Nghiên cứu tìm ph tối ưu của môi trường nuôi cấy virus sử dụng cho sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm tại polyvac

LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iii
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... iv
BẢNG KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................ vii
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN .......................................................................................3
1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH SỞI TRÊN THẾ GIỚI .......................... 3
1.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC BỆNH SỞI ......................................... 4
1.2.1 Phạm vi vật chủ........................................................................................................ 4
1.2.2 Phương thức lây truyền.......................................................................................... 4
1.2.3 Tính cảm thụ - miễn dịch ........................................................................................ 4
1.2.4 Biểu hiện quá trình dịch .......................................................................................... 4
1.3. VIRUS SỞI ....................................................................................................... 5
1.3.1 Phân loại .................................................................................................................. 5
1.3.2 Hình thái học ............................................................................................................ 5
1.3.3 Thành phần hóa học ................................................................................................ 6
1.3.4 Cấu trúc .................................................................................................................... 7
1.3.5 Đặc tính của virus sởi ............................................................................................. 7
1.3.6 Quá trình nhân lên của virus sởi trên tế bào ...................................................... 11
1.3.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của TB và sự nhân lên của virus .. 14
1.4. BỆNH SỞI ...................................................................................................... 20
1.4.1 Chu kỳ phát triển của virus sởi trong cơ thể bệnh nhân ................................. 20
1.4.2 Triệu chứng bệnh ................................................................................................ 20
1.4.3 Biến chứng của bệnh sởi .................................................................................... 21
1.5. PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH SỞI .............................................................. 22

1.5.1 Vắc xin phòng bệnh sởi ......................................................................................... 22
1.5.2 Điều trị bệnh sởi .................................................................................................... 23

i


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

1.5.3 Tình hình tiêm chủng vắc xin sởi phòng bệnh tại Việt Nam .............................. 23
1.6. SẢN XUẤT VẮC XIN SỞI TẠI POLYVAC ............................................... 25
CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................26
2.1 . ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ....................................................................... 26
2.2

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ ......................................................... 27

2.2.1 Nguyên vật liệu ................................................................................................... 27
2.2.2 Thiết bị ................................................................................................................. 28
2.3

. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 29

2.3.1 Khảo sát nồng độ NaHCO3 bổ sung vào môi trường nuôi cấy virus ............ 29
2.3.2 Thiết kế nghiên cứu............................................................................................. 29
2.3.3 Pha môi trường nuôi cấy virus M199............................................................... 31
2.3.4 Quy trình thử nghiệm và đánh giá chất lượng vắc xin sởi bán thành phẩm 36
2.3.5 Phân tích số liệu.................................................................................................. 37
CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..............................................................38

3.1. Khảo sát mối quan hệ giữa nồng độ NaHCO3 bổ sung vào môi trƣờng nuôi
cấy virus với giá trị pH đo đƣợc của môi trƣờng .................................................. 38
3.2. Kết quả nghiên cứu nhóm I ............................................................................ 40
3.3. Kết quả nghiên cứu nhóm II ........................................................................... 41
3.4. Kết quả nghiên cứu nhóm III.......................................................................... 43
3.5. Kết quả nghiên cứu nhóm IV ......................................................................... 44
3.6. Kết quả nghiên cứu nhóm V ........................................................................... 46
3.7. Đánh giá mối liên hệ giữa pH môi trƣờng với hiệu giá vắc xin sởi bán thành
phẩm từ nhóm I đến nhóm V ................................................................................. 47
3.8. Kiểm định chất lƣợng 3 lô vắc xin sởi bán thành phẩm ................................. 49
3.9. Kết quả hiệu giá vắc xin sởi BTP sản xuất từ năm 2009 ÷ 2012 tại Polyvac 50
KẾT LUẬN ...............................................................................................................53
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................55

ii


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai
công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Học viên

Lê Tuấn Anh

iii


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS. Nguyễn Thúy Hƣờng – Trung
Tâm Nghiên cứu sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế, PGS.TS Nguyễn Thị Xuân
Sâm – Viện Công Nghệ sinh học, Công nghệ Thực phẩm Trƣờng Đại học Bách Khoa
Hà Nội đã tận tình giúp đỡ và hƣớng dẫn tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp này.
Trong thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua, tôi luôn nhận đƣợc sự giúp
đỡ và tạo điều kiện của thầy cô trong Bộ môn và các thầy cô trong Phòng Đào tạo Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội. Tôi xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ
quý báu đó.
Toàn bộ nội dung nghiên cứu trong luận văn này đƣợc thực hiện và hoàn
thành tại Phòng Bán thành phẩm, phòng Môi Trƣờng và Phòng Kiểm định thuộc
Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế (Polyvac). Tôi xin chân
thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của tập thể cán bộ các phòng ban. Nhân đây tôi
xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất vắc
xin và sinh phẩm y tế (Polyvac) nơi tôi đang công tác đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
học tập và làm việc, sắp xếp thời gian để tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập của mình.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè đồng nghiệp và gia đình đã luôn
quan tâm giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận
văn tốt nghiệp này.

Hà Nội, tháng 09/2015.
Học Viên

Lê Tuấn Anh

iv


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

BẢNG KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Bulk

Vắc xin Sởi bán thành phẩm

BS

Bovine serum – Huyết thanh bò

BSA

Bovin Serum Albumin - Albumin huyết thanh bò

CPE

Cytopathic Effect - Hiệu quả hủy hoại tế bào

CGI

Cell Growth Index - Chỉ số phát triển tế bào

EK

Erythromycin & Kanamycin

GM 5% BS

Môi trƣờng phát triển 5% huyết thanh bò

HG

Hiệu giá

M199/PR (+)

Môi trƣờng M199 có đỏ phenol

M199/PR (-)

Môi trƣờng M199 không có đỏ phenol

MVVAC

Vắc xin sởi sản xuất tại Việt Nam

NBCS

New born calf serum – Huyết thanh bê mới sinh

PFU

Plaque Forming Unit – Đơn vị tạo đám hoại tử

POLYVAC

Trung tâm nghiên cứu sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế

SCD

Soybean Casein Digest – Môi trƣờng Casein đậu tƣơng

TCMR

Tiêm chủng mở rộng

TGC

Thioglycholate – Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn

VX

Vắc xin

TB

Tế bào

TBĐV

Tế bào động vật

WFI

Water for Injection – Nƣớc pha tiêm

WHO

Tổ chức Y tế Thế giới

v


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Các loại môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu .........................................26
Bảng 2.2: Nguyên vật liệu dùng cho sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm .............27
Bảng 2.3: Các loại môi trƣờng dùng cho sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm .......27
Bảng 2.4: Thiết bị dùng cho sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm...........................28
Bảng 2.5: Bảng phân chia nhóm nghiên cứu ............................................................30
Bảng 2.6: Công thức môi trƣờng M199/PR(+) .........................................................31
Bảng 2.7: Công thức môi trƣờng M199/PR(-) ..........................................................33
Bảng 2.8: Công thức pha chế thành phần môi trƣờng M199/PR (+) trong các nhóm
nghiên cứu ở các nồng độ NaHCO3 khác nhau .........................................................35
Bảng 2.9: Công thức pha chế thành phần môi trƣờng M199/PR (-) trong các nhóm
nghiên cứu ở các nồng độ NaHCO3 khác nhau ........................................................35
Bảng 2.10: Tiêu chuẩn đánh giá vắc xin sởi bán thành phẩm ...................................36
Bảng 3.1. Kết quả đo pH của môi trƣờng nuôi cấy virus tại các nồng độ ................38
NaHCO3 khác nhau ...................................................................................................38
Bảng 3.2. Kết quả pH môi trƣờng nuôi cấy virus và hiệu giá vắc xin ......................40

