Nghiên cứu thu nhận peptit kìm hãm enzym chuyển hóa angiotensin từ thủy phân protein đậu tương bằng enzym và khả năng ứng dụng

Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến cô giáo hướng dẫn PGS.TS.
Trần Liên Hà – giảng viên Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm
trường đại học Bách khoa Hà Nội, người đã luôn luôn hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ Sinh học
và Thực phẩm, các cán bộ phòng thí nghiệm của Viện công nghệ Sinh học và Thực
phẩm, các bạn sinh viên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, tận tình giúp đỡ tôi để hoàn
thành luận văn.
Cuối cùng tôi xin gửi tới gia đình, bạn bè, những tình cảm tốt đẹp nhất vì
sự động viên, quan tâm, giúp đỡ của mọi người dành cho tôi trong thời gian làm
luận văn.
Hà Nội, ngày

tháng 9 năm 2011
Học viên

Trương Thị Ngọc Hồi

Luận văn thạc sỹ khoa học

1

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu luận văn khoa học của tôi.
Các kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực, các thông số, kết quả
tính toán được là hoàn toàn chính xác và chưa được công bố ở bất kỳ công trình
nghiên cứu nào khác.
Hà Nội, ngày

tháng 9 năm 2011
Học viên

Trương Thị Ngọc Hồi

Luận văn thạc sỹ khoa học

2

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................1
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................2
MỤC LỤC..............................................................................................................3

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................6
DANH MỤC CÁC BẢNG.....................................................................................7
DANH MỤC CÁC HÌNH......................................................................................9
MỞ ĐẦU..............................................................................................................11
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................13
1.1. Giới thiệu về enzym chuyển hóa angiotensin (ACE) ........................................ 13
1.1.1. Angiotensin ................................................................................................ 13
1.1.2. Cấu trúc hóa học của enzym chuyển hóa angiotensin (ACE) ................... 13
1.1.3. Tính chất của ACE .................................................................................... 14
1.2. Bệnh cao huyết áp ở người và vai trò của ACE trong bệnh cao huyết áp......... 16
1.2.1. Bệnh cao huyết áp ở người........................................................................ 16
1.2.2. Hệ thống Renin-Angiotensin-Aldosterol (RAAS) ...................................... 17
1.2.3. Hệ thống Kinin-Nitric-Oxide (KNOS)....................................................... 18
1.3. Các peptit ức chế enzym chuyển hóa angiotensin (ACEIP).............................. 19
1.3.1. Lịch sử nghiên cứu .................................................................................... 19
1.3.2. Đặc tính và cơ chế hoạt động của ACEIP................................................. 20
1.3.3. Phân loại ACEIP ....................................................................................... 21
1.4. Các con đường sản xuất ACEIP ........................................................................ 25
1.4.1. Sản xuất ACEIP bằng con đường tổng hợp hóa học................................. 25
1.4.2. Sản xuất ACEIP từ protein tự nhiên.......................................................... 25
1.5. Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng ACEIP ......................................... 31
1.5.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng ACEIP trên thế giới ............ 31
1.5.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất ACEIP trong nước ................................... 32

Luận văn thạc sỹ khoa học

3

2009 - 2011

Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

1.6. Đậu tương và protein đậu tương trong sản xuất ACEIP.................................... 33
1.6.1. Nghiên cứu sản xuất ACEPI bằng Enzym protease .................................. 34
1.6.2. Nghiên cứu sản xuất ACEIP từ vi khuẩn................................................... 36

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................38
2.1. Nguyên liệu........................................................................................................ 38
2.1.1. Enzym protease và cơ chất ........................................................................ 38
2.1.2. Hóa chất .................................................................................................... 38
2.1.3. Thiết bị....................................................................................................... 38
2.1.4. Môi trường................................................................................................. 39
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 39
2.2.1. Chuẩn bị dịch thủy phân protein đậu tương ............................................. 39
2.2.2. Phương pháp lên men thu protease và phương pháp thu nhận peptit từ
dịch thủy phân protein đậu tương ....................................................................... 39
2.2.3. Phương pháp phân tích ............................................................................. 41
2.2.4. Phương pháp tối ưu cổ điển ...................................................................... 44
2.2.5. Tinh sạch peptit ......................................................................................... 44
2.2.6. Phương pháp sấy phun sản phẩm sau lên men ......................................... 46
2.2.7. Xác đinh chỉ tiêu an toàn thực phẩm của sản phẩm ................................ 47
2.2.8. Phương pháp xác định độc tính cấp.......................................................... 48
2.2.9. Thử nghiệm trên mèo................................................................................. 49

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.....................................................51
3.1. Xác định khả năng kìm hãm ACE của dịch peptit sau thủy phân ..................... 51
3.2. Tối ưu điều kiện thủy phân protein đậu tương bằng trypsin ............................. 52

3.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến khả năng kìm hãm ACE khi sử dụng
trypsin thủy phân protein đậu tương ................................................................... 52
3.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân của trypsin ................... 53
3.2.3. Tối ưu nhiệt độ thủy phân protein đậu tương............................................ 54
3.2.4. Tối ưu pH thủy phân protein đậu tương.................................................... 55
3.3. Tối ưu điều kiện thủy phân protein đậu tương bằng pepsin .............................. 57

