Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ốc cối (conus SPP ) và đa dạng di truyền của loài ốc cối conus textile ở vùng biển nam trung bộ việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LÊ THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU MỐI QUAN HỆ TIẾN HÓA GIỮA CÁC LOÀI ỐC
CỐI (CONUS SPP.) VÀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA LOÀI ỐC CỐI
CONUS TEXTILE Ở VÙNG BIỂN
NAM TRUNG BỘ - VIỆT NAM.

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. Đặng Thúy Bình

2. TS. Trƣơng Quốc Phong

Hà Nội - 2012


LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đặng Thúy Bình (Viện
phó – Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và môi trƣờng, Trƣờng ĐH Nha Trang),
TS. Trƣơng Quốc Phong (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển CNSH, Viện Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩmTrƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội), những
ngƣời đã tận dìu dắt và hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu Công nghệ sinh
học và môi trƣờng – ĐH Nha Trang đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo và cán bộ công tác tại

Viện Công nghệ sinh học và thực phẩm, Viện đào tạo sau đại học – Trƣờng Đại học
Bách khoa Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời
gian học tập.
Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân và bạn bè đã
nhiệt tình động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 15 tháng 09 năm 2012
Học viên

Lê Thị Thu Hà

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự chỉ bảo của
thầy cô hƣớng dẫn và giúp đỡ của tập thể cán bộ nghiên cứu Bộ môn Sinh học phân
tử - Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và môi trƣờng - ĐH Nha Trang. Các số
liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên.

Lê Thị Thu Hà

iii


LỜI CẢM ƠN............................................................................................................................... ii
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................................ iii
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................................... viii

DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................................... viii
MỞ ĐẦU.......................................................................................................................................1
1. Mục đích nghiên cứu của đề tài .................................................................................................2
2. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài........................................................................2
CHƢƠNG I – TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................4
1. TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI ỐC CỐI (CONUS SPP.) VÀ ĐỘC TỐ CỦA CHÚNG .............4
1.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ PHÂN BỐ CỦA ỐC CỐI (CONUS SPP.) ............4
1.1.1. Hệ thống phân loại ốc cối (Conus spp.) .........................................................................4
1.1.2. Đặc điểm sinh thái và phân bố ......................................................................................4
1.1.3. Đặc điểm hình thái của ốc cối .......................................................................................5
Hình 1.2: Các dạng hình thái vỏ khác nhau của ốc cối (Conus spp.) ..........................................6
1.1.4. Chế độ ăn và phƣơng thức săn mồi ...............................................................................7
1.1.5. Đặc điểm sinh sản của ốc cối ........................................................................................7
1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐỘC TỐ CỦA ỐC CỐI (CONUS SPP.) ..........................................8
1.2.1. Giới thiệu chung ...........................................................................................................8
1.2.2. Ứng dụng y học của độc tố ốc cối .................................................................................8
2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DI TRUYỀN ỐC CỐI (CONUS SPP.) .............................................. 10
2.1. CÁC CHỈ THỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN .......................... 10
2.1.1. Chỉ thị hình thái .......................................................................................................... 11
2.1.2. Chỉ thị sinh hóa........................................................................................................... 12
2.1.3. Các chỉ thị phân tử ......................................................................................................... 12
2.1.3.1. Chỉ thị DNA ti thể ................................................................................................ 13
2.1.3.2. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ................................ 14
2.1.3.3. Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)..................................... 15
2.1.3.4. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ................................. 16
2.1.3.5. Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats hay Microsatellite) .................................. 16
2.1.3.6. Chỉ thị SNP (Single nucleotide polymorphisms) ................................................... 17
2.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN ỐC CỐI .............................................................. 17

iv

2.2.1. Nghiên cứu cấu trúc hệ gen của ốc cối..................................................................... 17
2.2.2. Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa ............................................................................ 19
2.2.3. Mối liên hệ giữa phát sinh loài và chế độ dinh dƣỡng ở ốc cối (Conus spp.) ............ 21
2.2.4. Nghiên cứu di truyền ốc cối ở Việt Nam ................................................................. 22
2.2.5. Nghiên cứu di truyền độc tố .................................................................................... 23
2.2.6. Nghiên cứu di truyền quần thể ốc cối và động vật thân mềm ................................... 24
CHƢƠNG II – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................ 26
1. ĐỐI TƢỢNG, THU MẪU VÀ PHƢƠNG PHÁP THU MẪU .................................................. 26
1.1. ĐỐI TƢỢNG VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ...................................................................... 26
1.2. PHƢƠNG PHÁP THU MẪU ỐC CỐI .................................................................................. 26
2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................................................. 27
2.1 TÁCH CHIẾT DNA, KHUYẾCH ĐẠI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ ................................................ 27
2.1.1. Tách chiết DNA.......................................................................................................... 27
2.1.2. Khuyếch đại gen ......................................................................................................... 28
2.1.3. Điện di gel agarose ..................................................................................................... 29
2.1.4. Giải trình tự ................................................................................................................ 29
2.2. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG LOÀI VÀ MỐI QUAN HỆ TIẾN HÓA ......................................... 30
2.2.1 Phân tích đa dạng loài ốc cối ........................................................................................ 30
2.2.2. So sánh trình tự các loài ốc cối .................................................................................... 30
2.2.3. Phân tích đa dạng loài ốc cối Conus textile dựa trên hapotype ..................................... 30
2.2.4. Phân tích mối quan hệ loài bằng cây tiến hóa (phylogenetic analyst) ........................... 30
2.2.5. Phân tích di truyền quần thể loài Conus textile ............................................................ 31
CHƢƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 33
3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ........................................................................... 33
3.2. KẾT QUẢ KHUYẾCH ĐẠI GEN VÀ GIẢI TRÌNH TỰ DNA ............................................. 34
Hình 3.3: Ảnh chụp kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 16S mtDNA (A) và CO1 mt
DNA (B) của một số mẫu ốc cối. Ký hiệu 1,2: Conus textile; 3,4: C. striatus; 5, 6: C. vexilum;
7: C. bandanus; C: mẫu đối chứng âm; M: DNA marker. ..................................................... 35

