Nghiên cứu đặc tính enzyme xylanase của nấm mốc aspergillus niger, tách dòng và biểu hiện gene mã hóa xylanase trên escherichia coli BL21

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
-----------------------------------------------

NGUYỄN THỊ THƯƠNG THƯƠNG

ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ENZYME XYLANASE CỦA
NẤM MỐC ASPEGILLUS NINER, TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN
GENE MÃ HÓA XYLANASE TRÊN ESCHERICHIA COLI BL21

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRẦN LIÊN HÀ

HÀ NỘI - 2010


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Liên Hà –
phòng Vi sinh và kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học- Công nghệ Thực
phẩm, trường đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình chỉ bảo, truyền thụ cho tôi kiến
thức cũng như lòng say mê khoa học trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện
đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo trong Viện Công nghệ
sinh học – Công nghệ thực phẩm đã truyền đạt cho tôi những kiến thức khoa học vô
cùng bổ ích trong suốt quá trình học tập.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thành viên trong phòng thí nghiệm Vi
sinh và kỹ thuật di truyền, phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thuộc Viện Công
nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, trường đại học Bách Khoa Hà Nội đã nhiệt

tình giúp đỡ và hướng dẫn mỗi khi tôi gặp khó khăn trong làm thí nghiệm.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân, những người đã
luôn động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học
tập và nghiên cứu.

Hà Nội ngày 27/10/2010
Học viên: Nguyễn Thị Thương Thương

Nguyễn Thị Thương Thương

1

Lớp CHCNSH.K810


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
STT

Ký hiệu

Tên đầy đủ

1

DNA

Deoxyribonucleic acid

2

PCR

Polymerase Chain Reaction

3

CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

4

TAE

Tris-Acetate-EDTA

5

TE

Tris-EDTA

6

EtBr

Ethydium bromide

7

EDTA

Ethylen diamin tetra acetate

8

CI

Chloroform/isoamylalcohol

9

SDS

Sodium dodecyl sulphate

10

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

11

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

12

DNS

Dinitrosalicylic acid

13

APS

Ammonium persulfate

14

bp

Base pair

15

kDa

kilodalton

16

LB

Luria Broth

17

TEMED

Tetramethylethylenediamine

18

DTT

Dithiothreitol

19

mRNA

Messenger RNA

20

RT-PCR

Reverse transcription PCR

21

E. coli

Escherichia coli

22

A. niger

Aspergillus niger

23

OD

Optical density

Nguyễn Thị Thương Thương

2

Lớp CHCNSH.K810


DANH MỤC BẢNG BIỂU

STT

Tên bảng

Trang

1

Bảng 1.1 Các vi sinh vật sing tổng hợp xylanase

20

2

Bảng 1.2 Đặc tính của một số xylanase từ vi sinh vật

21

3

Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi sử dụng cho phản ứng nhân gen 37
PCR

Nguyễn Thị Thương Thương

3

Lớp CHCNSH.K810


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
STT

Trang

Tên hình

1

Hình 1.1 Cấu trúc của arabinoxylan của cỏ Graminiae

10

2

Hình 1.2 Vị trí tấn công của các enzyme vào xylan của cỏ

12

3

Hình 1.3 Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 10 từ

15

Bacillus haloduans
4

Hình 1.4 Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11

16

5

Hình 1.5 Cơ chế phản ứng thủy phân của xylan bởi xylanase

17

của Bacillus circulans
6

Hình 2.1 Cấu trúc vector tách dòng, biểu hiện pRSET A

31

7

Hình 2.2 Qui trình tinh sạch xylanase tái tổ hợp

46

8

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình sinh

48

tổng hợp xylanase của chủng
9

Hình 3.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình sinh tổng hợp

49

xylanase của chủng
10

Hình 3.3: Ảnh hưởng của pH lên quá trình sinh tổng hợp

50

xylanase của chủng
11
12

Hình 3.4: Điện di đồ DNA tổng số của chủng B7
Hình 3.5: Điện di đồ sản phẩm của phản ứng PCR khuếch đại

51
54

gene mã hóa xylanase
13

Hình 3.6: So sánh trình tự gen mã hoá enzym xylanse của

56

chủng B7 với đoạn gen mã hoá enzym xylanse được công bố
trên cơ sở dữ liệu NCBI với mã số EU423881.1
14

Hình 3.7: Trình tự nucleoti của gen xynB của nấm mốc

58

Aspergillus niger
15

Hình 3.8: Qui trình thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng

59

cds của gen xylanase

Nguyễn Thị Thương Thương

4

Lớp CHCNSH.K810


16

Hình 3.9: Vị trí cắt của các enzym giới hạn trên gen xylanase

60

của nấm mốc Aspergillus niger B7
17

Hình 3.10: Điện di đồ sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại

61

exon của gen xylanase
18

Hình 3.11:Điện di đồ sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại cds

63

của gen xylanase
19

Hình 3.12: Điện di đồ tinh sạch sản phẩm phản ứng PCR

63

khuếch đại cds của gene xylanase
20

Hình 3.13: Điện di đồ sản phẩm cắt vector pRSET A bằng

65

enzyme giới hạn
21

Hình 3.14: Khuẩn lạc E. coli Top10 sau khi biến nạp vector

66

pRSET A gắn cds xylanase
22

Hình 3.15: Điện di đồ plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc sau

67

khi biến nạp

23

Hình 3.16: Điện đi đồ cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp sau khi

68

tinh sạch với hai enzym XhoI và NcoI
24

Hình 3.17: Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng PCR với

69

cặp mồi XynF1, XynR2
25

Hình 3.18: E. coli BL21 được biến nạp vector pRSET A-

70

xylanase
26

Hình 3.19: Điện di đồ protein tổng số của dịch tế bào E. coli

71

tái tổ hợp
27
28

Hình 3.20: Hoạt tính xylanase trong dịch phá tế bào
Hình 3.21: Hoạt tính xylansae trong dịch nổi

