Nghiên cứu các đặc tính của gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân da cá da trơn thành acid amin làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
-----------------------------------------

ĐÀO VĂN NGUYÊN

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH CỦA GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ
ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN DA CÁ DA TRƠN THÀNH
ACID AMIN LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC PHẨM
CHỨC NĂNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
-----------------------------------------

ĐÀO VĂN NGUYÊN

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH CỦA GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ
ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN DA CÁ DA TRƠN THÀNH
ACID AMIN LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC PHẨM
CHỨC NĂNG

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. TS. PHẠM THỊ TÂM
2. TS. ĐẶNG MINH HIẾU

Hà Nội - 2015
MỤC LỤC


MỤC LỤC
MỤC LỤC ..................................................................................................................2
MỤC LỤC ..................................................................................................................3
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................7
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................8
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI......................................................................................13
2. MỤC TIÊU .........................................................................................................14
2.1.

Mục tiêu chung................................................................................................14

2.2.

Mục tiêu cụ thể ................................................................................................14

3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..............................................................................14
3.1.1.

Nghiên cứu các đặc tính vật lý, hóa học của gelatinase tái tổ hợp ..............14

3.1.2. Nghiên cứu các điều kiện thủy phân da cá da trơn thành acid amin bằng
gelatinase tái tổ hợp...................................................................................................15
3.1.3. Nghiên cứu đánh giá các chỉ tiêu về an toàn thực phẩm của acid amin thủy

phân ( vi sinh vật, độc tính cấp tính, độc tính bán trƣờng diễn ) ..............................15
4. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................................15
5. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ...................................................15
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................16
I. Tổng quan về gelatin và gelatinase ........................................................................16
I.1. Gelatin .................................................................................................................16
I.2. Gelatinase............................................................................................................18
I.3. Một số loài vi khuẩn sử dụng để tách chiết gelatinase .......................................19
I.3.1. Vi khuẩn Pseudomonas ....................................................................................................... 19
I.3.2. Vi khuẩn Aeromonas hydrophila ......................................................................................... 21

I.4. Tình hình thực tế về nuôi trồng cá da trơn và chế biến các phụ phẩm của cá da
trơn ở Việt Nam ........................................................................................................23
I.5. Thành phần thủy phân từ da cá ...........................................................................25
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................28
II.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...............................................................................28
II.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................................................................28

3


II.2.1. Vật liệu hóa chất .............................................................................................28
II.2.2. Nghiên cứu đặc tính vật lý, hóa học của gelatinase tái tổ hợp ......................29
II.2.2.1. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của các ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính
của gelatinase tái tổ hợp ................................................................................................................ 30
II.2.2.2. Phƣơng pháp xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính và độ bền nhiệt của
gelatinase tái tổ hợp ...................................................................................................................... 30
II.2.2.3. Phƣơng pháp xác định pH thích hợp cho hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp .................. 31
II.2.2.4. Phƣơng pháp đánh giá ảnh hƣởng của chất tẩy rửa đến hoạt tính của gelatinase tái
tổ hợp ............................................................................................................................................ 31

II.2.2.5. Phƣơng pháp đánh giá ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính của
gelatinase tái tổ hợp ...................................................................................................................... 31

II.2.3. Nghiên cứu các điều kiện thủy phân da cá da trơn thành acid amin bằng
gelatinase tái tổ hợp. .................................................................................................32
II.2.3.1. Phương pháp tiền thủy phân hóa học da cá da trơn ....................................................... 32
II.2.3.2. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đối với khả năng thủy
phân của enzyme gelatinase tái tổ hợp đối với mẫu da cá đã xử lý qua dung dịch kiềm
NaOH 2M...................................................................................................................................... 34
II.2.3.3. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của pH đối với khả năng thủy phân của enzyme
gelatinase tái tổ hợp đối với mẫu da cá tra/ ba sa đã qua tiền xử lý bằng dung dịch kiềm
NaOH 2M...................................................................................................................................... 35
II.2.3.4. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu quả thủy phân ........................ 35
II.2.3.5. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của thời gian đến hiệu quả thủy phân ....................... 36

II.3. Nghiên cứu đánh giá các chỉ tiêu về an toàn thực phẩm của acid amin thủy
phân. ..........................................................................................................................36
II.3.1. Phƣơng pháp kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật................................................36
II.3.1.1. Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí: TCVN 4884:2005 (ISO 4833:2003) .................. 36
II.3.1.2. Xác định Salmonella sp: TCVN 4829:2005 (ISO 06579:2002)...................................... 36
II.3.1.3. Xác định Staphylococcus sp: TCVN 4830-1:2005 (ISO 6888-1:1999, With Amd.
:2003) ............................................................................................................................................ 36

II.3.2. Phƣơng pháp xác định độc tính cấp tính ........................................................37
II.3.3. Phƣơng pháp xác định độc tính bán trƣờng diễn ............................................37
III.1. Xác định một số đặc tính vật lý, hóa học của gelatinase tái tổ hợp .................39
III.1.1. Ảnh hƣởng của các ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp ....... 39
III.1.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ và độ bền nhiệt của gelatinase tái tổ hợp ................................... 40
III.1.3. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính của enzyme gelatinase tái tổ hợp ................................. 42