3.3. XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH LOÀI ................................................................................. 35
3.3.1. Cây phát sinh loài dựa trên gen 16S mtDNA ............................................................... 35
3.3.2. Cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mt DNA ............................................................. 38
3.3.3. THẢO LUẬN ............................................................................................................. 44
3.3.3.1. Mối quan hệ loài ốc cối dựa trên các chỉ thị phân tử CO1 và 16S mtDNA .................... 44
3.3.3.2. Mối quan hệ giữa loài và chế độ dinh dƣỡng ........................................................ 47

v


3.4. ĐA DẠNG DI TRUYỀN ỐC CỐI (CONUS TEXTILE) ......................................................... 49
3.4.1 Đa dạng di truyền Conus textile ................................................................................... 49
3.4.2. Di tuyền quần thể của ốc cối (Conus textile) tại vùng biển Nam Trung Bộ ........................ 50
3.4.3. THẢO LUẬN ............................................................................................................. 52
3.4.3.1. Đa dạng haplotype ............................................................................................... 52
3.4.3.2. Di truyền quần thể của ốc cối Conus textile tại vùng ven biển Nam Trung Bộ ............... 54
3.5. XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU ............................................................................................ 57
CHƢƠNG IV – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .................................................................. 58
KẾT LUẬN ................................................................................................................................. 58
KIẾN NGHỊ ................................................................................................................................ 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................ 60
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT .............................................................................................................. 60
TÀI LIỆU TIẾNG ANH .............................................................................................................. 60
PHỤ LỤC .................................................................................................................................... 67
So sánh trình tự DNA của một số loài ốc cối có đặc điểm hình thái ngoài giống nhau ........................... 67

vi


BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

AFLP
ATP
BI
bp
BT
cDNA
CLC
CO1
cs
D-loop
DNA
dNPT
ĐVTM
EST
ITS
kb
LS
ML
MP
mt DNA
NADH
PCR
PIC
PP
RAPD
rDNA
RFLP
SC
SNP
SSR

TBE
VP
ESTs
NMDA

Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều đoạn nhân bản)
Adenosine triphosphate
Bayesain inference
Base pair (cặp bazơ)
Giá trị bootstrap
Complementary DNA
Cù Lao Chàm
Oxidase cytochrom c subunit 1
Cộng sự
Displacement loop
Deoxyribonucleic acid
Deoxynucleotide triphosphate
Động vật thân mềm
Expressed sequence tags
Internal Transcribed Space
Kilo base
Lý Sơn
Maximum likelihood
Parsimony
Mitochondrial DNA (DNA ti thể)
Nicotinamide adenine dinucleotide
Polymerase Chain Reaction
Polymorphic Information Content (Chỉ số thông tin đa hình của mồi)
Posterior probability (độ tin cậy)
Randomly Amplified Polymorphic DNA (Đa hình các đoạn DNA đƣợc

khuyếch đại ngẫu nhiên)
Ribosomal DNA
Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài đoạn cắt
giới hạn)
Sông Cầu
Single Nucleotide Polymorphism (đa hình nucleotide đơn)
Simple Sequence Repeats (Sự lặp lại trình tự đơn giản
Tris-Boric acid-EDTA
Vân Phong
Expressed sequence tags
N-methyl-D-aspartate

vii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1
Bảng 1.2
Bảng 2.1
Bảng 2.2
Bảng 2.3
Bảng 2.4
Bảng 3.1
Bảng 3.2
Bảng 3.3
Bảng 3.4

Các nhóm peptide độc của ốc cối, vùng đặc hiệu và biểu hiện ở các
nhóm ốc cối khác nhau
Sự khác nhau giữa mã di truyền trong nhân và ngoài ty thể

Trình từ các đoạn mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Các thông số của quá trình phân tích các trình tự và mô hình tiến hóa
của phân tích đa dạng loài ốc cối
Các thông số của quá trình phân tích các trình tự và mô hình tiến hóa
của phân tích di truyền quần thể Conus textile
Các trình tự gen 16S, CO1 mtDNA và chế độ ăn của các loài ốc cối
Các nhóm loài ốc cối trên cây phân loại từ các phƣơng pháp MP, ML
và BI.
Giá trị tƣơng đồng của các haplotype trình tự gen CO1 mtDNA của
Conus textile
Mã số các đoạn gen 16S và CO1 của các mẫu ốc cối đƣợc đăng ký
trên ngân hàng gen quốc tế Genbank

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1
Hình 1.2
Hình 1.3
Hình 1.4
Hình 2.1
Hình 3.1
Hình 3.2
Hình 3.3
Hình 3.4
Hình 3.5
Hình 3.6
Hình 3.7

Hình thái vỏ của ốc cối (Conus spp.)
Các dạng hình thái vỏ khác nhau của ốc cối (Conus spp.)

Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile
Cấu trúc trình tự DNA ribosome
Quy trình tách chiết ADN, khuếch đại gen và giải trình tự
Vị trí lấy mẫu mô tách chiết DNA ốc cối
Ảnh kết quả điện di DNA tổng số
Ảnh chụp kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 16S mtDNA (A)
và CO1 mt DNA (B) của một số mẫu ốc cối
Cây phát sinh loài dựa trên gen 16S mtDNA của ốc cối
Cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mtDNA của ốc cối
Cây phát sinh loài theo phƣơng pháp BI dựa trên gen CO1 mtDNA
của ốc cối
Cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mtDNA của ốc cối Conus textile

viii


MỞ ĐẦU
Đa dạng sinh học là một trong những yếu tố đóng vai trò quan trọng trong
cuộc sống của con ngƣời, là nguồn tài nguyên lớn của mỗi quốc gia. Ở một mức độ
nào đó nó duy trì sinh quyển, hay cung cấp nguyên vật liệu cơ bản cho các ngành
công – nông nghiệp và các nhu cầu thiết yếu khác của con ngƣời. Tuy nhiên, thực tế
hiện nay cho thấy sự gia tăng dân số và các hoạt động khai thác quá mức của con
ngƣời đã và đang làm cho nguồn tài nguyên thiên nhiên này dần cạn kiệt. Việc sử
dụng hợp lý và bảo tồn đa dạng sinh học trở nên bức thiết hơn bao giờ hết.
Ở nƣớc ta, ốc là một trong những nguồn lợi hải sản có mức độ phong phú về
thành phần loài, có giá trị thực phẩm và kinh tế cao. Song những năm gần đây, tình
trạng khai thác vô tội vạ cộng với sự ô nhiễm môi trƣờng đang làm cho nguồn lợi ốc
có chiều hƣớng suy giảm nghiêm trọng. Nhiều loài thân mềm có giá trị cao có nguy
cơ tuyệt chủng nhƣ ốc tù và, ốc đụn, ốc bàn tay, trai tai tƣợng, ốc vú nàng [96].
Nhiều loài ốc có nguy cơ tuyệt chủng hoặc đe dọa bị tuyệt chủng đã đƣợc liệt kê

trong danh mục những loài cần đƣợc bảo tồn [97].
Ốc cối là loại động vật thân mềm, có nọc độc, sống chủ yếu sống ở các vùng
biển nhiệt đới trong những rạn san hô. Chúng đƣợc biết đến là những loài có giá trị
kinh tế cao nhờ màu sắc và hoa văn đẹp mắt. Vỏ ốc cối đƣợc khai thác để làm đồ
trang sức, mỹ nghệ, đồ lƣu niệm đƣợc nhiều ngƣời ƣa chuộng.
Ở Việt Nam có hơn 76 loài ốc cối [45] và khoảng 500 - 700 loài đƣợc ghi nhận
trên toàn thế giới [67,22]. Ốc cối thƣờng đƣợc khai thác để làm hàng mỹ nghệ và
còn là nguồn thực phẩm cao cấp ở một số quốc gia nhƣ Vanuatu, New Caledonia,
Philippines. Gần đây, ốc cối còn đƣợc biết đến nhƣ là một loại dƣợc liệu quí để
chữa các cơn đau mãn tính, ung thƣ và nhiều bệnh khác [71,88,79]. Chính điều này
sẽ làm tăng mối đe dọa cho các loài ốc cối nếu con ngƣời tiếp tục khai thác quá mức
mà không có biện pháp bảo vệ.
Những nghiên cứu về ốc cối ở Việt Nam phần lớn vẫn đƣợc thực hiện ở mức
độ khảo sát, thu thập mẫu và tƣ liệu liên quan [45], phân loại, mô tả đặc điểm hình

