Nghiên cứu hoàn thiện và ứng dụng kỹ thuật đánh giá tác động hoạt hóa in vitro tế bào lympho người của một số chế phẩm sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG

NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ĐÁNH GIÁ
TÁC ĐỘNG HOẠT HÓA IN VITRO TẾ BÀO LYMPHO NGƢỜI
CỦA MỘT SỐ CHẾ PHẨM SINH HỌC
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. Lê Văn Đông
2. GS.TS Đặng Thị Thu

Hà Nội – Năm 2012


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng luận văn này là kết quả nghiên cứu do bản thân tôi
thực hiện cùng với sự cộng tác của các đồng nghiệp. Những số liệu và kết quả trình
bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực, khách quan và không vi phạm bản
quyền của bất kỳ tác giả nào khác .
Học viên

Hoàng Thị Huyền Trang


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới TS.BS Lê Văn Đông,
phó chủ nhiệm bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân Y, GS.TS Đặng Thị Thu – Giảng
viên cao cấp - Viện Công Nghệ sinh học & Công Nghệ Thực Phẩm -Trường Đại
Học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, góp ý và động viên cũng như tạo
điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất, phòng thí nghiệm cho tôi trong quá trình thực
hiện luận văn tốt nghiệp này.
Trong quá trình thực tập và thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm, tôi đã nhận
được sự hướng dẫn và giúp đỡ nhiệt tình của Ths. Đỗ Minh Trung và toàn thể cán
bộ nhân viên phòng thí nghiệm miễn dịch - Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sinh y
dược học, Học viện Quân Y, nhân dịp này tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành nhất
vì sự giúp đỡ quý báu đó.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến Viện Công nghệ sinh học & Công Nghệ
Thực Phẩm, Viện đào tạo sau đại học – Đại học Bách Khoa Hà Nội, đặc biệt là các
thầy, cô giáo đã dạy dỗ và chỉ bảo tôi nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong
quá trình học tập giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, đồng
nghiệp cơ quan công tác Khoa Vi sinh Y học, Bệnh viện 103 đã luôn bên cạnh động
viên, chia sẻ những khó khăn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành
khóa học và thực hiện tốt luận văn tốt nghiệp này.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2012

Học viên

Hoàng Thị Huyền Trang


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN
AIDS
APC
ARN

Acid Deoxyribo Nucleic
Acquired Immune Deficiency Syndrome
Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải
Antigen Prensenting Cell
Tế bào trình diện kháng nguyên
Acid Ribonucleic

CMI

Cell Mediated Immunity
Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào

CD

Cluster of Differentiation

Cụm biệt hóa

CSF

Colony stimulating factor
Yếu tố kích thích tạo colony tế bào
(bào lạc)

CSIF
DMSO
ĐƯMD
FCS
FDA
GM-CSF
HIV

Cytokine synthesis inhibitor factor
Yếu tố ức chế tổng hợp cytokine
Dimethyl Sulphoxide
Đáp ứng miễn dịch
Fetal bovine serum
Huyết thanh bê bào thai
Food and Drug Administration
Cục quản lý dược phẩm và thực phẩm Mỹ
Granulocyte monocyte colony stimulating factor
Yếu tố kích thích tạo colony bạch cầu hạt đơn nhân
Human immunodeficiency virus
Virus gây suy giảm miễn dịch ở người

IFN

Human leukocyte antigen
Kháng nguyên bạch cầu của người (hay kháng nguyên hòa hợp
mô ở người)
Interferon

IL
IL-2

Interleukin
Interleukin 2

HLA


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

IL-2R
Ig
KN
LGL
LAK
MHC
MIF
MAF
M
NK
PBS
PBMC
PE

PHA
RBC
SIg
S
Tc
Th

Hoàng Thị Huyền Trang

Interleukin-2 receptor
Thụ thể của Interleukin-2
Immunoglobulin
Kháng nguyên
Large granular lymphocyte
Tế bào lympho có hạt lớn
Lymphokine-activated killer
Tế bào giết được hoạt hóa bởi lymphokine
Major Histocompatibility complex
Phức hợp hòa hợp tổ chức chủ yếu
Macrophage inhibition factor
Yếu tố ức chế đại thực bào
Macrophage activation factor
Yếu tố hoạt hóa đại thực bào
Mitosis
Nguyên phân
Natural killer cell
Tế bào giết tự nhiên
Phosphate Buffered Saline
Peripheral blood mononuclear cells
Tế bào đơn nhân máu ngoại vi

Polyetylen
Phytohaemagglutinin
Red blood cell
Tế bào hồng cầu
Surface immunoglobulin
Globulin miễn dịch bề mặt
Synthesis
Tổng hợp
Cytotoxic T cell
Tế bào T độc
Helper T cell
Tế bào T hỗ trợ


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

TDTH
TCR
TIL
TNF

Hoàng Thị Huyền Trang

Delayed type hypersensitivity T cell
Tế bào T quá mẫn muộn
T cell receptor
Thụ thể tế bào T
Tumour Infitrating lymphocytes
Tế bào lympho thâm nhiễm vào khối u
Tumor necrosis factor