Luận văn thạc sỹ khoa học

4

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

3.3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến khả năng kìm hãm ACE khi sử dụng
pepsin thủy phân protein đậu tương.................................................................... 57
3.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân...................................... 58
3.3.3. Tối ưu nhiệt độ thủy phân protein đậu tương............................................ 59
3.3.4. Tối ưu pH thủy phân protein đậu tương.................................................... 60
3.4. Tối ưu điều kiện thủy phân protein đậu tương bằng dịch lên men protease
của Bacillus subtilis CN2 .............................................................................................. 61
3.4.1. Tối ưu tỷ lệ E/S và thời gian phản ứng thủy phân protein đậu tương của
dịch protease ....................................................................................................... 61
3.4.2. Tối ưu nhiệt độ thủy phân protein đậu tương của dịch protease .............. 62
3.4.3. Tối ưu pH thủy phân protein đậu tương của dịch protease ...................... 64
3.5. Khả năng kìm hãm ACE của các loại enzym sau quá trình tối ưu .................... 65

3.6. Tinh sạch peptit.................................................................................................. 66
3.7. Kết quả xác định chỉ tiêu an toàn thực phẩm của sản phẩm.............................. 69
3.8. Kết quả xác định độc tính cấp............................................................................ 69
3.9. Kết quả thử nghiệm trên mèo ........................................................................... 70
3.10. Đặc tính của sản phẩm sau khi sấy phun ......................................................... 74

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..............................................................................76
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................78
PHỤ LỤC.............................................................................................................86

Luận văn thạc sỹ khoa học

5

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
RAAS

Giải thích
Renin - Angiotensin - Aldosterol System (hệ thống Renin -Angiotensin Aldosterol).

ACEI

Angiotensin I converting enzym inhibitor (chất ức chế enzym chuyển
angiotensin I).

ACEIP

Angiotensin I converting enzyme inhibitor peptits (peptit ức chế
enzym chuyển hóa angiotensin).

ACE

Angiotensin I converting enzyme (enzym chuyển hóa angiotensin I).

BSA

Bovine serum albumin (albumin huyết thanh bò).

Da

Dalton.

IC50

50% inhibitory concentration (mg/ml) (nồng độ ức chế 50% hoạt tính
ACE).

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulphate - polyacrylamide gel electrophoresis (điện di
gel polyacrylamid).

FAPGG

Furylacryloyl-Phenylalanyl-Glycyl-Glycine

E/S

Tỷ lệ Enzym/cơ chất

Luận văn thạc sỹ khoa học

6

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc tính dược lý của các ACEI được phê chuẩn tại Mỹ[45]..............24
Bảng 1.2: Những peptit cho hoạt tính ức chế ACE từ nước ................................27
Bảng 1.3: Các sản phẩm thương mại từ sản phẩm protein sữa [51]. .................28
Bảng 1.4: Giá trị IC50 của một số sản phẩm lên men từ đậu tương [52]. ...........29
Bảng 1.5: Khả năng ức chế ACE của một số loại protein thực vật.....................30
Bảng 1.6. Một vài protease sử dụng trong quá trình sản xuất ACEIP
[Enrollment in local colleges, 2005][25].............................................34
Bảng 3.1 Hoạt tính kìm hãm của một số enzym...................................................66
Bảng 3.2: Các chỉ tiêu an toàn thực phẩm của sản phẩm ...................................69
Bảng 3.3: Độc tính cấp của dung dịch thử .........................................................70

Bảng 3.4: Huyết áp của mèo trước và sau khi uống nước (lô chứng)(n = 5) .....71
Bảng 3.5: Huyết áp của mèo trước và sau khi uống dịch chiết đậu tương liều
1ml/kg (n = 4) .......................................................................................72
Bảng 3.6: Huyết áp của mèo trước và sau khi uống dịch chiết đậu tương liều
4ml/kg (n = 5) .......................................................................................73
Bảng 3.7: Đặc tính của chế phẩm sau khi sấy phun............................................74
Bảng B. 1: Kết quả đo OD595nm để xây dựng đường chuẩn BSA .........................86
Bảng B.2: Kết quả đo OD để xây dựng đường chuẩn peptit ...............................87
Bảng B.3: Ảnh hưởng của tỷ lệ E/S và thời gian phản ứng tới hàm lượng
peptit tạo thành sau thủy phân protein đậu tương bởi trypsin............88
Bảng B.4: Nồng độ peptit của dịch thủy phân ở các nhiệt độ phản ứng khác
nhau khi thủy phân protein đậu tương bằng trypsin ............................88
Bảng B.5: Nồng độ peptit của dịch thủy phân ở các giá trị pH khác nhau khi
thủy phân protein đậu tương bằng trypsin ...........................................88
Bảng B.6: Ảnh hưởng của tỷ lệ E/S và thời gian phản ứng tới hàm lượng
peptit tạo thành sau thủy phân protein đậu tương bởi pepsin .............89
Bảng B.7: Nồng độ peptit của dịch thủy phân ở các nhiệt độ phản ứng khác
nhau khi thủy protein đậu tương bằng pepsin......................................89

Luận văn thạc sỹ khoa học

7

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

Bảng B.8: Nồng độ peptit của dịch thủy phân ở các giá trị pH khác nhau khi
thủy phân protein đậu tương bằng pepsin............................................89
Bảng B.9: Ảnh hưởng của tỷ lệ E/S và thời gian phản ứng tới hàm lượng
peptit tạo thành sau thủy phân protein đậu tương bởi dịch protease ..90
Bảng B.10: Nồng độ peptit của dịch thủy phân ở các nhiệt độ phản ứng khác
nhau khi thủy protein đậu tương bằng dịch protease...........................90
Bảng B.11: Nồng độ peptit của dịch thủy phân ở các giá trị pH khác nhau khi
thủy phân protein đậu tương bằng dịch protease. ...............................90