Nguyễn Thị Thương Thương

5

72
73

Lớp CHCNSH.K810


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................8
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .....................................................................................10
1.1 Xylan và phức hệ enzyme phân cắt xylan......................................................10
1.1.1 Xylan.........................................................................................................10
1.1.2 Phức hệ enzyme phân cắt xylan................................................................11
1.2 Khái niệm và phân loại xylanase.....................................................................13
1.2.1 Khái niện về xylanase...............................................................................13
1.2.2. Phân loại xylanase ...................................................................................14
1.2.3. Cấu trúc của xylanase ..............................................................................15
1.2.4 Cơ chế xúc tác của xylanase .....................................................................16
1.3 Nguồn thu xylanase từ tự nhiên.......................................................................18
1.3.1 Sinh tổng hợp xylanase từ vi khuẩn..........................................................18
1.3.2 Sinh tổng hợp xylanase từ nấm mốc.........................................................19
1.4 Ứng dụng trong một số lĩnh vực.....................................................................22
1.4.1 Sản xuất cồn nhiên liệu.............................................................................22

1.4.2 Sản xuất thức ăn chăn nuôi .......................................................................22
1.4.3 Sản xuất bánh............................................................................................22
1.4.5 Tẩy trắng giấy và bột giấy ........................................................................23
1.4.6 Các chất hoạt động bề mặt........................................................................23
1.5 Xylanase tái tổ hợp .........................................................................................24
1.5.1 Hệ thống vật chủ được sử dụng trong tách dòng và biểu hiện gene mã hóa
xylanase từ nấm mốc .........................................................................................25
1.5.2 Một số nghiên cứu liên quan ở Việt Nam.................................................29
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................31
2.1 Chủng vi sinh vật, tế bào chủ, vector sử dụng ................................................31
2.2 Hóa chất và thành phần môi trường nuôi cấy..................................................32
2.3 Thiết bị.............................................................................................................33
2.4 Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp xylanase của chủng ...............................34
2.5 Phương pháp tách chiết DNA..........................................................................34

Nguyễn Thị Thương Thương

6

Lớp CHCNSH.K810


2.5.1 Tách chiết DNA tổng số ...........................................................................34
2.5.2 Tách chiết DNA plasmid ..........................................................................35
2.6 Phương pháp PCR ...........................................................................................36
2.7 Phương pháp điện di trên gel agarose .............................................................39
2.8 Phương pháp tinh sạch DNA bằng bộ kit MINELUTE (QUIAGEN) ............40
2. 9 Phương pháp cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn .........................................41
2.10 Phương pháp gắn DNA bằng enzyme T4-ligase...........................................41
2. 11 Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến.........................................................42

2.12 Phương pháp biến nạp vào E. coli bằng sốc nhiệt .....................................43
2.13 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme xylanase....................................43
2.14 Thu hồi và tinh sạch enzyme tái tổ hợp .....................................................44
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................47
3.1 Nghiên cứu một số đặc tính của chủng ...........................................................47
3.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính xylanase .........................47
3.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính xylanase.......................................48
3.13 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính xylanase................................................49
3.2 Tách dòng gene mã hóa enzyme xylanase từ chủng nấm mốc Aspergillus
niger B7 .................................................................................................................50
3.2.1 Tách chiết DNA của chủng.......................................................................50
3.2.2 Khuếch đại gene mã hóa xylanase từ chủng Aspergillus niger B7 ..........51
3.2.3 Khuếch đại cds của gene xylanase............................................................57
3.2.6 Gắn cds gene xylanase vào vector pRSET A bằng enzyme T4 -ligase ....64
3.2.4 Biến nạp vetor tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli TOP10 ..................66
3.3 Biểu hiện gene xylanase trong E. coli BL21 ...................................................70
3.4 Mức độ biểu hiện xylanase..............................................................................70
3.5 Định tính hoạt tính xylanase............................................................................72
3.6 Định lượng hoạt tính xylanase bằng phản ứng DNS.......................................73
KẾT LUẬN ...............................................................................................................74
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................75
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................76

Nguyễn Thị Thương Thương

7

Lớp CHCNSH.K810

MỞ ĐẦU
Hiện nay trên trái đất, mỗi năm thực vật sản sinh ra một lượng sinh khối
khổng lồ ước tính đạt tới bốn mươi tỷ tấn. Tất cả mọi hoạt động của con người cũng
như các loài động vật đều cần đến thực vật. Chúng là nguồn lương thực để nuôi
sống con người và động vật đồng thời là nguồn cung cấp nguyên, nhiên vật liệu cho
các ngành công nghiệp [3]. Để thay đổi tính chất của vật liệu đầu vào cho phù hợp
với sản phẩm mong đợi người ta phải tìm cách thay đổi cấu trúc của thành tế bào
thực vật. Tuy nhiên thành tế bào thực vật lại có cấu tạo khá vững chắc bởi cellulose,
hemicellulose và lignin, trong đó cellulose chiếm (35-50%), hemicellulose chiếm
(20-30%), lignin chiếm (20-30%) theo trọng lượng khô [33]. Chỉ tính riêng
hemicellolose, hàng năm lượng hemicellulose được tạo thành là 3,9 tỷ tấn. Nhưng
hầu hết lượng hemicellulose không được sử dụng một cách hiệu quả bởi nếu muốn
sử dụng hiệu quả hemicellulose cần phải thủy phân triệt để xylan một loại
polysaccharide chiếm phần lớn trong thành phần hemicellulose. Tuy nhiên để phá
hủy chúng thì người ta thường sử dụng các hóa chất mạnh như axit mạnh, hay kiềm
mạnh. Do đó chi phí để sản xuất các sản phẩm thường cao và nhất là gây ảnh hưởng
nghiêm trọng đến môi trường sinh thái. Chính vì vậy yêu cầu đặt ra là phải thay thế
bằng các phương pháp an toàn hơn đối với môi trường [30].
Để thủy phân hoàn toàn xylan tự nhiên cần có các esterase [29] để loại bỏ liên
kết của các axit acetic và axit phenolic với xylose và xylanase là hệ enzyme thủy
phân xylan đang rất được quan tâm hiện nay [34]. Xylanase có tiềm năng ứng dụng
lớn trong đời sống hàng ngày của con người: (1) làm tác nhân tẩy trắng bột giấy và
sử dụng trong công nghiệp sản xuất giấy; (2) trong công nghiệp thực phẩm nó được
sử dụng là chất bổ sung vào bánh mỳ, nước hoa quả, rượu trắng; (3) bổ sung vào
thức ăn động vật để tăng giá trị dinh dưỡng; (4) nâng cao khả năng sử dụng sinh
khối (biomass) trong côngnghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học [36].