Yếu tố hoại tử u


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần môi trường nuôi tế bào ..................................................... 32
Bảng 3.1: Đáp ứng của tế bào với nồng độ Interleukin-2 khác nhau do Việt
Nam sản xuất ........................................................................................ 54
Bảng 3.2: Đáp ứng của tế bào với nồng độ Interleukin-2 khác nhau do Trung
Quốc sản xuất ....................................................................................... 55
Bảng 3.3: Nồng độ 9 cytokine tạo thành trong dịch nuôi cấy tế bào tại các thời
điểm khác nhau ..................................................................................... 60
Bảng 3.4: Biến đổi nồng độ của các cytokine của tế bào lympho Th1 có nồng độ
thay đổi................................................................................................. 63


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

DANH MỤC CÁC HÌNH VỄ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Tế bào lympho và các tế bào máu khác .................................................. 3
Hình 1.2: Tế bào lympho khi nhuộm bằng phương pháp Wright............................ 4
Hình 1.3: Các tế bào máu và cấu trúc của hệ miễn dịch ......................................... 5
Hình 1.4: Nguồn gốc và quá trình tuần hoàn của của các tế bào lympho trong cơ
thể .......................................................................................................... 7
Hình 1.5: Sơ đồ Venn tóm tắt một số đáp ứng miễn dịch được điều chỉnh bởi

các cytokin. .......................................................................................... 13
Hình 1.6: Biểu đồ tổng quan về chu kỳ tế bào ...................................................... 15
Hình 1.7: Cấu trúc tinh thể của interleukin 2........................................................ 21
Hình 1.8: Sơ đồ chuyển hóa MTT........................................................................ 29
Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát quy trình đánh giá tác dụng hoạt hóa tế bào lympho
người của chế phẩm sinh học bằng kỹ thuật MTT ................................. 38
Hình 3.1: Ảnh hưởng của chất chỉ thị đỏ phenol .................................................. 43
Hình 3.2: Hình thái tế bào sau các thời điểm nuôi cấy ......................................... 44
Hình 3.3: Sự thay đôi về hình thái tế bào ............................................................. 45
Hình 3.4: Kết quả nhuộm Giemsa hình thái tế bào đáp ứng với Interleukin-2
(IL-2) và chất kích thích phân bào PHA ................................................ 46
Hình 3.5: Kết quả nghiên cứu so sánh IL-2 Trung Quốc khi bổ sung 2% PHA .... 49
Hình 3.6: Đáp ứng của tế bào với nồng độ PHA khác nhau ................................. 50
Hình 3.7: Sự tạo thành tinh thể formazan của tế bào lympho ............................... 52
Hình 3.8: Hoạt tính gây đổi mầu cơ chất MTT..................................................... 52
Hình 3.9: Đáp ứng của tế bào với nồng độ IL-2 khác nhau .................................. 56
Hình 3.10: Đáp ứng của tế bào theo thời gian bảo quản chế phẩm IL-2 ............... 58
Hình 3.11: Nồng độ 9 cytokine tạo thành trong dịch nuôi cấy tế bào ................... 61
Hình 3.12: Nồng độ 9 cytokine tạo thành trong dịch nuôi cấy tế bào khi bổ sung
IL-2 ...................................................................................................... 62
Hình 3.13: Biến đổi nồng độ của 3 cytokine của tế bào lympho Th1 có nồng độ
thay đổi................................................................................................. 64
Hình 3.14: Biến đổi nồng độ của 2 cytokine của tế bào lympho Th2 có thay đổi
nồng độ ................................................................................................. 65


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VỄ, ĐỒ THỊ
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .................................................................................. 3
1.1. TẾ BÀO LYMPHO ..................................................................................... 3
1.2. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI TẾ BÀO LYMPHO ........................................... 4
1.3. CÁC LOẠI TẾ BÀO LYMPHO ................................................................. 5
1.3.1. Tế bào lympho B.................................................................................... 6
1.3.2. Tế bào lympho T .................................................................................... 7
1.3.2.1. Nguồn gốc, đặc điểm........................................................................... 7
1.3.2.2. Chức năng của lympho bào T .............................................................. 9
1.3.3. Tế bào giết tự nhiên (Natural Killer: NK) ............................................. 11
1.4. CYTOKINE .............................................................................................. 11
1.4.1. Tính chất chung ................................................................................... 11
1.4.2. Chức năng sinh học .............................................................................. 14
1.4.3. Cơ chế hoạt động ................................................................................. 14
1.4.4. Vai trò hoạt hóa các tế bào lympho của cytokine .................................. 14
1.4.4.1. Sự hoạt hoá tế bào lympho T ............................................................. 15
1.4.4.2. Sự hoạt hoá tế bào lympho B ............................................................. 16
1.4.5. Phân loại cytokine ................................................................................ 16
1.4.5.1 Phân loại theo cấu trúc ....................................................................... 16
1.4.5.2 Phân loại theo chức năng.................................................................... 17
1.4.6. Một số cytokine ................................................................................... 17
1.4.6.1. Interleukin 1 (IL-1) ........................................................................... 17
1.4.6.2. Interleukin 10 (IL-10)........................................................................ 18
1.4.6.3. Interleukin 13 (IL-13)........................................................................ 18

1.4.6.4. Các interferon (IFN) .......................................................................... 19
1.4.6.5. Các yếu tố hoại tử u (TNF: Tumor necrosis factors) .......................... 20


