Tách dòng và biểu hiện gene mã hóa chitinase của Bacillus licheniformis KNUC213 trong nấm men Pichia pastoris

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
**************************



CHU THỊ HOA



TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GENE MÃ HÓA CHITINASE CỦA
BACILLUS LICHENIFORMIS KNUC213 TRONG NẤM MEN PICHIA
PASTORIS


Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30



LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội – 2012

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CẢM ƠN

Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phí Quyết Tiến-ngƣời
thầy đã dìu dắt tôi những bƣớc đi đầu tiên trên con đƣờng nghiên cứu khoa học,
truyền đạt cho tôi những kiến thức, chỉ bảo tận tình và có những đóng góp mới mẻ,
sâu sắc về lĩnh vực nghiên cứu. Đồng thời, thầy cũng tạo điều kiện tốt nhất về thời
gian và điều kiện làm việc khi tôi thực hiện những nghiên cứu trong luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Văn Hiếu, KS. Quách Ngọc Tùng và
tập thể cán bộ Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình
hƣớng dẫn thí nghiệm, thƣờng xuyên chỉ bảo kiến thức chuyên môn, góp ý cho
luận văn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi học tập và rèn luyện trong suốt quá
trình thực tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Sinh trƣờng Đại học
Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi trong suốt
quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật đã tạo mọi điều kiện về mặt thời gian, luôn động viên khích lệ tôi trong quá
trình học tập.
Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những ngƣời
thân đã luôn yêu thƣơng, ủng hộ, động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập
để tôi có đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay.






Hà Nội, ngày 24 tháng 12 năm 2012
Học viên
Chu Thị Hoa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu
Tên đầy đủ
Amp
Ampicillin
Bp
Base pair
CHI
Chitinase
DNA
Deoxyribonucleic acid
dNTPs
Deoxyribonucleic triphotphate
EDTA
Ethylennediaminetetraacetic
EtBr
Ethidium Bromide
GlcN
N- glucosamine
GlcNAc
N- acetylglucosamine
LB
Môi trƣờng Luria Bertani
OD
Optical Density (mật độ quang)
PCR
Polymerase chain reaction
rCHI
Chitinase tái tổ hợp

SDS
Sodium dodecyl sulfate
TAE
Đệm Tris – Acetate – EDTA
TE
Đệm Tris – EDTA
YPD
Môi trƣờng Yeast – Peptone – Dextrose
YPDS
Môi trƣờng Yeast – Peptone – Dextrose
- Sorbitol



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC BẢNG


Bảng
Tên bảng
Trang
1.1

1.2
3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

3.6
Gen chi mã hóa chitinase từ các chủng Bacillus
licheniformis
Tình hình nghiên cứu chitinase trên thế giới
Đặc điểm nuôi cấy của chủng vi khuẩn KNUC213 trên môi
các trƣờng thạch khác nhau
Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa của chủng KNUC213
khi sử dụng kit API 50 CHB sau 48 giờ nuôi cấy ở 37C
Ảnh hƣởng của nhiệt độ, nồng độ muối, pH đến khả năng
phát triển của chủng B. licheniformis KNUC213
Kết quả so sánh độ tƣơng đồng trình tự amino acid của
endochitinase từ B. licheniformis KNUC213 (AEQ55312)
với các trình tự amino acid của chitinase tƣơng ứng từ các
chủng B. licheniformis khác đƣợc đăng ký trên GenBank
(NCBI)
So sánh hoạt tính enzyme chitinase của các chủng nghiên
cứu tại các thời điểm khác nhau
Ảnh hƣởng của ion kim loại lên hoạt tính rCHI của chủng
nấm men P. pastoris Y2

8
15

35

37


38
43


48


54

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. CHITIN 3
1.1.1. Cấu trúc hóa học của chitin 3
1.1.2. Vai trò và ứng dụng của chitin 4
1.2. CHITINASE 5
1.2.1. Giới thiệu về chitinase 5
1.2.2. Cơ chế thủy phân chitin 5
1.2.3.2. Dựa vào phản ứng phân cắt 6
1.2.3.3. Căn cứ vào cấu trúc phân tử 7
1.2.4. Cấu trúc phân tử chitinase 8

1.2.5. Nguồn thu nhận chitinase 9
1.2.5.1. Chitinase từ thực vật 9
1.2.5.2. Chitinase từ động vật 10
1.2.5.3. Chitinase từ vi sinh vật 10
1.2.5.4. Chitinase từ vi sinh vật tái tổ hợp 11
1.2.6. Vai trò và ứng dụng của chitinase 12
1.2.7. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính của chitinase 13
1.2.7.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ 13
1.2.7.2. Ảnh hƣởng của pH 14
1.2.7.3. Ảnh hƣởng của ion kim loại 14
1.2.8. Tình hình nghiên cứu chitinase trên thế giới và Việt Nam 15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.2.8.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 15
1.2.8.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 17
1.3. BIỂU HIỆN CHITINASE TRONG PICHIA PASTORIS 18
1.3.1. Đặc điểm của hệ biểu hiện P. pastoris 18
1.3.2. Vector biểu hiện ở pPICZA 20
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. VẬT LIỆU 22
2.1.1. Các chủng sinh vật và plasmid 22
2.1.2. Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu 22
2.1.3. Các dung dịch sử dụng và môi trƣờng nghiên cứu 22
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn KNUC213 24
2.2.2. Tách DNA tổng số của vi khuẩn Bacillus licheniformis KNUC213 25
2.2.3. Khuếch đại gen chi mã hóa chitinase của B. licheniformis KNUC21325
2.2.4. Điện di DNA trên gel agarose 27
2.2.5. Tinh sạch sản phẩm PCR 27

2.2.6. Cắt và ghép nối gen 27
2.2.7. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli bằng phƣơng pháp sốc nhiệt 28
2.2.8. Tách chiết plasmid từ vi khuẩn 29
2.2.9. Giải trình tự gen chi 29
2.2.10. Thiết kế vector biểu hiện gen chi trong P. pastoris 30
2.2.11. Biến nạp vector tái tổ hợp vào P. pastoris X33 bằng phƣơng pháp xung điện . 30
2.2.12. Biểu hiện rCHI 31
2.2.13. Tách chiết enzyme ngoại bào 32
2.2.14. Điện di protein trên gel polyacrylamide-SDS 32
2.2.15. Xác định hoạt tính của enzyme chitinase 32
2.2.16. Xác định đặc tính của rCHI 34