Nguyễn Thị Thương Thương

8

Lớp CHCNSH.K810


Tuy được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống, nhưng việc sử dụng
xylanase còn hạn chế do hiệu suất sinh tổng hợp của các chủng vi sinh vật tự nhiên
sinh enzyme này chưa cao. Xuất phát từ những yêu cầu đặt ra chúng tôi thực hiện
đề tài “ Nghiên cứu đặc tính enzyme xylanase của nấm mốc Aspergillus niger,
tách dòng và biểu hiện gene mã hóa xylanase trên Escherichia coli BL21”.

Nguyễn Thị Thương Thương

9

Lớp CHCNSH.K810


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 Xylan và phức hệ enzyme phân cắt xylan
1.1.1 Xylan
Xylan, một trong những thành phần cơ bản của hemicellulose, là
polysaccharide cơ bản thứ hai sau cellulose được tìm thấy trong tế bào thực vật [3].
Thuật ngữ hemicellulose được dùng để chỉ những nhóm polysaccharide dị thể của
thành tế bào thực vật mà kết hợp chặt chẽ với cellulose và lignin. Trong thực tế,
thành tế bào thực vật là một vật liệu phức tạp trong đó cellulose (35-50%),
hemicellulose (20-30%) - một nhóm carbohydrade trong đó dạng xylan là loại chủ
yếu - và lignin (20-30%) liên kết chặt chẽ với nhau [33]. Hàm lượng hemicellulose
khác nhau ở những loài thực vật khác nhau, và khác nhau ở những mô khác nhau
của cùng một cây. Xylan chiếm khoảng 30% vật liệu thành tế bào của thực vật sống
lâu năm, từ 15-30% đối với gỗ cứng và 7-10% đối với gỗ mềm.

Xylan là một polysaccharide hỗn tạp có chứa các nhóm phụ là các gốc
acetyl, 4-O-methyl-D-glucuronosyl và α-arabinofuranosyl liên kết với bộ khung
được tạo bởi các gốc xylopyranose. Bộ khung này được liên kết với nhau theo kiểu
β-1,4-glycozide. Lignin bao quanh xylan, liên kết với xylan bằng liên kết este bằng
các gốc của axit 4-O-methyl-D-glucuronic[6, 29].

Hình 1.1: Cấu trúc của arabinoxylan của cỏ Graminiae [10]

Nguyễn Thị Thương Thương

10

Lớp CHCNSH.K810


Với các cây gỗ mềm, các nhóm phụ của xylan chủ yếu là axit 4-O-methyl
glucuronic và arabinose. Chúng liên kết với bộ khung xylan bằng liên kết α-1,3glycozit. Hiếm khi thấy các nhóm acetyl trong xylan của gỗ mềm. Tỷ lệ arabinose
so với xylose thường là 0,6 [11].
Hemicellulose trong gỗ cứng có nhóm phụ là axit 4- O-methyl glucuronic, axit
acetic và axit uronic. Bộ khung của xylan gỗ cứng này gồm các gốc β-1,4-Dxylopyranose, trung bình cứ 10 – 20 gốc xylose thì có một axit 4- O-methyl
glucuronic liên kết với nó theo kiểu α-1,2-glycozit. Xấp xỉ 60-70% các đơn vị
xylose được este hóa với axit acetic ở nhóm hydroxyl của carbon thứ 2 hoặc thứ 3
và trung bình thì cứ mười đơn vị xylose thì có một nhóm axit uronic liên kết với gốc
xylose theo kiểu α-1,2-glycoside [6, 11, 36]. Xylan có tiềm năng to lớn để chuyển
đổi thành sản phẩm cuối cùng hữu ích, tuy nhiên để chuyển đổi hoàn toàn xylan đòi
hỏi cần phải có một hệ enzyme để phân cắt [34].
1.1.2 Phức hệ enzyme phân cắt xylan
Có nhiều phương pháp có thể được sử dụng để thủy phân hoàn toàn xylan. Sử
dụng kiềm mạnh hoặc axit mạnh là những biện pháp đang được sử dụng phổ biến
hiện nay bởi hiệu quả thủy phân và giá trị kinh tế. Nhưng vấn đề ô nhiễm môi

trường đang ngày càng gia tăng, đòi hòi các nhà khoa học phải tìm tòi, nghiên cứu
ra phương pháp thủy phân polysaccharide nói chung và xylan nói riêng bằng
enzyme sinh học. Phân huỷ sinh học xylan là sự kết hợp hoạt động của nhiều loại
enzyme [30] trong đó endo-β-1,4-xylanase (β-1,4-D-xylanxylanohydrolase, EC
3.2.1.8) thực hiện nhiệm vụ phân cắt mạch chính xylan bằng việc thủy phân ngẫu
nhiên khung xylan tạo ra các oligosaccharide. Sau đó exo-β-1,4-D-xylosidase (β1,4-D-xylan xylohydrolase EC 3.2.1.37) thủy phân các oligosaccharide thành các
monomer. Các nhóm bên có mặt trong xylan được giải phóng bởi α-Larabinofuranosidase, α-D-glucuronidase, galactosidase và acetyl xylan esterase [13].