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

1.4.7. Ứng dụng của cytokine trong điều trị ................................................... 20
1.5. INTERLEUKIN 2 ..................................................................................... 21
1.5.1 Sự tạo thành interleukin 2 ..................................................................... 21
1.5.2 Tính chất của interleukin 2 .................................................................... 22
1.5.3. Chức năng miễn dịch ........................................................................... 23
1.5.4. Sử dụng interleukin 2 (IL-2) trong điều trị lâm sàng............................. 24
1.6. CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HOẠT HÓA TẾ BÀO
LYMPHO NGƢỜI CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC ........................................ 27
1.6.1. Kỹ thuật đánh giá khả năng tồn tại của tế bào....................................... 27
1.6.2. Kỹ thuật đo sự hợp nhất của các nucleotide phóng xạ .......................... 28
1.6.3. Kỹ thuật MTT ...................................................................................... 29
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 31
2.1. VẬT LIỆU ................................................................................................. 31
2.1.1. Đối tượng ............................................................................................. 31
2.1.2. Vật liệu ................................................................................................ 31
2.1.3. Hóa chất và môi trường ........................................................................ 31
2.1.4. Thiết bị máy móc ................................................................................. 32
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 33
2.2.1. Phương pháp tách tế bào lympho ......................................................... 33
2.2.2. Phương pháp nhuộm và đếm tế bào bằng xanh trypan .......................... 34
2.2.3. Phương pháp nuôi cấy tế bào................................................................ 35
2.2.4. Thử nghiệm tăng sinh tế bào lympho in vitro bởi chế phẩm sinh học

interleukin 2 tái tổ hợp .................................................................................. 35
2.2.5. Phương pháp nhuộm Giemsa ............................................................... 36
2.2.6. Kỹ thuật MTT ...................................................................................... 37
2.2.7. Thử nghiệm chế tiết cytokin thứ cấp .................................................... 38
2.2.8. Phương pháp phân tích số liệu.............................................................. 41
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ....................................................... 42
3.1. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM TĂNG SINH TẾ BÀO LYMPHO IN VITRO
.......................................................................................................................... 42
3.1.1. Xác định ảnh hưởng của chất chỉ thị đỏ phenol .................................... 42
3.1.2. Kết quả sự thay đổi hình thái và số lượng tế bào theo thời gian nuôi cấy
...................................................................................................................... 44
3.1.3. Kết quả tăng sinh tế bào của một số hoạt chất sinh học ........................ 45


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

3.1.4. Xác định ảnh hưởng của nồng độ PHA kích thích phân bào khi kết hợp
với IL-2 ......................................................................................................... 48
3.1.5. Kết quả đánh giá sự tồn tại và tăng sinh tế bào bằng kỹ thuật MTT ...... 51
3.1.6. Phương thức đáp ứng của tế bào phụ thuộc liều chế phẩm IL-2 ............ 53
3.1.7. Phương thức đáp ứng của tế bào theo thời gian bảo quản chế phẩm IL-2
tái tổ hợp........................................................................................................ 57
3.2. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM CHẾ TIẾT CYTOKINE THỨ CẤP ............ 59
KẾT LUẬN .......................................................................................................... 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 68


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

MỞ ĐẦU
Các tế bào lympho (lymphocyte) là những tế bào bạch cầu chịu trách nhiệm
chính trong đáp ứng miễn dịch.
Là một cytokine quan trọng của hệ thống miễn dịch do các tế bào lympho T
hoạt hóa tổng hợp nên, Interleukin 2 có tác dụng hoạt hóa đầu nguồn đối với các tế
bào khác, kích thích sự sinh sôi của các tế bào lympho phụ thuộc IL-2 và đóng vai
trò như một chất điều hòa miễn dịch đối với các tế bào lympho B, đại thực bào
(macrophages), các tế bào giết tự nhiên (natural killer). IL-2 rất cần thiết cho sự
hình thành trí nhớ miễn dịch của các tế bào T, đây là một trong những đặc tính quan
trọng và đặc trưng của hệ miễn dịch giúp bảo vệ cơ thể [1] [4].
IL-2 còn được gọi là tác nhân điều biến miễn dịch, hiện được sử dụng nhiều
trong y học như một liệu pháp miễn dịch để điều trị ung thư, HIV, các bệnh nhiễm
trùng, dị ứng, nhiễm virus mạn tính, đánh giá phản ứng của cơ thể trong quá trình
cấy ghép mô, nội tạng và như một tá dược trong vacxin. Trong đó để chữa trị ung
thư là một trong những ứng dụng quan trọng nhất của IL-2.
Do có những ứng dụng quan trọng trong y-dược nên cùng với việc phát hiện
ra các dòng tế bào phụ thuộc IL-2, các thử nghiệm sản xuất IL-2 trong các hệ thống
in vitro cũng được tiến hành. Nhờ vào công nghệ gen hiện đại, hiện đã có những sản
phẩm IL-2 tái tổ hợp với chất lượng tốt và bán dưới dạng thương phẩm. Một số
hãng dược phẩm danh tiếng như NOVATIS đã sản xuất thành công IL-2 tái tổ hợp
để sử dụng trong chữa trị một số loại bệnh ung thư (ung thư thận, ung thư hắc tố
melanoma…). IL-2 đã được chấp nhận sử dụng trong điều trị ở nhiều quốc gia trên
thế giới như Mỹ, Vương quốc Anh (United Kingdom) [4][32].
Ở Việt Nam, chế phẩm IL-2 tái tổ hợp của người đã được nghiên cứu và sản
xuất cũng như nghiên cứu xác định hoạt tính sinh học trên tế bào [4]. Tuy nhiên đây
là một chế phẩm mới, do đó cần phải đánh hoạt tính sinh học của sản phẩm trên tế
bào lympho người trước khi đưa vào sử dụng.