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
3.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG VI KHUẨN KNUC213 36
3.1.1. Đặc điểm nuôi cấy 36
3.1.2. Đặc điểm hình thái tế bào 37
3.1.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 37
3.2. TÁCH DÒNG GEN chi MÃ HÓA CHITINASE CỦA CHỦNG B.
licheniformis KNUC213 40
3.2.1. Tách DNA tổng số 40
3.2.2. Khuếch đại gen chi bằng kỹ thuật PCR 40
3.2.3. Tách dòng gen chi trong vector pJET1.2/blunt 41
3.2.4. Giải và phân tích trình tự gen chi của B. licheniformis KNUC213 43
3.3. BIỂU HIỆN GEN chi MÃ HÓA CHITINASE TỪ CHỦNG B. licheniformis
KNUC213 TRONG P. pastoris X33 45
3.3.1. Thiết kế vector biểu hiện pPICZαA::chi 45
3.3.2. Tạo chủng P. pastoris tái tổ hợp có khả năng biểu hiện rCHI 46
3.3.3. Biểu hiện rCHI bởi chủng P. pastoris Y2 48

3.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ 51
3.4.2. Ảnh hƣởng của pH 52
3.4.3. Ảnh hƣởng của ion kim loại 54
CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56
KẾT LUẬN 56
KIẾN NGHỊ 57
Phụ lục 1: Sơ đồ cấu trúc plasmid pJET1.2/blunt 62
Phụ lục 2: Sơ đồ cấu trúc plasmid pPICZA 63
Phụ lục 3: Khả năng sử dụng các nguồn cacbon của chủng Bacillus licheniformis
KNUC213 65
Phụ lục 4: Trình tự gen chi của chủng Bacillus licheniformis KNUC213. 66

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỞ ĐẦU

Chitin là polyme sinh học không phân nhánh, đƣợc cấu thành từ các
đơn vị N-acetyl D-glucosamin (GlcNAc) thông qua liên kết β-(1,4)-glucozit.
Chitin rất phổ biến, phân bố rộng rãi trong tự nhiên chỉ sau cellulose và đóng
vai trò là polysaccharide cấu trúc của các sinh vật nhƣ: thành tế bào của nấm,
khung vỏ ngoài của động vật chân đốt, vỏ ngoài của các loài giáp xác và giun
tròn Một trong những phƣơng pháp chuyển hóa chitin tạo các dẫn xuất
mạch ngắn chitin-oligosaccharide có giá trị kinh tế và ứng dụng cao, an toàn
đối với con ngƣời và môi trƣờng là sử dụng enzyme chitinase.
Chitinase (EC 3.2.1.14) là enzyme phân hủy cơ chất chitin không hòa
tan trong nƣớc thành các sản phẩm chitooligosaccharide hòa tan thông qua
quá trình thủy phân liên kết β-(1,4)-glucozit. Hiện nay, chitinase đƣợc ứng
dụng chủ yếu trong sản xuất chitooligosaccharide, nano-chitin, N-acetyl D-
glucosamine. Đây là những sản phẩm giá trị ứng dụng cao và đƣợc sử dụng
trong thực phẩm, nông nghiệp, y dƣợc, kháng nấm và côn trùng. Ngoài ra,

chitinase còn đƣợc sử dụng nhƣ thuốc trừ sâu sinh học trong nông nghiệp nhờ
khả năng phân hủy chitin cấu trúc trong thành tế bào của nấm, côn trùng gây
bệnh và xử lý các chất thải giàu chitin
Theo các công bố trên thế giới, chitinase có thể thu nhận từ nhiều nhóm
vi sinh vật nhƣ: vi khuẩn (Serratia sp., Bacillus sp., Aeromonas sp., Vibrio
sp., Pseudomonas sp., Alteromonas sp…), nấm sợi (Trichoderma sp.,
Gliocladium virens, Fusarium chlamydosporum, Trichothecium roseum,
Stachybotry elegans, Talaromyces flavus,…), xạ khuẩn (Streptomyces griseus,
Str. plicatus, Str. lydicus…). Tuy nhiên, chitinase thu nhận từ các chủng tự
nhiên thƣờng không ổn định, hoạt tính không cao, chứa nhiều loại chitinase
khác nhau (nhóm exochitinase và endochitinase) ảnh hƣởng đến phổ sản
phẩm thủy phân chitin cũng nhƣ quy mô thu nhận và ứng dụng chitinase
nhằm tạo ra các sản phẩm chuyển hóa của chitin.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Hiện nay, nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đã nâng cao hiệu suất
của quá trình sản xuất chitinase bằng cách tạo ra các chủng vi sinh vật tái tổ
hợp. Cho đến nay gen chi mã hóa chitinase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác
nhau đã đƣợc biểu hiện thành công trong nấm men, vi khuẩn; trong đó hệ
thống biểu hiện trên nấm men Pichia pastoris đang đƣợc sử dụng rộng rãi do
có các đặc tính: nuôi cấy đơn giản, đạt sinh khối cao trên môi trƣờng khoáng
rẻ tiền, dễ dàng nâng cấp quy mô sản xuất, dễ điều khiển hệ thống biểu hiện
enzyme nhờ quá trình cảm ứng Xuất phát từ những tiềm năng ứng dụng của
chitinase và ƣu điểm của hệ thống biểu hiện trên P. pastoris, chúng tôi đã
thực hiện đề tài: ―Tách dòng và biểu hiện gene mã hóa chitinase của B.
licheniformis KNUC213 trong Pichia pastoris‖ nhằm nâng cao quá trình sinh
tổng hợp endochitinase có hoạt tính cao, tạo tiền đề cho sản xuất enzyme ở
quy mô lớn.
Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ

sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam với các nội dung chính sau:
- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn KNUC213 có hoạt
tính chitinase nhằm khai thác nguồn gen.
- Tách dòng và phân tích trình tự gen chi mã hóa chitinase của chủng B.
licheniformis KNUC213.
- Biểu hiện gen chi mã hóa chitinase của chủng B. licheniformis
KNUC213 trong P. pastoris X33.
- Bƣớc đầu nghiên cứu một số tính chất của chitinase tái tổ hợp (rCHI).