Nguyễn Thị Thương Thương

11

Lớp CHCNSH.K810


Hình 1.2 Vị trí tấn công của các enzyme vào xylan của cỏ [31].
Exo-β-1,4-D-xylosidase (EC 3.2.1.37) xúc tác thủy phân β-1,4-D-xylooligosaccharide bằng cách loại bỏ xylose từ đầu không khử. Có nhiều công bố về
Bacillus sp [11] và một số nấm [26] sinh tổng hợp β-xylosidase nội bào. Enzyme αArabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) thủy phân nhóm cuối cùng không khử α-Larabinofuranosyl của arabinan, arabinoxylan và arabinogalactan. Một lượng lớn các
vi sinh vật bao gồm nấm, xạ khuẩn và các loài vi khuẩn được công bố là có khả
năng sinh tổng hợp α-arabinosidase. Rhodothermus marinus là loài chịu nhiệt có
sinh enzyme lớn nhất với hoạt độ 6,6 U/ml [9]. Enzyme α-D-glucuronidase (EC
3.2.1.1) thủy phân liên kết α-1,2-glycosidic giữa xylose và D-glucuronic axit hoặc
liên kết ete với 4-O-methyl [18].
Sự thủy phân liên kết α-1,2 -glycosidic bền vững đóng vai trò quan trọng
trong thủy phân xylan. Tương tự như liên kết giữa cacbonhydrat và lignin, dạng liên
kết 4-O-methyl-glucuronidase với xylose là hàng rào trong sự phá hủy gỗ. Có nhiều
vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp α-glucuronidase [14].

Nguyễn Thị Thương Thương

12

Lớp CHCNSH.K810


Để thủy phân hoàn toàn xylan tự nhiên cần có các esterase để loại bỏ liên kết
của các axit acetic và axit phenolic với xylose. Esterase phá vỡ liên kết của xylose
với axit acetic (acetyl xylan esterase (EC 3.1.1.6), các gốc chuỗi bên arabinose với
axit ferulic (feruloyl esterase) và gốc chuỗi bên arabinose với axit p-coumaric (pcoumaroyl esterase). Phân cắt các nhóm acetyl, feruloyl và p-coumaroyl từ xylan thì
thuận lợi cho sự loại bỏ lignin. Chúng có thể góp phần làm hòa tan lignin bởi sự
phân cắt các liên kết este giữa lignin và hemicellulose. Nếu sử dụng cùng với
xylanase và các enzym phân hủy xylan khác trong tẩy trắng bột giấy, các esterase
có thể phá vỡ và làm lỏng lẻo một phần cấu trúc của thành tế bào [6].
Enzyme quan trọng nhất trong hệ thống enzyme thủy phân cơ chất xylan là
enzyme xylanase [31]. Vì nó là enzyme khởi đầu cho hệ thống phản ứng phân cắt
các liên kết của xylan.
1.2 Khái niệm và phân loại xylanase
1.2.1 Khái niện về xylanase
Theo Hội hóa sinh và sinh học phân tử thế giới (the International Union of
Biochemistry and Molecular Biology) enzym có mã số EC 3.2.1.8 [31] có:
¾ Tên được công nhận là: endo-β-1,4-xylanase
¾ Phản ứng: thủy phân phía trong của các liên kết β-1,4-D-xylosidic trong
xylan.
¾ Các tên khác gồm có: endo-β-1,4-xylan 4-xylanohydrolase; endo-1,4xylanase; xylanase; β-1,4-xylanase; endo-1,4-xylanase; endo-β-1,4xylanase; endo-1,4-β-D-xylanase; 1,4-β-xylan xylanohydrolase; βxylanase; β-1,4-xylan xylanohydrolase; endo-1,4-β-xylanase; β-Dxylanase
¾ Tên hệ thống: 4-β-D-xylan xylanohydrolase

Nguyễn Thị Thương Thương

13

Lớp CHCNSH.K810


1.2.2. Phân loại xylanase
Enzyme xylanase thường được tìm thấy ở thực vật và vi sinh vật. Chúng được
phân chia thành hai nhóm dựa vào sự tương đồng về đặc tính lý hóa như là khối
lượng phân tử, điểm đẳng điện và các đặc tính xúc tác khác nhau của chúng:
- Enzyme endo-xylanase họ 10 gồm các enyzyme có nguồn gốc từ thực vật,
nấm mốc và vi khuẩn có khối lượng phân tử cao với giá trị pI thấp (trước đây gọi là
họ F)
- Enzyme endo-xylanse họ 11 gồm các enzyme có nguồn gốc từ nấm mốc và vi
khuẩn có khối lượng phân tử thấp với giá trị pI cao được (trước đây gọi là họ G)
[32, 20].
Sự khác biệt về đặc tính xúc tác giữa các họ xylanase là endo-xylanase của họ
10 có khả năng thủy phân các liên kết glycozit cạnh các điểm nhánh và hướng về
đầu không khử còn endo-xylanase thuộc họ 11 không có khả năng đó [18]. Trong
khi endo-xylanase của họ 10 cần hai gốc xylopyranosyl không thay thế giữa các
nhánh thì endo-xylanase của họ 11 cần có ba gốc xylopyranosyl liên tiếp không
thay thế.
Ngoài việc phân loại enzyme xylanase làm 2 nhóm lớn, nhiều nhà khoa học
cũng đã tiến hành nghiên cứu, phân chia enzyme xylanase thành những nhóm nhỏ
hơn. Sapag và cộng sự [32] chia xylanase họ 11 thành 6 nhóm chính. Nhóm I, II và
III chứa chủ yếu các enzyme của nấm mốc. Các enzyme nhóm I và II thường là các
enzyme có khối lượng khoảng 20 kDa được sinh tổng hợp từ các họ Ascomyceta và
Basidiomyceta. Các enzyme nhóm I có giá trị pI bazơ trong khi đó nhóm II có giá
trị pI ở phía axit. Các enzyme của nhóm III chủ yếu được tạo ra bởi các nấm yếm
khí. Trong khi đó, các xylanase của vi khuẩn được chia thành ba nhóm là A, B và C.
Nhóm A là các xylanase được sinh tổng hợp bởi họ Actinomycetaceae và
Acillaceae, hoàn toàn là những vi khuẩn hiếu khí gram dương. Nhóm B và C thì
chứa các enzyme chủ yếu từ các vi khuẩn yếm khí gram dương, những loài thường

