Phân lập, tuyển chọn và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn có khả năng sinh axit lactic từ đường xylose

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi
đã nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của các thầy cô giáo, gia
đình và bạn bè.
Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. TRẦN LIÊN
HÀ - Phòng Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học và
Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, đã tận tình định
hướng, hướng dẫn, truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu trong suốt thời gian
thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, nghiên cứu sinh Phí Thị Thanh
Mai cùng các anh chị, các bạn học viên, sinh viên phòng thí nghiệm hóa sinh - sinh
học phân tử đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình
học tập và thực hiện luận văn.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè và
người thân đã động viên, khuyến khích giúp tôi vượt qua những khó khăn trong suốt
quá trình nghiên cứu.
Hà Nôi, ngày 26 tháng 3 năm 2015
Nguyễn Thị Thùy


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Kết quả của luận văn này là kết quả nghiên cứu của tôi
được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Trần Liên Hà trường
Đại học Bách khoa Hà Nội, cùng sự giúp đỡ của tập thể các cán bộ nghiên cứu,
nghiên cứu sinh, học viên, sinh viên đang học tập và làm việc tại phòng thí
nghiệm Vi sinh – Hóa sinh và Sinh học Phân tử, Viện Công nghệ Sinh học và
Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội.
Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng
tải trên các tác phẩm, tạp chí và trang web theo danh mục tài liệu kham khảo
của luận văn.

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên.

Hà Nội, ngày 26 tháng 3 năm 2015
Nguyễn Thị Thùy


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

MỤC LỤC
DANH MỤC VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................2
1.1. Giới thiệu chung về axit lactic ..........................................................................2
1.1.1. Đặc điểm và tính chất của axit lactic..........................................................2
1.1.2. Ứng dụng của axit lactic.............................................................................3
1.2. Quá trình tổng hợp axit lactic ..........................................................................4

1.2.1. Tổng hợp axit lactic bằng phƣơng pháp hóa học .......................................4
1.2.2. Tổng hợp axit lactic bằng phƣơng pháp sinh học ......................................5
1.3. Giới thiệu về Biomass – nguồn cung cấp Xylose .............................................8
1.3.1. Phân loại .....................................................................................................9
1.3.2. Thành phần .................................................................................................9
1.3.3. Các bƣớc tổng quát để sản xuất axit lactic từ nguyên liệu Biomass ........13
1.4. Lên men axit lactic từ đƣờng Xylose..............................................................15
1.4.1. Giới thiệu về nguồn đƣờng Xylose ..........................................................15
1.4.1.1. Công thức hóa học ...........................................................................15
1.4.1.2. Tính chất...........................................................................................16
1.4.2. Cơ chế lên men axit lactic từ đƣờng Xylose ............................................16
1.5. Vi khuẩn lên men axit lactic từ Xylose ..........................................................19
1.5.1. Giới thiệu về vi khuẩn lactic ....................................................................19
1.5.2. Đặc điểm...................................................................................................19
1.5.3. Một số chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ xylose ..........21
1.5.4. Nhu cầu dinh dƣỡng của vi khuẩn lactic ..................................................23
1.5.4.1. Nguồn dinh dƣỡng carbon ...............................................................23
1.5.4.2. Nguồn dinh dƣỡng nitơ ....................................................................24
1.5.4.3. Nguồn dinh dƣỡng vitamin ..............................................................24


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

1.5.4.4. Các hợp chất khoáng ........................................................................24
1.5.4.5. Các hợp chất hữu cơ khác ................................................................25
1.5.5.Ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng đến sự sinh trƣởng, phát triển và
khả năng lên men tạo axit lacticcủa vi khuẩn lactic .................................25
1.5.5.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ...................................................................25

1.5.5.2. Ảnh hƣởng của pH ...........................................................................25
1.5.5.3. Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng ........................................................26
1.5.5.4. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cấp giống ........................................................26
1.6. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn có khả năng lên men tạo axit lactic từ
Xylose trong nƣớc và trên thế giới ................................................................26
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................28
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc ...........................................................28
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ...............................................................................28
2.1.2. Dụng cụ và hóa chất .................................................................................28
2.1.3. Môi trƣờng................................................................................................29
2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu .........................................................................29
2.2.1. Phƣơng pháp phân lập các chủng vi sinh vật ...........................................29
2.2.2. Phƣơng pháp tuyển chọn ..........................................................................29
2.2.2.1. Phƣơng pháp cấy chấm điểm ...........................................................29
2.2.2.2. Phƣơng pháp đục lỗ thạch ................................................................29
2.2.2.3. Phƣơng pháp định tính axit lactic ....................................................30
2.2.2.4. Phƣơng pháp định lƣợng axit lactic .................................................30
2.2.3. Xác định đặc tính sinh lý – sinh hóa của chủng đƣợc chọn ....................31
2.2.3.1. Quan sát mô tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào ...................31
2.2.3.2. Quan sát mô tả các đặc điểm sinh lý ................................................32
2.2.4. Định tên vi sinh vật bằng phƣơng pháp sinh học phân tử ........................32
2.2.4.1. Tách chiết DNA tổng số...................................................................32
2.2.4.2. Phƣơng pháp điện di gel agarose .....................................................33
2.2.4.3. Phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA........................................34