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CHITIN
1.1.1. Cấu trúc hóa học của chitin
Chitin là polyme sinh học không phân nhánh, cấu thành từ các đơn vị
N-acetyl D-glucosamine (GlcNAc) thông qua liên kết β-(1-4)-glycosyl (Hình
1.1). Chitin là một trong các polymer sinh học phổ biến nhất trong tự nhiên
chỉ đứng sau cellulose (cấu trúc hóa học của chitin gần giống với cellulose)
và đóng vai trò là polysaccharide cấu trúc của các sinh vật nhƣ: thành tế bào
của nấm, khung vỏ ngoài của động vật chân đốt, vỏ ngoài của các loài giáp
xác và giun tròn. Trong cấu trúc của chitin, nhóm (-OH) ở nguyên tử C
2
đƣợc
thay thế bằng nhóm axetyl amino (-NHCOCH
3
).
Liên kết β-(1-4)-glycosyl của mỗi đơn phân trong cấu trúc của chitin

lệch nhau một góc 180
o
tạo nên mạch xoắn và loại liên kết này kém bền, dễ
bị cắt đứt bởi tác nhân có tính axit hay enzyme [7]. Cấu tạo hóa học của
chitin đƣợc thể hiện trong hình 1.1. Công thức phân tử của chitin:
(C
8
H
13
O
5
N)
n,
Khối lƣợng phân tử: (203,09)n với thành phần các nguyên tố:
C = 47,29%; H = 6,4%; O = 39,4%; N = 6,91%.

Hình 1.1. Công thức cấu tạo hóa học của chitin
Các nghiên cứu nhiễu xạ sử dụng tia X cho thấy, chitin tồn tại dƣới ba
dạng α-, β- và γ-chitin do sự khác nhau về sắp xếp của các nhánh phân tử bên
trong tinh thể chitin. Trong α-chitin, các nhánh đƣợc sắp xếp theo hƣớng đối
song (antiparallel), β-chitin gồm các nhánh song song và γ-chitin đƣợc hình
thành từ hỗn hợp hai loại α-chitin và β-chitin. Trong ba loại trên thì α-chitin là

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

phổ biến và đƣợc ứng dụng nhiều nhất [26]. Tất cả các dạng chitin đều có mặt
trong thành phần của vỏ tôm, trong các loài nhuyễn thể, vỏ cua cũng nhƣ
trong biểu bì của các loại côn trùng… Dạng β-chitin, đƣợc tìm thấy trong
protein của mực ống [2].
1.1.2. Vai trò và ứng dụng của chitin

Chitin và các dẫn xuất chitin/chitosan oligosaccharide và D-
glucosamine… có nhiều đặc tính quý nhƣ: có hoạt tính kháng nấm, kháng
khuẩn, có khả năng tự phân huỷ sinh học cao, không gây dị ứng, không gây
độc hại cho ngƣời và gia súc, có khả năng tạo phức với một số kim loại nhƣ:
Cu
2+
, Ni
2+
, Co
2+
Trong số đó D-glucosamine là loại monome có tính năng
ƣu việt đƣợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp dƣợc do khả năng tăng
cƣờng hấp thụ kháng sinh vào máu cũng nhƣ góp phần trong điều trị các
bệnh viêm khớp và viêm nang khối u [8]. Ngoài ra D-glucosamine còn là vật
liệu ban đầu để điều chế các chất trung gian D-arabrinose và axit D-arabonic
cần thiết để sản suất riboflavin và vitamin B6. Do vậy chitin và một số dẫn
xuất của chúng đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣ: xử lý nƣớc
thải và bảo vệ môi trƣờng, dƣợc học và y học, nông nghiệp, công nghiệp,
công nghệ sinh học…
Do chitin là sản phẩm polyme tự nhiên nên đặc trƣng chung của chitin
là không độc, có tính chất tạo màng, tạo sợi, hấp thụ các ion kim loại, làm
đông các dịch huyền phù có chứa các chất hòa tan và các đặc tính sinh học
đặc biệt khác. Những đặc tính sinh học, hóa lý của chitin mở ra những hƣớng
ứng dụng mới và đƣợc xem là các polyme sinh học quan trọng, có nhiều tiềm
năng sử dụng cao hơn xelluloza trong rất nhiều lĩnh vực [27]. Ngoài ra, sự có
mặt của nhóm N-acetyl trong chitin cũng mở ra nhiều hƣớng mới trong lĩnh
vực tổng hợp hóa học để tạo ra nhiều vật liệu polyme có cấu trúc phức tạp
hơn và có các định hƣớng ứng dụng khác nhau [20].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.2. CHITINASE
1.2.1. Giới thiệu về chitinase
Chitinase là enzyme xúc tác quá trình phân hủy cơ chất chitin không
hòa tan trong nƣớc thành các sản phẩm chitooligosaccharide hòa tan trong
nƣớc thông qua quá trình thủy phân liên kết glucosyl. Chitinase có trong
nhiều loại sinh vật khác nhau nhƣ vi khuẩn, nấm mốc, côn trùng, thực vật và
động vật. Chitinase đóng các vai trò khác nhau trong các sinh vật nhƣ: là một
phần trong hệ tiêu hóa của động vật không xƣơng sống, phân hủy một phần
vỏ cutin trong các loài côn trùng và giáp xác; giúp thực vật kháng lại các loại
nấm gây bệnh, là một phần trong các tác nhân gây bệnh của virus, giúp nấm
phân hủy và thu nhận cơ chất Chitinase có mặt trong nhiều loại sinh vật bao
gồm virus, vi khuẩn, nấm, côn trùng, thực vật bậc cao và các loại động vật.
Chitinase từ vi khuẩn đóng vai trò trong thu nhận dinh dƣỡng và ký sinh.
1.2.2. Cơ chế thủy phân chitin

Hình 1.2. Cơ chế thủy phân chitin bởi chitinase
Chitinase thuộ c nhó m enzyme thủy phân (hydrolase) xúc tác quá trình
phân hủy cơ chất chitin thành các sản phẩm chitooligosaccharide hòa tan
trong nƣớc thông qua quá trình thủy phân liên kết β-1,4- glycosyl giƣ̃ a C
1
và
C
4
của hai phân tử N -acetyl glucosamine liên tiế p nhau trong phân tƣ̉ chitin
(Hình 1.2).


