huperzin A bằng HPLC là phƣơng pháp đơn giản nhanh chóng và chính
xác với khả năng thu hồi tốt và có thể sử dụng để đánh giá chất lƣợng của Huperzia
Serrata [35].
Trong các loài khác nhau của Huperziaceae, hàm lƣợng Huperzin A cao nhất
đƣợc tìm thấy ở Phlegmariurus caritus cao hơn loài Huperzia serata. Cây trồng
trong điều kiện độ ẩm cao (ở các khu rừng ẩm ƣớt) cũng cho hàm lƣợng Huperzin A
cao hơn đáng kể so với cây trồng trong môi trƣờng có độ ẩm thấp. Lƣợng Huperzin
A cũng thay đổi đáng kể theo mùa, cao nhất ở giữa mùa thu và thấp nhất vào đầu
mùa xuân [22].
Thử nghiệm lâm sàng trƣớc đây đã chỉ ra phƣơng pháp cải thiện chức năng bộ
nhớ sử dụng kiểm tra MMSE, MQ, ADAS-COG và ADL. Kiểm tra ADAS-COG và
MMSE, chỉ nâng cao nhận thức với liều 0,4mg Huperzin A, nhƣng ở liều 0,2mg thì
không quan sát đƣợc sự cải thiện. Do vậy nguồn thông tin đầy hứa hẹn là Huperzin
A đƣợc dung nạp tốt ở liều lƣợng 0.4mg trong vòng 24 tuần. Vì vậy, Huperzin A là
sự lựa chọn tiềm năng để điều trị bệnh Alzeimer [13].
Năm 1999, Wen Yen Gao và cộng sự đã tách chiết thành công Huperzin H từ
H. serrata bằng cách sử dụng đệm tách chiết là HCl 1% và CHCl3, loại bỏ đệm chiết
dƣới điều kiện chân không. Cho alkaloid thô qua cột silica gel [(20x80cm)x5] và rửa
giải bằng CHCl3- acetone (tỷ lệ 10:1 đến 1:1) sau cùng là methanol. Loại methanol
dƣới điều kiện chân không thu đƣợc một hỗn hợp, đƣa hỗn hợp này qua chạy sắc ký
trung tính Al2O3 và cột silica gel thu đƣợc Huperzin H [31].
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
15
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Tám mẫu Thạch tùng răng cƣa thu tại các địa điểm khác nhau ở Sapa và Đà
Lạt đƣợc Vƣờn Quốc gia Hoàng Liên và Viện Sinh học Tây nguyên cung cấp. Đây
là loài cây đặc hữu chỉ phát triển tại các vùng núi cao trên 1000 mét so với mặt biển
và bị khai thác cạn kiệt bán sang Trung Quốc do đó chỉ còn phát hiện đƣợc ở 5 vùng
tại Sa Pa và 3 vùng tại Đà Lạt (thể hiện ở bảng 2.1).
Bảng 2.1. Địa điểm lấy mẫu sử dụng trong nghiên cứu
STT
Địa điểm
Tên mẫu sử dụng trong
nghiên cứu
1
Nậm Cang – Sa Pa
SP1
2
Bản Hồ - Sa Pa
SP2
3
Tả Van – Sa Pa
SP3
4
Lao Chải – Sa Pa
SP4
5
Tả Phìn – Sa Pa
SP5
6
Bidoup – Núi Bà
DL1
7
Đơn Dƣơng – Lâm Đồng
DL2
8
Nam Ban – Lâm Hà
DL3
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
16
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
Bản đồ các vị trí lấy mẫu ở Sa Pa và Đà Lạt thể hiện ở hình 2.1 và 2.2.
Hình 2.1. Bản đồ 5 vị trí lấy mẫu ở Sa Pa
Hình 2.2. Bản đồ 3 vị trí lấy mẫu ở Đà Lạt
HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047
17