sống trong dạ cỏ [32].

Nguyễn Thị Thương Thương

14

Lớp CHCNSH.K810


1.2.3. Cấu trúc của xylanase
Cấu trúc bậc ba của endoxylanase họ 10 và 11 được xác định cho hàng loạt
các enzyme [44], từ cả vi khuẩn và nấm mốc. Endo-xylanase 1BCX từ Bacillus
circulans có nét đặc trưng của họ 11 [18]. Nếp gấp domain xúc tác là do hai nếp gấp
β tạo thành (A và B) chủ yếu là bởi các mặt β đối song và một chuỗi xoắn α ngắn và
tương tự như một phần bàn tay phải được đóng lại [32]. Sự khác nhau trong hoạt
động xúc tác của các endo-xylanase của họ 10 và 11 được cho là do sự khác nhau
trong cấu trúc bậc ba của chúng. Cấu trúc bậc 3 của endo-xylanase chủ yếu được
sắp xếp từ các mảnh β. Cấu trúc toàn thể của domain xúc tác của xylanase họ 10
như là một cái thùng hình trụ được tạo thành từ 8 mảnh β.

Hình 1.3 Cấu trúc không gian 3 chiều của Xylanase họ 10 từ Bacillus
halodurans [14]
Các thành viên của họ F11 có dạng domain xúc tác từ các mảnh nếp gấp β
cái mà làm thành một vùng lõm hai lớp xung quanh vị trí xúc tác. Vũng lõm này
được so sánh với lòng bàn tay và các ngón tay trong khi cái vòng giống như ngón
cái của tay phải. Cái vòng (loop) nhô ra thành vùng lõm và giới hạn trong một phân
tử isoleusin [18].

Nguyễn Thị Thương Thương

15

Lớp CHCNSH.K810


Hình 1.4 Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11
Xylanase có thể liên kết với từ ba đến năm vònng xylopyranose ở gần vị trí
xúc tác. Meagher và các cộng sự [25] nhận thấy rằng Xyn 2 của Trichoderma reesei
có thể liên kết với năm vòng xylopyranose, trong khi đó thì Xyn 1 chỉ có thể liên
kết với 3 vòng xylopyranose ở gần vị trí xúc tác. Các vị trí cho các gốc
xylopyranose liên kết được xác định bởi sự có mặt của tyrosine chứ không phải bởi
tryptophan [7, 45].
1.2.4 Cơ chế xúc tác của xylanase
Hàng loạt các mô hình đã được đưa ra để giải thích cơ chế hoạt động của
xylanase. Hoạt động của xylanase dẫn đến sự thủy phân xylan. Sự thủy phân nhìn
chung có thể là kết quả của sự duy trì hay nghịch chuyển của trung tâm anomeric
của các monomer đường khử của cacbonhydrat. Đề xuất này bao gồm một hoặc hai
trạng thái chuyển tiếp hóa học [40]. Sự dịch chuyển glycosyl thường dẫn đến trong
sự thay thế tính ái nhân ở cacbon bão hòa của trung tâm anomeric và diễn ra với sự
duy trì hoặc nghịch chuyển của cấu hình anomeric. Hầu hết các enzyme thủy phân
polysaccharide kiểu như cellulase và xylanase được biết đến với sự thủy phân các
cơ chất của chúng với sự duy trì của cấu hình anomeric của C1. Có sự liên quan của
cơ chế dịch chuyển kép cho sự duy trì anomeric của sản phẩm [29]. Cơ chế dịch
chuyển kép bao gồm các đặc điểm:

Nguyễn Thị Thương Thương

16

Lớp CHCNSH.K810

9 Xúc tác axit với việc thêm một proton vào cơ chất.
9 Một nhóm carboxyl của enzyme ở trạng thái hoạt động
9 Một liên kết trung gian cộng hóa trị glycosyl xuất hiện giữa enzyme với
cacbonhydrat này trong đó cấu hình anomeric của đường tham gia liên kết
này đối lập với đường của cơ chất.
9 Các tương tác không phải là cộng hóa trị được tạo ra với tỷ lệ tăng lên [29]
(hình 1.5)

Hình 1. 5 Cơ chế phản ứng thủy phân xylan bởi xylanase của Bacillus circulans
(1 XNB)[18].
a) Cơ chất xylan được gắn vào vị trí lõm đã tạo thành giữa tyr65 và tyr69.
glu172 là chất xúc tác acid/base glu78 là vùng ái nhân (nucleophile). b) Glycone
được liên kết với glu78, liên kết này được giữ trong suốt phản ứng chuyển glycosyl
(transglycosylating). c) Nước dịch chuyển đến vùng ái nhân. d) Phá bỏ liên kết và
làm yếu glycone cho phép enzym di chuyển đến một vị trí mới trên cơ chất. Bởi vì
aglycone được giải phóng m (b) và glycone được giải phóng trong (d). Nhiều

Nguyễn Thị Thương Thương

17

Lớp CHCNSH.K810


xylanase của họ 11 thể hiện một cơ chế cắt trong mạch ngẫu nhiên hơn là theo một
quy luật nhất định [18].
Endo β-1,4-xylanase phá vỡ cấu trúc dạng rắn của thành tế bào bằng cách
phân hủy liên kết β-1,4-xylan trong đoạn polysaccharide-β-1,4-xylan thành xylose.