sởi bán thành phẩm nhóm I .......................................................................................40
Bảng 3.3. Kết quả pH môi trƣờng nuôi cấy virus và hiệu giá vắc xin ......................42
sởi bán thành phẩm nhóm II ......................................................................................42
Bảng 3.4. Kết quả pH môi trƣờng nuôi cấy virus và hiệu giá vắc xin ......................43
sởi bán thành phẩm nhóm III ....................................................................................43
Bảng 3.5. Kết quả pH của môi trƣờng nuôi cấy virus và hiệu giá của vắc xin .........45
sởi bán thành phẩm nhóm IV ....................................................................................45
Bảng 3.6. Kết quả pH môi trƣờng nuôi cấy virus và hiệu giá của vắc xin ...............46
sởi bán thành phẩm nhóm V .....................................................................................46
Bảng 3.7: Kết quả pH môi trƣờng và hiệu giá tƣơng ứng của 3 lô vắc ....................47
xin sởi bán thành phẩm từ nhóm I đến nhóm V ........................................................47
Bảng 3.8. Kết quả kiểm định chất lƣợng của 3 lô vắc xin sởi bán thành phẩm ........49
từ nhóm I đến nhóm V ..............................................................................................49
Bảng 3.9. Kết qủa tính toán hiệu suất sản xuất vắc xin sởi thành phẩm từ hiệu giá
các lô BTP nghiên cứu và sản xuất thƣờng quy ........................................................52

vi


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Nguồn gốc chủng AIK-C .............................................................................3
Hình 1.2 Cấu tạo của hạt virus sởi ..............................................................................7
Hình 1.3. Ảnh hƣởng của pH lên hiệu giá virus sởi chủng Edmonston .....................8
Hình 1.4: Hiệu giá của virus sởi ở các giá trị pH khác nhau ......................................9
Hình 1.5 Sự nhân lên của virus sởi ........................................................................... 11
Hình 1.6 Các virus sởi nẩy chồi qua màng sinh chất của TB phôi gà sau 72 giờ gây

nhiễm .........................................................................................................................13
Hình 1.7 Các virion virus sởi sau khi thoát ra khỏi màng TB phôi gà nằm tập trung
sát màng TB với đa dạng về kích thƣớc. ...................................................................13
Hình 3.1. Giá trị pH của môi trƣờng nuôi cấy virus tại các nồng độ NaHCO3 khác
nhau ...........................................................................................................................39
Hình 3.2. Đồ thị thể hiện giá trị pH của môi trƣờng nuôi cấy virus và hiệu giá của
vắc xin sởi bán thành phẩm nhóm I ..........................................................................41
Hình 3.3. Đồ thị thể hiện giá trị pH của môi trƣờng nuôi cấy virus và hiệu giá của
vắc xin sởi bán thành phẩm nhóm II .........................................................................42
Hình 3.4. Đồ thị thể hiện giá trị pH của môi trƣờng nuôi cấy viru và hiệu giá của
vắc xin sởi bán thành phẩm nhóm III ........................................................................44
Hình 3.5. Đồ thị thể hiện giá trị pH của môi trƣờng và hiệu giá của vắc xin sởi bán
thành phẩm nhóm IV .................................................................................................45
Hình 3.6. Đồ thị thể hiện giá trị pH của môi trƣờng và hiệu giá của vắc xin sởi bán
thành phẩm nhóm V ..................................................................................................47
Hình 3.7. Mối liên hệ giữa pH của môi trƣờng với hiệu giá của vắc xin sởi bán
thành phẩm từ nhóm I đến nhóm V ..........................................................................48
Hình 3.8: Hiệu giá vắc xin sởi bán thành phẩm sản xuất từ năm 2009 ÷ 2012 ........51

vii


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

MỞ ĐẦU
Bệnh sởi là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do virus sởi gây nên. Bệnh lây
nhiễm qua đƣờng hô hấp, tốc độ lan truyền nhanh và dễ lây thành dịch, đặc biệt là
trẻ em, tỷ lệ cảm nhiễm với sởi rất cao 90% trẻ chƣa có miễn dịch sẽ bị nhiễm bệnh

nếu tiếp xúc với bệnh nhân sởi. Bệnh có biểu hiện là sốt, dấu hiệu viêm đƣờng hô
hấp trên và điển hình là phát ban [2,3].
Bệnh sởi là nguyên nhân thứ năm gây tử vong cho trẻ dƣới 5 tuổi và đứng đầu
trong số các bệnh truyền nhiễm. Trƣớc khi có vắc xin sởi, bệnh thƣờng gây ra các
vụ bùng nổ dịch lớn trên khắp thế giới gây tử vong và để lại những biến chứng
nghiêm trọng. Những biến chứng do sởi chủ yếu là ỉa chảy, viêm phổi, viêm tai giữa
nặng hơn có thể viêm não để lại các di chứng về thần kinh[2,3,6]. Biện pháp hiệu
quả nhất để phòng ngừa và tiến tới thanh toán bệnh sởi là tiêm vắc xin sởi. Vắc xin
sởi là một trong những vắc xin có tỷ lệ đáp ứng miễn dịch cao, khả năng miễn dịch
kéo dài, hiệu lực bảo vệ của vắc xin sởi đạt trên 90% [7,8].
Từ năm 2008 trở về trƣớc thì toàn bộ vắc xin sởi sử dụng trong Chƣơng trình
TCMR đều phải nhập khẩu với giá thành cao và không chủ động. Từ thực tế đó,
POLYVAC đã đƣợc Bộ Y tế giao thực hiện dự án sản xuất vắc xin sởi - dự án hợp tác
giữa Chính phủ Nhật Bản và chính phủ Việt Nam với nguồn vốn ODA - nguồn vốn viện
trợ không hoàn lại của chính phủ Nhật Bản. Mục tiêu của dự án là xây dựng một cơ sở
sản xuất vắc xin sởi với công suất 7.5 triệu liều/năm đạt tiêu chuẩn GMP của WHO,
nhận chuyển giao kỹ thuật sản xuất vắc xin sởi tại Việt Nam, nhằm chủ động nguồn
cung cấp vắc xin sởi cho trẻ em Việt Nam và hƣớng tới xuất khẩu, giúp giảm gánh nặng
bệnh tật và giảm chi phí y tế do bệnh sởi gây nên.
Quy trình sản xuất vắc xin sởi đƣợc chuyển giao công nghệ hoàn toàn từ Viện
nghiên cứu Kitasato - Nhật Bản sang cho Polyvac từ nguyên liệu đầu đến vắc xin
Sởi thành phẩm. Trong đó, các giai đoạn sản xuất vắc xin sởi có liên quan mật thiết
với nhau, bên cạnh chủng virus và tế bào thì môi trƣờng nuôi cấy là một trong
những yếu tố đầu tiên quan trọng trong quá trình sản xuất vắc xin sởi.
Năm 2009 Polyvac đã thực hiện thành công việc nhận chuyển giao công nghệ
sản xuất vắc xin sởi từ Viện Kitasato - Nhật Bản và 1,3 triệu liều vắc xin sởi đầu
tiên đã đƣợc đƣa vào chƣơng trình tiêm chủng mở rộng quốc gia để sử dụng cho trẻ