4


III.1.4. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa đến hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp ................................. 42
III.1.5. Ảnh hƣởng của dung mơi hữu cơ đến hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp ........................ 43

III.2. Các điều kiện thủy phân da cá da trơn thành acid amin bằng gelatinase tái tổ
hợp .............................................................................................................................44
III.2.1 Các điều kiện tiền thủy phân da cá..................................................................................... 44
III.2.1.1. Kết quả xác định nhiệt độ tiền thủy phân da cá tra/basa .......................................... 44
III.2.1.2. Kết quả xác định pH tiền thủy phân da cá tra/basa .................................................. 45
III.2.1.3. Kết quả xác định thời gian tiền xử lý da cá tra/basa ................................................. 46

III.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân da cá bằng enzyme
gelatinase tái tổ hợp...................................................................................................46
III.2.2. Ảnh hƣởng của chất kiểm sốt pH đến q trình thủy phân da cá bằng
enzyme gelatinase tái tổ hợp .....................................................................................47
III.2.3. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân ..............48
III.2.4. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến hiệu suất thủy phân ................................. 49
III.2.5. Phân tích thành phần axit amin trong sản phẩm thủy phân ............................................... 49

III.3. Đánh giá các chỉ tiêu về an toàn thực phẩm của acid amin thủy phân ............50
III.3.1. Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật ........................................................................... 50
a.

Xác định mật độ vi sinh hiếu khí tổng số ......................................................................... 51

b.

Kết quả định lƣợng mật độ E.coli .................................................................................... 51

c.

Kết quả định lƣợng Salmonella sp và Staphylococcus sp ................................................ 52

III.3.2. Kết quả xác định độc tính cấp tính trên chuột nhắt trắng [3,4] ............................................ 53
III.3.3. Kết quả xác định độc tính bán trƣờng diễn ....................................................................... 53
Cơng thức máu của chó thí nghiệm.......................................................................................... 53
Kết quả theo dõi các chỉ số chức năng gan .............................................................................. 58
Kết quả theo dõi các chỉ số chức năng thận ............................................................................. 61
Đánh giá bệnh tích vi thể trên gan, thận chó thí nghiệm .......................................................... 62

PHẦN III – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..............................................................66
4.1. Kết luận ..............................................................................................................66
4.1.1. Xác định được một số đặc tính vật lý, hóa học của enzyme gelatinase tái tổ hợp như
sau: 66
4.1.2. Các điều kiện thủy phân da cá da trơn thành acid amin bằng gelatinase tái tổ hợp.......... 66
4.1.3. Kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh, độc tính của mẫu acid amin thủy phân từ da cá tra/cá
basa ............................................................................................................................................... 67

5


4.2. Kiến nghị ............................................................................................................67
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................68
I.

Tài liệu tham khảo tiếng Việt ................................................................................................ 68

II.

Tài liệu tham khảo tiếng Anh ................................................................................................ 68

6


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho phép em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các thầy
giáo, cô giáo đã và đang giảng dạy tại bộ môn Công nghệ sinh học – Trƣờng Đại
Học Bách Khoa Hà Nội, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để cho em học tập và hồn
thành khóa học.
Cho phép em gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Phạm Thị Tâm và
TS. Đặng Minh Hiếu, là những thầy cơ đã trực tiếp hƣớng dẫn tận tình và tạo mọi
điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn tới sự hỗ trợ về tài chính cũng nhƣ phƣơng pháp từ đề
tài cấp Nhà nƣớc mã số KC06.15/11-15. Em xin cảm ơn tập thể cán bộ Khoa Công
Nghệ Sinh Học, Viện Sau đại học trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội, đặc biệt là
tập thể cán bộ, học viên, sinh viên Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà
Nội đã chia sẻ khó khăn, giúp đỡ em để em thực hiện đƣợc các nội dung của đề tài.
Trong quá trình học tập và thực hiện đề tài em khơng tránh khỏi đƣợc những
sai sót, kính mong các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn bỏ qua và đóng góp ý
kiến để em hồn thiện hơn.
Em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất đến gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh
động viên và giúp đỡ em để em hồn thành khóa học này.
Hà Nội, tháng 9 năm 2015
Ngƣời viết luận văn

Đào Văn Nguyên

7


LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của nhóm nghiên cứu và tơi,
nằm trong nhánh nhỏ của đề tài “ Nghiên cứu công nghệ sản xuất gelatinase tái tổ
hợp và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm. “ cấp Nhà nƣớc mang mã
số KC06.15/11-15.
Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không
trùng lặp với các đề tài khác.
Tác giả

Đào Văn Nguyên

8


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Thành phần axit amin của gelatin ................................................................17
Bảng 2. Một số lồi vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase ......................................19
Bảng 3. Các thành phần acid amin chủ yếu trong da một số loại cá nƣớc lạnh, nƣớc
ấm và bì lợn (thành phần trong 1000g) .....................................................................26
Bảng 4 - Ảnh hƣởng các ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính của gelatinase tái tổ
hợp .............................................................................................................................39
Bảng 5: Thành phần acid amin trong dịch thủy phân ...............................................50
Bảng 6a: Kết quả xác định mật độ tổng số vi khuẩn hiếu khí trong mẫu .................51
axit amin ....................................................................................................................51
Bảng 6b: Kết quả xác định mật độ E. coli trong bột axit amin ................................51