1.3 Nguồn thu xylanase từ tự nhiên
Xylanase được sinh tổng hợp chủ yếu bởi các vi sinh vật, nhiều loại vi khuẩn
và nấm được công bố là có khả năng sản xuất xylanase [3, 40, 46]. Tuy nhiên, có
nhiều nghiên cứu về xylanase có nguồn gốc từ thực vật, ví dụ, sự sinh tổng hợp
endo-xylanase trong quả lê Nhật Bản trong suốt giai đoạn chín của quả. Cleemput
và các cộng sự [9] đã tinh chế được một loại endo-xylanase với khối lượng phân tử
là 55 kDa từ bột mì của cây lúa mì châu Âu. Một số loài động vật thân mềm dưới
nước cũng có khả năng sinh tổng hợp xylanase.
1.3.1 Sinh tổng hợp xylanase từ vi khuẩn
Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp nhiều các enzyme sử dụng cho các
quá trình công nghiệp trong đó có xylanase vì đặc tính bền nhiệt của nó. Một số
loài sinh tổng hợp xylanase với hoạt độ cao ở pH kiềm và nhiệt độ cao là
Bacillus sp. Bacillus SSP-34 có khả năng sinh tổng hợp xylanase với hoạt độ 506
U/ml trong môi trường tối ưu. Trước đó thì Ratto và các cộng sự đã công bố
Bacillus circulans tổng hợp lên xylanase có hoạt độ 400 U/ml. Nó hoạt động tối
ưu ở pH 7,0 và 40% hoạt độ được duy trì ở pH 9,2. Streptomyces cuspidosporus
sinh tổng hợp được xylanase có hoạt độ 49 U/ml trong môi trường xylan [23, 35]
. Bacillus sp NCL 87-6-10 tổng hợp được xylanase với hoạt độ 93 U/ml trong
môi trường có cảm ứng zeolit và có hiệu quả hơn khi sử dụng Tween 80. Một
chủng khác là Bacillus circulans AB16 tổng hợp xylanase có hoạt độ 19,28 U/ml
khi sinh trưởng trên môi trường rơm rạ. Streptomyces sp QG-11-3 có khả năng
sinh enzyme xylanase có hoạt độ 96 U/ml [34, 35]. Các sinh vật khác sinh tổng
hợp xylanase được đưa ra ở bảng 1.1

Nguyễn Thị Thương Thương

18

Lớp CHCNSH.K810

1.3.2 Sinh tổng hợp xylanase từ nấm mốc
Các enzyme xylanase được sinh tổng hợp từ nấm mốc thường có pH tối ưu
thấp hơn so với các xylanase có nguồn gốc từ vi khuẩn. Giá trị pH tối ưu của
xylanase từ nấm mốc thủy phân xylan thì thường dao động từ pH 3,0 đến 8,0 và ổn
định ở pH 5,0 [34] (bảng 1.2).
Giá trị pH tối ưu của xylanase vi khuẩn nhìn chung cao hơn so với pH tối ưu
của xylanase từ nấm. Trong công nghệ sản xuất giấy và bột giấy, để sử dụng
xylanase từ nấm mốc cần phải hạ pH xuống thấp do đó mà xylanase từ nấm mốc ít
được dùng hơn so với vi khuẩn. Tuy nhiên trong nhiều ngành công nghiệp khác,
như công nghiệp sản xuất đồ uống, công nghiệp sản xuất cồn nhiên liệu, thì đây lại
là một ưu thế rất lớn của xylanase nấm mốc vì môi trường cho enzyme hoạt động là
môi trường axit. Gomes và các cộng sự [13] đã công bố thu được hoạt độ xylanase
là 188,1 U/ml với pH tối ưu 4,5 từ Trichoderma viride. Tương tự với T. viride, T.
reesei cũng được biết đến với khả năng sinh tổng hợp xylanase cao với hoạt độ 960
U/ml. Giống như Trichoderma sp, Schizophillum commune cũng là một trong
những loài tổng hợp xylanase cao với hoạt độ xylanase là 1244 U/ml. Nằm trong
nhóm nấm mùn trắng, một loài nấm phá hủy thành tế bào thực vật có tiềm năng là
Phanerochaete chrysosporium sản xuất xylanase có hoạt độ 15-20 U/ml trong môi
trường nuôi cấy. Aspergillus niger có hoạt độ xylanase là 76,6 U/ml sau 5,5 ngày
lên men. Nấm sinh tổng hợp xylanase có một số các hạn chế đó là khi sản xuất
enzyme trên môi trường lỏng ở quy mô công nghiệp thì hoạt độ thu được thường
thấp hơn thực tế. Điều này là do khi tiến hành lên men trong môi trường lỏng các
ứng suất xảy ra trong thiết bị lên men làm sinh khối của nấm dễ bị phá vỡ dẫn đến
việc làm giảm lượng enzyme thu được [34].

Nguyễn Thị Thương Thương

19

Lớp CHCNSH.K810


Bảng 1.1 Các vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase [34]

Vi sinh vật

Xylanase (U/ml)

Nấm mốc
Aspergillus awamori VTT-D-75028

12,00

Aspergillus niger KKS

138

Aspergillus niger

250

Fusarium oxysporum VTT-D-80134

3,70

Phanerochate chrysosporium

15-20

Piromyces sp.strain E 2

7,96
650-780

Thermomyces lanuginosus

960

Trichoderma reesei
Vi khuẩn
Bacillus SSP-34

506

Bacillus circulans

400

Bacillus stearothermophilus StrainT6

2,33

Bacillus sp.