Luận văn thạc sỹ khoa học

8

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc và hình dáng của ACE từ huyết tương, tế bào soma và tế
bào sinh dục, biễu diễn trung tâm hoạt động, vị trí gắn kẽm, các
vùng N và C [57]...................................................................................14
Hình 1.2: Mô hình của trung tâm hoạt động của ACE và liên kết với ...............15
Hình 1.3: Hoạt động của hệ Renin-Angiotensin-Aldosterone [7].......................17
Hình 1.4: Hệ thống Kinin-Nitric-Oxide [45] . ....................................................18
Hình 1.5: ACE xúc tác tạo thành Angiotensin II hoạt động từ Angiotensin I,
đồng thời làm vô hoạt bradykinin [68].................................................19
Hình 1.6: Mô hình liên kết trong phản ứng giữa peptit kìm hãm ACE (LeuGly-Pro) và trung tâm hoạt động của ACE [49]..................................21

Hình 1.7: Công thức cấu tạo của Captopril[45]. ..............................................22
Hình 1.8: Công thức cấu tạo của Enalapril [64].................................................23
Hình 1.9: công thức cấu tạo của Lisinopri [67]..................................................23
Hình 3.1: So sánh khả năng kìm hãm ACE của các loại enzyme .......................51
Hình 3.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ E/S sử dụng enzym trypsin đến khả năng kìm
hãm ACE ...............................................................................................52
Hình 3.3: Khả năng tạo peptit ở các tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân ................54
Hình 3.4: Khả năng tạo peptit ở các nhiệt độ thủy phân khác nhau ...................55
Hình 3.5: Khả năng tạo peptit ở các pH khác nhau ............................................56
Hình 3.6: Ảnh hưởng của tỷ lệ E/S sử dụng enzym pepsin đến khả năng
kìm hãm ACE .......................................................................................57
Hình 3.7: Khả năng tạo peptit ở các tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân ................58
Hình 3.8: Khả năng tạo peptit ở các nhiệt độ khác nhau ....................................59
Hình 3.9: Khả năng tạo peptit ở các pH khác nhau ............................................60
Hình 3.10: Khả năng tạo peptit ở các tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân ..............61
Hình 3.11: Khả năng tạo peptit ở các nhiệt độ khác nhau ..................................63
Hình 3.12: Khả năng tạo peptit ở các pH khác nhau ..........................................64
Hình 3.13. Khả năng kìm hãm ACE sau quá trình tối ưu....................................65
Hình 3.14. Khả năng kìm hãm ACE qua các giai đoạn tinh sạch .......................67

Luận văn thạc sỹ khoa học

9

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

Hình 3.15: Kết quả điện di SDS-PAGE. ..............................................................68
Hình 3.16: Thử nghiệm trên mèo .........................................................................71
Hình 3.17: Chế phẩm thô sau khi sấy phun chứa peptit ức chế ACE sử enzym
trypsin với cơ chất là protein đậu tương. ............................................74
Hình P.1: Đường chuẩn BSA ...............................................................................86
Hình P.2: Đường chuẩn xác định hàm lượng peptit............................................87

Luận văn thạc sỹ khoa học

10

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

MỞ ĐẦU
Hiện nay, bệnh cao huyết áp được biết đến không những là nguyên nhân
hàng đầu của đột quỵ và suy thận mà còn là tác nhân gây mù lòa và chứng mất trí
nhớ. Số người mắc bệnh cao huyết áp ngày một nhiều, tỷ lệ gia tăng căn bệnh cao
huyết áp đồng nghĩa với hàng triệu trường hợp tử vong vì bệnh tim mạch sẽ bùng
phát [70]. Theo thống kê của Viện Tim mạch Việt Nam thì ước tính ở Việt Nam
hiện có khoảng gần 25% dân số bị mắc bệnh tăng huyết áp, cứ 4 người thì có 1
người phải chung sống với căn bệnh này [71]. Chính vì thế mà trên thị trường ngày
càng xuất hiện nhiều thuốc để chữa căn bệnh này. Các thuốc chống cao huyết áp giúp
giảm huyết áp theo nhiều cơ chế khác nhau. Trong đó, sự ức chế enzym chuyển hóa
angiotensin (ACE) được coi là một liệu pháp hữu hiệu trong điều trị bệnh cao huyết áp.

Rất nhiều chất ức chế ACE (ACEIP) được tổng hợp bằng con đường hóa học như
captopril, benazepril, enlapril, alacepril, chúng mang lại nhiều lợi ích cho liệu pháp
chống bệnh cao huyết áp. Tuy nhiên, ACEIP tổng hợp bằng con đường hóa học cũng
có nhiều tác dụng phụ như: gây ho khan, phát ban ở da và nhiễu loạn vị giác, làm thay
đổi trao đổi huyết thanh [8].
Vì những tác dụng phụ trên mà thế giới hiện đại ngày nay đang có xu hướng
quay về với các hợp chất thiên nhiên có trong động vật và cây cỏ, khai thác kinh
nghiệm y học cổ truyền và nền văn minh ẩm thực của các dân tộc phương Đông.
Đồng thời hạn chế tối đa việc đưa các hóa chất vào cơ thể - thủ phạm của các phản
ứng phụ, quen thuốc, nhờn thuốc (hiện nay, 90-95% số nhóm chất quan trọng như
kháng sinh, các loại vitamin , các nội tiết tố….có nguồn gốc hóa học tổng hợp). Xu
thế này cùng với những thành công bước đầu đã đạt được và những tiềm năng to lớn
của nước ta về tài nguyên sinh học, đó là những cơ sở quan trọng để chúng ta đẩy
mạnh nghiên cứu, sản xuất các loại thực phẩm chức năng - một lĩnh vực có nhiều
triển vọng. Chính vì thế nên các thuốc chứa peptit ức chế enzym chuyển hóa
angiotensin được tổng hợp bằng nguồn tự nhiên đã rất được quan tâm, nghiên cứu.
Nhóm sản phẩm này đã được công nhận là không thể thiếu trong điều trị bệnh cao