1


thái [68]; xác định độc tính và kiểm chứng tính chất của một số độc tố [94]. Từ năm
2008-2010, Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và môi trƣờng, Đại học Nha
Trang đã tiến hành khảo sát, phân loại, mô tả đặc điểm hình thái, xây dựng môi
quan hệ tiến hóa và bƣớc đầu khảo sát độc tính của các loài ốc cối thu tại vùng biển
Nam Trung bộ [3]. Tuy nhiên, những nghiên cứu sâu về đặc điểm di truyền, mối
quan hệ tiến hóa vẫn còn rât hạn chế. Xuất phát từ những lý do trên, tôi đã tiến hành
thực hiện đề tài “Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ốc cối (Conus
spp.) và đa dạng di truyền của loài ốc cối Conus textile ở vùng biển Nam Trung
Bộ - Việt Nam”.
1. Mục đích nghiên cứu của đề tài
Xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ốc cối (Conus spp.) và nghiên cứu
đa dạng di truyền, cấu trúc quần thể của loài ốc cối Conus textile ở vùng biển Nam

Trung Bộ, làm cơ sở cho công tác bảo tồn các loài có nguy cơ tuyệt chủng.
2. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
 Ý nghĩa khoa học của đề tài
Ốc cối (Conus spp.) bao gồm khoảng 700 loài, phân bố rộng rãi ở vùng biển
nhiệt đới và vùng biển ấm [67]. Các loài thuộc họ ốc này có chứa tuyến độc tố có
thể sản xuất ra các dạng độc tố với sự đa dạng cao (ƣớc tính hơn 70.000 peptide độc
tố), tác động đến thụ thể thần kinh của nhiều loài động vật. Điều này giúp cho
chúng có khả năng săn mồi cao và phân bố rộng. Điều đó tạo điều kiện thuận lợi
cho biến dị loài và sự hình thành loài mới [17]
Hiện nay, phân loại ốc cối chủ yếu dựa vào kích thuớc vỏ, kiểu, hoa văn và
màu sắc hay vân trên vỏ, cụ thể là những đƣờng gờ hay phần lồi trên vỏ. Bên cạnh
đó, mô tả các dải răng kitin cũng đƣợc coi là một chỉ tiêu phân loại quan trọng. Tuy
nhiên, đặc điểm hình thái có thể chịu tác động của môi trƣờng, biến dị cá thể cùng
loài (Intraspecific) và khác loài (Interspecific), dễ gây nhầm lẫn trong quá trình
phân loại. Do đó, việc phân tích mối quan hệ tiến hóa dựa trên việc giải mã thông
tin di truyền là việc hết sức cần thiết.

2


 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Xây dựng cây phát sinh chủng loại của 26 loài ốc cối tìm thấy ở ven biển Nam
Trung Bộ - Việt Nam. Từ đó xác định đƣợc mối quan hệ loài và chế độ ăn của
chúng trong quá trình tiến hóa.
Nắm đƣợc các thông số về trình tự và mô hình tiến hóa của phân tích đa dạng các
loài ốc cối (Conus spp.) và di truyền quần thể của loài Conus textile ở vùng biển Nam
Trung Bộ - Việt Nam dựa trên đặc điểm di truyền gen 16S và CO1 của DNA ti thể.
Những dẫn liệu về nguồn lợi, đa dạng sinh học, cấu trúc quần thể và đa dạng di
truyền sẽ là những cơ sở khoa học và nguồn số liệu đầu vào cho việc tƣ vấn, đề xuất
các vấn đề về quản lý và sử dụng hợp lý nguồn lợi ốc cối ở vùng biển Việt Nam.

3


CHƢƠNG I – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI ỐC CỐI (CONUS SPP.) VÀ ĐỘC TỐ CỦA
CHÚNG
1.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ PHÂN BỐ CỦA ỐC CỐI
(CONUS SPP.)
Giống ốc cối thuộc họ Conidae là một trong những giống có số lƣợng loài lớn
nhất trong ngành động vật thân mềm. Cho đến nay, trên thế giới ngƣời ta đã xác
định có khoảng 500 - 700 loài. Ốc cối là loại động vật ăn thịt, săn mồi sống và có
nọc độc. Thức ăn chính của chúng là cá, giun biển và ĐVTM. Nhiều loài trong họ
Conidae có vỏ rất đẹp và là mặt hàng mỹ nghệ có giá trị. Ngoài ra một số loài trong
họ ốc này có tuyến độc rất nguy hiểm có thể gây chết ngƣời. Do vậy chúng đã thu
hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu động vật thân mềm từ hàng trăm năm nay.
1.1.1. Hệ thống phân loại ốc cối (Conus spp.)
Hệ thống phân loại của ốc cối đang đƣợc dùng phổ biến nhất hiện nay là [95]:
Ngành: Mollusca (Linnaeus, 1758)
Lớp: Gastropoda (Cuvier, 1795)
Bộ: Sorbeoconcha (Ponder & Lindberg, 1997)
Tổng họ: Conoidea (Fleming, 1822)
Họ: Conidae (Rafinesque, 1815)
Giống: Conus (Linnaeus, 1758)
1.1.2. Đặc điểm sinh thái và phân bố
Ốc cối phân bố khắp nơi trên thế giới, chúng thƣờng phân bố ở vùng vĩ độ
giữa 400 Bắc và 400 Nam, một số loài có thể phân bố ở vĩ độ trên 400 nhƣ ở Nam
Phi, Nam Australia, Nam Nhật Bản và biển Địa Trung Hải. Ngoài ra chúng còn
phân bố ở các vùng biển nhiệt đới và vùng biển ấm nhƣ Philippine, Indonesia,
Australia, Mexico, Florida, Hawaii... Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng cho thấy một