120

Bacillus sp. strain NCL 87-6-10

93

Bacillus circulans AB 16

19,28

Streptomyces sp. QG-11-3

96

Thermoactinomyces thalophilus sub group C

42

Nguyễn Thị Thương Thương

20

Lớp CHCNSH.K810


Bảng1. 2 Đặc tính của một số xylanase từ vi sinh vật [34]
KLPT

Điều kiện tối ưu

Độ bền

pI

Km

Vmax

(mg/ml)

(µmol

(KDa)

Vi sinh vật

pH

Nhiệt

pH (giờ)

Nhiệt độ
(giờ)

độ

/ phút /

Nấm mốc
Acrophialophora

22

7,0

55

-

60 (1)

-

16 -

-

Aspergillus awamori

39

5,5-6

55

-

-

5,7-6,7

1,0

10000

23

5,0

50

-

-

3,7

0,33

3333

26

4,0

45-50

-

-

3,3-3,5

0,09

455

Aspergillus nidulans

34

6

56

4,0-6,7

56

3,4

0,97

1091

Aureobasidium pullulans

25

4,8

54

4,5

50

9,4

7,6

2650

Cephalosporium sp.

35

7,5-

50

-

-

6,3

5,26

118,4

24

7,5-

50

-

-

4,4

4,16

145,2

Erwinia chrysanthemi

42

5,5

55

4-7

35

8,8

-

-

Penicillium

33

7,0

60

6,0-7,5

40 (3)

8,6

-

-

purpurogenum

23

3,5

50

4,5-5,5

40 (3)

5,9

-

-

Trichoderma viride

22

5

53

-

-

9,3

4,5

160

Trichoderma harzianun

20

5,0

50

-

40

-

0,58

0,106

7,1

9,4

4330

0,7

145

Vi khuẩn
Aeromonas caviae ME1

20

7

50

3,0-4,0

6.5-8

Bacillus sp. Strain SPS-0

99

6,0

75

-

70 (4)

6

65

4,5-10

-

8,5

4,5

-

Bacillus

sp.

W1 21.5

(JCM2888)

49.5

7,9

70

4,5-7,0

-

3,7

0,95

-

Streptomyces T-7

20.64

4,5-5,5

60

5,0 (144)

37 (264)

7,8

10

7600

50

5,5-6,5

60-65

5,5-6,5

55

7,1

9,1

-

25

5,0-6,0

60-65

5,0-6,0

55

10.06

-

-

25

5,0-6,0

60-65

5,0-6,0

55

10.26

11.2

-

266 b

6

80

-

-

-

0,36

1,18

35 c

7

90-

-

-

-

0,24

19,5

Streptomyces

sp.

No

3137

Thermotoga thermarum

Nguyễn Thị Thương Thương

21

Lớp CHCNSH.K810


1.4 Ứng dụng trong một số lĩnh vực
1.4.1 Sản xuất cồn nhiên liệu
Sự tiêu thụ nhanh chóng nguồn năng lượng hóa thạch đang cần sự thay thế
từng bước một với các nguồn thay thế, nguồn này phải thân thiện với môi trường và
phải góp phần bảo vệ trái đất thoát khỏi sự khủng hoảng [31]. Để thu được
bioethanol cần biến đổi nguyên liệu từ thực vật qua các bước như: tiền xử lý bằng
hóa chất, sau đó thủy phân lignocellulose biopolymer thành các đường khử (sử
dụng enzyme hoặc hóa chất), rồi lên men các đường khử thành rượu, và cuối cùng

là chưng cất và tinh chế bioethanol [36, 40]. Tuy nhiên, tiền xử lý và sử dụng hóa
chất để thủy phân làm giá thành sản xuất cồn còn cao và gây ảnh hưởng lớn tới môi
trường. Do đó mà các nhà nghiên cứu đang cố gắng sử dụng công nghệ enzyme để
thực hiện quá trình này, việc nghiên cứu tạo ra các loại enzyme có hoạt lực cao, và
phối hợp sử dụng các enzyme như xylanase, cellulase, laccase đang được đẩy mạnh
nghiên cứu.
1.4.2 Sản xuất thức ăn chăn nuôi
Một ứng dụng quan trọng của xylanase là được dùng để bổ sung vào thức ăn
chăn nuôi. Sự có mặt của xylanase trong thức ăn chăn nuôi làm giảm độ nhớt trong
đường tiêu hóa, giảm rối loạn tiêu hóa, tăng cường hấp thu thức ăn, nhờ vậy cải
thiện hệ vi sinh vật đường ruột, giúp phân thải ra khô hơn [10, 26, 41].
Ngoài xylanase, một số enzyme khác cũng được bổ sung vào thức ăn chăn
nuôi, bao gồm: mananase, ß – glucanase và cellulase, α – amylase, protease và
phytase [3]. Các loại enzyme này đều được sử dụng rộng rãi trong nhiều năm qua
trên toàn thế giới từ Châu Âu, đến Châu Mĩ và Châu Á.
1.4.3 Sản xuất bánh
Các xylanase cũng được cho rằng có thể cải thiện chất lượng của bánh mì với
việc làm tăng thể tích đặc trưng của bánh. Điều này càng được nâng cao khi sử
dụng chung với amylase. Xylanase từ Aspergillus oryzae được sử dụng để sản xuất