Bảng 7: Kết quả xác định mật độ Salmonella và Staphylococcus ............................52
trong bột axit amin ....................................................................................................52
Bảng 8: Kết quả kiểm tra công thức máu của chó sau 15 ngày uống thuốc .............54
Bảng 9: Kết quả kiểm tra cơng thức máu của chó sau 30 ngày uống thuốc .............55
Bảng 10: Kết quả kiểm tra cơng thức máu của chó sau 60 ngày uống thuốc ...........56
Bảng 11: Kết quả kiểm tra công thức máu của chó trƣớc 15 ngày dừng ..................57
uống thuốc .................................................................................................................57
Bảng 12: Kết quả kiểm tra các chỉ số chức năng gan của chó sau 15 ngày ..............58
uống thuốc .................................................................................................................58
Bảng 13: Kết quả kiểm tra các chỉ số chức năng gan của chó sau 30 ngày ..............59
uống thuốc .................................................................................................................59
Bảng 14: Kết quả kiểm tra các chỉ số chức năng gan của chó sau 60 ngày uống
thuốc ..........................................................................................................................59
Bảng 15: Kết quả kiểm tra các chỉ số chức năng gan của chó trƣớc 15 ngày dừng
uống thuốc .................................................................................................................60
Bảng 16: Nồng độ albumin trong huyết thanh chó ở các lơ thí nghiệm (mg/dl) ......61
Bảng 17: Nồng độ creatinin trong huyết thanh chó ở các lơ thí nghiệm (µmol/l) ....62

9


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. Thành phần và cấu trúc gelatin ....................................................................17
Hình 2a. Cấu trúc gelatinase A .................................................................................18
Hình 2b. Cấu trúc gelatinase B .................................................................................18
Hình 3. Đặc điểm hình thái Pseudomonas aeruginosa .............................................20
Hình 4. Cá nhiễm khuẩn Pseudomonas ....................................................................21
Hình 5. Hình thái A. hydrophila ................................................................................22
Hình 6. Cá nhiễm khuẩn A.hydrophila .....................................................................23
Hình 8.a Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính của gelatinase ................................41

Hình 8.b Ảnh hƣởng của thời gian xử lý nhiệt đến hoạt tính của gelatinase ............41
Hình 9 - Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp ........................42
Hình 10 - Ảnh hƣởng của các chất tẩy rửa đến hoạt tính..........................................43
của gelatinase tái tổ hợp ............................................................................................43
Hình 11 - Ảnh hƣởng của các dung môi hữu cơ đến hoạt tính của gelatinase .........44
Hình 12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tiền thủy phân da cá tra/cá basa ..........................45
Hình 13 - Ảnh hƣởng của độ pH dịch thủy phân đến hiệu quả tiền xử lý ................46
Hình 14 - Ảnh hƣởng của thời gian tiền thủy phân tới hiệu quả thủy phân .............46
Hình 15 - Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến hiệu suất thủy phân .......................47
Hình 16- Ảnh hƣởng của pH đến hoạt động của enzyme gelatinase tái tổ hợp trong
quá trình thủy phân da cá tra/ ba sa đã qua tiền xử lý kiềm ......................................47
Hình 17 - Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân.....................................49
Hình 18 - Ảnh hƣởng của thời gian đến hiệu suất thủy phân ...................................49
Hình 19 - Hình ảnh vi thể gan chó bình thƣờng .......................................................63
Hình 20 - Hình ảnh vi thể gan chó sử dụng amino acid ............................................63
Hình 21 - Mơ học sinh thiết thận chó bình thƣờng ...................................................64
Hình 22 - Mơ học sinh thiết thận chó sử dụng bột amino acid thủy phân ................65

10


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt

Tên đầy đủ - Tên Việt hóa

ĐBSCL

Đồng bằng Sơng Cửu Long

kDa

Kilodalton

MMP-2

Matrix metalloprotease 2

MMP-9

Matrix metalloprotease 9

MMPs

Matrix metalloproteases

FDA

Food and Drug Administration
Food and Agriculture

FAO

Organization

bp

Base pair

LB

Luria-Bertani

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

Tris

Trisaminomethane

HCl

Hydrochloride

SDS

Sodium dodecyl sulfate

TE

Tris-EDTA

TAE

Tris base, acetic acid and EDTA

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam
International Organization for