1

LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

em. Thành công này ghi tên Việt Nam là 1 trong những quốc gia của khu vực Đông
Nam Á sản xuất đƣợc vắc xin sởi. Sự ra đời của vắc xin sởi đã đánh dấu bƣớc phát
triển của ngành sản xuất vắc xin Việt Nam.
Tuy nhiên, hiệu giá vắc xin sởi bán thành phẩm của Polyvac sản xuất còn chƣa
cao dẫn đến hiệu suất sản xuất còn thấp, làm tăng chi phí nhân công và chi phí sản
xuất và tăng giá thành vắc xin. Điều này có thể do một số yếu tố ảnh hƣởng liên
quan đến tính chất lý, hóa của virus sởi, trong đó có pH môi trƣờng sử dụng cho
nuôi cấy virus.
Với kinh nghiệm trong quá trình sản xuất vắc xin qua các năm, chúng tôi nhận
thấy ngoài các thành phần dinh dƣỡng có trong môi trƣờng, thì pH của môi trƣờng
nuôi cấy là một yếu tố quan trọng ảnh hƣởng tới sự phát triển và nhân lên của virus
sởi, qua đó quyết định tới hiệu giá của vắc xin. Do vậy, để nâng cao hiệu quả sản
xuất vắc xin sởi thì việc nghiên cứu tìm pH tối ƣu phù hợp với những điều kiện sản
xuất ở Việt Nam là rất quan trọng.
Trên cơ sở đó, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu:
“Nghiên cứu tìm pH tối ưu của môi trường nuôi cấy virus sử dụng cho sản
xuất vắc xin sởi bán thành phẩm tại Polyvac”.
Đề tài nghiên cứu nhằm giải quyết các mục tiêu sau:
Xác định pH tối ƣu của môi trƣờng nuôi cấy trong quy trình sản xuất vắc xin
sởi bán thành phẩm để thu đƣợc vắc xin sởi đạt hiệu giá cao nhất.
Nội dung của đề tài:
o Thực hiện sản xuất môi trƣờng nuôi cấy virus và sử dụng dung dịch NaHCO3
để điều chỉnh pH môi trƣờng ở 5 nồng độ NaHCO3 khác nhau.
o Thực hiện sản xuất 3 lô vắc xin sởi bán thành phẩm để nghiên cứu tìm dải
pH tối ƣu trong quy trình sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm.

o Thực hiện lấy mẫu và kiểm tra hiệu giá vắc xin của các nhóm nghiên cứu
bằng phƣơng pháp PFU (chuẩn độ hiệu giá bằng phƣơng pháp phủ thạch) để
lựa chọn đƣợc dải pH môi trƣờng tối ƣu cho sản xuất vắc xin sởi bán thành
phẩm đạt hiệu giá cao nhất.

2


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH SỞI TRÊN THẾ GIỚI
Sởi và bệnh sốt phát ban đã đƣợc biết đến từ thế kỷ 17. Đến thế kỷ 19 Nil
Filatow (1885) và Clement Dukes (1894) đã mô tả sự khác nhau giữa các loại sốt
phát ban. Năm 1900, Clement Dukes đề xuất gọi sởi là “bệnh phát ban thứ tư”.
Trong 1 thời gian dài, “bệnh phát ban thứ tư” là 1 trong những nguyên nhân tử
vong hàng đầu ở trẻ nhỏ.
Đến năm 1954 Enders và Peebles lần đầu tiên phân lập đƣợc virus sởi đã
đánh dấu một bƣớc tiến trong nghiên cứu bệnh sởi và trên cơ sở đó vắc xin sởi bất
hoạt đã ra đời. Tuy nhiên vắc xin sởi bất hoạt hiệu quả thấp, do vậy các nhà khoa
học đã nghiên cứu sản xuất vắc xin sống giảm độc lực. Sau 1 số lần cấy chuyển trên
tế bào phôi gà đã tạo ra đƣợc chủng virus giảm độc lực Edmonston A và B.

Edmonston

Edmonston A

Schwarz

AIK-C

FF-8

Beckenham 4A

Beckenham 16

ESC

Edmonstone B

Ed-Zagreb

Belgrade

Philips

Moraten

Hình 1.1 Nguồn gốc chủng AIK-C

Trên thế giới có nhiều chủng virus đƣợc sử dụng cho sản xuất vắc xin.
Trong đó chủng AIK-C đƣợc đánh giá là chủng có phản ứng phụ thấp nhất cũng
nhƣ tỷ lệ sốt trên 390C là thấp nhất. Đặc biệt chƣa ghi nhận bất kỳ một phản ứng
phụ nào trên hệ thần kinh trong khi tỷ lệ đáp ứng miễn dịch cao nhất so với các
chủng khác. Nhật Bản đã nghiên cứu sản xuất vắc xin sởi từ chủng Edmonston bằng
kỹ thuật đơn dòng trên tế bào thận cừu và tế bào phôi gà ở nhiệt độ 33 0C tạo chủng
AIK-C. Kết quả cho thấy virus phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 330C và phát triển rất

yếu hoặc không phát triển ở nhiệt độ 39 – 400C, chứng tỏ sự nhạy cảm với nhiệt của
virus sởi. Từ chủng AIK-C, vắc xin sởi đã đƣợc sản xuất và đƣa vào sử dụng rộng
rãi tại Nhật Bản. Đến năm 1963 vắc xin sống giảm độc lực đã đƣợc cấp phép lƣu

3


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

hành tại Mỹ và đã mang lại hiệu quả phòng bệnh cao, giảm đáng kể tỷ lệ mắc bệnh
và tử vong, thậm chí đã thanh toán đƣợc bệnh sởi ở một số nƣớc Châu Mỹ [14,15].
1.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC BỆNH SỞI
1.2.1 Phạm vi vật chủ
Ngƣời là vật chủ tự nhiên cho các virus sởi hoang dại. Ngoài ngƣời ra, ngƣời
ta không tìm thấy một động vật nào khác là vật chủ của virus sởi. Tuy nhiên khỉ
cũng có thể nhiễm với virus sởi, thông thƣờng bệnh gây bởi virus trên khỉ nhẹ hơn
gây trên ngƣời. Một số công bố cho thấy, có thể gây nhiễm với các chủng vắc xin
cho loài gậm nhấm mới sinh và còn bú bằng con đƣờng não tủy [3,5].
1.2.2 Phương thức lây truyền
Mầm bệnh sởi là virus sởi, virus sởi lây từ ngƣời sang ngƣời qua đƣờng hô
hấp. Mầm bệnh đƣợc thải ra khỏi ngƣời bệnh (nguồn truyền nhiễm thông qua nói, ho,
hắt hơi, mớm cơm, hôn... ). Sau khi ra khỏi nguồn truyền nhiễm, mầm bệnh tồn tại tạm
thời trong môi trƣờng không khí, bề mặt dụng cụ, mặt đất. Virus sởi có thể tồn tại trong
môi trƣờng không khí ít nhất 34 giờ nhƣng dễ bị tiêu diệt trong môi trƣờng khô, nóng.
Từ môi trƣờng không khí, bề mặt dụng cụ, virus xâm nhập vào cơ thể cảm nhiễm qua
đƣờng mũi họng, cƣ trú và nhân lên ở các tế bào niêm mạc biểu mô đƣờng hô hấp rồi
xâm nhập vào máu và gây bệnh cho cơ thể[2,3,5].
1.2.3 Tính cảm thụ - miễn dịch