Nguyễn Thị Thương Thương

22

Lớp CHCNSH.K810


thực phẩm thương mại truyền thống của Nhật như là sake (một loại rượu từ gạo) và
shoyu koji (từ đậu nành và hạt lúa mì) [41]. Người ta chỉ ra rằng hiệu quả phân giải
thành tế bào đậu tương và lúa mì cải thiện giá trị sử dụng các vật liệu thô và làm

giảm lượng bã ép lọc đậu tương. Multifect và Enzeko là tên thương mại của một số
các xylanase thương mại cũ được sử dụng trong công nghệ làm bánh. Novozyme
đưa ra một số các enzyme xylanase mới, có thể là kết hợp với các enzyme khác, để
cải thiện bột nhào, đặc biệt là trong các nhà máy bánh mỳ. Một số các enzyme
xylanase thương mại như Celluclast BG, Fungamyl Super AX, Fungamyl Super
MA and the Pentopan®.
1.4.5 Tẩy trắng giấy và bột giấy
Sự tiến bộ trong ứng dụng của công nghệ sinh học tới công nghệ sản xuất
giấy và bột giấy đã có những phát triển có ý nghĩa qua những năm gần đây. Một
trong những ứng dụng thành công nhất là việc sử dụng endo-1,4-β-D-xylanase cho
bước tiền xử lý quá trình tẩy trắng bằng Clo và Clo dioxit. Dựa trên nghiên cứu của
một lượng lớn các phòng thí nghiệm và nhà máy, nó đang được thiết lập để tiền xử
lý cho bột giấy kraft với xylanase [2] đã nâng cao một cách có ý nghĩa khả năng tẩy
trắng của bột giấy bằng cách sử dụng các tác nhân tẩy trắng bằng Clo tiếp theo. Lợi
ích có ý nghĩa nhất của việc tẩy trắng tìm thấy từ việc tiền xử lý bằng xylanase là
làm nó sáng hơn, giảm lượng hóa chất tẩy trắng cần thiết mà vẫn cho độ sáng cao,
và giảm lượng hợp chất Clo hữu cơ trong nước thải tẩy trắng. Hiệu quả của tiền xử
lý bằng xylanase dựa trên các tác nhân tẩy trắng có chứa oxy được nghiên cứu với một
bột giấy kraft gỗ mềm. Bột giấy được tiền xử lý với một dung dịch chứa xylanase 12%.
Xử lý enzym cũng làm loại bỏ một lượng nhỏ của lignin làm giảm giá trị kappa của bột
giấy đi 3%. Sự tăng tính nhớt có thể là do các phân tử polysaccharide khối lượng phân
tử cao được làm giàu, diễn ra khi xylan được loại bỏ [31].
1.4.6 Các chất hoạt động bề mặt
Alkyl glycoside là một trong những chất quan trọng nhất của các chất hoạt
động bề mặt. Về phương diện thương mại, chúng được sản xuất từ các đường đơn

Nguyễn Thị Thương Thương

23

Lớp CHCNSH.K810


như là glucose và một rượu béo. Nhưng sự glycosyl hóa sử dụng polysaccharide thì
dễ dàng thực hiện hơn trong sản xuất công nghiệp, bởi vì sự thủy phân của
polysaccharide và các bước tiếp theo có thể được bỏ qua. Xylanase từ
Aureobasidium pullulans được sử dụng cho sự glycosyl hóa của xylan, 1-octanol
and 2-ethyl hexanol thành octyl-β-D-xylobioside, xyloside and 2-ethylhexyl-β-Dxylobioside tương ứng.
1.5 Xylanase tái tổ hợp
Trong tự nhiên, có rất nhiều các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp
enzyme xylanase, tập trung chủ yếu ở các loài vi khuẩn và nấm mốc [31]. Các
enzyme xylanase có nguồn gốc từ vi khuẩn thường có tính chịu nhiệt và pH cao
hơn so với enzyme xylanase có nguồn gốc từ nấm mốc [34]. Chính vì vậy, nấm mốc
thường được dùng làm nguồn sinh tổng hợp xylanase sử dụng trong các ngành công
nghiệp như thực phẩm hoặc cồn nhiên liệu , trong khi đó vi khuẩn lại là nguồn sinh
enzyme phù hợp cho ngành công nghiệp giấy. Mặc dù tính chịu nhiệt có thể tốt cho
quá trình sản xuất của các enzym bền nhiệt, nhưng nó thường không có tính thực tế
bởi năng suất thấp và quá trình lên men có nhiệt độ cao cần các trang thiết bị đặc
biệt. Kỹ thuật gene đã tạo ra được các sản phẩm mang tính thương mại nhờ việc
chuyển gene vào các cơ thể chủ thích hợp để sản xuất (Baba và cộng sự, 1994) [33].
Một loạt các nghiên cứu gần đây đã tách dòng và biểu hiện xylanase trong các vật
chủ vi khuẩn, nấm men và nấm mốc khác nhau. Một số ví dụ, xylanase được tách
dòng vào trong E. coli bao gồm A. oryzae (Kimura và cộng sự, 2002), A. pullulans
(Ohta và cộng sự, 2001), Bacillus
Clostridium

lyticus

(Srivastava và cộng sự, 2001),

thermocellum (Fernandes và cộng sự, 1999) and Caldocellum

saccharolyticum (Lüthi và cộng sự, 1990). Một số xylanase từ T. lanuginosus IOC4145 (Damaso và cộng sư, 2003) và A. niger (Berrin và cộng sự, 2000) được biểu
hiện trong Pichia pastoris [31]. Sự biểu hiện của các protein ngoại lai vào trong hệ
thông prokaryote được sử dụng một cách rộng rãi nhất bởi khả năng biểu hiện ở
mức cao, cả trong những nghiên cứu cơ bản và trong sản xuất thương mại. Thêm
vào đó, tốc độ sinh trưởng nhanh và sự dễ dàng trong việc nuôi cấy của E. coli

Nguyễn Thị Thương Thương

24

Lớp CHCNSH.K810