ISO

Standardization

RE

Restriction enzyme

AST

Aspartate transaminase

ALS

Alanine transaminase

CMC

Carboxyl methyl cellulose
Isopropyl β-D-1-

IPTG

thiogalactopyranoside

Amp

Ampicillin

11


MCS

Multiple cloning sites

MtOH

Methanol

EtOH

Ethanol

nBtOH

nButanol

IsOH

Isopropanol

Act

Aceton

TSVKHK

Tổng số vi khuẩn hiếu khí

ATVSTP

An tồn vệ sinh thực phẩm

QCVN

Quy chuẩn Việt Nam

BYT

Bộ Y tế

cfu

colony-forming unit

ANOVA

ANALYSIS OF VARIANCE

LSD

Least-Significant Difference

AST

Aspartate amino tranferase

ALT

Alanin amino transferase

FCS

Fetal calf serum

MOI

Multiplicity of infection

CPE

Cytopathic ẹffect

EP

European Pharmacopoeia

12


PHẦN I – MỞ ĐẦU
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Trong những năm gần đây, xuất khẩu thủy hải sản là một trong những mặt trận
hàng đầu đem lại nhiều nguồn ngoại tệ cho nƣớc ta, trong đó xuất khẩu các sản
phẩm từ cá da trơn đứng thứ hai sau tôm. Ở Việt Nam, cá da trơn hiện đƣợc nuôi tại
hầu hết các tỉnh, thành phố Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) với diện tích trên

5.500 ha đạt sản lƣợng xuất khẩu hơn 1,11 triệu tấn/năm, có kim ngạch 1,76 tỷ USD
trong năm 2014. Cá da trơn đƣợc ƣu chuộng ở nhiều nƣớc trên thế giới do thịt cá da
trơn cung cấp nhiều acid amin và acid béo cần thiết cho cơ thể. Bên cạnh sản phẩm
chính là thịt nạc cá, chủ yếu là phi-lê dạng miếng, cịn có nhiều sản phẩm phụ trong
quá trình chế biến nhƣ đầu cá, xƣơng cá và da cá. Đây là nguồn phụ phẩm khổng lồ,
phần lớn chỉ đƣợc sử dụng ở dạng thô sơ làm thức ăn cho gia súc. Nhìn chung, chƣa
có quy định cụ thể nào về tỷ lệ quy đổi từ cá nguyên liệu thành cá phi-lê dạng
miếng, nhƣng theo ƣớc tính cứ 2 – 2,5 kg cá nguyên liệu sẽ chế biến đƣợc 1 kg cá
phi-lê, phụ thuộc vào kỹ thuật chế biến và tùy sản phẩm cụ thể, còn lại 1 – 1,5 kg sẽ
nằm trong phần phụ phẩm chế biến, trong đó da cá chiếm từ 4 – 6% trên tổng lƣợng
phụ phẩm. Từ da cá có thể tạo ra những sản phẩm khác có giá trị kinh tế cao hơn và
có nhiều ứng dụng hơn trong thực tế, giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng. Đặc biệt là
gelatin, có thể ứng dụng trong cơng nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dƣợc phẩm.
Trong sản xuất hiện đại ngày nay, enzyme tái tổ hợp nói riêng và enzyme nói
chung đang là hƣớng đi mới đƣợc ứng dụng vào nhiều ngành khác nhau đem lại
hiệu quả chuyển hóa cơ chất nhanh hơn rất nhiều lần so với phƣơng pháp hóa học
trƣớc kia, phản ứng xảy ra trong điều kiện êm dịu, đặc biệt an tồn với con ngƣời –
thân thiện với mơi trƣờng.
Gelatinase là một trong những enzyme đƣợc nghiên cứu hiện nay để có thể thủy
phân gelatin. Gelatin là một loại protein khơng mùi, khơng vị, trong suốt hoặc có
màu hơi vàng, chúng bị thủy phân ở enzyme gelatinase. Gelatinase đƣợc tách chiết
từ nhiều loại vi khuẩn khác nhau nhƣ Pseudomonas, Aerromonas, Enterobacter …

13


Tuy nhiên nguồn gelatinase tách chiết từ vi khuẩn này thƣờng là tác nhân gây nên
ngộ độc của vi khuẩn, đồng thời độc tố của vi khuẩn còn tồn tại có thể gây hại với
con ngƣời và động vật và cây trồng nhƣ vi khuẩn Pseudomonas gây bệnh mủ xanh
ở ngƣời. Vì vậy, sản xuất enzyme tái tổ hợp đang là hƣớng đi mới và có thể giải

quyết triệt để bài tốn an tồn cho mơi trƣờng.
Với những u cầu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên cứu các đặc tính
Gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân da cá da trơn thành acid amin
làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng ”. Nhằm mong muốn ứng dụng
thành công nghiên cứu này vào sản xuất gelatinase tái tổ hợp đảm bảo an toàn cả về
chất lƣợng lẫn số lƣợng để có thể giải quyết một phần phụ phẩm của ngành công
nghiệp chế biến cá da trơn của nƣớc ta hiện nay.
2. MỤC TIÊU
2.1.

Mục tiêu chung

Xác định đƣợc các đặc tính vật lý, hóa học của gelatinase tái tổ hợp để làm cơ sở
cho việc ứng dụng enzyme trong thủy phân da cá da trơn thành nguyên liệu sản xuất
thực phẩm chức năng
2.2.

Mục tiêu cụ thể

2.2.1. Xác định đƣợc đặc tính vật lý, hóa học của gelatinase tái tổ hợp
2.2.2. Nghiên cứu các điều kiện thủy phân da cá da trơn thành acid amin bằng
gelatinase tái tổ hợp
2.2.3. Nghiên cứu đánh giá các chỉ tiêu về an toàn thực phẩm acid amin thủy
phân.