Bệnh sởi lây rất nhanh, đến 90% số trẻ chƣa có miễn dịch sẽ bị bệnh nếu tiếp
xúc với bệnh nhân sởi. Bệnh thƣờng gây bùng nổ thành dịch và nếu ai chƣa có miễn
dịch đều có thể bị bệnh, bệnh sởi gặp ở mọi lứa tuổi, mọi giới. Tuy nhiên bệnh
thƣờng gặp ở trẻ nhỏ dƣới 5 tuổi hoặc tuổi đi học. Hầu hết các trƣờng hợp mắc bệnh
nặng thƣờng ở trẻ nhỏ từ 2 ÷ 6 tuổi và thanh, thiếu niên, trẻ suy dinh dƣỡng, suy
giảm miễn dịch. Ở trẻ nhỏ nếu trƣớc khi tiêm vắc xin mà không còn miễn dịch do
mẹ truyền, thì sau khi tiêm vắc xin cũng có miễn dịch suốt đời [5].
1.2.4 Biểu hiện quá trình dịch
Bệnh sởi có thể gây thành dịch ở khắp nơi trên thế giới, không phân biệt
quốc gia có khí hậu nhiệt đới, hàn đới hay ôn đới. Bệnh có thể gặp quanh năm
nhƣng mùa đông xuân gặp nhiều hơn mùa hè thu và có thể gây thành dịch. Trƣớc
khi có vắc xin, các vụ dịch thƣờng xảy ra theo chu kỳ 2 ÷ 4 năm và thƣờng vào mùa
đông – xuân ở các thành phố lớn. Lứa tuổi mắc bệnh thƣờng gặp nhất là 2 ÷ 6 tuổi.

4


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

1.3. VIRUS SỞI
1.3.1 Phân loại
Virus sởi là một trong 3 thành viên trong chi Morbillivirus thuộc họ
Paramyxoviridae, họ này gồm 3 nhóm 14,15].


Các Paramyxovidae:
o Para - influenza 1, 2, 3, 4 (á cúm)
o Virus quai bị

o Virus gây bệnh Newcastle (toi gà)
o Virus Sendai



Các virus Pneumo: Virus hợp bào đƣờng hô hấp



Các virus Morbilli:
o Virus sởi
o Virus gây bệnh Carre ở chó
o Virus dịch hạch bò
Ba virus thuộc chi Morbillivirus có mối liên quan chặt chẽ với nhau nhƣ

giống nhau về hình thái, kích thƣớc, đều là các týp đơn, gây bệnh giống nhau trên
vật chủ mẫn cảm và đặc biệt là đều gây hiệu lực hủy hoại trên nuôi cấy tế bào tạo
các hợp bào đa nhân, các tiểu thể trong bào tƣơng và trong nhân. Tuy bản chất có
nhiều tính chung nhƣng mỗi loài virus đó chỉ có 1 vật chủ riêng biệt. Tác dụng bảo
vệ chéo giữa 3 loại virus nhóm Morbillivirus cho thấy:
o Virus sởi không nhậy cảm và nhân lên ở bò.
o Các virus gây bệnh Carre, dịch hạch bò không nhậy cảm và nhân lên ở ngƣời.
Kết quả nghiên cứu về di truyền học cho thấy các chủng dòng Morbillivirus
có sự khác nhau về biểu vị (epitope) ở các thành phần kháng nguyên ngƣng kết
hồng cầu (HA) và ở Protein khuôn mẫu M.
1.3.2 Hình thái học
Những kết quả nghiên cứu dùng siêu ly tâm và kính hiển vi điện tử cho thấy
các virion sởi là những hạt có vỏ bọc, hình cầu, với lõi nucleocapsid xoắn cuộn hoặc
là hình sợi chỉ. Đƣờng kính của hạt có nhiều kích cỡ, thay đổi từ 120-250 nm, tính
trung bình là 150 nm. Quan sát hình thái học hạt virus sởi dƣới kính hiển vi điện tử

cho thấy bao quanh phía ngoài virion sởi là một vỏ bọc dầy 10-20nm, gồm các

5


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

glycoprotein và lipit tạo thành một vòng sẫm mầu, có đƣờng kính 30-60nm.
Nucleocapsit của virus sởi chỉ gồm 1 sợi ARN đơn có trọng lƣợng phân tử 6.2 ÷
6.4x106 Dalton và rất nhiều protein lõi cuộn xoắn ốc [14,15].
1.3.3 Thành phần hóa học
 Axit nucleic:
ARN đƣợc tách chiết từ các hạt virus và nucleocapsit sởi tinh chế có hệ số
lắng 50 – 52S trên gradien tỷ trọng sucroza với trọng lƣợng phân tử 4.5 x 106 đến
6.4 x 106 Dalton.
Genom của virus sởi là một sợi ARN âm (-), kết hợp với 1 menpolyemeraza
phụ thuộc ARN đƣợc gọi là transcriptaza. Tổng thể ARN – Transcriptaza nằm trong
một capsit hình soắn ốc, cuộn lại bên trong 1 vỏ bọc có gai. Ikegami (1978) đã nêu
rõ, ARN của virus sởi gồm một chuỗi gần 10.000 nucleotit, ƣớc lƣợng là có thể mã
hóa cho khoảng 10 protein có trọng lƣợng phân tử trung bình. Cũng giống nhƣ các
virus khác, axit nucleic của virus sởi có cấu trúc một sợi mở.
 Thành phần Protein virus:
Những tiến bộ trong kỹ thuật tinh chế và xác định tính chất sinh học và phân
tử của các hạt virion sởi nguyên vẹn nhận thấy chúng có chứa các thành phần cấu
trúc đại phân tử. Các hạt virus tinh chế, bằng phân tích trên gen polyacrylamit
(SDS-PAGE), có chứa ít nhất 6 chuỗi polypeptit đặc hiệu. Các chuỗi polypeptit có
trọng lƣợng phân tử đƣợc xác định nhƣ sau:
o Protein L (Large):

180 – 200K

o Protein P (Polymeraza):

70K

o Protein H (Hemagglutinin):

70 – 80K

o Protein F (Fusion):

56 – 60K

o Protein M (Matrix):

36 – 37K

o Protein NP (Nucleoprotein):

60K

Các Protein virus có chức năng riêng biệt, trong đó 3 protein tạo phức hợp
với ARN virus (L, NP và P) và 3 protein còn lại tham gia vào kết cấu của vỏ bọc
(H, M và F). Protein trội nhất là NP, có trọng lƣợng phân tử 60K và là 1 protein gắn
photphat, có chức năng bảo vệ ARN virus.
o Thành phần protein L chỉ chiếm hàm lƣợng giới hạn.
o Protein P (Polymeraza) có độ nhạy cao với các enzyme ly giải protein
o Cả hai protein L và P đều tham gia vào thành phần các phức hợp phiên mã.

6


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

1.3.4 Cấu trúc
Vật liệu di truyền của virus sởi là ARN đơn âm. Virus có hình cầu không
đồng nhất với kích thƣớc từ 150 - 200nm. Vỏ virus bao gồm 2 lớp lipit. Trên bề mặt
có 2 loại glycoprotein ký hiệu là H và F chúng tạo nên những gai nhô lên trên bề
mặt virus. Protein H (hemagglutinin) có chức năng ngƣng kết hồng cầu và bám dính
lên bề mặt tế bào trong khi đó, protein F (fusion) tạo ra các cầu nối liên kết các tế
bào với nhau. Protein M (matrix) tạo nên một lớp nền ở bên trong vỏ. Protein NP
tạo nên các nucleocapsit bao quanh ARN hình xoắn ốc. Protein P (photphorynate)
và L (large) cũng đƣợc chứa trong nucleocapsit và liên quan đến quá trình sao chép
ARN [14,15].