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.2.3. Phân loại chitinase
1.2.3.1. Dựa vào trình tự amino acid
Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện,
peptide nhận biết và vùng cảm ứng, ngƣời ta phân loại chitinase thành 5
nhóm:
- Nhóm I: Là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein
nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycine hoặc prolin ở đầu
carboxyl (C) (peptide nhận biết). Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối
với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhƣng không cần cho hoạt động xúc
tác.
- Nhóm II: Là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác,
thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino
acid tƣơng tự chitinase ở nhóm I. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi
khuẩn.
- Nhóm III: Trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II.
- Nhóm IV: Là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm,
41-47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tƣơng tự nhƣ chitinase
nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhƣng kích thƣớc phân tử nhỏ hơn
đáng kể so với chitinase nhóm I.
- Nhóm V: Dựa trên những dữ liệu về trình tự, ngƣời ta nhận thấy vùng gắn
chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa
ở thực vật bậc cao.
1.2.3.2. Dựa vào phản ứng phân cắt
Enzyme phân giải chitin đƣợc phân loại thành 3 loại: endochitinase,
chitin-1,4-β-chitobiosidase, N-acetyl-β-D-glucosamineidase (exochitinase).
- Endochitinase (EC 3.2.1.14): là nhóm enzyme phân cắt nội mạch
chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn oligosaccharide.
- Chitin-1,4- β-chitobiosidase: là enzyme phân cắt chitin tạo thành các
sản phẩm chính là các dimer chitobiose.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

- N-acetyl- β-D-glucosamineidase (exochitinase): là enzyme tiếp tục
phân cắt chitin từ một đầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-
glucosamine.
1.2.3.3. Căn cứ vào cấu trúc phân tử
Chitinase đƣợc sắp xếp thành ba họ glycohydrolase 18 glycohydrolase
19 và glycohydrolase 20.
- Họ glycohydrolase 18: Là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi,
cấu trúc không gian của một số chitinase thuộc họ glycohydrolase 18 đã đƣợc
nghiên cứu bao gồm chitinase vi khuẩn (Serratia marcascens) và chitinase
thực vật. Tâm hoạt động của các enzyme này tạo thành từ 8 sợi xoắn α/β cuộn
tròn. Sợi số 8 của phiến cuộn vào bên trong cấu trúc hình nhộng với vòng
xoắn thể hiện nhƣ một chiếc nhẫn hƣớng ra ngoài (Hình 1.3). Các chitinase
thuộc họ glycohydrolase 18 đƣợc thu nhận từ các chủng vi sinh vật nhƣ:
Aeromonas hydrophila, B. circularis, Trichoderma harzianum, Serratia
marcescens…

Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian của enzyme chitinase Serratia
marcescens
- Họ glycohydrolase 19: Họ này gồm hơn 130 chi, thƣờng thấy chủ yếu
ở thực vật nhƣ: cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu
hà lan (Pisum sativum), ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Str. griceus, vi khuẩn
Haemophilus influenzae… Các loại chitin thuộc họ 19 có cấu trúc hình cầu
với một vòng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

- Họ glycohydrolase 20: Họ glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-
Glucosamine acetyl hexosaminidase có nguồn gốc từ vi khuẩn và ngƣời.

1.2.4. Cấu trúc phân tử chitinase
Chitinase là enzyme quan trọng đƣợc ứng dụng nhiều trong các lĩnh
vực khác nhau nhƣ y học, công nghiệp, nông nghiệp và nghiên cứu. Nhiều
nghiên cứu gen chi mã hóa chitinase đã đƣợc công bố, và tập trung chủ yếu
vào các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus với kích thƣớc gen 1731 - 2388 bp
(Bảng 1.1), đây là những tiền đề cơ bản để tạo ra các chủng vi sinh vật tái tổ
hợp có hiệu suất biểu hiện enzyme cao.
Bảng 1.1. Gen chi mã hóa chitinase từ các chủng Bacillus licheniformis.
Chủng
Kích thƣớc
gen (bp)
Khối lƣợng chitinase
(kDa)
Mã số truy cập
GenBank
B. licheniformis KNUC213
1731
57,6
AEQ55312
B.licheniformis
DSM8785
1743
58,0
ACK44109
B. licheniformis N1
1919
59,8
ACU43581
B. licheniformis
CBFOS-03

2388
59,8
ACM46020
B. licheniformis DSM 13
1689
56,3
ACW83016

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Hình 1.4. Mô hình cấu trúc không gian của chitinase Hodeum vungare
Chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lƣợng phân
tử khoảng 30 kDa. Ở loài thân mềm, chân đốt, động vật có xƣơng (cá, lƣỡng
cƣ, thú) chitinase có trọng lƣợng phân tử cao vào khoảng 120 kDa. Giá trị pI
chitinase có thay đổi từ 3,0-10,0 ở thực vật bậc cao và tảo; pI từ 4,7-9,3 ở côn
trùng, giáp xác, thân mềm, cá và 3,5-8,8 ở vi sinh vật. Chitinase tách chiết từ
lúa mạch (Hodeum vulgare) đã đƣợc tinh thể hóa và phân tích cấu trúc bằng
tia X (Hình 1.4 ).
1.2.5. Nguồn thu nhận chitinase
Enzyme chitinase hiệ n diệ n ở hầ u hế t cá c gi ới sinh vậ t nhƣ: vi sinh vật,
thực vật hay trong các loại động vật không xƣơng sống, động vật có xƣơng
sống [19].
1.2.5.1. Chitinase từ thực vật
Chitinase tham gia vào cơ chế tự vệ của thực vật chống lại các nấm kí
sinh gây bệnh cho cây trồng. Ngƣời ta đã quan sát thấy chitinase tách chiết từ
cây cần tây có khả năng ức chế sợi nấm phát triển. Tuy nhiên, một số tác giả
khác cho rằng chitinase còn có vai trò khác: tham gia vào quá trình hình thành
phôi. Những thực vật bậc cao có khả năng tạo chitinase nhƣ: cao su (Hevea
brasiliensis), thuốc lá (Nicotiana sp.), lúa mạch (Hordeum vulgare) cà rốt,