3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.1.1. Nghiên cứu các đặc tính vật lý, hóa học của gelatinase tái tổ hợp
3.1.1.1.

Xác định hoạt lực enzyme với các điều kiện nhiệt độ, pH, có mặt các

ion kim loại

14


3.1.1.2.

Xác hoạt tính, độ bền nhiệt độ, độ bền pH của gelatinase tái tổ hợp

3.1.2. Nghiên cứu các điều kiện thủy phân da cá da trơn thành acid amin bằng
gelatinase tái tổ hợp
3.1.2.1.

Nghiên cứu các điều kiện tiền thủy phân da cá da trơn ( cá tra/ cá basa

)
3.1.2.2.

Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu quả thủy phân da cá tra/

cá basa
3.1.2.3.

Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian đến hiệu quả thủy phân da cá tra/

cá basa
3.1.3. Nghiên cứu đánh giá các chỉ tiêu về an toàn thực phẩm của acid amin
thủy phân ( vi sinh vật, độc tính cấp tính, độc tính bán trƣờng diễn )
3.1.3.1.

Nghiên cứu đánh giá các chỉ tiêu vi sinh vật của sản phẩm bột acid

amin thủy phân
3.1.3.2.

Nghiên cứu đánh giá khả năng gây độc tính cấp của sản phẩm acid

amin trên động vật thí nghiệm
3.1.3.3.

Nghiên cứu đánh giá khả năng gây độc tính bán trƣờng diễn của sản

phẩm acid amin trên động vật thí nghiệm.
4. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu: Gelatinase tái tổ hợp
5. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
5.1.

Thời gian nghiên cứu: Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 09 năm 2014

đến tháng 09 năm 2015
5.2.

Địa điểm nghiên cứu: Phịng thí nghiệm của khoa Cơng Nghệ Sinh

Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội.

15

PHẦN II – NỘI DUNG
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I. Tổng quan về gelatin và gelatinase
I.1. Gelatin
Gelatin là một polymer tự nhiên có nguồn gốc từ collagen của da, xƣơng của
bị, lợn, cá. Trong tự nhiên, gelatin đóng vai trị nhƣ một nguồn nitơ giàu dinh
dƣỡng, rất nhiều loài vi sinh vật có khả năng phân giải gelatin tạo ra peptide và acid
amin để xây dựng cấu trúc cơ thể của chúng. Hiện nay, gelatin có nguồn gốc từ da
cá đang đƣợc xác định là nguồn cung cấp chính cho nhu cầu sử dụng gelatin, do nó
giải quyết vấn đề xử lý chất thải và tạo ra một sản phẩm giá trị gia tăng. Gelatin
đƣợc thu nhận từ sự biến tính nhiệt phân collagen có trong da, xƣơng, mơ liên kết
của động vật, là một loại protein phổ biến trong giới động vật. Gelatin hịa tan khi
đun nóng (khoảng 40oC) và cô đặc khi làm lạnh, cùng với nƣớc ở điều kiện bình
thƣờng có dạng sệt. Theo Hofmeister: Gelatin là sản phẩm của sự thủy phân
Collagen bởi nhiệt:
C102H149N31O38 (collagen) + H2O



C102H151N31O39 (gelatin)

Gelatin là một protein tạo bởi axit amin sắp xếp trên một chuỗi đƣờng thẳng
và đƣợc liên kết bởi sự kết hợp của hai hay nhiều axit amin, là hỗn hợp dị hể các sợi
polypeptid sợi đơn và sợi đa, mỗi sợi có cấu hình proline xoắn ốc bên trái, chứa từ
300 – 400 amino acid. Cấu trúc của gelatin đƣợc hình thành từ sự liên kết của 18
loại amino acid khác nhau, liên kết theo một trạt tự nhất định, tuần hoàn. Gelatin
chứa một lƣợng lớn glycine, proline và 4- hydroxyproline.

16

Thành phần gelatin

Cấu trúc gelatin

Hình 1. Thành phần và cấu trúc gelatin
Về cấu tạo, gelatin chứa 18 – 20 acid amin, trong đó có 8 trên 9 acid amin
thiết yếu, hàm lƣợng các acid amin glycenin, hydroxyproline đặc biệt cao, chiếm
khoảng 50% tổng số acid amin có trong gelatin (Hình 1).
Sản phẩm sau khi thủy phân gelatin bao gồm một số acid amin theo bảng sau:
Bảng 1. Tỷ lệ (%) acid amin trong 100g gelatin sau khi thủy phân