Hình 1.2 Cấu tạo của hạt virus sởi
H: Hemagglutinin protein ; F: Fusion protein; M: Matrix protein;
L: Large protein: NP: Nucleoprotein, P: Photphorynate protein

1.3.5 Đặc tính của virus sởi
Virus sởi sống, giảm độc lực dùng để sản xuất vắc xin đƣợc các nhà khoa
học chứng minh là rất nhạy cảm với nhiệt độ, ánh sáng và pH của môi trƣờng nuôi
cấy… Theo nghiên cứu tại Viện Kitasato, chủng virus vắc xin sởi AIK-C có nhiệt
độ sinh trƣởng tối ƣu là 33oC và sinh trƣởng rất kém hay không sinh trƣởng ở nhiệt
độ 39 ÷ 40oC. Khi nuôi cấy virus, hiệu giá chủng virus sởi đạt cao nhất trong

7


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

khoảng pH môi trƣờng từ 7.0 – 8.0. Hiệu giá virus sởi giảm nhanh ở pH dƣới 7.0 và
trên 8.0 [20].

Hình 1.3. Ảnh hƣởng của pH lên hiệu giá virus sởi chủng Edmonston

Virus sởi có sức đề kháng yếu, nhậy cảm với nhiệt độ, ở 4oC trong 2 tuần có thể
còn khả năng gây nhiễm, ở 56oC nó bị phá hủy trong vòng 30 phút. Còn ở 37oC chỉ
trong vòng 2 giờ mất 1/2 hoạt tính gây nhiễm. Nó bị bất hoạt bởi ánh sáng, siêu âm,
cồn, formalin, tia cực tím. Sức đề kháng của virus sởi sẽ cao hơn nếu đƣợc bảo quản
ở dạng đông khô và có thêm các chất bảo quản nhƣ S.Glutamate, D.Sorbitol,
Lactose, Gelatine [12, 26].
Một số tác giả nghiên cứu hiệu giá tồn dƣ của virus sởi ở các dải pH khác nhau
bằng cách trộn 1 thể tích virus sởi với 2 thể tích dịch đệm để lạnh với giá trị pH
khác nhau và ủ trong bể đựng nƣớc đá trong 3 giờ. Số lƣợng virus đƣợc xác định
thông qua việc đếm số đám hoại tử. Kết quả cho thấy virus sởi ổn định nhất ở điều
kiện pH môi trƣờng là 7.6 và virus sởi sẽ bị bất hoạt nhanh chóng ở cả môi trƣờng
pH axit và pH kiềm [12, 26].

8


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Hiệu giá tồn dƣ (%)

Hình 1.4: Hiệu giá của virus sởi ở các giá trị pH khác nhau

Tính bền vững:
Virus sởi rất nhậy cảm với các chất tẩy rửa hoặc các dung môi hòa tan lipid nhƣ
aceton. Virus sởi có sức đề kháng yếu, nhậy cảm với nhiệt độ. Virus sởi dễ dàng bị
bất hoạt ở pH < 4.5. Nó bị bất hoạt bởi ánh sáng, siêu âm, cồn, formalin, tia cực tím.
Tính ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin)
Không giống các thành viên của họ Morbillivirus, virus sởi có hoạt tính ngƣng
kết hồng cầu mà chỉ ngƣng kết hồng cầu khỉ: Rheus, Patas, Vervet monkey và
baboon. Hồng cầu ngƣời không bị ngƣng kết. Protein H của virus sởi tấn công đến
tế bào hấp phụ rồi nhân lên trên tế bào. Các tế bào nhiễm virus sởi (In vitro) gặp
hồng cầu khỉ thì sẽ ngƣng kết các hồng cầu lại nhƣ dạng “bông hồng”. Với ngƣời là
vật chủ của virus sởi do vậy virus sởi không ngƣng kết hồng cầu ngƣời.
Tính tan huyết (haemolysis)
Khả năng ly giải hồng cầu của virus sởi là do Protein F của virus. Hoạt tính ly
giải hồng cầu cũng phụ thuộc vào hai yếu tố pH và nhiệt độ. Nhiệt độ tan huyết tốt
nhất là 37 oC và pH thích hợp nhất là 7.4. Khả năng các Paramyxovirus gây ra CPE
trên tế bào cũng ở pH trung tính và tạo thành các tế bào khổng lồ.

9


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Kháng nguyên của virus sởi
Virus sởi chỉ có 1 typ kháng nguyên, phân tích đặc tính di truyền của virus sởi
lƣu hành ở các vùng khác nhau cho thấy sự khác biệt về trình tự các nucleotide thì ở
Việt Nam chỉ khác nhau <1.8%. Chủng Việt Nam và các nƣớc có cùng một
genotype 4 – 6% và so với khác genotype là 6.1 – 10.9%.
Norrby và Gellman đã miêu tả 4 cấu trúc kháng nguyên của virus sởi:
 Kháng nguyên ngƣng kết hồng cầu
 Kháng nguyên tan máu
 Kháng nguyên trung hòa
 Kháng nguyên kết hợp bổ thể
Trong đó, hai kháng nguyên chính để nhận biết virus sởi là kháng nguyên ngƣng
kết hồng cầu và kháng nguyên tan máu. Các nghiên cứu cho thấy kháng nguyên gây
ngƣng kết hồng cầu là kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch bảo vệ vì khi tiêm
kháng nguyên ngƣng kết hồng cầu tinh khiết cho ngƣời và động vật thấy xuất hiện
kháng thể kháng sởi với hiệu giá cao, giống nhƣ gây miễn dịch bằng vắc xin sởi bất
hoạt bởi formalin. Sự tác động giữa kháng nguyên ngƣng kết hồng cầu của virus sởi
với hồng cầu khỉ chủ yếu là do phản ứng enzyme vì tốc độ phản ứng ngƣng kết
hồng cầu tăng khi nhiệt độ tăng đến 37°C. Rất có thể ban đầu enzyme của virus phá
hủy một số cấu trúc trên bề mặt hồng cầu, sau đó các thụ thể đƣợc bộc lộ, tạo điều
kiện để gây ngƣng kết hồng cầu 14,15, 26]. Kháng nguyên ngƣng kết hồng cầu bền
ở 60°C trong hơn 1 giờ, không bị phá hủy bởi các enzyme phá hủy thụ thể. Các
kháng nguyên ngƣng kết hồng cầu cũng không nhạy cảm với các enzyme ARN-ase
và ADN-ase [14,15].
Kháng nguyên tan máu là một glycoprotein có trên bề mặt vỏ ngoài virus với
chức năng dung hợp tế bào để tạo các hợp bào. Hoạt tính tan máu của virus sởi có
liên quan chặt chẽ với khả năng gây hủy hoại tế bào sớm, nó giúp cho virus sởi dễ
dàng xâm nhập vào bên trong tế bào và tƣơng ứng với khả năng gây nhiễm của
virus. Kháng nguyên tan máu có pH thích hợp là 8.0 [14,15].
Kháng nguyên trung hòa nằm ở vỏ ngoài virus và tham gia vào phản ứng trung
hòa. Protein H đóng vai trò chính trong sinh miễn dịch của virus. Các kháng thể

kháng trực tiếp Polypeptid này có cả 2 hoạt tính ức chế ngƣng kết hồng cầu và trung

10


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

hòa. Chức năng của protein H là tấn công và bám vào các receptor của tế bào chủ,
từ đó lọt đƣợc vào trong tế bào để virus nhân lên.
Kháng nguyên kết hợp với bổ thể là cấu trúc chính của nucleocapsit là dạng
kháng nguyên hòa tan, bị phân hủy bởi ether, từ dó có thể tách các thành phần kết
hợp bổ thể có kích thƣớc khoảng 13nm.
1.3.6 Quá trình nhân lên của virus sởi trên tế bào
1.3.6.1 Quá trình sinh tổng hợp virus
Chu kỳ nhân lên của virus sởi giống các Paramyxovirus có vật liệu di truyền là
ARN. Quá trình nhân lên của virus sởi bao gồm 5 giai đoạn [12,14].