4


số loài có thể thích ứng với sự thay đổi của điều kiện môi trƣờng nhƣ ở vùng biển
nóng mũi Cape, Nam Phi hay vùng biển lạnh phía tây Califonia, Hoa Kỳ.
Trong khi đó, một số loài cận nhiệt đới đƣợc tìm thấy vùng triều dƣới độ sâu
10 – 30m và dƣới các tảng đá ở vùng triều nông [84]. Một số loài có thể sống ở các
rừng ngập mặn, hoặc sống ở vùng nƣớc sâu đến 400 m.
Tại Việt Nam, ốc cối phân bố chủ yếu ở các vùng ven biển thuộc khu vực Nam
Trung Bộ từ Đà Nẵng đến Kiên Giang và quanh các hải đảo. Hylleberg và Kilburm
(2003) trong khuôn khổ dự án Tropical Marine Molluscs Program đã công bố 76
loài ốc cối đƣợc tìm thấy ở vùng biển Việt Nam dựa trên việc thu thập mẫu, khảo
sát các bộ sự tập ở bảo tàng sinh vật biển Việt Nam [45].
1.1.3. Đặc điểm hình thái của ốc cối
 Đặc điểm hình thái ngoài
Ốc cối có hình dạng nhƣ trái tim với các kích cỡ khác nhau, loài có kích cỡ lớn
nhất có chiều cao vỏ đến 23cm [80]. Các loài ốc cối thƣờng có màu sắc sặc sỡ với
những hoa văn rất đẹp mắt. Vỏ thuôn dài, bằng đá vôi, chắc, nặng, xoắn theo chiều
kim đồng hồ. Đầu có 1 xúc tu (râu), toàn thân đƣợc bao bọc trong lớp vỏ dày vững
chắc. Ốc cối là động vật ăn thịt, chúng ăn mồi sống, chúng thƣờng đi săn mồi và ăn
các loại giun, ĐVTM, cá nhỏ và thậm trí cả một số loài ốc cối khác. Để phân loại ốc
cối ngƣời ta thƣờng dựa vào màu sắc hoa văn trên vỏ, các dạng khác nhau của vỏ và
các chỉ tiêu phân loại về hình thái đƣợc mô tả ở hình 1.1.

5


Hình 1.1: Hình thái vỏ của ốc cối (Conus spp.) [92]
Bên cạnh đó việc đo đạc các thông số hình thái nhƣ chiều cao tháp vỏ, chiều

cao vỏ, chiều cao tầng thân và chiều rộng cũng góp phần quan trọng trong việc định
danh các loài ốc cối. Vỏ của ốc cối thƣờng có 3 dạng hình thái khác nhau: Hình nón,
hình nón rộng và hình nón hẹp (Hình 1.2).
Hình nón rộng: Phần chóp thấp
hay bằng phẳng (C. betulinus)
C.
ebraeus

C.
betulinus

Hình nón: Phần chóp không
cao và không thấp quá (C.
ebraeus)

Hình nón hẹp: Phần chóp
cao so với cơ thể (C.
lynceus)

Hình 1.2: Các dạng hình thái vỏ khác nhau của ốc cối (Conus spp.)
)

 Đặc điểm cấu tạo trong
Vòi hút (Proboscis): là vũ khí săn mồi của ốc cối. Độc tố đƣợc tiêm vào con mồi
bằng các răng chứa trong túi răng kitin. Vòi hút có thể duỗi dài ra gấp 2 lần cơ thể ốc cối.
Súc tu (Siphon): siphon của ốc có chức năng nhƣ mũi. Đó là một túi có thể
duỗi dài ra và phát hiện ra con mồi trong môi trƣờng nƣớc xung quanh. Nó cũng
góp phần đƣa nƣớc đến mang giúp cho quá trình hô hấp.
Chân: Chân có cấu tạo bằng cơ giúp ốc cối di chuyển trên các bề mặt.
Miệng: Ốc cối có miệng có thể mở rộng ra phía trƣớc để nuốt con mồi. Hệ

thống cơ có thể co duỗi để đƣa miệng vào trong vỏ.
Mắt: Ốc cối có 2 mắt, nằm ở 2 bên miệng. Hiện tại vẫn chƣa biết đƣợc về khả
năng nhìn của ốc cối hay câu hỏi đặt ra là liệu chúng có đủ ánh sáng khi sống ở các
vùng biển sâu hay không.

6


1.1.4. Chế độ ăn và phƣơng thức săn mồi
Ốc cối là động vật ăn thịt (canivorous), có tính chuyên hóa cao, với thức ăn chủ
yếu là các loài giun biển (70%), cá nhỏ (15%), ĐVTM (15%), và ngay cả các loài ốc
cối khác [71,88]. Chúng có một cơ quan bắt mồi chuyên biệt là dải răng kitin (túi
răng kitin). Răng kitin của ốc cối hõm sâu và có gai, giống nhƣ những cây lao thu
nhỏ. Ốc cối chỉ sử dụng răng kitin một lần, một khi răng kitin đƣợc sử dụng để tiêm
nọc độc vào con mồi, nó sẽ đƣợc loại bỏ và ốc cối phải tái tạo lại răng mới. [93].
Khi ốc cối nhận ra đối tƣợng, vòi của chúng sẽ kéo dài ra, nhờ một lực co cơ
những mũi tên từ ống vòi đƣợc phóng rất nhanh kèm theo một lƣợng lớn độc tố
đƣợc phóng thích và làm tê liệt nhanh chóng con mồi. Sự tấn công này chỉ xảy ra
trong khoảng một phần nghìn giây. Chất độc sẽ làm tê liệt con mồi và gây tử vong
cho đối tƣợng trong thời gian rất ngắn. Độc tố ốc cối chứa đựng hàng trăm các hợp
chất khác nhau và thể hiện sự khác biệt giữa các loài khác nhau. Các nhà khoa học
cũng chỉ ra rằng, độc tố ốc cối cũng thay đổi tùy theo khẩu phần ăn, tùy theo mùa,
và tùy theo từng vùng địa lí khác nhau [91].
1.1.5. Đặc điểm sinh sản của ốc cối
Sinh sản của ốc cối vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu rộng rãi, nhƣng hầu hết các loài
này đều có sự phân chia giới tính và thụ tinh trong. Trứng đƣợc đẻ một lần trong
năm [54]. Mỗi trứng đƣợc bao bọc bởi nhiều nang trứng, mỗi nang trứng lại chứa
rất nhiều trứng khác nhau.
Ấu trùng và con non của ốc cối thƣờng có hai hình thức chính: Dạng ấu trùng
Veliger (ấu trùng bơi lội tự do), và dạng con non Juvenile (có hình dáng gần giống

cá thể trƣởng thành). Thời kì đầu của quá trình phát triển thƣờng bị hạn chế, bởi số
lƣợng ấu trùng bị hao hụt rất nhiều. Do đó, trong quá trình ƣơng nuôi ốc cối thƣờng
gặp nhiều khó khăn. Thời kì ấu trùng sống ngoài khơi thƣờng kéo dài khoảng từ 1
đến 50 ngày. Vòng đời của ốc cối kéo dài khoảng 10 – 15 năm trong tự nhiên, cũng
nhƣ trong điều kiện nuôi nhốt.