17


I.2. Gelatinase
Gelatinase là một enzyme thủy phân protein có trong một số loài vi khuẩn và
động vật bậc cao. Gelatinase là enzyme thuộc nhóm protease - nhóm hydrolase, xúc
tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và
peptid thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, peptone. Hoạt tính của enzyme
khơng chỉ phụ thuộc vào hoạt lực của nó mà cịn phụ thuộc nhiều vào các tác nhân
mơi trƣờng mà nó xúc tác. Enzyme này có khả năng thủy phân các cấu trúc ngoại
bào nhƣ elastin, collagen và gelatin.
Ở cơ thể con ngƣời, gelatinase đƣợc chia thành hai loại, đó là: gelatinase A
và gelatinase B (hình 2a, 2b). Gelatinase A hay gelatinase 72 kDa còn đƣợc gọi là
collagenase 72 kDa typ IV thuộc nhóm MMP-2, đƣợc mã hóa bởi gen GelE có kích
thƣớc là 501bp. Gelatinase B hay gelatinase 92 kDa cịn đƣợc gọi là collagenase 92
kDa typ IV thuộc nhóm MMP-9, đƣợc mã hóa bởi gen GelE có kích thƣớc là
615bp. Enzyme này chủ yếu đƣợc sinh ra bởi các tế bào đại thực bào, tiểu cầu, bạch

cầu đa nhân, bạch cầu trung tính, xơ phơi và tế bào sừng. Chức năng chính của
gelatinase là phối hợp với các MMPs khác để chỉnh sửa các mô sinh dƣỡng, hỗ trợ
sự phát triển của phơi thai, hình thành mạch máu, tham gia quá trình rụng trứng,
chữa lành vết thƣơng, tham gia hình thành xƣơng.
Trong lĩnh vực nghiên cứu về sinh hóa và chẩn đốn ung thƣ, gelatinase 92

Hình 2a. Cấu trúc gelatinase A

Hình 2b. Cấu trúc gelatinase B

18


kDa đƣợc sử dụng để sàng lọc chất ức chế hoạt động của enzyme, cịn trong chẩn
đốn, gelatinase là yếu tố chỉ thị để chẩn đoán sớm sự di căn của khối u.
Ở vi khuẩn, gelatinase thuộc loại protease có trọng lƣợng phân tử là 72 kDa,
với trung tâm hoạt động có chứa ion Zn2+, hoạt động chính của enzyme này là thủy
phân các liên kết peptit của gelatin để tạo ra các đoạn peptit ngắn và các axit amin
các chủng sản sinh gelatinase (bảng 2)
Bảng 2. Một số loài vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase
Tên lồi

Hoạt tính Gelatinase

Staphylococcus aureus

+

Bacillus subtilis

+

Clostridium perfringens

+

Corynebacterium sp

+

Proteus spp

+

Pseudomonas aeruginosa

+

Pseudomonas fluorescens

+

Serratia plymuthica

+

Serratia liquefaciens

+

Serratia rubidaea

+

Peudomonas anguilliseptica

+

I.3. Một số loài vi khuẩn sử dụng để tách chiết gelatinase
I.3.1. Vi khuẩn Pseudomonas
Phân loại khoa học
Giới (Domain): Bacteria
Ngành (phylum): proteobacteria
Lớp (class): Gramma proteobacteria
Bộ (ordo) : Pseudomonadales

19


Họ (familia): Pseudomonadaceae
Chi (genus): Pseudomonas
Migula(1894)
Lồi điển hình : Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens,
Pseudomonas Stutzeri, Pseudomonas Putida , Pseudomonas oleovorans ,
Pseudomonas denitrificans
Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas (viết tắt là Ps) là trực khuẩn
Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu (tiên mao một hoặc chùm tiên
mao) và khơng có bào tử. Các đặc điểm sinh lí là dị dƣỡng, khơng lên men, linh
hoạt về dinh dƣỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen. Chúng thƣờng sinh ra
sắc tố, các sắc tố này thƣờng biểu thị cho độc tính của loại vi khuẩn này, chúng gây

tổn thƣơng hoặc làm mất hoạt tính sinh lý bình thƣờng của các tế bào biểu mơ trong
đƣờng hơ hấp.
Hình 3. Đặc điểm hình thái Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas là vi khuẩn xuất hiện ở nhiều nơi trong môi trƣờng. Khả năng
biến dƣỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều
mơi trƣờng khác nhau nhƣ nƣớc, đất, trên cây, trên và trong các động vật. Trong số
những lồi Pseudomonas này, có những lồi tiêu biểu có thể đƣợc sử dụng trong
cơng nghệ sinh học.
Một trong những enzyme quan trọng nhất do Pseudomonas sinh ra là
protease. Một số đề tài nghiên cứu về protease của loại vi khuẩn này, kết quả cho

20


thấy protease có hoạt tính cao trong canh cấy, và có các đặc tính khác nhau, áp dụng
có hiệu quả trong thực tế nhƣ đặc tính bền trong dung mơi, không bị tác động bởi
các ion kim loại, bền với chất tẩy rửa. Bên cạnh đó chúng cịn có khả năng tiết ra
enzyme gelatinase phân giải gelatin có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp, dƣợc
phẩm, mỹ phẩm.
Ở cá, Pseudomonas thƣờng gây nhiễm khuẩn huyết liên quan đến các stress,
các thƣơng tổn da, vẩy do các tác nhân cơ học, nuôi với mật độ cao, dinh dƣỡng
kém, hàm lƣợng ôxy giảm. Chúng xâm nhập vào cơ thể cá qua các thƣơng tổn ở
mang, da. Các loài cá hay bị nhiễm khuẩn Pseudomonas là cá tra, cá basa, cá trê, cá
bống tƣợng, cá tai tƣợng... gây nên những dấu hiệu bệnh lý nhƣ xuất huyết từng
đốm nhỏ trên da, xung quanh miệng và nắp mang, phía mặt bụng. Bề mặt cơ thể có
thể chảy máu, tuột nhớt nhƣng khơng xuất huyết vây và hậu mơn.