Tổng hợp
mRNA

Dung hợp

Sao chép

Sao chép
Dịch mã và biến đổi

Nảy chồi

Hình 1.5 Sự nhân lên của virus sởi

Hấp phụ và thâm nhập:
Một trong những điều quan trọng nhất là khả năng nhận biết các receptor đặc
hiệu trên bề mặt của tế bào đích, điều đó cho phép virus sởi gắn vào màng tế bào và
phân hủy bởi enzyme. Sau đó nucleocapsit thâm nhập vào bên trong bào tƣơng.
Phiên mã ARN của virus:

11


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

ARN của virus sởi là một sợi đơn âm (-) Genom của nó là một phân tử liên tục,
là khuôn mẫu để tổng hợp các ARN thông tin (ARNm). Virus có một polymeraza
đặc hiệu gọi là transcriptaza. Nếu thiếu polymeraza này thì ARN của virus không
còn có khả năng gây nhiễm. Sợi ARN (-) làm khuôn mẫu để tổng hợp ARNm với 3
tiểu đơn vị, từ đó tổng hợp các protein của virus. ARNm mang đoạn poly (A) có 70
– 140 nucleotid ở đầu 3’. ARN genom không có đoạn poly (A). Bằng phƣơng pháp
Clon gen di truyền, một số tác giả nghiên cứu thấy đoạn đầu cùng 3’ là các gen NP,
P và M. ARN(-) của tiểu đơn vị 52s là khuôn để tổng hợp ARN(+). Chính sợi
ARN(+) này đến lƣợt làm khuôn để tổng hợp sợi ARN(-) và chính ARN(-) đƣợc
bọc trong vỏ capsit.
Dịch mã (tổng hợp protein của virus):
Protein đƣợc tổng hợp trƣớc tiên là Nucleocapsit (NP). Sau đó lần lƣợt 6 chuỗi
polypeptid đƣợc tổng hợp trong bào tƣơng. Các protein H và F xuất hiện ở vùng
quanh nhân, sau đó di chuyển ra phía ngoài màng và tập hợp trong bào tƣơng.

Lắp ráp và hoàn chỉnh:
Sự lắp ráp các nucleocapsit của virus sởi đƣợc thực hiện ở màng bào tƣơng gồm
4 giai đoạn:
o Hỗn hợp các glycoprotein virus bên trong màng bào tƣơng.
o Hình thành các gai H và F hƣớng ra bên ngoài.
o Sắp xếp vào các vị trí ở lớp protein phía mặt trong của màng.
o Nối các nucleocapsit phía dƣới và phía trên tiếp xúc với màng bọc
ARN lại để hình thành một hạt virus mới. Các nucleocapsit dƣ thừa tập
hợp lại dƣới dạng tiểu thể lớn trong bào tƣơng có thể quan sát đƣợc
dƣới kính hiển vi điện tử hoặc kính hiển vi quang học.
Nảy chồi và giải phóng hạt virus:
Các hạt virion hoàn chỉnh tiến sát màng bào tƣơng của tế bào đã bị biến đổi và
từ màng này sẽ tạo thành vỏ bọc virus. Màng tế bào vỡ ra và giải phóng hạt virus
hoàn chỉnh ra khỏi tế bào và lại bắt đầu 1 chu kỳ mới.
1.3.6.2 Gây nhiễm virus sởi trên tế bào
Nhiều loại tế bào nhạy cảm với virus sởi nhƣ tế bào thận khỉ, thận ngƣời,
thận chuột lang, thận cừu, tế bào phôi gà tiên phát, các loại tế bào thƣờng trực nhƣ:

12


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Vero, KB (tế bào ung thƣ biểu mô hầu họng) và Hela. Tế bào B95a đƣợc chuyển thể
bởi virus Epstein-Barr từ nguyên bào lympho của khỉ đuôi sóc gần đây đƣợc xem là
nhạy cảm nhất với virus sởi. Tỷ lệ nhân lên của virus sởi là thấp. Chúng bắt đầu
nhân lên trong tế bào cả Vero và KB sau 20 giờ xâm nhiễm và chúng đạt đỉnh cao
vào ngày thứ 4-6. Số lƣợng virus tạo ra trên tế bào KB vẫn giữ ở tỷ lệ cao cho đến

ngày thứ 12. Trong thời gian đó tế bào chủ dần dần thoái hoá. Số lƣợng virus giải
phóng ra ngoài chỉ bằng 1/10 - 1/100 số lƣợng virus đƣợc tổng hợp và số còn lại
đều dính chặt vào tế bào chủ.
Gây nhiễm virus sởi trên tế bào phôi gà đƣợc sử dụng để sản xuất vắc xin sởi
sống, giảm độc lực. Khả năng nhân lên của virus sởi có thể đƣợc xác định bằng kỹ
thuật tạo đám hoại tử trên tế bào nuôi.

Hình 1.6 Các virus sởi nẩy chồi qua màng Hình 1.7 Các virion virus sởi sau khi thoát
sinh chất của TB phôi gà sau 72 giờ gây ra khỏi màng TB phôi gà nằm tập trung sát
màng TB với đa dạng về kích thƣớc.

nhiễm

1.3.6.3 Bản chất của hiện tượng hủy hoại tế bào
Sự nhân lên của virus sởi không liên quan đến sự giảm sút quá trình trao đổi
chất của tế bào chủ. Trong tất cả các trƣờng hợp không có sự phá vỡ một cách nhanh
chóng tế bào, ngƣợc lại tế bào vẫn còn khả năng trao đổi chất trong thời gian dài. Tuy
nhiên sự tổng hợp các protein capsit xâm nhập chậm chạp và đôi khi làm ngừng quá
trình tổng hợp ARN, AND và protein của tế bào chủ. Tác động hủy hoại có hai dạng:
o Dạng 1:
Tƣơng đối điển hình, do hiện tƣợng liên hợp của tế bào trong quá trình nhân
lên của virus sởi đƣợc miêu tả bởi Enders và Peebles. Virus gây ra sự xáo trộn
chức năng phân chia của tế bào dẫn đến sự hình thành các tế bào khổng lồ đa nhân