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

2.2.4.4. Giải trình tự ......................................................................................34
2.3. Khảo sát ảnh hƣởng các điều kiện nuôi cấy đến khả năng tổng hợp
axit lactic của chủng vi khuẩn ........................................................................35
2.3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ...........................................................................35
2.3.2. Ảnh hƣởng của pH ...................................................................................35
2.3.3. Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng ................................................................35
2.3.4. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cấp giống ................................................................36
2.4. Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy theo phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm bậc
hai Box-Behnken............................................................................................36
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ ...........................................................................................39
3.1. Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng lên men tạo axit lactic từ Xylose .......39
3.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men tạo axit lactic cao nhất ....41
3.2.1. Định tính axit lactic ..................................................................................41
3.2.2. Xác định lƣợng axit của mỗi chủng .........................................................42
3.2.4. Định lƣợng axit lactic sinh ra từ hai chủng Y5 và Y6 bằng
phƣơng pháp HPLC ..................................................................................44
3.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa của chủng Y6 ....................................................45
3.4. Định tên bằng phƣơng pháp sinh học phân tử ................................................45
3.4.1.Tách DNA tổng số.....................................................................................45
3.4.2. PCR nhân đoạn gen 16S rRNA ................................................................46
3.4.3. Giải trình tự DNA.....................................................................................47
3.5. Khảo sát ảnh hƣởng các điều kiện nuôi cấy đến khả năng tổng hợp
axit lactic của chủng Y6 .................................................................................50
3.5.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ...........................................................................50
3.5.2. Ảnh hƣởng của pH ...................................................................................51
3.4.3. Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng ...............................................................52
3.4.4. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cấp giống ...............................................................54
3.6. Tối ƣu bằng quy hoạch thực nghiệm sử dụng phần mềm DX 7 .....................56
3.7. Động học quá trình lên men tổng hợp axit lactic của chủng Y6 ở
điều kiện tối ƣu ..............................................................................................61

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ ...............................................................63


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

4.1. Kết luận ...........................................................................................................63
4.2. Kiến nghị ........................................................................................................63
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................64
PHỤ LỤC .................................................................................................................... I


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

16SF

Mồi xuôi

16SR

Mồi ngƣợc

ADP

Adenosine diphosphate

ATP

Adenosine triphosphate

Ca

Canxi

DNA

Deoxylribonucleic axit

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic Axit

g/L

Gam/lít

g/g

Gam/gam

G-

Gram âm

G+

Gram dƣơng

PCR
PLA

Polymerase Chain Reaction
Polylactic axit

RNA

Ribonucleic Axit

SDS

Sodium dodecyl sulfate

v/p

Vòng/ phút

v/v

Thể tích/ thể tích


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. 1. Cấu tạo hóa học của axit lactic...................................................................2
Hình 1. 2. Hai đồng phân quang học của axit lactic ..................................................2
Hình 1. 3. Quá trình lên men glucose ở vi khuẩn lactic .............................................6
Hình 1. 4. Sơ đồ chuyển hoá glucose thành axit lactic trong lên men đồng hình .......7
Hình 1. 5. Cấu trúc lignocelluloses ............................................................................9
Hình 1. 6. Các loại cấu trúc tiêu biểu của hemicelluloses .......................................12
Hình 1. 7. Phân tử xylan và cơ chế chuyển đổi sang Xylose ...................................13
Hình 1. 8. Sơ đồ tổng hợp axit lactic từ sinh khối thực vật ......................................14
Hình 1. 9. Cấu tạo đƣờng Xylose .............................................................................15
Hình 1. 10. Cơ chế lên men lactic từ đƣờng Xylose ................................................18
Hình 1. 11. Vi khuẩn Latobacillus brevis ................................................................21
Hình 1. 12. Vi khuẩn Lactobacillus plantarum .......................................................22
Hình 1. 13. Vi khuẩn Streptococcus lactis ...............................................................22
Hình 1. 14. Vi khuẩn Lactobacillus fermentum .......................................................23
Hình 3. 1. Kết quả thử bằng thuốc thử Uffelmann………………………………...41
Hình 3. 2. Kết quả cấy chấm điểm của các chủng đƣợc chọn ..................................42
Hình 3. 3. Kết quả đục lỗ thạch của 9 chủng đƣợc chọn ..........................................43
Hình 3. 4. Hàm lƣợng axit tạo thành của các 9 chủng ..............................................43
Hình 3. 5. Hình thái vi bào của chủng Y6.................................................................45
Hình 3. 6. Kết quả điện di tách DNA tổng số ...........................................................46
Hình 3. 7. Kết quả điện di sản phẩm sau PCR ..........................................................46
Hình 3. 8.Cây phân loại và độ tƣơng đồng của chủng Y6 với các chủng thuộc
loài Lactobacillus fermentum ................................................................. 47
Hình 3. 9.Kết quả thử dịch lên men trên môi trƣờng có glucose bằng thuốc thử
Uffelmann .................................................................................................49
Hình 3. 10. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hàm lƣợng axit tạo thành .........................50
Hình 3. 11. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng tới hàm lƣợng axit lactic tạo thành ......51