Luận văn thạc sỹ khoa học

11

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

huyết áp và được xếp hàng đầu trong điều trị suy tim ứ đọng mãn tính, có thể dùng

nhiều năm mà không gây tác dụng phụ [25, 52].
Ở Việt Nam số người bị bệnh cao huyết áp và tim mạch ngày càng gia tăng.
Theo một điều tra gần đây nhất của Viện Tim mạch Quốc gia tại 8 tỉnh và thành phố
của nước ta thì tỷ lệ THA của những người từ 25 tuổi trở lên đã là 27,4% [72]. Các
nghiên cứu đã chỉ ra rằng, enzym chuyển hóa angiotensin (ACE) là nhân tố quan
trọng làm tăng huyết áp máu, vì vậy sự ức chế enzym ACE được coi là một liệu
pháp hữu hiệu trong điều trị bệnh cao huyết áp [24]. Hiện nay đã có một số nghiên
cứu về việc sử dụng những nguồn tự nhiên để tạo peptit có khả năng ức chế ACE
(ACEIP) và đã có được một số kết quả khả quan như việc lên men vi sinh vật sử
dụng nguồn thức ăn từ đậu tương hoặc sử dụng enzym để thủy phân cơ chất casein.
Việt Nam là nước nông nghiệp nên các sản phẩm nông nghiệp rất sẵn có và
rẻ tiền. Đậu tương là một sản phẩm nông nghiệp được sử dụng làm nguồn thức ăn,
song bên cạnh đó nó có thể được sử dụng là nguồn cơ chất rất tiềm năng cho phản
ứng thủy phân vì hàm lượng protein rất cao (34gam trong 100 gam đậu tương) [8].
Trước tình hình thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu thu nhận peptit kìm hãm enzym chuyển hóa angiotensin từ thủy phân protein
đậu tương bằng enzym và khả năng ứng dụng”.
Mục tiêu của đề tài:
Nghiên cứu, lựa chọn enzym thủy phân protein đậu tương để thu nhận
ACEIP, tinh sạch tạo chế phẩm và khả năng ứng dụng.
Nội dung của đề tài:
- Lựa chọn enzym thủy phân để thu nhận ACEIP hiệu quả nhất;
- Tối ưu điều kiện thủy phân protein đậu tương để thu nhận ACEIP;
- Tinh sạch ACEIP;
- Xác định các chỉ tiêu vệ sinh an toàn thực phẩm của chế phẩm;
- Xác định độc tính cấp của dịch chứa peptit.
- Thử nghiệm hoạt tính của ACEIP trên mèo.

Luận văn thạc sỹ khoa học

12

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về enzym chuyển hóa angiotensin (ACE)
1.1.1. Angiotensin
Angiotensin được phát hiện vào cuối những năm 1930 tại Ấn Độ và Ác–
hen–ti-na rồi sau đó được tổng hợp và xác định các đặc tính bởi các nhà khoa học
tại phòng thí nghiệm Cleveland Clinic và Ciba tại Basel, Thụy Sỹ [17].
Angiotensin là α-2-glycoprotein có trọng lượng phân tử từ 50.000 Da đến
100.000 Da, gây co thắt mạch máu và làm tăng huyết áp, nó là một phần của hệ
thống Renin-Angiotensin-Aldosterol (RAAS). Ở người angiotensin có chứa 452
axit amin còn ở những loài khác thì có những chiều dài khác nhau, do gan tổng hợp
và đi vào trong huyết tương rồi gắn vào globulin. Ngoài mô, tiểu quản thận, ngoại
mạc mạch máu, một số vùng tiểu não cũng tổng hợp angiotensin [60].
1.1.2. Cấu trúc hóa học của enzym chuyển hóa angiotensin (ACE)
Enzym chuyển hóa angiotensin là một metalopeptitase, có liên kết màng,
xúc tác quá trình biến đổi decapeptit angiotensin I không hoạt động thành
octapeptit angiotensin II hoạt động bằng cách cắt bỏ dipeptit đầu cacbon và làm
vô hiệu hóa bradykinin [90]. Đây là một enzym có nguyên tố kẽm (Zn) trong
trung tâm hoạt động, có tâm hoạt động là His-Glu-X-X-His, có mặt ở nội mô
mạch máu, đặc biệt là mạch máu phổi, nội mô tim và tiểu não, ngoài ra trong
huyết tương cũng gặp enzym này.
Trong cơ thể người, ACE tồn tại chủ yếu ở hai dạng là ACE soma và ACE

sinh dục. ACE soma có trọng lượng phân tử 170 kDa, chứa 1302 amino axit, được
tìm thấy trên bề mặt trong của phổi, thận, ruột, nhau thai, và đám rối của tràng
mạch. ACE này được cộng hợp bởi vùng cacbon và vùng nitơ nên có hai trung tâm
hoạt động, mỗi vùng đều có một kiểu gắn Zn2+ đặc thù với His-Glu-X-X-His tại
trung tâm hoạt động. ACE soma có vai trò điều khiển áp suất máu và cấu trúc, chức
năng của thận [21].