.
Hình 4. Cá nhiễm khuẩn Pseudomonas

I.3.2. Vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gammaproteobacteria
Bộ: Aeromonadales
Họ: Aeromonadacea
Giống: Aeromonas

21


Lồi: A.hyrophila
A.hydrophila là một lồi vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que ngắn. Kích
thƣớc chiều rộng thƣờng từ 0,3 đến 1µm, và chiều dài từ 1 đến 3 µm. Chúng khơng
có khả năng hình thành bào tử và có thể sinh trƣởng ở nhiệt độ thấp (4oC). A.
hydrophila có khả năng di động nhờ vào tiên mao ở một đầu của vi khuẩn. Trong
một số điều kiện sinh trƣởng nhất định một số tế bào có thể có tiên mao ở một bên.

Hình 5. Hình thái A. hydrophila
Đƣợc xếp vào nhóm sinh vật dị dƣỡng. Lồi này chủ yếu đƣợc tìm thấy trong
các vùng khí hậu nhiệt đới nhƣ: Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Thái Lan, Úc...
và Việt Nam. Chúng phân bố nhiều trong các vùng nƣớc ngọt, nƣớc lợ, mặn, ở các
cửa sơng... ngồi ra cịn có thể bắt gặp lồi này trong các nguồn nƣớc có chứa clo và
các hợp chất khác có hay khơng có clo. Vi khuẩn này phổ biến hơn trong môi
trƣờng nuôi cá nƣớc ngọt. Nó đƣợc tìm thấy cả trong tầng nƣớc đứng và lớp trên
cùng của lớp trầm tích (Hazen 1979). Cho tới những năm 1950, ngƣời ta mới phân
lập đƣợc loài này trên ngƣời và 1 số động vật. A.hydrophila là loài đƣợc biết đến
nhiều nhất trong 6 loài thuộc Aeromonas . Nó có thể tiêu hóa các vật liệu nhƣ
gelatin và hemoglobin. Nó có khả năng thích nghi với các điều kiện khắc nghiệt của
mơi trƣờng nhƣ: có thể sống đƣợc trong mơi trƣờng có chứa clo, bị làm lạnh, hay
nhiệt độ thấp, vì vậy lồi này rất khó bị tiêu diệt.

22


A. hydrophila thƣờng đƣợc biết đến là nguyên nhân gây nên bệnh đốm đỏ
trên cá. Khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ mà nó kí sinh, A. hydrophila đi theo các
mạch máu để đến với các tổ chức kí sinh đầu tiên, A. hydrophila có thể kí sinh ở
bất cứ vị trí nào mà nó bắt gặp. Khi kí sinh nó tăng sinh rất nhanh và sản sinh ra độc
tố Aerolysin Cytotoxic Enterotoxin (ACE), là loại độc tố có thể phá hoại tổ chức
mơ. Nó là ngun nhân gây sự hƣ thối trên thực phẩm tƣơi sống bao gồm cả cá và
hải sản. Tất cả các loài A. hydrophila, A. caviae, A. sobria đều đƣợc xem là tác nhân
gây bệnh cơ hội, nghĩa là chúng chỉ gây nhiễm khi hệ miễn dịch của kí chủ bị suy
yếu.

Hình 6. Cá nhiễm khuẩn A.hydrophila
I.4. Tình hình thực tế về ni trồng cá da trơn và chế biến các phụ phẩm của
cá da trơn ở Việt Nam
Cá tra là loại cá da trơn sinh sống ở vùng nƣớc ngọt thuộc khu vực phía Nam
và Đơng Nam của Châu Á, do đó chỉ một số quốc gia Châu Á nhƣ Việt Nam, Malai-xi-a, Băng-la-đét, In-đơ-nê-xia và Ấn Độ mới có thể ni đƣợc loại cá này. Việt
Nam đƣợc coi là quốc gia sản xuất cá tra lớn nhất thế giới, chiếm 52% tổng sản
lƣợng. Theo thống kê của Liên minh Nuôi trồng Thủy sản Toàn cầu (GAA), tổng

23


sản lƣợng cá tra nuôi của thế giới năm 2015 dự kiến đạt 2,2 triệu tấn, tăng nhẹ 5%
so với năm 2014.
Hoạt động nuôi cá tra tập trung chủ yếu ở Đồng Bằng Sơng Cửu Long, với
tổng diện tích năm 2014 đạt 5.500 ha. Hai tỉnh An Giang và Đồng Tháp có sản
lƣợng cá tra lớn nhất vùng. Do có ƣu điểm nhƣ dễ nuôi, lớn nhanh, thịt ngon nên
tiềm năng ni cá tra/cá basa vẫn cịn khá lớn. Việc phát triển nuôi cá tra/cá basa sẽ