7


1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐỘC TỐ CỦA ỐC CỐI (CONUS SPP.)
1.2.1. Giới thiệu chung
Đặc tính của ốc là loài di chuyển chậm nên dễ bị các loài động vật ăn thịt
khác tấn công. Do đó, muốn tồn tại và phát triển cơ thể chúng phải có cấu tạo đặc
biệt để thích nghi với điều kiện môi trƣờng. Cơ quan đó chính là tuyến độc. Tuyến
độc tiết ra nọc độc giúp chúng bắt những con mồi xa dễ dàng bằng cách tấn công
làm tê liệt con mồi, mặt khác tuyến độc còn là vũ khí giúp chúng tự vệ cũng nhƣ
tiêu diệt kẻ thù.
Ốc cối săn mồi bằng một hệ thống nọc độc phát triển cao có thể làm tê liệt con
mồi trong vài giây, nhờ vậy đảm bảo sự bắt mồi và tránh để mồi lộ ra lâu có thể bị
các con cá lớn hơn giành mất. Mỗi loài ốc cối sản sinh ra một loại độc tố riêng, đó là
một hỗn hợp của các peptide ngắn, có liên kết disunfua, có khả năng làm bất động
con mồi nhanh. Độc tố đó tùy thuộc vào loài ốc săn mồi là cá (piscivorus species),
ĐVTM (molluscivorus species) hay giun biển (vermivorus species) [56].
Độc tố không chỉ là một vũ khí để săn mồi mà còn đƣợc sử dụng để tự bảo vệ,
canh tranh và cho những hoạt động sinh học khác, vì vậy sự phân hóa của độc tố ốc
cối là điểu tất nhiên. Mạng lƣới phức tạp của các tƣơng tác sinh học trong khu hệ sinh
học biển đa dạng nhƣ vậy tạo cơ hội cho mỗi loài ốc cối tích lũy thành phần độc tố
đặc trƣng, khác biệt với các loài khác trong quá trình tiến hóa của chúng [71].
1.2.2. Ứng dụng y học của độc tố ốc cối
Trong vòng 20 năm qua, đã có hơn 2.600 nghiên cứu đƣợc tiến hành nhằm đánh

giá một cách chính xác về đóng góp quan trọng của các độc tố chiết xuất từ loài ốc cối
đối với ngành dƣợc và sinh học tế bào. Trong khi nghiên cứu chất độc có thể gây
chết ngƣời của một loài ốc biển, các nhà khoa học đã phát hiện chất này có tác
dụng giảm đau. Hiện nay có trên 1000 chuỗi peptid đƣợc định danh và xác định
đƣợc tính chất ức chế các kênh ion của chúng. So với nguồn từ trên 50.000 cho đến
100.000 loại peptide trong độc tố ốc cối, đây mới chỉ là một con số nhỏ bé.
Các ứng dụng độc tố ốc cối trong sinh học thần kinh và bào chế thuốc đang
gia tăng nhanh chóng, nhƣ sản xuất thuốc hỗ trợ trong gây mê, thuốc giảm đau,
8


điều trị một số bệnh (đau mãn tính, động kinh, tim mạch, rối loạn tâm thần, ung
thƣ, đột quỵ) [64].
Hiện nay đã phát hiện ra các kênh nhạy cảm với điện thế đƣợc xếp thành sáu
nhóm theo các tính chất điện sinh lý và tính chất dƣợc học, đƣợc ký hiệu là L-, N-,
P-, Q-, T-, và R- (type). Kênh canxi loại N bao gồm 5 tiểu đơn vị, trong đó, tiểu đơn
vị α2-δ có ái lực mạnh với các độc tố, ví dụ ω-conotoxin MVIIA. Độc tố ωconotoxin MVIIA đi vào cơ thể sẽ liên kết với tiểu đơn vị α2-δ, làm thay đổi cấu
hình của tiểu đơn vị này, dẫn tới kìm hãm sự vận chuyển ion canxi qua màng tế bào,
sự truyền tín hiệu của các nơron thần kinh bị khóa. Khả năng ngăn chặn này rất
chính xác, làm cho tín hiệu đau đớn không tới não đƣợc mà thần kinh vẫn làm việc
bình thƣờng [8,42,74]. Do vậy, các độc tố ốc cối đƣợc sử dụng trong điều trị các
cơn đau mạn tính, các bệnh thần kinh nhƣ Parkinson, bệnh thuộc hệ thần kinh tự
động, ung thƣ, tim mạch và nhiều bệnh khác.
Loại peptide kỵ nƣớc TxVIA tách chiết từ ốc Conus textile là loại δ-conotoxin
đầu tiên đƣợc phân lập do tác dụng độc tính lạ thƣờng của nó khi tiêm vào ốc và tôm
hùm [43]. Tác dụng của nó là làm chậm sự bất hoạt kênh natri của neuron trong các
loài ĐVTM. δ-conotoxin EvIA có tác dụng chọn lọc đối với các kênh Nav 1.2, 1.3 và
1.6 và điều này làm cho nó có tác dụng với các neuron của động vật có vú [7].
Contulakin-G có khả năng yếu hơn 100 lần so với neurotensin đối với thụ thể
neurotensin I, nhƣng lại có khả năng làm giảm đau nhiều hơn khoảng 100 lần. Do

khả năng của nó có thể giảm đau mạnh mẽ và trong một dải rộng contulakin-G
(CGX-1160) đã đƣợc áp dụng rất sớm bởi công ty Cognetix Inc để giảm đau.
Cho đến nay, có 6 peptide độc tố ốc cối đã đƣợc thử nghiệm lâm sàng, trong
đó, Prialt (tên thƣờng gọi là Ziconitide), ω-conotoxin MVIIA từ Conus magus, đã
đƣợc cấp phép sử dụng trong điều trị các cơn đau bởi Cục quản lý thực phẩm và
dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) vào tháng 12 năm 2004. Ngoài ra, 2 độc tố khác cũng
đang đƣợc thử nghiệm cận lâm sàng. Một loại peptide khác, cũng hoạt động theo cơ
chế nhƣ trên, là ω-conotoxin GVIA từ Conus geographus cũng đƣợc ứng dụng rộng

9


rãi trong khoa học thần kinh, với khoảng hơn 2000 nghiên cứu trên giấy tờ, cũng
nhƣ trong nghiên cứu dƣợc lý học [88].
Một phần lớn các conopeptide đầu tiên đƣợc nghiên cứu ứng dụng đạt đến mức
thử nghiệm lâm sàng; trong số 30 peptide đầu tiên đƣợc tinh sạch từ tuyến độc tố ốc
cối, và ít nhất 10% đã đạt đến Pha I trong thí nghiệm lâm sàng ở ngƣời. Ứng dụng
chủ yếu của các peptide ốc cối là thuốc giảm đau (Bảng 1.1)
Bảng 1.1. Các nhóm peptide dộc của ốc cối, vùng đặc hiệu và biểu hiện ở các
nhóm ốc cối khác nhau [88]
Phân tử đích