1


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

Từ cơ sở thực tiễn và lý luận trên, chúng tôi tiến hành đề tài: ―Nghiên cứu
hoàn thiện và ứng dụng kỹ thuật đánh giá tác động hoạt hóa in vitro tế bào
lympho người của một số chế phẩm sinh học”. Nhằm đánh giá hoạt tính sinh học
cũng như so sánh hình thức tác dụng để có thể đánh giá cụ thể về tác dụng của chế
phẩm sinh học IL-2 tái tổ hợp tạo ra tại Việt Nam.
Mục tiêu nghiên cứu:
-

Xây dựng và tối ưu hóa quy trình đánh giá hoạt động hoạt hóa, tăng sinh
in vitro các tế bào lympho người.

-

Ứng dụng quy trình đã sử dụng đánh giá hoạt tính sinh học của
Interleukin-2 tái tổ hợp của người do Việt Nam sản xuất lên các tế bào
lympho người in vitro.

Nội dung đề tài:
Để giải quyết các mục tiêu trên chúng tôi tiến hành các nội dung sau:
-

Nghiên cứu khả năng kích thích hoạt hóa tăng sinh các tế bào lympho

khi nuôi trong môi trường bổ sung chế phẩm sinh học IL-2 tái tổ hợp và
đánh giá mức độ hoạt hóa tăng sinh của tế bào thông qua quan sát hình
thái tế bào và đo lường mức độ hoạt động của ti thể sinh enzyme chuyển
hóa chất mầu MTT.

-

Nghiên cứu cơ chế tác động và khả năng kích thích các tế bào lympho
sinh ra các cytokine thứ cấp của chế phẩm sinh học IL-2 tái tổ hợp.

2


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

CHƢƠNG I
TỔNG QUAN
1.1. TẾ BÀO LYMPHO
Các tế bào lympho (lymphocyte) là những tế bào bạch cầu chịu trách nhiệm
chính trong đáp ứng miễn dịch. Đặc điểm chính của chúng về phương diện miễn
dịch là tính đa dạng, tính đặc hiệu ký ức, nhận biết những gì là của bản thân và
không phải của bản thân. Được hình thành từ các mô bạch huyết là một mạng lưới
các sợi và các tế bào (các hạch lympho, lách, tuyến ức, amydal, các mảng Peyer, và
đôi khi ở trong tủy xương), do đó, chúng phân tán khắp cơ thể và là một trong
những tế bào có số lượng cao nhất ở động vật có vú [57].
Ở người lớn trung bình có 1012 tế bào lympho. Các tế bào lympho chiếm
khoảng 20-30% tổng số bạch cầu máu ngoại vi và có khả năng di chuyển vào kẽ mô
và các cơ quan dạng lympho [3].

Hình 1.1: Tế bào lympho và các tế bào máu khác
Đại thực bào (mầu hồng/tím), Tế bào lympho T (mầu xanh), và
các tế bào Hồng cầu (hình đĩa lõm)
Nguồn:

3


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

1.2. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI TẾ BÀO LYMPHO

Hình 1.2: Tế bào lympho khi nhuộm bằng phƣơng pháp Wright
Nguồn: />Các tế bào lympho thường có kích thước nhỏ (7-8µm), nhưng cũng có những
tế bào lympho kích thước lớn hơn (10-20µm) [58].
Nhân (cấu trúc trung tâm) của tế bào lympho bao gồm một tập hợp dày đặc
các chất nhiễm sắc bên trong. Nhân của tế bào lympho có mầu tím/xanh đậm khi
nhuộm bằng phương pháp nhuộm của Wright [6]. Màng nhân có giới hạn rõ, nhân
thường tròn, nhưng có thể có răng cưa và nằm lệch tâm bên trong một lượng tương
đối nhỏ tế bào chất có mầu xanh nhạt [13]. Chuỗi Polyribosome là một đặc điểm nổi
bật của các tế bào lympho và có thể quan sát được dưới kính hiển vi. Các ribosome
này tham gia vào quá trình tổng hợp protein cho phép các tế bào lympho sản sinh ra
một lượng lớn các cytokines và các globulin miễn dịch [6].
Không giống như các tế bào bạch cầu khác như tế bào bạch cầu ái kiềm
(basophils), bạch cầu trung tính (neutrophil) và tế bào bạch cầu ái toan
(eosinophils), tế bào chất của tế bào lympho thường không chứa hạt. Tuy nhiên, ở
dạng tế bào lympho lớn có thể có tương đối nhiều tế bào chất và các tế bào chất này

bao gồm vài hạt nhỏ màu đỏ/tím sáng, đối lập với các hạt của các tế bào trong tủy

4


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

xương [57][58]. Dưới kính hiển vi đối pha thấy lympho bào chuyển động chậm
chạp kiểu amip [1].