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Hình 3. 12. Ảnh hƣởng của nồng độ dịch đƣờng đến hàm lƣợng axit lactic tạo thành
...................................................................................................................................53
Hình 3. 13. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống đến lƣợng axit lactic tạo thành ...................54
Hình 3. 14. Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi nhiệt độ, pH thay đổi, nồng độ cơ chất
ở giá trị trung bình ................................................................................59
Hình 3. 15. Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi nhiệt độ, nồng độ cơ chất thay đổi, pH
ở giá trị trung bình ................................................................................59
Hình 3. 16. Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi pH, nồng độ cơ chất thay đổi, nhiệt độ
ở giá trị trung bình ................................................................................60
Hình 3. 17. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ƣu để sinh tổng hợp axit ........................60
Hình 3. 18. Kết quả thí nghiệm so sánh hàm lƣợng axit lactic trong các điều kiện
nuôi cấy L. fermentum Y6 ....................................................................61
Hình 3. 19. Động thái quá trình sinh axit của chủng L. fermentum Y6 ....................62


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1. Các thành phần chính của lignocellulose ................................................10
Bảng 2. 1. Các biến số và khoảng chạy của chúng………………………………..37
Bảng 2. 2. Ma trận thực nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm Box - Behnken ........37
Bảng 3. 1. Thống kê các chủng đã phân lập đƣợc từ các nguồn…………………39
Bảng 3. 2. Kết quả tuyển chọn 9 chủng vi khuẩn .....................................................44
Bảng 3. 3. Kết quả định lƣợng axit lactic bằng phƣơng pháp HPLC .......................44

Bảng 3. 4. Bảng thể hiện đặc tính sinh lý – sinh hóa của chủng Y6 .........................45
Bảng 3. 5. Các nghiên cứu khác sử dụng vi khuẩn lên men axit lactic từ Xylose ....48
Bảng 3. 6. Kết quả định lƣợng axit lactic bằng HPLC của chủng Y6 .....................55
Bảng 3. 7. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken và hàm lƣợng axit lactic thu đƣợc 57
Bảng 3. 8. Kết quả phân tích phƣơng sai mô hình ƣu bằng phần mềm DX7.1.5 ....58
Bảng 3. 9. Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm .................59


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

MỞ ĐẦU
Ngày nay, vấn đề tiết kiệm năng lƣợng đang đƣợc cả thế giới quan tâm, việc
sử dụng những nguồn năng lƣợng có thể tái tạo, sẵn có, rẻ tiền nhƣ biomass là một
trong những hƣớng đi đƣợc tập trung nghiên cứu. Có nhiều nghiên cứu sử dụng
biomass là nguyên liệu cho quá trình lên men sản xuất nhiên liệu sinh học nhƣ
ethanol hay các hợp chất hóa học khác. Tuy nhiên, đó mới là sử dụng nguồn năng
lƣợng từ nguồn đƣờng 6C mà chƣa có nhiều ứng dụng sử dụng năng lƣợng từ
đƣờng 5C nhƣ xylose, một loại đƣờng chiếm tỷ lệ lớn trong biomass. Nếu tận dụng
đƣợc lƣợng đƣờng 5C này không những sử dụng triệt để năng lƣợng dồi dào từ
biomass mà còn có thể góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng do chúng gây ra.
Một trong những hƣớng nghiên cứu hiện nay đang đƣợc quan tâm là sử dụng
Biomass để sản xuất axit lactic, một trong những axit hữu cơ có ứng dụng lâu đời
và rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣ: công nghệ thực phẩm, dƣợc phẩm, y tế… Đặc
biệt, việc ứng dụng axit lactic để chế tạo nhựa sinh học polylactic axit có thể coi
nhƣ một phát kiến vƣợt bậc. Việc sử dụng đƣờng Xylose làm nguồn Carbon để lên
men tạo axit lactic là một hƣớng mới cần đƣợc tập trung nghiên cứu để tận dụng
nguồn năng lƣợng sẵn có đó. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân
lập, tuyển chọn và tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn có khả năng