Luận văn thạc sỹ khoa học

13

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

ACE sinh dục chỉ có duy nhất trong bộ phận sinh dục, trọng lượng phân tử
100 kDa, kích thước 732 amino axit, chỉ có một trung tâm hoạt động và một kiểu
gắn Zn2+, nó tương ứng với vùng C của ACE soma. ACE này có vai trò chủ yếu
trong sinh sản [49].

Hình 1.1: Cấu trúc và hình dáng của ACE từ huyết tương, tế bào soma và tế bào
sinh dục, biễu diễn trung tâm hoạt động, vị trí gắn kẽm, các vùng N và C [57].
Những nghiên cứu trên hệ gen của người gần đây đã chỉ ra rằng còn một
dạng ACE thứ ba là ACE đồng đẳng hay ACE 2. Dạng ACE thứ ba này có một
trung tâm hoạt động đơn và có khả năng thủy phân AngI và AngII nhưng không
thủy phân bradykinin [56, 58].
Bên cạnh vai trò như là hoạt động kiểm soát sự co bóp mạch, ACE còn được

biết đến như là một enzym tiêu hóa trong ruột [33]. ACE có thể thủy phân các cơ
chất khác như các enkephalin, chuỗi β của insulin. ACE cũng có liên quan đến sự
miễn dịch cũng như sự sinh sản do nó có mặt trong một số cơ quan sinh sản [27].
1.1.3. Tính chất của ACE
ACE hoạt động như một dipeptit cacboxypeptitase có khả năng giải phóng
dipeptit đầu cacbon từ các cơ chất có một nhóm cacboxyl tự do cuối cùng. ACE ưu
tiên phân cắt những cơ chất có các amino axit kỵ nước tại vị trí thứ 3 từ dưới lên và
có ít ái lực với những cơ chất có các amino axit dicacboxylic đầu cacbon (Glu, Asp)
hoặc với prolin ở vị trí cuối cùng [57]. Theo cơ chế này, nó sẽ xúc tác việc phân cắt

Luận văn thạc sỹ khoa học

14

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

6 angiotensin I thành peptit gây co mạch angiotensin II và làm bất hoạt các peptit
gây giãn mạch như bradykinin và kallidin.
Mức độ thủy phân angiotensin I và bradykinin ở hai vùng cacbon và nitơ là
khác nhau, vùng cacbon đòi hỏi nồng độ ion clo cao hơn để hoạt động tối ưu, đặc
tính này được tạo nên do arginin có trong vùng. Tại hai vùng, ái lực liên kết với một
vài chất ức chế ACE là khác nhau, ví dụ với enalapril thích hợp liên kết tại vùng
cacbon, trong khi ramipril lại bị cản trở ở cả hai vùng.
Ngoài ra, ACE đóng vai trò như một endopeptitase với các cơ chất đã được
amid hóa ở đầu cacboxyl giống như cơ chất P và hormone giải phóng hormone

lutein hóa (luteinising hormone releasing hormone (LHRH)) [45]. Bằng những thí
nghiệm hóa học, người ta đã xác định được axit glutamic, tyrosine và arginine là
những cấu tử hoạt động của trung tâm xúc tác.

Hình 1.2: Mô hình của trung tâm hoạt động của ACE và liên kết với
cơ chất peptit [58].

Luận văn thạc sỹ khoa học

15

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

Cơ chất liên kết với nguyên tử kẽm thông qua nhóm cacboxyl của các chất
này, nhằm tăng hoạt tính tấn công nucleophil của nhóm cacboxyl của axit glutamic.
Sự tham gia liên tục của các phân tử nước sẽ hoàn thiện quá trình phân cắt liên kết
peptit. Tyrosine cho một proton vào nhóm -NH của peptit có thể bẻ gãy được, trong
khi tính đặc hiệu được xác định bởi liên kết giữa nhóm cacboxyl với arginine [58].
1.2. Bệnh cao huyết áp ở người và vai trò của ACE trong bệnh cao huyết áp
1.2.1. Bệnh cao huyết áp ở người
Cao huyết áp hiện nay là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tỷ lệ tử vong cao,
nhất là ở những người lớn tuổi, nhân rộng ở các nước phát triển và cả ở các nước
như Ấn Độ, Trung Quốc, các nước Châu Mỹ Latinh và Châu Phi... Hiện nay, cao
huyết áp được biết là một trong những chứng bệnh nguy hiểm ảnh hưởng tới 25%
dân số toàn cầu. Tổ chức Y tế thế giới World Health Organization (WHO) nhận

định rằng con số người mắc bệnh cao huyết áp sẽ tăng từ một tỷ người (năm 2000)
lên đến 1,56 tỷ người vào năm 2025. Cao huyết áp được điều khiển bằng các con
đường sinh học khác nhau. Trong đó có hệ Renin – angiotensin- aldosterone
(RAAS) và Kinin-nitric-oxide (KNOS) là đích quan trọng. Trong hệ RAAS và
KNOS, angiotensin converting enzym (ACE) giữ một vai trò sinh lý quan trọng –
nó làm tăng huyết áp máu bằng cách cắt dipeptit đầu C tận cùng của angiotensin I
thành angiotensin II (AngII) – nhân tố gây co mạch và ức chế bradykinin – nhân tố
gây giãn mạch, vì vậy sự ức chế ACE được coi là một liệu pháp hữu hiệu trong điều
trị bệnh cao huyết áp [62, 72].