Hình 1.3: Các tế bào máu và cấu trúc của hệ miễn dịch
1.3. CÁC LOẠI TẾ BÀO LYMPHO
Dựa vào sự khác nhau trong quá trình biệt hóa, khác nhau về hình thái, chức
năng, đặc biệt sự khác nhau các dấu ấn bề mặt mà các tế bào lympho được chia
5


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

thành các quần thể và dưới quần thể. Nhờ sự phát triển của các kháng thể đơn dòng
nên việc định danh xếp loại các quần thể tế bào lympho ngày càng được bổ sung.
Cho đến nay, hai quần thể chính của tế bào lympho được thừa nhận đó là quần thể
lympho bào T và lympho bào B [1].
Về mặt hình thái khi quan sát dưới kính hiển vi thường thì không thể phân
biệt được các tế bào lympho với nhau, nhưng khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử
dễ dàng thấy bề mặt tế bào B xù xì, có nhiều mấu, đó là các phân tử kháng thể bề

mặt SIg (surface immunogobulin). Kháng thể bề mặt này sẽ dùng để sao ra các
kháng thể mà tế bào B sẽ sinh ra trong quá trình phát triển sau này [1][3][5].
Trên bề mặt tế bào T nhẵn nhụi hơn (không có SIg ở tế bào T) nhưng lại có
phân tử glycoprotein tương ứng, đó là thụ thể của tế bào T, dùng để nhận biết kháng
nguyên và phân tử MHC, thụ thể này đặc hiệu với kháng nguyên nên tương tác giữa
tế bào T và kháng nguyên là tương tác đặc hiệu [1][2][4].
Sự tương tác của tế bào T hoặc tế bào B sẽ kích thích tế bào lympho bước
vào các pha G1, S, G2 và M của chu trình tế bào.
1.3.1. Tế bào lympho B
Từ tế bào gốc, các tiền tế bào B của loài chim đều phân chia biệt hóa ở túi
Fabricius (Bursa Fabricius) nên được gọi là lympho bào B và hoạt động của chúng
phụ thuộc vào túi Fabricius. Ở người, người ta tìm thấy các tế bào tiền thân của
lympho B trong gan bào thai và trong tủy xương của người trưởng thành, sau đó các
tiền lympho B trưởng thành ngay trong tủy xương (chữ B cũng đúng với vị trí
trưởng thành chủ yếu của các tế bào này ở động vật có vú là tủy xương: Bone
marrow).
Dưới kính hiển vi điện tử các tế bào lympho B có bề mặt xù xì, nổi gai: đó là
các globulin miễn dịch bề mặt (Surface immunoglobulin: SIg). Có thể phát hiện các
SIg một cách dễ dàng bằng các kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang. Về phương diện
chức năng, các globulin này đóng vai trò là các thụ thể dành cho kháng nguyên. Có
khoảng 1,5 x 105 phân tử kháng thể trên màng của một tế bào B. Mỗi một phân tử

6


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

có một vị trí kết hợp kháng nguyên. Tất cả các tế bào thuộc dòng biệt hóa từ một tế

bào B ban đầu sẽ kết hợp đặc hiệu cùng với một loại kháng nguyên [1][3][5].
Tế bào lympho B là tế bào sinh kháng thể và chịu trách nhiệm đáp ứng miễn
dịch dịch thể. Sau khi kháng nguyên xâm nhập và được các đại thực bào hoặc chính
các tế bào lympho B xử lý, các tế bào lympho B sẽ được thông tin và biến thành
những tế bào mẫn cảm. Sau đó những tế bào này trở thành những nguyên tương bào
và phát triển thành những quần thể không những tại hạch lympho khu vực mà còn
đi đến các hạch khác trong toàn cơ thể. Một số các nguyên tương bào sẽ chuyển
thành tế bào plasma (tương bào) để sản xuất ra kháng thể. Mỗi dòng tế bào plasma
chỉ sản xuất ra một kiểu globulin miễn dịch. Quá trình tăng sinh và biệt hóa lympho
B thành tế bào plasma (sản xuất kháng thể) diễn ra có kèm theo sự thay đổi SIg
[1][5].
1.3.2. Tế bào lympho T
1.3.2.1. Nguồn gốc, đặc điểm [1]

Hình 1.4: Nguồn gốc và quá trình tuần hoàn của của các tế bào lympho trong
cơ thể
Tế bào lympho T có cùng nguồn gốc với Tế bào lympho B và mọi tế bào
miễn dịch huyết học khác: đó là tủy xương. Khi qua tuyến ức, lympho bào T bị giữ
lại, nhờ các hormon ―tại chỗ‖ của tuyến ức tiết ra mà các lympho bào T có một môi

7


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

trường phù hợp để tăng sinh và biệt hóa, trưởng thành, sau đó di cư vào vùng tủy
ức, tiếp tục chín và được tung ra máu để định cư lần hai ở các cơ quan bạch huyết:
hạch, lách, niêm mạc … Trong máu, lympho bào T có tỷ lệ và số lượng cao hơn hẳn