đậu nành (hạt), khoai lang (lá) và đặc biệt một số loài tảo biển cũng là
nguồn cung cấp chitinase.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.2.5.2. Chitinase từ động vật
Từ một số động vật nguyên sinh, từ các mô và tuyến khác nhau trong
hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật không xƣơng nhƣ: ruột khoang, giun tròn,
thân mềm, chân đốt (trong dịch ruột của ốc sên Helix aspersa), có thể thu
nhận đƣợc chitinase. Đối với động vật có xƣơng sống, chitinase đƣợc tiết ra
từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lƣỡng cƣ, bò sát ăn sâu bọ, trong
dịch dạ dày của những loài chim, thú ăn sâu bọ. Ngoài ra, enzyme chitinase
còn đƣợc thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt quá trình phát triển
và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da.
Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài của chúng trong quá trình biến
thái hay lột xác. Tuy nhiên, hoạt tính của chitinase thu từ thực vật, động vật
còn chƣa cao, vì vậy việc thu nhận chitinase chủ yếu vẫn từ vi sinh vật.
1.2.5.3. Chitinase từ vi sinh vật
Chitinase đƣợc tạo ra bởi các loài nấm sợi thuộc các chi Trichoderma,
Aspergillus, Calvatia và cả ở các nấm lớn nhƣ Lycoperdon, Coprinus
Chitinase từ nấm cũng đóng vai trò quan trọng về mặt dinh dƣỡng, hoạt động
của chúng rất linh hoạt trong quá trình phát triển và trong sự phát sinh hình
thái của nấm bởi do chitin là thành phần chính của vách tế bào nấm. Chitinase
còn giữ vai trò chính trong hoạt động ký sinh nấm nhằm đối kháng lại các loài
nấm gây bệnh thực vật.
Ngoài nấm, chitinase đƣợc tìm thấy trong vi khuẩn nhƣ
Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Bacillus. . .
Chitinase có thể là một loại enzyme cảm ứng, trong các môi trƣờng nuôi cấy
vi khuẩn khi bổ sung chitin đã tăng khả năng sinh tổng hợp, đồng thời ổn định
hoạt tính chitinase sau quá trình tách chiết. Ngoài ra, vi khuẩn tổng hợp

chitinase để phân giải chitin trong môi trƣờng tạo nguồn cacbon cung cấp cho
hoạt động sinh trƣởng và phát triển. Tuy nhiên, chitinase từ nấm và vi khuẩn
biển đƣợc các nhà khoa học quan tâm hơn cả vì có khả năng chịu pH, nồng độ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

muối, hoạt tính cao, đặc hiệu với nguồn cơ chất và sinh ra trong thời gian
ngắn.
1.2.5.4. Chitinase từ vi sinh vật tái tổ hợp
Những hệ biểu hiện phổ biến nhất hiện nay bao gồm E. coli, B.
subtilis, S. cerevisiae, P. pastoris, A. niger và tế bào động vật. Mỗi hệ biểu
hiện có những ƣu điểm và giới hạn riêng, tuỳ thuộc sản phẩm protein mà cần
lựa chọn hệ biểu hiện phù hợp. B. subtilis có khả năng biểu hiện và bài tiết rất
tốt protein có nguồn gốc vi khuẩn ra ngoài môi trƣờng nuôi cấy. E. coli có thể
biểu hiện hầu hết các protein kích thƣớc vừa phải, không quá kỵ nƣớc hay
chứa nhiều gốc cystein. Tuy nhiên, con đƣờng tiết protein của E. coli có nhiều
giới hạn. Hệ biểu hiện E. coli và B. subtilis đều có chung một nhƣợc điểm là
mặc dù có khả năng sản xuất protein của sinh vật nhân chuẩn ở mức độ cao,
nhƣng những protein này thƣờng không mang họat tính hoặc không hòa tan
[11]. Hệ biểu hiện trong tế bào động vật có thể biểu hiện các nhóm protein
khác nhau và có ý nghĩa đặc biệt trong y dƣợc học, tuy nhiên quá trình chọn
lọc, nhân dòng và nuôi cấy tế bào phức tạp hơn nhiều so với cách sử dụng vi
sinh vật. Hệ biểu hiện trong nấm men là một giải pháp hữu hiệu khắc phục
những giới hạn trên.
Nấm men là hệ biểu hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi hiện nay bởi nó
có nhiều ƣu điểm. Chúng là sinh vật nhân chuẩn đƣợc nghiên cứu rất kỹ về
mặt di truyền, có khả năng tích hợp các gen lạ của các sinh vật nhân thực
khác vào genome của mình. Ngoài ra, chúng là sinh vật nhân chuẩn duy nhất
có khả năng thực hiện đƣợc các thao tác kỹ thuật di truyền phân tử dễ dàng
nhƣ ở E. coli và có khả năng phát triển rất mạnh trong môi trƣờng nuôi cấy.