sinh axit lactic từ Xylose”.
Nội dung nghiên cứu gồm:
-

Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp axit lactic cao từ
Xylose.

-

Định tên chủng vi khuẩn có khả năng tạo axit lactic từ xylose cao nhất

-

Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp axit lactic từ
đƣờng Xylose

-

Tối ƣu hóa một số yếu tố ảnh hƣởng tới chủng vi khuẩn sinh tổng hợp axit
lactic từ đƣờng Xylose.

HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718

1


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về axit lactic
1.1.1. Đặc điểm và tính chất của axit lactic
Axit lactic (danh pháp IUPAC: 2-hydroxypropanoic) là một hợp chất hoá học
đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh hoá. Axit lactic lần đầu tiên đƣợc
tách bởi nhà hoá học ngƣời Thuỵ Điển, Carl Wilhelm Scheele [2], có công thức hoá
học là C3H6O3.

Hình 1. 1. Cấu tạo hóa học của axit lactic
Axit lactic tồn tại dƣới dạng chất lỏng không màu, không mùi; có khối lƣợng
riêng 1,24 g/cm3; tnc = 18 oC; ts = 119 oC/12 mmHg; pKa = 3,85. Tan trong nƣớc,
etanol, ete.
Trong cấu tạo phân tử của chúng có một carbon bất đối xứng nên chúng có hai
đồng phân quang học: D-axit lactic và L-axit lactic. Hai đồng phân quang học này
có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân
cực ánh sáng, một sang phải và một sang trái. Do đó tính chất sinh học của chúng
hoàn toàn khác nhau [6].
COOH
H

C

OH

COOH
HO

CH3

Axit D- lactic

C

H

CH3

Axit L- lactic axit

Hình 1. 2. Hai đồng phân quang học của axit lactic [37]

HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718

2


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Loại L-axit lactic ở dạng tinh thể, tan trong nƣớc, cồn etylic, ete, không tan
trong CHCl3. Nhiệt độ nóng chảy là 28oC, góc quay cực ở 15oC là 2,67 o.
Loại D-axit lactic ở dạng tinh thể, tan trong nƣớc, cồn. Nhiệt độ nóng chảy là
28 oC, nhiệt độ sôi 103 oC, góc quay cực ở 15 oC là -2,26 o.
Nếu D-axit lactic và L-axit lactic có trong một hỗn hợp theo tỷ lệ 50/50
ngƣời ta gọi là hỗn hợp Raxemic. Hỗn hợp này đƣợc ký hiệu là DL axit lactic.
Trong quá trình lên men không khi nào có một hỗn hợp có tỷ lệ lý tƣởng này mà chỉ
có đƣợc hỗn hợp này khi tiến hành tổng hợp hữu cơ. DL – axit lactic là dịch lỏng,
có khả năng tan trong nƣớc, trong cồn, không tan trong CHCl3. Nhiệt độ nóng chảy
của chúng là 16,7 oC, nhiệt độ sôi là 122 oC [6].

1.1.2. Ứng dụng của axit lactic
Từ lâu, con ngƣời đã biết sử dụng quá trình lên men lactic một cách tự nhiên
trong chế biến thực phẩm nhƣ quá trình muối dƣa cà, làm sữa chua... Gần đây, một
số nghiên cứu đã tối ƣu hóa các yếu tố công nghệ trong việc sử dụng vi khuẩn lactic
sản xuất thực phẩm lên men nhƣ nem chua [8]; vi khuẩn lactic đồng hình lên men
nhanh làm giảm pH, vi khuẩn lactic dị hình lên men chậm và tạo thành mùi thơm
đặc trƣng của sữa chua; trong sản xuất tƣơng quá trình lên men lactic tạo pH thích
hợp cho sản phẩm và tăng hƣơng vị cho sản phẩm [1]; bổ sung Lactate calcium vào
thành phần sữa bột dinh dƣỡng, bánh ngọt, bánh nƣớng. Khi khoa học kỹ thuật phát
triển, sản phẩm của quá trình lên men lactic là axit lactic càng đƣợc ứng dụng rộng
rãi hơn trong các lĩnh vực của đời sống nhƣ: trong công nghiệp nhẹ axit lactic là
dung môi cho công nghiệp sản xuất sơn, vecni, nhuộm và thuộc da…
Đặc biệt, axit lactic có khả năng trùng hợp tạo thành polymer là polylactic
axit, điều này làm tăng tính ứng dụng axit lactic trong công nghiệp. PLA đƣợc
ứng dụng nhiều trong y học và trong giải quyết các vấn đề về sinh thái. Trong y
học, PLA đƣợc dùng làm chỉ “tự tiêu”, PLA cũng đƣợc dùng làm thiết bị cố
định các vết gãy xƣơng nhỏ và sau đó có khả năng tự phân huỷ…[13]. Bên cạnh
đó, sự xuất hiện của PLA đã giải quyết những vấn đề về môi trƣờng do sản
HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718