lympho bào B, rất phù hợp với chức năng nhận biết kháng nguyên, trực tiếp bao bọc
và loại trừ kháng nguyên của chúng.
Giống như các lympho B, các lympho T cũng có các thụ thể trên màng dành
cho kháng nguyên. Tuy nhiên khác với các phân tử globulin miễn dịch gắn trên
màng tế bào B (SIg) đó là các thụ thể của tế bào T chỉ nhận diện kháng nguyên khi
kháng nguyên đó kết hợp với phân tử MHC của chính tế bào đó. Việc tế bào T nhận
diện kháng nguyên kết hợp với phân tử MHC của bản thân chỉ ra một sự khác nhau
cơ bản giữa đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào và đáp ứng miễn dịch dịch thể.
Các dòng tế bào lympho T được biệt hóa hoặc ở các giai đoạn trưởng thành
khác nhau có thể được phân biệt nhờ sự xuất hiện của các phân tử trên màng tế bào
và các phân tử này được nhận biết bởi các kháng thể đơn dòng đặc hiệu. Các phân
tử protein trên màng tế bào này được coi là ―dấu ấn‖ bề mặt của tế bào. Các dấu ấn
này có nhiều tên gọi nhưng đến nay đã thống nhất chọn tên cho các protein đó là
cụm biệt hóa có ký hiệu là CD (C= Cluster class: cụm; D= Differentiation,
determinant: biệt hóa, xác định), kèm theo con số nói lên thứ tự phát hiện ra nó.
Dưới quan điểm miễn dịch CD cũng là kháng nguyên của tế bào mang nó, còn về
mặt phân loại thì CD giúp ta phân biệt giai đoạn của một lympho T, đồng thời phân
biệt các nhóm T khác nhau…
Có thể phân biệt các tiểu quần thể tế bào T với nhau nhờ sự có mặt của một
trong hai phân tử trên màng là CD4 hay CD8. Các tế bào T mang dấu ấn CD8
(TCD8+) thường có chức năng như những tế bào T gây độc (Tc). Các tế bào T
mang dấu ấn CD4 (TCD4+) thường có chức năng là các tế bào T hỗ trợ (Th).

8


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

1.3.2.2. Chức năng của lympho bào T [1]
Lympho bào T với nhiều phân nhóm (dưới nhóm), thực hiện được các chức
năng cơ bản và toàn diện nhất của đáp ứng miễn dịch mà lympho bào B không thể
làm được đầy đủ. Đó là:
-

Nhận biết kháng nguyên: Do Th và Tc phụ trách

-

Điều hòa, kiểm soát mức độ đáp ứng miễn dịch (cả miễn dịch dịch thể):
do Th và Ts phụ trách.

-

Loại trừ kháng nguyên: Do Tc + TDTH và các tế bào ―diệt‖ phụ trách

-

Ghi nhớ miễn dịch

A, Vai trò của CD4 và CD8
Khả năng nhận biết kháng nguyên của tế bào T là cho toàn hệ miễn dịch
[1][3]:
- Các tế bào T mang dấu ấn CD4 (TCD4+) nhận diện các kháng nguyên kết
hợp với phân tử MHC lớp II, thường có chức năng là các tế bào T hỗ trợ (Th). Sau
khi nhận diện các kháng nguyên được trình diện cùng phân tử MHC lớp II trên
màng tế bào trình diện kháng nguyên thì các tế bào Th tăng sinh một cách ồ ạt. Các
tế bào Th chế tiết nhiều cytokine khác nhau, thường được gọi là các lymphokine,
đóng vai trò trung tâm trong quá trình hoạt hóa tế bào B, tế bào Tc và nhiều tế bào

khác tham gia vào đáp ứng miễn dịch.
- Các tế bào T mang dấu ấn CD8 (TCD8+) nhận diện các kháng nguyên kết
hợp với phân tử MHC lớp I và thường có chức năng như những tế bào T gây độc
(Tc). Tế bào Tc được hoạt hóa nhờ vào sự tương tác giữa phức hợp kháng nguyênphân tử MHC trên bề mặt tế bào của bản thân cơ thể đã bị biến đổi (ví dụ các tế bào
đã nhiễm virus) khi có mặt các lymphokine thích hợp. Các tế bào Tc đã hoạt hóa
được gọi là các tế bào T gây độc có khả năng giết chết các tế bào đã bị biến đổi.
Các lympho bào T có hai vai trò quan trọng trong miễn dịch chống virus.
Đầu tiên, thông qua giải phóng ra các lymphokines thích hợp, chúng sắp đặt lại đáp
ứng miễn dịch, kiểm soát các loại kháng thể được tiết ra bởi tế bào B đặc hiệu với

9


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

kháng thể, điều hòa sự viêm nhiễm tại nơi nhiễm trùng, hỗ trợ sự phát triển của tế
bào T có hoạt tính kháng virus. Chức năng thứ hai của tế bào T là chúng có khả
năng nhận diện một cách đặc hiệu virus – các tế bào nhiễm trùng và thậm chí phá
hủy các tế bào trước khi các thế hệ virus sau được giải phóng hoặc cung cấp các
lymphokines có thể hạn chế sự sao chép của virus. Tất cả những chức năng xoay
quanh sự nhận diện các kháng nguyên của virus trên bề mặt các tế bào APC [13].
B, Vai trò thụ thể (cấu trúc và chức năng của thụ thể TCR- T cell receptor)
[1][13]
Phân tử CD4 và CD8 giúp Th và Tc tiếp cận đúng tế bào trình diện kháng
nguyên: bằng MHC lớp I hay là MHC lớp II. Còn việc trực tiếp nhận biết kháng
nguyên lại do các thụ thể của tế bào T, ký hiệu là TCR (T cell receptor). Mỗi một
dòng tế bào T lại biểu hiện một thụ thể với kháng nguyên lên trên bề mặt của chúng.
Về cấu trúc thụ thể của tế bào T (TCR) bao gồm một heterodimer của hai