Kênh canxi loại
N (Cav 2.2)
Thụ thể
neurotensin
Kênh vận chuyển
norepinephrine
Thụ thể nicotinic
Thụ thể NMDA

(N-Methyl-Daspartate)
Kênh K+
Kênh Na+

Peptide ốc cối

Ứng dụng

Ω-MVIIA (Prialt;
zicontide)
Ω-CVID (AM336)
Contulakin-G (CGX1160)
χ-MrIA (derivative)
(Xen-2174)
α-Vc1.1 (ACV-1)

Giảm đau
Giảm đau

Giai đoạn tiến
hành
Chấp nhận
FDA 12/04;
Pha 1

Nguồn
[66,83]

Giảm đau

Pha 1

[5]

Giảm đau

Pha 1

[69]

Giảm đau

Pha 1

[81]

Conantokin-G (CGX1007)

Động kinh;
giảm đau

Pha 1

[62]

κ-PVIIA (CGX-1051)

Nhồi máu
cơ tim

µO-MrVIB (CGX-1002)

Giảm đau

Đang thử
nghiệm
Đang thử
nghiệm

[60]
[16]

2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DI TRUYỀN ỐC CỐI (CONUS SPP.)
2.1. CÁC CHỈ THỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN
Đa dạng di truyền là kết quả của quá trình biến đổi trong vật chất di truyền
sinh vật (sự thay đổi nucleotide, gen, nhiễm sắc thể hoặc toàn bộ hệ gen sinh vật)
theo các con đƣờng tự nhiên (lai, phân ly, tái tổ hợp, đột biến tự nhiên…) hay tác
động của con ngƣời (lai – chọn tạo giống, gây đột biến, chuyển gen…). Tất cả các
quá trình này tác tạo nên sự biến đổi gen và tấn số allen, dẫn đến những thay đổi
trong kiểu hình của sinh vật.

10


Những thông tin về đa dạng di truyền và mối quan hệ giữa các nguồn vật liệu
có vai trò, ý nghĩa hết sức quan trọng và là sức mạnh của công tác cải tạo giống vật
nuôi. Từ những kết quả đánh giá đa dạng di truyền, các nhà khoa học có thể quy
hoạch và bảo tồn các nguồn gen quý, duy trì tính đa dạng sinh học hoặc khai thác,
hỗ trợ trong các chƣơng trình chọn tạo giống thôn qua chọn lựa các cặp bố mẹ nhằm
thu đƣợc ƣu thế lai cao nhất [10].

Việc nghiên cứu đa dạng di truyền đã đƣợc thực hiện từ khá lâu với nhiều
phƣơng pháp tiếp cận khác nhau, thông qua các đặc điểm kiểu hình (chỉ thị hình
thái), thành phần protein và hoạt chất (chỉ thị hóa sinh) hay sự khác biệt trong DNA
(chỉ thị DNA). Mỗi loại chỉ thị đều có những ƣu – nhƣợc điểm cũng nhƣ khả năng
đánh giá mức độ đa dạng di truyền khác nhau. Trong đó chỉ thị hình thái đƣợc sử
dụng sớm nhất và là cơ sở ban đầu trong đánh giá phân loại động vật, còn chỉ thị
DNA hiện nay đƣợc sử dụng rộng rãi trong đánh giá đa dạng di truyền, là công cụ
hữu hiệu trong công tác chọn tạo giốn vật nuôi.
2.1.1. Chỉ thị hình thái
Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị hình thái là phƣơng pháp đánh
giá thông qua đặc điểm về hình thái (hình dạng, kích thƣớc, đặc điểm các bộ
phận…). Với ƣu điểm là dễ dàng tiếp cận nghiên cứu, mà không đòi hỏi thiết bị đặc
biệt đắt tiền cũng nhƣ quy trình thực hiện phức tạp. Hiện nay, phƣơng pháp này vẫn
đƣợc sử dụng phổ biến và khá hiệu quả trên các đối tƣợng vật nuôi nói chung và các
đối tƣợng thủy hải sản nói riêng, để giúp các nhà nghiên cứu nhận biết và phân biệt
các giống khác nhau bằng mắt thƣờng một cách nhanh chóng. Tuy nhiên, việc sử
dụng các chỉ thị hình thái trong phân tích đa dạng di truyền có những hạn chế: (1)
Số lƣợng các chỉ tiêu hình thái có hạn lại chịu tác động rất lớn của môi trƣờng cũng
nhƣ phụ thuộc vào giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể. (2) Việc đánh
giá mang tính chất thống kê nên cần phải thực hiện với số lƣợng lớn để đảm bảo
tính chính xác. (3) Có nhiều tính trạng do đa gen quy định mà không phải toàn bộ
các gen đều biểu hiện ra kiểu hình để có thể đánh giá đƣợc [53].

11


2.1.2. Chỉ thị sinh hóa
Chỉ thị sinh hóa đƣợc phát hiện nhờ phƣơng pháp isozyme, dựa trên cơ sở gen
quy định sinh tổng hợp protein. Isozyme là các enzyme có trình tự amino acid khác
nhau nhƣng cùng xúc tác cho một kiểu phản ứng hóa học. Về mặt di truyền có thể

chia isozyme thành hai dạng là isozyme đơn gen (các isozyme này chịu sự kiểm soát
của một gen) và isozyme đa gen (các isozyme đƣợc mã hóa bởi hai hay nhiều gen).
Do số lƣợng chỉ thị isozyme không nhiều và sự biểu hiện của chúng phụ thuộc vào
giai đoạn sinh trƣởng và phát triển của cá thể nên các chỉ thị isozyme đƣợc ứng dụng
tƣơng đối hạn chế trong đánh giá đa dạng di truyền và phân nhóm ƣu thế lai.
2.1.3. Các chỉ thị phân tử
Năm 1988, kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ra đời đã mở đầu cho
cuộc cách mạng của hàng loạt DNA marker mới nhanh chóng thay thế isozyme.
DNA marker rất phong phú do sự đa dạng của DNA và chúng không lệ thuộc vào
yếu tố môi trƣờng. Trong chọn lọc nhờ DNA marker, các gen mục tiêu đƣợc phát
hiện nhờ vào các marker mà không cần sự biểu hiện thành kiểu hình của gen đó.
Tuy nhiên các kỹ thuật DNA lại rất đắt tiền, tốn kém đó là lý do khả năng ứng dụng
vào nghiên cứu di truyền quần thể còn hạn chế. Thêm vào đó ở các nghiên cứu quần
thể, sự khác biệt gen giữa hai quần thể đòi hỏi phải phân tích một số lƣợng lớn các
cá thể (trên 30 cá thể) để cho kết quả tin cậy và chính xác. Vì vậy các kỹ thuật DNA
vẫn không thể thay thế hoàn toàn isozyme trong các nghiên cứu quần thể.
Dựa trên kiểu hình có thể phân loại DNA marker thành 2 loại: (1) Marker
đồng trội: là những marker có thể phân biệt đƣợc cá thể đồng hợp tử và cá thể dị
hợp tử, đó là các marker isozyme, microsatellite, PCR nhân RFLP. Trong trƣờng
hợp này tần số alen có thể đƣợc tính trực tiếp từ dữ liệu kiểu gen. (2) Marker trội:
RAPD marker không thể phân biệt những cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử.
Các ứng dụng về chỉ thị DNA đã cho phép nhanh chóng điều tra sự đa dạng di
truyền trong vật nuôi và chọn giống thủy sản, xác định cặp bố mẹ, xác định chủng
loài, xây dựng chi tiết bản đồ liên kết gene cho các loài thủy sản. Các nghiên cứu sử