làm tăng sản lƣợng cá nuôi nƣớc ngọt trong cả nƣớc, tăng thêm lƣợng thủy sản xuất
khẩu và góp phần phát triển ổn định nghề nuôi. Tuy nhiên, theo báo cáo của Bộ
Nông nghiệp và Phát triển Nơng thơn, diện tích ni trồng của Việt Nam biến động
khá lớn trong năm năm trở lại đây. Lý do chính về vấn đề này có lẽ phụ thuộc vào
tốc độ xuất khẩu. Thơng thƣờng, diện tích nuôi trồng sẽ tăng khi xuất khẩu tăng và
ngƣợc lại. Điều này khiến nhiều doanh nghiệp quan tâm hơn tới việc tăng doanh thu
từ các nguồn khác nhƣ các mặt hàng chế biến sẵn, các mặt hàng giá trị gia tăng, tận
dụng phế phẩm của quá trình phi lê, tăng giá trị sử dụng cho phế phẩm. Mặt khác,
nếu không tận thu lƣợng phụ phẩm sau chế biến này sẽ gây thất thốt lãng phí lớn
trong sản xuất và ơ nhiễm mơi trƣờng. Trong khi đó, chúng ta lại hồn tồn có thể
tận dụng các phụ phẩm này thành các sản phẩm thủy phân có khả năng ứng dụng
rộng rãi trong các ngành thực phẩm, mỹ phẩm và sản xuất nông nghiệp… đáp ứng
đƣợc một lƣợng lớn nhu cầu ngày càng tăng cao về các sản phẩm chống lão hóa,
các sản phẩm làm đẹp, dƣợc phẩm, thực phẩm chức năng, thức ăn nuôi trồng thủy
sản hay các sản phẩm sử dụng trong nơng nghiệp.
Thành phần chính của phụ phẩm là các phần thừa, khó chế biến xử lý. Da
chứa 85% collagen, một loại protein có 19 axit amin, trong đó có 8 axit amin khơng
thay thế, và có thể coi đây là một nguồn protein khá hồn chỉnh, trong đó axit amin
glycine, hydroxyproline và proline chiếm tới 50% tổng lƣợng axit amin trong
collagen.
Để xử lý nguồn phụ phẩm da cá tra thành axit amin, enzyme gelatinase đƣợc
coi là giải pháp đem lại hiệu suất cao, tạo ra sản phẩm an tồn và ít gây ơ nhiễm mơi

24


trƣờng. Từ thực trạng và bài tốn kinh tế đó, Cơng ty Cổ phần Vĩnh Hồn, Đồng
Tháp là cơng ty đầu tiên trong nƣớc đầu tƣ, xây dựng nhà máy để chiết xuất các sản
phầm từ da cá da trơn với cơng suất 2000 tấn/năm, trong đó có 1.000 tấn là collagen
và 1.000 tấn là gelatin (Công ty CP Vĩnh Hoàn - Báo cáo thƣờng niên, 2014)

Cũng theo nhƣ nghiên cứu của tác giả Trần Thanh Nhãn năm 2009[1] , hiệu
suất tách chiết gelatin từ da cá da trơn đạt 16%, nguồn gelatin này đạt các tiêu
chuẩn dƣợc điển Việt Nam III, an tồn với vật ni, con ngƣời có thể sử dụng đƣợc
trong ngành thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.
Nhƣ vậy, việc sản xuất acid amin từ da cá tra/ cá ba sa để sử dụng trong
ngành thực phẩm và thức ăn chăn nuôi là một vấn đề khả thi và là một hƣớng đi
đúng đắn nhằm khai thác hiệu quả và triệt để hơn nghề nuôi cá tra/cá basa hiện nay.
I.5. Thành phần thủy phân từ da cá
Gelatin là một polymer tự nhiên có nguồn gốc từ collagen của da, xƣơng của
bị, lợn, cá. Gelatin có nguồn gốc từ da cá đang đƣợc xác định là nguồn cung cấp
chính do nó giải quyết vấn đề xử lý chất thải và tạo ra một sản phẩm giá trị gia tăng.
Bên cạnh đó, thị phần của gelatin có nguồn gốc từ bị hoặc lợn đang dần giảm do chi
phí sản xuất cao, do dịch bệnh tai xanh ở lợn, xốp não, lở mồm long móng ở bị
(Jongjareonrak và cộng sự, 2006). Hơn nữa, gelatine trong da cá mới đƣợc chấp
nhận ở các quốc gia Hồi Giáo.
Hiện nay, trên thế giới, gelatin có nguồn gốc từ da cá đƣợc sản xuất từ cá tuyết, cá
rô phi đen (Oreochromis mossambicus) ( B.Jamilat, K.G. Harvinder, 2002 )[4] , cá rô
phi đỏ (Oreochromis nilotica)[5] , cá rô sông Nile (Lates niloticus),

cá hồng

(Priacanthus macracanthus), cá mập, cá đối,... ( Cheow và cộng sự, 2007)[6].
Theo nghiên cứu của Panida và cộng sự, 2008, trong da cá rơ phi sơng Nile
có chứa 89,4% gelatin. Bên cạnh đó, theo nghiên cứu của các tác giả Go´ mezGuille´n và cộng sự, 2005 [7] cho thấy: thủy phân gelatin từ da cá đã thu đƣợc 4 loại
acid amin chính, hàm lƣợng các acid amin này tƣơng đƣơng với các thành phần
trong gelatin từ da lợn (đã đƣợc thƣơng mại hóa). (bảng 3).

25