protein màng tách rời gọi là chuỗi α và β, mang các gốc glucid, cùng nối liên chuỗi
(và nội chuỗi) bằng các cầu disulphua (S-S). Đặc biệt, mỗi chuỗi cũng bao gồm
một vùng hằng định (C; constant), có tận cùng bằng nhóm –COOH và vùng biến
đổi (V; variable) có tận cùng nhóm –NH2: chính vùng biến đổi đã giúp mỗi quần thể
Th, Tc chỉ nhận ra một kháng nguyên phù hợp. Và cũng có sự sắp xếp lại gen khi
tổng hợp vùng V. Do vậy, TCR được xếp vào đại gia đình Ig.
Giống như Ig, vùng biến đổi liên kết với vùng hằng định bởi sự sắp xếp lại
gen, ngoài ra với tổ hợp đa dạng được tạo ra trong vùng CDR3 (như với Ig, nằm ở
vị trí giao nhau của các vùng hằng định và biến đổi) bằng cách chèn một (đối với
các chuỗi α) hoặc hai (đối với các chuỗi β) phân đoạn bổ sung nhỏ. Do đó, giống
như với Ig, hầu hết tính đa dạng trong TCR xảy ra ở vùng CDR3, nơi được cho rằng
có liên quan mật thiết với việc peptide liên kết chặt chẽ với phân tử MHC. Không
giống như các tế bào B, tế bào T không biến đổi vùng hằng định của thụ thể kháng
nguyên, nơi mà có thể được hiểu là do thụ thể chỉ cung cấp tín hiệu để hoạt hóa tế
bào T.

10


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

1.3.3. Tế bào giết tự nhiên (Natural Killer: NK)
NK là một tiểu quần thể tế bào có khả năng diệt một số tế bào đích: tế bào u,
tế bào vật chủ bị nhiễm virus. Chức năng quan trọng của tế bào NK có lẽ là kiểm
soát miễn dịch, ngăn chặn sự di cư của tế bào u qua máu, bảo vệ cơ thể chống lại sự
nhiễm virus. Tế bào NK hoạt hóa tiết ra một số chất như gamma interferon, TNF,
GM-CSF tác động lên các tế bào khác [1].
1.4. CYTOKINE

Tham gia vào đáp ứng miễn dịch có nhiều loại tế bào khác nhau, chủ yếu là
các tế bào dạng lympho, các tế bào viêm và các tế bào tạo máu khác. Những tương
tác phức tạp xảy ra giữa các tế bào này với nhau được thực hiện thông qua một
nhóm các protein được gọi chung là các cytokine để nói lên vai trò của chúng trong
các tương tác tế bào với tế bào. Thuật ngữ ―cytokin‖ bao gồm nhiều loại chất điều
hòa được sinh ra trong khắp cơ thể bởi các tế bào có nguồn gốc phôi sinh học đa
dạng [1][20].
Về cơ bản, cytokine là những phân tử nhỏ hay là các phân tử protein tín hiệu
nội bào, chúng có thể được phân loại như là các protein hoặc glycoprotein điều hòa
có trọng lượng phân tử thấp (khoảng 8 đến 30 kDa, trung bình khoảng 25 kDa)
được chế tiết bởi các tế bào bạch cầu và nhiều loại tế bào khác trong cơ thể đáp ứng
với một số kích thích. Các cytokine tham gia vào sự điều hòa phát triển của các tế
bào miễn dịch, đồng thời có một số cytokine có tác động trực tiếp lên ngay bản thân
tế bào tiết ra chúng [1][46].
1.4.1. Tính chất chung
Sau khi bị kích thích, hầu hết các tế bào có nhân đều tiết ra các loại cytokine,
mặc dù vậy thì tế bào bạch cầu vẫn là nguồn sinh cytokine chủ yếu. Một cytokine
có thể do nhiều loại tế bào tiết ra và một loại tế bào có thể tiết ra nhiều loại
cytokine. Cytokine có thể được tạo thành trong một số mô nhưng thường được sinh
ra khi vi khuẩn, chất độc, phóng xạ, áp lực oxy mạnh, biến dạng tế bào và quan
trọng nhất là bởi các cytokin khác kích thích [1][46].

11


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

Hầu hết các cytokine được tổng hợp một lần nữa trước khi chúng được tiết ra

trong đáp ứng miễn dịch khi bị kích thích. Do đó, điều tiết sự hình thành cytokine
có thể diễn ra ở các giai đoạn phiên mã, dịch mã và giải phóng của quá trình.
Mỗi cytokine có một thụ thể đặc hiệu cho chúng trên màng các tế bào đích
làm khởi động các con đường dẫn truyền tín hiệu vào bên trong tế bào và cuối cùng
dẫn đến thay đổi biểu hiện gence của tế bào đích và các yếu tố phiên mã của chúng,
dẫn đến việc sản sinh ra các cytokine khác, gia tăng số lượng thụ thể bề mặt đối với
các phân tử khác hoặc ức chế các tác động riêng của chúng bằng cách ức chế ngược.
Tế bào đích của cytokine được thể hiện bởi sự có mặt của các thụ thể dành cho
cytokine trên bề mặt tế bào. Thông thường ái lực giữa cytokine và thụ thể dành cho
cytokin rất cao. Chính vì có ái lực cao mà cytokine có tác động sinh học ngay cả ở
các nồng nộ rất thấp tới mức picomole [58].
Tác dụng của một cytokin cụ thể lên một tế bào nhất định phụ thuộc vào
cytokine, sự đa dạng về các yếu tố ngoại bào của chúng, sự hiện diện và sự đa dạng
của các thụ thể bổ sung trên bề mặt tế bào và các tín hiệu xuôi được hoạt hóa bởi
các thụ thể liên kết trong đó hai yếu tố sau cùng có thể thay đổi tùy theo loại tế bào.
Các cytokin được đặc trưng bởi sự lặp lại, trong đó nhiều cytokine có chức năng
tương tự nhau. Các cytokine khi kết hợp với các kháng thể gây ra tác dụng miễn
dịch mạnh hơn khi tác động đơn lẻ [15].
Hình thức hoạt động của các cytokin có thể phân thành các loại sau [1]:
-