Luận văn thạc sỹ khoa học

16

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

1.2.2. Hệ thống Renin-Angiotensin-Aldosterol (RAAS)

Hình 1.3: Hoạt động của hệ Renin-Angiotensin-Aldosterone [7].
Khi áp suất máu giảm, thận của chúng ta sẽ tiết ra renin, một enzym protease
vào trong máu của cơ thể. Enzym này sẽ xúc tác để phân cắt angiotensin thành
những đoạn peptit nhỏ, một trong số đó là angiotensin I, tồn tại ở dạng không hoạt
động. Lúc này tại bề mặt của phổi và màng trong của thận sẽ tiết ra enzym ACE có
tác dụng chuyển hóa Angiotensin I thành Angiotensin II, có rất nhiều hoạt tính sinh
học, sẽ kích thích hệ thần kinh trung ương, đồng thời nó còn tiết ra một loại hormon

là aldosteron từ vỏ thượng thận. Aldosteron có vai trò giữ natri, tiết kali và làm tăng
quá trình giữ nước. Sự gia tăng này làm cho thể tích chất lỏng trong cơ thể tăng lên
dẫn đến gia tăng áp suất máu và gây cao huyết áp [7].

Luận văn thạc sỹ khoa học

17

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

1.2.3. Hệ thống Kinin-Nitric-Oxide (KNOS)

Hình 1.4: Hệ thống Kinin-Nitric-Oxide [45] .
Khi áp suất máu trong cơ thể tăng lên thì hệ thống Kinin-Nitric-Oxide sẽ
được hoạt hóa. Trong hệ thống này có kallidin là một nhân tố gây giãn mạch được
tạo thành từ kininogen nhờ hoạt động của kallikrein [60]. Kininogen được tổng hợp
chủ yếu ở gan, đưa vào huyết tương, ở đó chất này gắn vào globulin huyết tương,
còn kallikreine có chủ yếu ở thận, nhưng cơ chế điều hành chất này chưa rõ. Hơn
nữa, sự thủy phân của kallidin nhờ kallikrein cũng tạo thành peptit gây giãn mạch
khác là bradykinin. Bradykinin là 1 polypeptit có tính giãn mạch, có cấu trúc gồm 9
axit amin (nanopeptit). Phân tử này làm trung gian cho phản ứng giãn mạch nhờ
liên kết với các thụ thể β dẫn đến một loạt các phản ứng làm tăng nồng độ Ca2+
trong tế bào [60]. Sự tăng nồng độ Ca2+ kích thích enzym tổng hợp nitric oxide để
biến L-arginine thành nitric oxide NO dẫn đến hạ huyết áp. Nitric oxide là một phân
tử khí có liên quan trong viêc hạ huyết áp trong nhiễm trùng và phản vệ. NO thúc

đẩy các đáp ứng bảo vệ như giãn phế quản, giãn mạch vành và làm giảm sự giải
phóng của histamine [23]. Con đường gây giãn mạch này có thể bị ức chế bởi hoạt
động của ACE -chất làm giảm hoạt tính của bradykinin [62].

Luận văn thạc sỹ khoa học

18

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

Ta có thể thấy vai trò của enzym chuyển hóa angiotensin trong hệ thống
huyết áp của người có thể được biểu diễn dưới sơ đồ sau:

Hình 1.5: ACE xúc tác tạo thành Angiotensin II hoạt động từ Angiotensin I,
đồng thời làm vô hoạt bradykinin [68].
1.3. Các peptit ức chế enzym chuyển hóa angiotensin (ACEIP)
1.3.1. Lịch sử nghiên cứu
Lịch sử nghiên cứu các chất ức chế enzym chuyển angiotensin bắt đầu nǎm
1954, khi tầm quan trọng của enzym này được thừa nhận lần đầu. Nǎm 1968, hợp
chất đầu tiên có khả nǎng ức chế chuyển angiotensin I thành angiotensin II được
tách chiết từ nọc rắn. Nhưng những peptit này không được ứng dụng lâm sàng vì
khi uống chúng không phát huy tác dụng chống cao huyết áp [58].
Nǎm 1977, một chất ức chế cạnh tranh ACE quan trọng đó là captopril
được tổng hợp dựa trên cấu trúc chuỗi peptit đã biết từ nọc rắn Bothrops jararaca
- nó ức chế việc chuyển angiotengin I không hoạt động thành angiotensin II họat

động [41, 45], và captopril trở thành chất ức chế enzym chuyển angiotensin đầu
tiên được phép sử dụng lâm sàng. Kể từ đó, người ta đã xác định được ít nhất là