12


dụng chỉ thị di truyền sẽ gia tăng tính chắc chắn khi xác định những gen của mỗi
loci có tham gia vào di truyền số lƣợng giúp hỗ trợ quá trình chọn giống.

2.1.3.1. Chỉ thị DNA ti thể
Di truyền ty thể là di truyền theo dòng mẹ. Trong thực tế, có đến 99% ty thể
của tế bào con thừa hƣởng từ mẹ do bào quan này nằm trong tế bào chất của tế bào
trứng. So với trứng, tinh trùng có một số lƣợng các ty thể chỉ bằng 0,1% - 1,5%, số
lƣợng này đảm bảo năng lƣợng giúp tinh trùng vận động trong quá trình thụ tinh.
Khi tham gia thụ tinh, ty thể của tinh trùng bị loại bỏ nhờ cơ chế phân giải protein
phụ thuộc ubiquitin. Đôi khi cơ chế này diễn ra không hoàn toàn dẫn đến sự có mặt
của hai dòng ty thể của cả bố lẫn mẹ trong cơ thể con, hiện tƣợng này đƣợc gọi là
dị tế bào chất (heteroplasmy).
DNA ty thể không có intron, trong phân tử không có sự tái tổ hợp. Tốc độ biến
đổi của DNA ty thể nhanh hơn nhiều so với DNA trong nhân, có thể là do ty thể
thiếu hụt các cơ chế sửa chữa DNA. Tốc độ đột biến cao dẫn đến nhiều biến dị
trong ty thể, không chỉ giữa các loài mà còn xảy ra ngay cả trong cùng một loài.
Số lƣợng ty thể có biến đổi về mặt di truyền trong tế bào tùy thuộc không
những vào số ty thể nó đƣợc thừa hƣởng từ mẹ mà còn vào các yếu tố gây đột biến
trong môi trƣờng. Những biến dị ở genome ngoài nhân không giống nhau giữa các
ty thể trong cùng một tế bào và giữa các tế bào khác nhau. Đây là một trong số các
ví dụ cho thấy rằng có rất nhiều biến dị trong mã di truyền của ty thể nhƣng không
có hại đối với cơ thể mang đột biến.
Trong hầu hết các trƣờng hợp, mã di truyền là phổ biến. Tuy thế, vẫn có một số
ngoại lệ trong di truyền học ty thể. Dƣới đây là một số trƣờng hợp mà ngƣời ta đã biết.
Bảng 1.2: Sự khác nhau giữa mã di truyền trong nhân và ngoài ty thể
Bộ ba

Mã của gen nhân

Mã của gen ty thể

AUA, AUU

Ile

Met

UGA

Stop

Trp

AGA, AGG

Arg

Stop

13


Hầu nhƣ toàn bộ các phân tử mtDNA đƣợc phiên mã, ngoại trừ khu vực kiểm
soát khoảng 1KB (D-loop), là nơi mà quá trình sao chép và phiên mã của phân tử
đƣợc bắt đầu [58].
Vùng điều khiển của DNA ty thể có tốc độ tiến hóa nhanh gấp 5-10 lần với các
gen ty thể khác. Trình tự nuleotide của vùng D-loop là một công cụ rất hữu hiệu để
đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài và giữa các quần thể
cùng loài. Chính vì thế mà các gen trong genome ty thể và vùng D-loop đóng một
vai trò vô cùng quan trọng trong các nghiên cứu thuộc lĩnh vực phân loại học phân
tử. Nhƣ vậy, DNA ty thể có thể đƣợc coi là một công cụ không thể bỏ qua khi tìm
hiểu về mối quan hệ phát sinh chủng loại hay sự tiến hóa của các quần thể.
Chỉ thị DNA ti thể khá phổ biến trong di truyền học thủy sản, một trong những

lý do quan trọng khi sử dụng chỉ thị này là để xác định nguồn gốc đàn bố mẹ vật
nuôi [9]. Về mặt kỹ thuật, chỉ thị mtDNA tƣơng tự với chỉ thị RFLP, tuy nhiên chỉ
thị mtDNA lấy các gen đích là DNA ti thể, khác biệt với việc sử dụng DNA nhân
trong RFLP [19]. DNA ti thể có số lƣợng lớn các allen trên một loci, nhƣng giá trị
PIC của các đoạn gen chỉ thị trên phân tử mtDNA cao hơn khi dùng chỉ thị
allozyme và thấp hơn khi sử dụng các chỉ thị là DNA nhân nhƣ RAPDs,
microsatellites, AFLPs, and SNPs.
2.1.3.2. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
RFLP đƣợc định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn,
biểu hiện sự khác nhau về kích thƣớc các phân đoạn đƣợc tạo ra khi cắt DNA bằng
các enzyme cắt giới hạn khi có sự thay đổi trình tự trên DNA hệ gen hoặc trong các
bào quan khác.
Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt hạn chế
(Restriction enzyme - RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA hệ gen.
DNA hệ gen sẽ đƣợc cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy điện di qua gel
agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA (đƣợc đánh dấu phóng xạ)
liên kết với một locus đặc biệt. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những
phân đoạn cắt khác nhau.