Kiểu tự tiết (autocrine): Chúng có tác động trở lại lên chính tế bào tiết ra
chúng.

-

Kiểu cận tiết (paracrine): chúng có tác động lên các tế bào lân cận xung quanh.

-

Kiểu nội tiết (endocrine): vào máu, tác động lên tế bào đích ở xa nơi chế tiết
(giống như hormon).

-

Tác động trực tiếp: cytokine đóng vai trò cầu nối trực tiếp giữa tế bào tiết với
tế bào đích.
Các cytokine điều hòa cường độ và thời gian của đáp ứng miễn dịch bằng

cách điều hòa sự tiết các kháng thể hoặc các cytokin khác [58].

12


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

Tác dụng của các cytokine có thể theo kiểu đa dụng (pleiotropy), có nghĩa là
các cytokine gây ra các hoạt tính sinh học khác nhau trên các tế bào đích khác nhau.
Ngược lại, tác động theo kiểu đồng dụng (redundancy) là các cytokine khác nhau có
thể gây ra một tác động sinh học tương tự nhau cho cùng một loại tế bào đích. Các
cytokine có thể có tác động hiệp đồng (synergy) với nhau có nghĩa là khi hai
cytokine cùng tác động thì gây ra hiệu quả lớn hơn tổng tác động của từng cytokine
khi tác động riêng lẻ; hoặc đối kháng (antogonism), tức là một cytokine này có tác
dụng ức chế một cytokine khác [1][58].

Hình 1.5: Sơ đồ Venn tóm tắt một số đáp ứng miễn dịch đƣợc điều chỉnh bởi
các cytokin.
Sơ đồ hình 1.7 cho thấy, mỗi một đáp ứng được kích thích bởi một vài

cytokin (kiểu đồng dụng), và mỗi một cytokin có khả năng kích thích một vài đáp
ứng khác nhau (kiểu đa dụng) [46].

13


Luận văn thạc sĩ kỹ thuật

Hoàng Thị Huyền Trang

Hoạt động của một cytokine trên một tế bào đích tương ứng nhìn chung sẽ
điều hòa sự xuất hiện của các thụ thể dành cho cytokin và xuất hiện các cytokine
mới, những cytokine mới này sẽ tác động lên các tế bào khác tạo nên một phản ứng
dây chuyền. Bằng cách đó đáp ứng đặc hiệu của một lympho bào với một kháng
nguyên sẽ ảnh hưởng đến hoạt tính của hàng loạt tế bào cần thiết cho việc sinh ra
một đáp ứng miễn dịch hữu hiệu.
1.4.2. Chức năng sinh học
Hiện nay đã biết có trên 90 cytokine khác nhau, do nhiều loại tế bào khác
nhau tiết ra và có rất nhiều tác dụng sinh học đan xen nên có nhiều cách đặt tên và
phân loại cytokine. Do đó, việc xác định chính xác một chức năng sinh học thuộc
một cytokine cụ thể là rất khó khăn. Chức năng sinh học chung nhất của các
cytokine là trung gian trao đổi thông tin giữa các tế bào để: Kích thích phát triển các
dòng tế bào khác nhau của cơ thể (tế bào miễn dịch, tế bào máu…); Hoạt hóa các tế
bào nhằm kích thích sự trưởng thành, biểu lộ các thụ thể trên bề mặt tế bào; Gây
độc làm tổn thương, ức chế tế bào… [1].
1.4.3. Cơ chế hoạt động
Cytokin sau khi gắn với thụ thể tương ứng, tế bào đích sẽ được khởi động
sao chép, dịch mã gen, chế tiết các thụ thể để tiếp nhận thêm cytokine; đồng thời
sản xuất cytokin mới để tác động lên các tế bào khác [1].
1.4.4. Vai trò hoạt hóa các tế bào lympho của cytokine

Các tế bào lympho T và B chưa chín, hay các tế bào lympho nghỉ ngơi, là
các tế bào còn đang ở giai đoạn G0 của chu trình tế bào và không nằm trong vòng
tuần hoàn. Sự hoạt hoá đưa tế bào ở giai đoạn nghỉ ngơi vào chu trình tế bào, trải
qua giai đoạn G1 để vào pha gian kỳ (pha S), trong giai đoạn này ADN được nhân
lên. Quá trình chuyển từ giai đoạn G1 đến pha S đóng một vai trò cực kỳ quan trọng
trong chu trình tế bào. Khi một tế bào đã đạt đến pha S nó hoàn thành chu trình tế
bào, chuyển qua giai đoạn G2 và vào thời kỳ phân bào (M).

14