13


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

(thƣờng từ hàng chục đến hàng trăm nhân). Các tế bào khổng lồ đa nhân này là đặc
tính tác nhân của các chủng virus hoang dại. Những tế bào khổng lồ này giống các
tế bào khổng lồ thấy ở bệnh phẩm bệnh lý từ bệnh nhân đƣợc chuẩn đoán nhiễm
sởi. Trong tổ chức nuôi cấy, các tế bào khổng lồ có liên quan đến sự gây nhiễm cao
và giảm thấp các interferon.
o Dạng 2:
Ngƣợc lại không có sự liên hợp. Các tế bào co rút lại tạo thành các hình sợi
hoặc con thoi. Ngƣời ta cũng có thể tìm thấy các đám tế bào hình tròn, dạng gây
độc này điển hình cho các chủng vắc xin sởi. Nó liên quan đến sự giảm tính gây
nhiễm nhƣng tăng hiệu giá ngƣng kết và tăng sự sản sinh ra các interferon. Trong
các huyền dịch tế bào gây nhiễm nhuộm bằng hematoxyline – eosine, ngƣời ta thấy
sự có mặt của các tiểu thể trong bào tƣơng và trong nhân. Tiểu thể chủ yếu tìm
thấy trong những tế bào đa nhân. Trong tƣơng bào chúng xuất hiện một ngày sau
gây nhiễm, còn trong nhân mãi đến ngày thứ 7 – 9 . Trƣớc khi xuất hiện các tiểu
thể trong nhân, nhận thấy sự biến đổi các nhân con. Những tiểu thể trong tƣơng
bào ở những giai đoạn sớm chứa nhiều ARN, ở giai đoạn muộn chứa ít hơn. Đó là
do trong những giai đoạn muộn virus phân tán trong bào tƣơng. Những tiểu thể
trong nhân chứa ít ARN hơn, vì đó không phải là nơi nhân lên của virus. Các
nghiên cứu bằng kính hiển vi điện tử quan sát thấy các tiểu thể có trong bào tƣơng
nhiều hơn trong nhân.
1.3.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của TB và sự nhân lên của virus
Để sản xuất đƣợc vắc xin virus bằng công nghệ nuôi cấy tế bào thì điều kiện
đầu tiên là phải lựa chọn đƣợc chủng virus vắc xin và dòng tế bào phù hợp cho
virus phát triển và nhân lên. Tại Polyvac, chúng tôi sử dụng chủng virus vắc xin sởi
AIK-C nhận từ Viện Kitasato, Nhật Bản và tế bào phôi gà tiên phát một lớp đƣợc
tách từ trứng gà SPF có phôi 9 ngày tuổi để sản xuất vắc xin sởi.
Để nuôi cấy tế bào và giúp cho sự nhân lên của virus sau khi gây nhiễm trên
tế bào trong quá trình sản xuất vắc xin sởi thì môi trƣờng nuôi cấy là một yếu tố
quan trọng mang tính chất quyết định, ảnh hƣởng tới sự phát triển của tế bào và sự

nhân lên của virus. Vì thế cần đặc biệt lƣu ý khi pha chế môi trƣờng nuôi cấy, phải

14


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

đảm bảo đầy đủ về thành phần và chính xác về hàm lƣợng các chất dinh dƣỡng (đa
lƣợng, vi lƣợng, nguồn Carbon), chất điều hòa sinh trƣởng… Một yếu tố rất quan
trọng đó là pH của môi trƣờng nuôi cấy, pH không chỉ ảnh hƣởng đến khả năng hòa
tan các chất khoáng mà còn ảnh hƣởng đến hoạt tính của các chất điều hòa sinh
trƣởng, các chất điều hòa sinh trƣởng sẽ bị mất hoạt tính nếu pH quá acid hoặc quá
kiềm [33].
Thành phần môi trƣờng nuôi cấy tế bào đƣợc thiết lập gần giống nhƣ thành
phần dịch lỏng trong cơ thể sống bao gồm muối vô cơ, carbonhydrate, vitamin, axit
amin, các tiền chất biến dƣỡng, nhân tố tăng trƣởng, hormone, các yếu tố vi lƣợng
và đặc biệt quan trọng là huyết thanh. Các chất dinh dƣỡng thiết yếu giúp tế bào
phân chia nhƣ amino acid, acid béo, đƣờng, các ion, các vitamin, cofactor và các
phân tử cần thiết để duy trì môi trƣờng hóa học cho các tế bào. Có hai loại môi
trƣờng để nuôi cấy tế bào:
o Nhóm môi trường tự nhiên là những môi trƣờng chứa các hợp chất tự nhiên
nhƣ Lactabumin hydrolysat, huyết thanh, tinh chế mô phôi (gà, ngƣời…)
o Nhóm môi trường tổng hợp là những môi trƣờng đƣợc chế từ các chất hóa học
nhƣ các axit amin, các vitamin, các muối khoáng…
Việc phát hiện ra khả năng nuôi cấy TBĐV ở mức in vitro cũng dẫn tới những
nỗ lực tìm kiếm các môi trƣờng nhân tạo với các thành phần phù hợp để nuôi cấy
chúng. Cho đến nay, các môi trƣờng nhân tạo này đã đáp ứng đƣợc việc nuôi cấy
TBĐV và đảm bảo cho sự phát triển của rất nhiều loại tế bào khác nhau. Từ loại

môi trƣờng cơ bản đƣợc hình thành ban đầu mang tên “Basal media of Eagle” 34]
đã xuất hiện thêm các môi trƣờng có thành phần phức tạp hơn nhƣ M199, DMEM.
Thành phần của các loại môi trƣờng tuy khác nhau nhƣng đều có chung một yếu tố
nhất định là chứa các axit amin thiết yếu, vitamin, muối, đƣờng glucose và huyết
thanh.
Axit amin: Trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào, các axit amin đƣợc cho vào môi
trƣờng nuôi cấy, chúng đƣợc sử dụngcho việc tổng hợp protein và axit nucleic,
tham gia vào qúa trình vận chuyển ion. Bởi vì các axit amin là lƣỡng tính, phản ứng
nhƣ là axit và bazơ. Các axit amin tự do có thể đóng vai trò nhƣ là các chất đệm.
Cũng giống nhƣ các tế bào trong cơ thể, TBĐV nuôi cấy in vitro cần đƣợc bổ sung

15


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

các axit amin thiết yếu, các axit amin cần thiết là các axit amin mà tế bào không tự
tổng hợp đƣợc nhƣ: Arginin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, methionin,
Phenylaanin, Thrionin, Tryptophan, valin. Bên cạnh đó, các tế bào nuôi cấy còn cần
thêm 3 axit amin quan trọng nữa là Cysteine, Glutamine và Tyrosine. Các tế bào
chức năng sản xuất nhƣ tế bào gan có thể tự tổng hợp đƣợc Tyrosine từ
phenylalanine, hay tế bào gan và thận đều có thể tự tổng hợp đƣợc glutamine. Các
axit amin còn lại và proline, các tế bào trong cơ thể hay nuôi cấy in vitro đều có thể
tự tổng hợp đƣợc .
Tuy nhiên nhu cầu về Cystein và Tyrosine thay đổi khác nhau tùy theo từng
dòng tế bào. Nồng độ của axit amin thƣờng hạn chế mật độ tối đa của tế bào và sự
cân bằng của axit amin sẽ ảnh hƣởng đến sự sống và tốc độ tăng trƣởng của tế bào.
Glutamine cần thiết cho hầu hết các dòng tế bào, các tế bào giữ chức năng vận

chuyển đòi hỏi cao vế Glutamine.
Trong môi trƣờng nuôi cấy lơ lửng và các công nghệ nuôi cấy đặc biệt khác
có thể đòi hỏi thêm các axit amin khác chẳng hạn nhƣ Serin cho việc phát triển tế
bào đơn lẻ. Vì vậy các axit amin khác ngoài 10 axit amin không thể thay thế thƣờng
đƣợc thêm vào hầu hết các môi trƣờng nuôi cấy tế bào. Vì các tế bào chỉ sử dụng
các đồng phân L của các axit amin, các đồng phân D có thể bị hạn chế, nhìn chung
trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào chỉ chứa các L axit amin. Những axit amin mà tế
bào không tự tổng hợp đƣợc là nhu cầu tối cần thiết cho sự phát triển của tế bào vì
nó là nguồn dƣ trữ tạo ADN và protein trong tế bào giúp tế bào sống và phát triển
tốt sau khi nuôi cấy. Hiện nay, một số nghiên cứu cho thấy rằng Glutamate đƣợc sử
dụng trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào nhƣ nguồn cung cấp năng lƣợng và carbon.
Vitamin:
Khi tăng thành phần môi trƣờng lên (mục đích để giảm hàm lƣợng huyết
thanh xuống) thì danh sách các Vitamin môi trƣờng cũng tăng theo. Khi mật độ tế
bào trong môi trƣờng thấp (trong giai đoạn nhân dòng tế bào) thì cần phải tăng
lƣợng Vitamin cho dù trong môi trƣờng đã có sự hiện diện của huyết thanh. Sự hạn
chế về Vitamin có ảnh hƣởng rõ rệt trên sức sống và tốc độ tăng trƣởng của tế bào
hơn là trên mật độ tế bào.