Đặc biệt, ở nấm men có quá trình sửa đổi sau dịch mã hoàn thiện để trở thành
dạng protein hoạt động và có khả năng tiết protein ra ngoài môi trƣờng hiệu
quả [11]. S. cerevisiae là chủng nấm men đầu tiên đƣợc sử dụng để biểu hiện
gen. Tuy vậy, S. cerevisiae cũng có một số giới hạn do chƣa có hệ vector biểu
hiện hữu hiệu, các plasmid dùng để biểu hiện thƣờng là d ạng đa phiên bản

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

(multi-copy) nên rất dễ bị đào thải [11]. Từ những hiểu biết kỹ lƣỡng về hệ
biểu hiện S. cerevisiae, hệ biểu hiện P. pastoris đã ra đời và khắc phục đƣợc
những nhƣợc điểm trên.
Nhiều tác giả trên thế giới đã nâng cao khả năng sinh tổng hợp các
chủng tự nhiên bằng cách tạo ra các chủng vi sinh vật tái tổ hợp đã đƣợc tập
trung nghiên cứu, một số công bố đã tạo thành công các chủng Escherchiasa
coli, Pichia pastoris tái tổ hợp mang gen mã hóa chitinase từ các nguồn sinh
vật khác nhau nhƣ: kết quả phân tích và giải trình tự gen chi từ Bacillus
lichenif ormis CBFO S-03 cho thấy, trình tự gen chi bao gồm 1797 bp, khung
đọc mở của gen bắt đầu với một codon khởi đầu ATG và kết thúc bằng codon
TAA, mã hóa cho 598 amino acid, protein có khối lƣợng phân tử là 62 kDa,
có nhiệt độ và pH tối ƣu cho hoạt độ của enzyme tƣơng ứng là 55
o
C và pH
9,0 [25]. Năm 2008, Cemal và cộng sự tiến hành phân lập, biểu hiện, tinh
sạch và nghiên cứu đặc điểm của enzyme chitinase từ chủng Bacillus
licheniformis A1, kết quả phân tích trình tự gen chi có kích thƣớc 1779 bp mã
hóa cho 592 amino acid, có độ tƣơng đồng cao (99%) so với trình tự gen chiB
từ Bacillus licheniformis đƣợc đăng kí trên Genbank có mã số AY205293,
khối lƣợng phân tử là 71 kDa, có hoạt tính tối ƣu ở nhiệt độ 65
o
C và pH 6,0

1.2.6. Vai trò và ứng dụng của chitinase
Chitinase đã và đang đƣợc quan tâm và nghiên cứu nhiều trên thế giới
do có khả năng ứng dụng rộng lớn. Chitinase đƣợc sử dụng trong nhiều ứng
dụng khác nhau trong y học, công nghiệp, nông nghiệp và nghiên cứu. Đánh
dấu các hạt vàng trên chitinase và chitosanase giúp các nhà khoa học định vị
chitin và chitosan trong nghiên cứu cấu trúc, hóa học tế bào và miễn dịch học.
Trong công nghiệp, chitinase đƣợc sử dụng để sản xuất các loại
chitooligosaccharide, N-acetyl D-glucosamine có chức năng kháng khuẩn,
kích thích enzyme lysozym hoạt động và tăng cƣờng miễn dịch. Ngoài ra,
chitinase đƣợc ứng dụng tạo ra các protein đơn bào; tạo ra các thể nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

sinh (protoplast) của nấm mốc, nấm men; diệt các nấm gây bệnh; xử lý các
chất thải giàu chitin; kiểm soát qúa trình lây nhiễm của mầm gây bệnh sốt rét.
Để thu đƣợc các loại chitin phân tử lƣợng thấp có thể sử dụng nhiều
phƣơng pháp khác nhau. Bằng phƣơng pháp hóa học, chitin bị phân cắt bởi
acid hữu cơ hay vô cơ cho hiệu suất thấp, chi phí cao, đặc biệt còn gây ô
nhiễm môi trƣờng. Bên cạnh đó, mức độ an toàn của sản phẩm cũng là vấn đề
đáng lƣu ý khi ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm, y dƣợc… Việc sử dụng
phƣơng pháp thủy phân bởi chitinase để phân cắt chitin là phƣơng pháp an
toàn nhất hiện nay. Sản phẩm thu hồi sau phản ứng thủy phân bởi enzyme an
toàn, hiệu suất thu hồi cao, không gây ô nhiễm môi trƣờng.
1.2.7. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính của chitinase
1.2.7.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ
trong một giới hạn nhất định, chƣa ảnh hƣởng đến cấu trúc enzyme. Ở nhiệt
độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt độ giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, còn ở
nhiệt độ thấp dƣới 0
o

C hoạt độ của enzyme giảm nhiều nhƣng lại có thể phục
hồi khi đƣa về nhiệt độ thích hợp. Theo những nghiên cứu trƣớc đây, nhiệt độ
tối ƣu cho chitinase ở vi sinh vật hoạt động là 40
o
C, ngoại trừ chitinase của
Aspergillus niger hoạt động trên cơ chất là glycol chitin có nhiệt độ tối thích
là 50
o
C. Tùy theo nguồn gốc thu nhận mà chitinase có thể có những nhiệt độ
tối ƣu khác nhau. Chitinase từ B. licheniformis phân lập từ suối nƣớc nóng có
khả năng hoạt động ở nhiệt độ 80
o
C, tuy nhiên chitinase từ côn trùng (tằm )
hoạt động kém ở nhiệt độ 40
o
C có thể do côn trùng phát triển ở nhiệt độ 25
o
C
nên nhiệt độ tối ƣu của chitinase từ côn trùng không cao. Chitinase từ chủng
vi khuẩn biển có nhiệt độ tối ƣu là 50
o
C nhƣ: Salinivibrio costicola,
Alteromonas [29], Vibrio alginolyticus và chitinases từ Aeromonas sp. 10S-24
[9]. Chitinase tái tổ hợp từ chủng B. circulans 4.1, Aeromonas sp. No. 10S -
24 có nhiệt độ tối ƣu là 50
o
C [20].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.2.7.2. Ảnh hưởng của pH
Hoạt độ của enzyme phụ thuộc vào pH môi trƣờng, những biến đổi dù
nhỏ trong nồng độ của các ion H
+
và OH
-
cũng ảnh hƣởng rõ rệt đến tốc độ
phản ứng của enzyme. Giá trị pH tối ƣu của chitinase dao động từ 4 đến 9 đối
với các chitinase ở thực vật bậc cao và tảo, ở động vật là 4,8 đến 7,5 và ở vi
sinh vật là 3,5 đến 8,0. pH tối thích của chitinase còn phụ thuộc vào cơ chất
sử dụng khi phản ứng. Đa số các chitinase đa đƣợc nghiên cứu có pH tối thích
khoảng 5,0 khi sử dụng cơ chất là chitin nhƣ chitinase của Streptomyces
grieus có pH tối ƣu là 6,3. Hầu hết các chitinase của vi khuẩn biển có hoạt
tính cao hơn ở pH kiềm (pH = 8,0) cũng với cơ chất là chitin [29]. Tuy nhiên,
một số chitinase tái tổ hợp nhƣ chitinase từ A. caviae biểu hiện hoạt tính tối
ƣu ở pH 6,2 - 6,5 [9], hay nhƣ từ B. circulans 4.1, B. sphaericus J1-1 có pH
tối ƣu là 7,0 [20] và chủng B. licheniformis CBFOS-03 có pH tối ƣu là 9 [25].
1.2.7.3. Ảnh hưởng của ion kim loại
Các ion kim loại làm biến đổi vận tốc phản ứng của enzyme, chúng có
thể kích thích hoặc ức chế hoạt động của enzyme. Một số ion kim loại có khả
năng liên kết phối trí với các nguyên tử oxy hoặc nguyên tử nitơ của nhóm
cacboxyl, amine hoặc peptide của các enzyme, làm cho trung tâm hoạt động
của enzyme có độ bền rất lớn, đồng thời các ion kim loại này tạo ra các cấu
trúc thuận lợi cho enzyme hoặc làm cho enzyme kết gắn đƣợc với cơ chất, do
đó tốc độ thủy phân của enzyme đƣợc tăng lên. Chitinase từ chủng Bacillus
sp. DAU101 bị ức chế mạnh mẽ bởi Zn
2+
, Cu
2+
và EDTA. Tuy nhiên, hoạt