Luận văn thạc sỹ khoa học

19

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

40 hợp chất ức chế ACE [24]. Tuy nhiên nhược điểm của các ACEIP tổng hợp
theo con đường hóa học là chúng đã gây ra những tác dụng phụ như ho khan
(xuất hiện trong 10 – 30 % số bệnh nhân điều trị), gây quái thai (khi mang thai
sử dụng ACEI), viêm da…. [65].
Vì những nhược điểm như trên, nên ngay từ những năm 1980 xu hướng tạo
ra các ACEIP có nguồn gốc tự nhiên đã diễn ra mạnh mẽ. Nghiên cứu đã được thực
hiện trên rất nhiều nguồn protein khác nhau. Như các nhà khoa học Nhật Bản đã sử
dụng nguồn nguyên liệu rất sẵn có ở đất nước họ để tìm ra ACEIP. Nghiên cứu sớm
nhất là của tác giả Kawamura vào năm 1989, ông đã thành công với cá mòi, cá ngừ
khô, thịt lợn [7].
Sau đó hầu hết các nhà khoa học của nhiều nước trên thế giới như Mỹ, Trung
Quốc, Đài Loan… đã chú ý nhiều đến nguồn protein thực vật (đậu tương, ngô…) và
các protein sữa, fomat…
Các sản phẩm chống cao huyết áp có nguồn gốc tự nhiên này được thử
nghiệm lâm sàng nhiều lần trên chuột cao huyết áp tự phát, hiện nay đã thử nghiệm
thành công trên người.

1.3.2. Đặc tính và cơ chế hoạt động của ACEIP
Những nghiên cứu về hoạt tính cấu trúc của các peptit từ nọc rắn cho thấy
các tripeptit đầu C có tác dụng quan trọng nhất trong liên kết với trung tâm hoạt
động của ACE. Trình tự tối ưu của đầu C cho liên kết với trung tâm hoạt động là
Phe-Ala-Pro [26, 58].
Mức độ họat động của các ACEIP được thể hiện qua khả năng liên kết với
ACE của chuỗi tripeptit đầu C tận cùng nằm trong chuỗi cấu trúc của ACEIP.
Tripeptit đầu C tận cùng có thể tương tác với các vị trí S1, S1’, và S2’ ở trung tâm
họat động của ACE [46].

Luận văn thạc sỹ khoa học

20

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

Hình 1.6: Mô hình liên kết trong phản ứng giữa peptit kìm hãm ACE (Leu-Gly-Pro)
và trung tâm hoạt động của ACE [49].
Đặc tính kỵ nước và ưa nước của peptit cũng là một nhân tố quan trọng tác
động đến hoạt tính ức chế. Tính ưa nước của peptit cao thường làm cho khả năng
kìm hãm thấp hoặc không có khả năng kìm hãm ACE do nó làm cho peptit không
thể tiến đến trung tâm hoạt động của ACE được. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng
ACE rất ưa các cơ chất có chứa các amino axit kị nước tại vị trí cacbon tận cùng
[56]. Người ta cho rằng, vị trí của các vật mang - (charge) liên quan tới chuỗi các
nhóm bên của các amino axit đóng góp vào tiềm năng ức chế của các ACEI [15,

44]. Thêm vào đó, peptit ức chế ACE một cách đặc hiệu - các chuỗi ức chế dài cũng được thừa nhận đóng góp vào khả năng ức chế của ACEI [28, 59].
ACEI là chất ức chế cạnh tranh của ACE, nó gắn vào tâm hoạt động của
ACE làm giảm hoạt lực enzym, ngăn không cho ACE thuỷ phân angiotensin I nên
không tạo thành angiotensin II cũng như ngăn chặn sự vô hoạt bradykinin dẫn đến
hạ huyết áp và làm ổn định huyết áp [57].
1.3.3. Phân loại ACEIP
1.3.3.1. ACEIP tổng hợp hóa học
Các ACEIP tổng hợp hoá học được sử dụng phổ biến trên thế giới. Nó được
tổng hợp theo phương pháp hoá học dựa trên cấu trúc của các ACEI tự nhiên. Các

Luận văn thạc sỹ khoa học

21

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

loại ACEI thuộc nhóm này thường gây ra các tác dụng phụ như: hạ huyết áp, chóng
mặt, choáng váng, nổi mề đay, ho khan, giảm chức năng của thận. Chính vì những
tác dụng phụ mà chúng gây ra, cho nên những năm gần đây, các nhà khoa học đã và
đang nghiên cứu tạo sản phẩm ACEI không gây ra những tác dụng phụ với cơ thể
con người.
ACEI tổng hợp hóa học có thể được chia làm 3 nhóm dựa vào công thức cấu
tạo phân tử của chúng:
*ACEIP chứa nhóm Sulfhydryl:
Tiêu biểu là Captopril -một ACEIP được tìm thấy đầu tiên [45].

Công thức phân tử: C9H15NO3S.

Hình 1.7: Công thức cấu tạo của Captopril[45].
Trọng lượng phân tử: M= 217,29 đvC.
Captopril có tác dụng chống cao huyết áp mạnh nhưng lại gây ra các tác
dụng phụ tuy ít gặp nhưng lại khá nặng: gây ra một số phản ứng trong cơ thể dẫn
đến giảm bạch cầu trung tính, phát ban, rối loạn vị giác.
* Các ACEIP chứa dicarboxylate.
Nhóm ACEI này ít gây ảnh hưởng phụ hơn Captopril do chúng không có
nhóm sulfhydryl, đang được sử dụng phổ biến như: Enalapril, Lisinopril, Peridopril,
Ramipril, Quinapril, Bennazepril [67].
Enalapril:
Công thức phân tử : C20H28N2O5
Khối lượng phân tử: M = 372 đvC

Luận văn thạc sỹ khoa học

22

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

.
Hình 1.8: Công thức cấu tạo của Enalapril [64].
Lisinopril:
Công thức phân tử: C21H31N3O5:

Hình 1.9: công thức cấu tạo của Lisinopri [67].
Khối lượng phân tử: M = 436 đvC
*ACEIP chứa phosphonate: Fosinopril (Monopril)

Hình 1.10: Công thức cấu tạo của Fosinopril [64].
Các ACEI tổng hợp hóa học được ứng dụng chữa bệnh cao huyết áp và được
liệt kê trong bảng danh mục của WHO năm 2006 là: benazepril (BEN), captopril
(CAP), cilazapril (CIL), delapril (DEL), enalapril (ENA), fosinopril (FOS),
imidapril (IMI), lisinopril (LIS), moexipril (MOE), perindopril (PER), quinapril
(QUI), ramipril (RAM), spirapril (SPI), temocapril (TEM), trandolapril (TRA) and
zofenopril (ZOF) [50].

Luận văn thạc sỹ khoa học

23

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

Hoạt tính sinh

1,7

Thận

6,25-300

75-91

Enalapril

Carboxyl

2-8

11

Thận

25-40

60

Lisinopril

Carboxyl

6-8

12

Thận

5-40

6-60

Benazepril

Carboxyl

1-2

10-11

Thận

5-80

>37

Quinapril

Carboxyl

2

25

Thận

5-80

>60

Ramipril

Carboxyl

3

9-18

Thận

1,25-20

50-60

Trandolapril

Carboxyl

4-10

15-24

Thận,gan

1-8

70

Moexipril

Carboxyl

1,5

2-9

Thận

7,5-30

13

Fosinopril

Phosphinyl

3

12

Gan,Thận 10-80

36

học, %

Liều dùng

0,7-0,9

( mg)

Cơ quan loại thải

Sulfhydryl

còn ½ (h)

Họat tính thuốc

Captopril

Nhóm gắn kẽm

cao nhất (h)

Họat tính thuốc

Bảng 1.1. Đặc tính dược lý của các ACEI được phê chuẩn tại Mỹ[45].

1.3.3.2. ACEIP tổng hợp tự nhiên
Đây là các ACEI thu được nhờ quá trình thuỷ phân các protein thực phẩm:
protein sữa, protein thực vật, protein động vật.
Năm 1967, nhà khoa học John Vane và Segio Ferreira Basin đã phát hiện
peptit từ nọc rắn ở vùng Nam Mỹ Bothrops jararaca có khả năng ức chế ACE [3].
Những peptit này chứa từ 3-15 amino axit, và hầu hết có trình tự Ala-Pro, hoặc ProPro.
Có nhiều thử nghiệm lâm sàng trên người và chuột đã chứng minh rằng
ACEI tự nhiên rất an toàn và không gây bất cứ một tác dụng phụ nào dù phải sử
dụng thuốc trong thời gian dài. Chính vì vậy mà ACEI tự nhiên đã và đang được
nghiên cứu và sản xuất trong những năm gần đây.

Luận văn thạc sỹ khoa học

24

2009 - 2011


Trương Thị Ngọc Hồi

Công nghệ sinh học

1.4. Các con đường sản xuất ACEIP
Hiện nay, ACEIP đã được sản xuất theo 2 cách chính đó là tổng hợp hoá học
và sản xuất từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên.
1.4.1. Sản xuất ACEIP bằng con đường tổng hợp hóa học
Quá trình sản xuất ACEIP bằng con đường tổng hợp hoá học dựa trên trình
tự những chuỗi peptit có khả năng kìm hãm ACE của protein thực phẩm đã được
thực hiện trên thế giới nhiều năm qua. Captopril là ACEI đầu tiên được tổng hợp
theo con đường hóa học vào năm 1977. Dựa trên cấu trúc cơ bản của Captopril, hai
ACEI là Enalapril và Lisinopril đã được tổng hợp. Tiếp theo đó người ta tổng hợp
được rất nhiều ACEI ứng dụng trên lâm sàng chữa bệnh cao huyết áp.
Tuy nhiên gần đây, việc tổng hợp ACEIP theo con đường tự nhiên được
quan tâm nhiều hơn do các đặc tính ưu việt mà nó đem lại. Đó là sản phẩm có giá
thành thấp, đem lại tính an toàn cao [6].
1.4.2. Sản xuất ACEIP từ protein tự nhiên.
Việc khám phá ra ACEIP trong nọc rắn cho thấy vẫn tồn tại các trình tự ức
chế ACE trong các protein tự nhiên. Điều này càng được khẳng định khi ACEIP
được phân tách từ quá trình thủy phân gelatin nhờ collagenase và từ casein nhờ
trypsin [42, 47]. Từ đó, một lượng lớn các ACEIP được phân tách từ protein thực

phẩm, và đặc biệt là từ protein sữa [16].
Các ACEIP có thể sản xuất từ các nguồn protein tự nhiên khác nhau như: từ
nguồn protein động vật, protein thực vật.
1.4.2.1. Sản xuất ACEIP từ nguồn protein động vật
ACEIP tự nhiên đã được sản xuất từ các nguồn protein động vật nhờ quá trình thủy
phân như: protein lợn, protein cá (cá mòi, cá ngừ, cá hồi), protein gà. Để thu được
peptit kìm hãm ACE từ động vật người ta sử dụng một số enzym thuỷ phân:
alcalase, thermolysin, pepsin, trypsin, chymotripsin [58].
- Sản xuất ACEIP từ protein trứng:

Luận văn thạc sỹ khoa học

25

2009 - 2011