16


LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Muối:
Các loại muối chủ yếu là thành phần chính tạo ra áp suất của môi trƣờng.
Trong huyền phù tế bào, lƣợng thƣờng đƣợc giẩm xuống để hạn chế sự kết cụm
của tế bào. Nồng độ đƣợc xác định bằng nồng độ CO2 ở dạng khí.

Glucose: Đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy để cung cấp năng lƣợng.
Dung dịch đệm:
Khi trong môi trƣờng có dung dịch muối cân bằng thì khả năng đệm của
dung dịch đệm bị hạn chế, đó là do sự hiện diện của phosphate. Trong những môi
trƣờng đòi hỏi cần có dung dịch đệm thì lƣợng phải tƣơng đƣơng với lƣợng CO2 ở
dạng khí khi bình nuôi cấy mở nắp.
Khoáng chất:
Cũng nhƣ một vài loại Vitamin, hầu hết các khoáng chất cần thiết cho tế bào
đƣợc cung cấp bởi huyết thanh. Việc bổ xung các chất này vào môi trƣờng nói
chung không cần thiết làm, trừ khi có sự giảm lƣợng huyết thanh trong môi trƣờng.
Trong môi trƣờng có hàm lƣợng huyết thanh thấp hoặc hoàn toàn không có huyết
thanh thì lúc đó cần phải bổ sung sắt, đồng, kẽm, selenium vào môi trƣờng nuôi cấy.
Các chất hữu cơ khác:
Các hợp chất khác nhau nhƣ nucleoside, các chất trung gian của chu trình
Krebs, Pyruvate và lipid cũng có mặt trong môi trƣờng nuôi cấy phức tạp. Những
hợp chất này cần thiết khi giảm lƣợng huyết thanh trong môi trƣờng nuôi cấy. Các
chất này có vai trò trong nhân dòng và duy trì các dòng chuyên biệt.
Huyết thanh:
Ngoài những yếu tố kể trên, việc bổ sung 5 - 20% huyết thanh động vật vào
môi trƣờng là cần thiết. Huyết thanh là hỗn hợp của hàng trăm protein các loại kèm
theo các yếu tố phát triển, các hormone sinh trƣởng và cả insulin. Vì vậy, ngƣời ta
cho rằng huyết thanh cung cấp các yếu tố kích thích sinh trƣởng và là nguồn
protein dồi dào cho tế bào nuôi cấy in vitro. Bên cạnh đó huyết thanh còn giữ vai
trò quan trọng trong sự bám dính của tế bào lên bề mặt cơ chất nuôi cấy. Trong
trƣờng hợp không đƣợc sử dụng huyết thanh nhƣ khi nghiên cứu biệt hoá tế bào
gốc thì một số thành phần khác cần đƣợc bổ sung nhƣ axit linoneic, axit lipoic,
putrescine, pyruvate, thymidine, các axit amin nhƣ L-alanine, L-asparagine, một số

17

LÊ TUẤN ANH 2013B

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

yếu tố vi lƣợng nhƣ Mn, Mo, Ni, Se, Si, Sn, V, Cd, các yếu tố sinh trƣởng và
hormone sinh trƣởng nhƣ insulin, transferring, hydrocortisol... [10,13].
Đƣợc cung cấp đầy đủ các yếu tố cần thiết kể trên từ môi trƣờng, tế bào nuôi
cấy có đủ khả năng tự tổng hợp các tiền chất của các axit nucleic để thực hiện quá
trình sinh trƣởng và phân chia của mình ở mức in vitro, duy trì đƣợc sự phát triển
ổn định trong quá trình nuôi cấy.
Điều kiện nhiệt độ và điều kiện môi trƣờng khí quyển trong khu vực nuôi cấy
rất cần thiết cho quá trình nuôi cấy TBĐV in vitro. Nhiều nghiên cứu cho thấy nhiệt
độ thích hợp nhất cho các tế bào nuôi cấy phát triển là 36.5-370C. Đây là nhiệt độ
cơ thể bình thƣờng của nhiều loài động vật. Sau khi đƣợc tách khỏi cơ thể, sống
trong nuôi cấy in vitro, các tế bào cũng yêu cầu điều kiện nhiệt độ tƣơng thích nhƣ
trong cơ thể sống để có thể phát triển và thực hiện các chức năng.
Về điều kiện môi trƣờng khí quyển trong khu vực nuôi cấy ví dụ nhƣ trong
tủ ấm thì nồng độ Oxygen và khí CO2 đƣợc xem là có ảnh hƣởng lớn nhất đến khả
năng phát triển của tế bào nuôi cấy.
Các loại tế bào hay mô khác nhau có yêu cầu khác nhau về nồng độ oxygen
trong môi trƣờng. Trong khi hầu hết các tế bào nuôi cấy in vitro chỉ cần có nồng độ
oxygen thấp 4] thì một số mô tế bào nhƣ phôi ở giai đoạn sớm lại yêu cầu thành
phần oxygen lên tới 95% trong khí quyển nuôi cấy chúng 35]. Sự khác biệt này chủ
yếu do các tế bào nuôi cấy dàn trải trên bề mặt nuôi cấy nên có thể dễ dàng tiếp xúc
với oxygen khuyếch tán và hoà tan trong môi trƣờng, ngƣợc lại các tế bào ở sâu
trong mô nuôi cấy không đƣợc tiếp xúc trực tiếp với môi trƣờng nên lƣợng oxygen
hoà tan cần cao hơn nhiều lần để thẩm thấu với hàm lƣợng cao hơn và tế bào nội mô
có thể hấp thụ đƣợc. Ngoài ra, trong môi trƣờng nuôi cấy không có huyết thanh thì vai
trò của oxygen hoà tan rất quan trọng, do đó nồng độ oxygen trong môi trƣờng thiết bị

nuôi cấy cần đƣợc quan tâm để đảm bảo cho sự phát triển phù hợp của tế bào. Bên
cạnh đó, môi trƣờng nuôi cấy luôn cần đƣợc duy trì lƣợng oxygen hoà tan trong đó,
giúp cho tế bào có đủ lƣợng oxygen cần thiết cho hoạt động sống của chúng.
Hàm lƣợng khí CO2 cũng đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình nuôi
cấy TBĐV in vitro bởi vì nó đƣợc xem là một trong những yếu tố duy trì độ pH cho
môi trƣờng nuôi cấy luôn ở trung tính, phù hợp cho tế bào phát triển.

18