tính của enzyme này lại tăng khi bổ sung các ion Co
2+
, Mg
2+
, Ca
2+
và Ba
2+
,
những cation này có thể bảo vệ các enzyme chống lại sự biến tính nhiệt và do
đó duy trì hoạt động của enzyme ở nhiệt độ cao [32].
Các ion kim loại nặng ở nồng độ gây biến tính có thể kìm hãm không
thuận nghịch hoạt độ của enzyme. Các ion kim loại nhƣ: Hg
+
, Ag
+
là những
chất ức chế hoạt tính enzyme chitinase. Một số nghiên cứu cho thấy, chất tẩy
rửa và EDTA gây ức chế hoạt tính của chitinase thu nhận từ chủng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Enterobacter sp. NRG4 và exochitinase Bacillus thuringiensis subsp. [32].
Hoạt tính chitinase từ chủng Alcaligenes xylosoxydans bị ức chế 25% khi có
mặt ion Cu
2+
ở nồng độ 5 mM/l, tuy nhiên không bị ảnh hƣởng bởi các ion
Ca
2+
, Ba

2+
và Mg
2+
ở cùng nồng độ. Hoạt tính của chitinase từ chủng
Enterobacter sp. G-1 không bị ảnh hƣởng bởi ion Ca
2+
. Chitinase từ
Enterobacter aerogenes đƣợc kích hoạt bởi các ion Zn
2+
, Ca
2+
, Ba
2+
và Mn
2+
và bị ức chế mạnh mẽ bởi Mg
2+
và Co
2+
.
1.2.8. Tình hình nghiên cứu chitinase trên thế giới và Việt Nam
1.2.8.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Tiềm năng ứng dụng rộng lớn của chitinase đã và đang đƣợc các nhà
khoa học quan tâm và nghiên cứu nhiều trên thế giới. Rất nhiều nƣớc tiến
hành nghiên cứu quá trình sản xuất chitinase nhƣ: Nhật, Canada, Mỹ, Hàn
Quốc… đƣợc tổng hợp trong bảng 1.2.
Bảng 1.2. Tình hình nghiên cứu chitinase trên thế giới
Đề tài nghiên cứu
Kết quả
Tham khảo

Nghiên cứu hoạt tính
enzyme chitinase từ khoai
lang
Xác định khối lƣợng phân tử
chitinase khoảng 16 kDa, pH
tối ƣu là 5,0, nhiệt độ tối ƣu
trong 25
o
C.

Hou WC và cs,
1998. Viện hàn
lâm Sinica,
NanKang, Đài
Loan [13].
Tinh sạch và xác định đặc
điểm của chitinase từ chủng
Streptomyces sp. M-20
Trọng lƣợng phân tử của
chitinase sau tinh sạch là
20,0 kDa.
Kim JK và cs,
2003. Đại học
Soonchunhyang,
Cheonan, Hàn
Quốc [16].
Xác định khả năng kháng
nấm của chitinase từ chủng
Xác định khối lƣợng phân tử
chitinase là 70 kDa.

Chien-Jui
Huang và cs,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Bacillus cereus 28-9
Nghiên cứu biểu hiện và tinh
sạch chitinase từ E. coli tái tổ
hợp
2004. Đại học
Quốc Gia Đài
Loan [7].
Tinh sạch và nghiên cứu đặc
tính của chitinase chịu nhiệt
từ Bacillus licheniformis
SK-1
Khối lƣợng phân tử của
chitinase sau tinh sạch là 72
kDa, điểm đẳng điện (pI) là
4,62. Enzyme hoạt động
trong dải nhiệt độ từ 40-70
o
C
và pH 4-9.
Sanya K và
Rath P, 2009
[24].
Tinh sạch và nghiên cứu đặc
điểm của của chủng
Bacillus circulans No41