14


RFLP có ƣu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt đƣợc cá thể đồng
hợp và dị hợp. Do kích thƣớc DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lƣợng
marker tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu. Tuy nhiên do qui trình thực
hiện phức tạp, nguy hiểm đối với sức khoẻ ngƣời nghiên cứu (sử dụng phóng xạ
đánh dấu), DNA yêu cầu có chất lƣợng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật
này. Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn. Một
cặp mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát, sau
đó đoạn DNA đƣợc khuếch đại đƣợc cắt bằng các RE, điện di và phân tích trên gel

nhuộm ethidium bromide hoặc bạc. PCR-RFLP bỏ qua bƣớc lai nên giá thành rẻ
hơn và ít nguy hiểm hơn phƣơng pháp RFLP. [58]
2.1.3.3. Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)
RAPD đƣợc định nghĩa là sự đa hình các đoạn DNA đƣợc khuếch đại ngẫu
nhiên. PCR RAPD thực hiện dựa trên cơ sở sự bắt cặp ngẫu nhiên của các mồi đơn
ngắn (10 nucleotide) với mạch khuôn. Các đoạn mồi oligonucleotide nếu bắt cặp
ngẫu nhiên với cả hai mạch đối diện của mạch khuôn DNA trong khoảng cách có
thể khuếch đại đƣợc (dƣới 3000bp) sẽ cho ra những đoạn DNA có kích thƣớc khác
nhau sau khi khuếch đại. Sự có mặt của các sản phẩm DNA khác nhau chứng tỏ đã
có một sự tƣơng đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA bộ gen và mồi. Các mồi
dùng trong RAPD thƣờng ngắn vì vậy dễ dàng tìm đƣợc các đoạn tƣơng đồng trên
mạch đơn DNA bộ gen. Do đó tính đa dạng thu đƣợc nhờ RAPD là đáng tin cậy, vì
khi có sự thay đổi một base nitơ nào đó thì nó sẽ ngăn cản việc tiếp hợp giữa mồi và
DNA mạch khuôn. Sự mất đoạn nhiễm sắc thể hoặc sự thêm bớt điểm gắn mồi cũng
nhƣ sự xen vào của một gen nào đó sẽ làm thay đổi kích thƣớc đoạn DNA đƣợc
khuếch đại. Nguyên tắc phản ứng RAPD cũng nhƣ nguyên tắc phản ứng PCR thông
thƣờng. Tuy nhiên, vì sử dụng mồi ngẫu nhiên nên nhiệt độ bắt cặp của mồi thấp để
tạo điều kiện bắt cặp không nghiêm ngặt. Nhiệt độ bắt cặp của phản ứng là 30oC36oC. Chính vì yếu tố đặc hiệu thấp nên kết quả RAPD thƣờng có độ lặp lại không
cao và khó tối ƣu phản ứng. Đây chính là trở ngại lớn nhất của RAPD vì kết quả
phụ thuộc rất nhiều yếu tố nhƣ thành phần phản ứng PCR (đặc biệt là thành phần

15


Mg2+ và chất lƣợng DNA bản mẫu), các thiết bị cũng nhƣ thao tác thí nghiệm.
Ngoài ra RAPD là một marker trội do đó những gen điều khiển tính trạng lặn sẽ khó
tìm thấy sự đa hình trong điện di. [58]
2.1.3.4. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
AFLP đƣợc định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết
hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gen, sử

dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có
thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng
gen. Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi
của các base trong vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt.
Thông thƣờng, RE sử dụng trong AFLP là một cặp enzyme, một enzyme cắt thƣờng
xuyên (tạo ra những trình tự nhỏ) và một enzyme cắt không thƣờng xuyên (nhằm
hạn chế số lƣợng các đoạn cắt). Cặp enzyme thƣờng đƣợc dùng nhất là EcoRI MseI. Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ
đƣợc gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase. Đoạn adaptor gồm 2
phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. Mồi của phản
ứng PCR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc
khoảng vài nucleotide. Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và
trình tự nucleotide chọn lọc mới đƣợc khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm
giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích. [58]
AFLP nhanh, đơn giản không phức tạp nhƣ RFLP nhƣng vẫn khảo sát đƣợc
toàn bộ gen. Kỹ thuật này đòi hỏi ít lƣợng DNA ban đầu, không cần biết trƣớc trình
tự đích và độ lặp lại phản ứng cao, các mồi sử dụng không cần đặc hiệu loài (các
mồi thƣơng mại có thể dùng cho hầu hết các loài). Tuy nhiên AFLP là một marker
trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp.
2.1.3.5. Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats hay Microsatellite)
Rải rác ở những vị trí khác nhau trên bộ gen eukaryote là những vùng có tính
biến dị cao. Những vùng này có chứa các trình tự DNA gọi là VNTR (variable
number tandem repeat) còn gọi là các tiểu vệ tinh. Các VNTR này đặc trƣng bởi số
16


lần lặp lại của trình tự lõi (đơn vị trình tự) DNA. Microsatellite là các VNTR có số
đơn vị trình tự lõi từ 1 – 6 bp, số lần lặp lại của microsatellite khoảng 70 lần. Do số
lần lặp lại của mỗi microsatellite là khác nhau ở mỗi cá thể nên tính đa hình tạo ra
khi sử dụng phƣơng pháp này là rất cao. Dựa trên trình tự DNA microsatellite đƣợc
bảo tồn ở các cá thể cùng loài cho phép chúng ta thiết kế mồi để khuếch đại trình tự

lặp lại trong toàn bộ kiểu gen, trình tự mồi sử dụng trình tự đặc hiệu ở hai đầu locus
microsatellite. Kết quả tạo ra các đoạn DNA có chiều dài khác nhau phân tách trên
gel polyacrylamide. Xác định trình tự đặc hiệu hai đầu locus microsatellite là bƣớc
đầu tiên rất quan trọng trong việc phân tích kỹ thuật này. Do đó, việc sử dụng
microsatellite gặp phải nhƣợc điểm lớn là phải xác định trình tự đặc hiệu cho mỗi
locus đa hình. Ƣu điểm lớn nhất của microsatellite là có tính đa hình cao và là một
marker đồng trội. [58]
2.1.3.6. Chỉ thị SNP (Single nucleotide polymorphisms)
Chỉ thị SNP dựa trên so sánh trình tự của từng gốc nucleotide giữa các cá thể
tại vị trí xác định, chính vì thế phƣơng pháp này rất chính xác và số lƣợng đa hình
cực kỳ nhiều. Theo ƣớc tính gần đây nhất, khoảng 100 – 300 bp của hệ gen có một
SNP (cũng có ƣớc tính SNP xảy ra một lần/1000 bp). Do đó, SNP là chỉ thị phân tử
phong phú nhất đƣợc biết đến cho đến nay [34].
Nhƣợc điểm chính của phƣơng pháp này là chi phí cho phát triển tốn kém, cần
phải sử dụng kỹ thuật xác định trình tự DNA nên chỉ thực hiện đƣợc ở các phòng thí
nghiệm có đủ trang thiết bị [23].
2.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN ỐC CỐI
2.2.1. Nghiên cứu cấu trúc hệ gen của ốc cối
 Cấu trúc hệ gen ti thể (Mitochondrial DNA – mtDNA) của Conus textile
Bandyopadhyay và cs (2008) tiến hành phân tích trình tự gen DNA ti thể của
ốc cối cho thấy thứ tự gen (gene orders) là tƣơng tự giữa Conus textile và
Lophiotoma cerithiformis (loài khác thuộc Conoidean) và Neogastropod Ilyanassa
obsoleta (không thuộc tổng họ Conoidea). Tuy nhiên, đoạn chèn (intergenic) giữa

17