trong Escherichia coli
Biểu hiện thành công gen chi
trong E. coli M15. Khối
lƣợng phân tử của chitinase
là 66 kDa. Chitinase hoạt
động tối ƣu ở pH 7,0 và nhiệt
độ 45
o
C
Patcharaporn và
cs, 2006 [20].
Nghiên cứu tách dòng và
biểu hiện gen mã hóa
chitinase chi58 từ
Chaetomium cuprum trên
Pichia pastoris
Chitinase có khối lƣợng phân
tử khoảng 58 kDa điểm đẳng
điện là 4.47. pH tối ƣu là 5,8
và nhiệt độ tối ƣu là 45
o
C.
Yan-Jun Wang,
và cs, 2009 [32].
Nhu cầu sử dụng chitinase có xu hƣớng gia tăng tại nhiều nƣớc trên thế
giới. Tuy nhiên, giá thành sản xuất chitinase cao đã làm giới hạn khả năng
ứng dụng, do vậy để sản xuất chitinase trong công nghiệp cần có nhiều
phƣơng pháp khác nhau: tuyển chọn chủng giống, thành phần môi trƣờng,
điều kiện lên men… để có thể sản xuất enzyme nhanh, giá thành rẻ.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.2.8.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Hiện nay, việc nghiên cứu các quy trình và sản xuất chitinase,
chitooligosaccharide, N-acetyl glucosamine đang đƣợc các nhà khoa học Việt
Nam quan tâm. Các phƣơng pháp sản xuất chitooligosaccharide và N-acetyl
glucosamine nhƣ thủy phân bằng axit dần đƣợc thay thế bằng phƣơng pháp sử
dụng chitinase và chitosanase. Bởi ƣu điểm an toàn, áp dụng quy mô sản xuất
lớn, hiệu suất thu hồi khá cao. Ngoài ra, việc điều chế glucosamine từ chitin
làm thuốc chống đau xƣơng khớp là một vấn đề có ý nghĩa quan trọng trong y
dƣợc, điều chế bằng phƣơng pháp dùng chitinase cùng với chitosanase để
thủy phân chitin thành glucosamine có nhiều ƣu điểm hơn hẳn so với phƣơng
pháp hóa học [8]. Những nghiên cứu trong những năm gần đây do các tác giả
Nguyễn Đinh Nga, Trần Cát Đông, Nguyễn Văn Thanh (ĐH Y dƣợc
TP.HCM – khoa Dƣợc) và Đinh Minh Hiệp (Sở KH&CN TP.HCM) thực hiện
khảo sát chitinase chiết tách từ lá khoai lang và từ Trichoderma ở 2 lĩnh vực:
mức độ kháng và hiệu lực gây tăng tác động của clotri-mazol trên Candida
albicans. Kết quả bƣớc đầu của nghiên cứu này cho khả năng mở ra một triển
vọng của hƣớng phối hợp chitinase với thuốc kháng nấm trong việc điều trị
bệnh nhiễm vi nấm da, niêm mạc qua đó giúp rút ngắn đƣợc thời gian, tăng
hiệu quả điều trị.
Ngoài việc ứng dụng các kỹ thuật truyền thống, một con đƣờng khác là
sử dụng công nghệ protein tái tổ hợp để sản xuất enzyme, đây là hƣớng đi
hiện đại phù hợp để sản xuất enzyme ở qui mô công nghiệp mà các nƣớc tiên
tiến đã và đang thực hiện. Hƣớng đi này giúp nâng cao năng suất sinh tổng
hợp enzyme đồng thời lƣợng enzyme thu đƣợc dễ dàng tinh sạch hơn khi sử
dụng chủng tự nhiên. Tại Việt Nam, trong những năm gần đây cũng đã có một
số nghiên cứu tách dòng và tạo chitinase tái tổ hợp bởi Phí Quyết Tiến và
cộng sự, Viện công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
có nhiều công trình công bố thành công trong việc biểu hiện chitinase tái tổ

hợp có nguồn gốc từ vi sinh vật trong Escherichia coli. Ngoài ra, PGS. TS

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Trƣơng Nam Hải và cộng sự 1999, đã tiến hành nghiên cứu đặc tính kháng
nấm của chitinase và sản xuất thành công chitinase tái tổ hợp có nguồn gốc từ
thực vật trên Escherichia coli.
Năm 2008, Trần Đình Toại và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu sản
xuất glucosamine từ vỏ tôm để điều trị bệnh viêm khớp. Kết quả, nhóm tác
giả đã nghiên cứu tìm đƣợc quy trình thu nhận chitin từ đầu, vỏ tôm phế liệu
bằng phƣơng pháp sinh học và tạo thành công glucosamine
Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu điều kiện lên men chitinase từ các
chủng vi sinh vật tự nhiên đƣợc các nhà khoa học tại Việt Nam công bố và
thu đƣợc nhiều kết quả khả quan. Năm 2010, Nguyễn Phƣơng Nhuệ và cộng
sự Viện Công nghệ sinh học đã công bố công trình tuyển chọn và nghiên cứu
khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase từ chủng B. circulans HT11 để ứng
dụng thu nhận chitooligosaccharide chức năng.
Nhìn chung, có thể tổng kết các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào sàng
lọc và nghiên cứu đặc điểm các vi sinh vật tự nhiên có khả năng sinh
chitinase. Các nghiên cứu trên đƣợc thực hiện tại Viện bảo vệ thực vật – Bộ
NN và PT nông thôn (nhóm nghiên cứu của GS. Phạm Thị Thùy), trƣờng Đại
học Cần Thơ-Bộ Giáo dục (nhóm nghiên cứu của TS. Trang Sĩ Trung),
Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội (nhóm nghiên cứu của TS. Lê Thanh Hà),
Trƣờng Đại học Quốc gia Hà Nội-Bộ Giáo dục (nhóm nghiên cứu của PGS.
TS. Dƣơng Văn Hợp). Gần đây, nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Quyền Đình
Thi (Viện Công nghệ sinh học-Viện KHCN Việt Nam) đã nghiên cứu tách
dòng và biểu hiện chitinase có nguồn gốc từ nấm mốc nhằm ứng dụng trong
phòng trừ các vi sinh vật gây hại trong nông nghiệp.
1.3. BIỂU HIỆN CHITINASE TRONG PICHIA PASTORIS
1.3.1. Đặc điểm của hệ biểu hiện P. pastoris

Hiện nay có bốn hệ tế bào sinh vật chủ thƣờng đƣợc sử dụng để biểu
hiện gen, bao gồm vi khuẩn (E. coli; B. subtilis), nấm men (S. cerevisiae; P.
pastoris), tế bào thực vật và tế bào động vật. Ngoài ra còn có thể biểu hiện