3


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

phẩm polyme từ nguồn nguyên liệu dầu mỏ gây ra bởi trên thực tế, các polyme
có nguồn gốc từ dầu mỏ hầu nhƣ không bị vi sinh vật phân huỷ mà phải tiêu huỷ
bằng cách đốt cháy và thải một lƣợng lớn CO2 ra khí quyển, gây nên hiện tƣợng

nóng lên toàn cầu. Trong khi đó, nhựa sinh học PLA có khả năng bị vi sinh vật
phân huỷ không gây ô nhiễm môi trƣờng, vì vậy chúng đang đƣợc nghiên cứu
để có thể thay thế các polyme có nguồn gốc từ dầu mỏ.
1.2.

Quá trình tổng hợp axit lactic
1.2.1.

Tổng hợp axit lactic bằng phương pháp hóa học

Một trong các quy trình công nghệ tổng hợp hoá học axit lactic cho mục đích
thƣơng mại là điều chế từ chất trung gian lactonitrile. Quy trình này gồm các bƣớc
cơ bản sau:
Bổ sung hydrogen cyanide (HCN) vào dung dịch acetaldehyde (trong môi trƣờng
kiềm) để tạo ra lactonitrile. Phản ứng này xảy ra trong pha lỏng ở áp suất cao.
Lactonitrile thô đƣợc thu lại và tinh sạch bởi quá trình chƣng cất.
CH3CHO

+
+

Acetaldehyd
e

HCN

CH3CHOHC
N
lactonitrile
nide

hydrogency
anide

Thủy phân lactonitrile bằng HCl hoặc H2SO4 tạo ra axit lactic cùng với muối
amonium.
CH3CHOHCN + H2O + 1/2H2SO4
Lactonitrile

+

+

axit sulphuric

CH3CHOHCO
OH
Axit lactic

+ 1/2(NH4)2SO4O
H
+muối ammonium

Este hóa axit lactic với methanol để tạo ra methyl lactate. Methyl lactate đƣợc
thu và tinh sạch bằng chƣng cất.
CH3CHOHCOOH
Axit lactic

+ CH3OH
Methanol

HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718

CH3CHOHCOOCH3

+ H2 O

Methyl lactate

4


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Thuỷ phân methyl lactate bằng nƣớc dƣới xúc tác của axit để tạo ra axit lactic và
methanol. Methanol đƣợc tạo ra từ quá trình trên lại đƣợc quay vòng cho quá trình
tiếp sau [3][14].
CH3CHOHCOOCH3 +
H2 O
CH3CHOHCOOH
+
CH3OH
+
+
3
Methyl lactate
Axit
lactic

+
+ methanol
H
H
Hiện nay, việc sản 2xuất axit lactic thƣơng phẩm bằng phƣơng pháp
2 hóa học vẫn
O (Nhật) và
đƣợc sử dụng ở mộtOsố nhà máy, điển hình là nhà máy Musashino
Sterling Chemicals Inc. (Mỹ). Tuy nhiên, phƣơng pháp này tồn tại nhiều nhƣợc
điểm lớn: trƣớc tiên, nguồn nhiên liệu dầu mỏ đang ngày một cạn kiệt và việc tìm ra
hƣớng sản xuất sử dụng các nguyên liệu mới đang đƣợc kêu gọi rộng rãi; đối với
môi trƣờng, sản xuất axit lactic theo phƣơng pháp hóa học thải ra một lƣợng lớn
CO2, gây ra sự biến đổi khí hậu, một vấn đề khá nóng bỏng cần đƣợc can thiệp và
hơn thế nữa, trên khía cạnh kinh tế, việc sản xuất axit lactic bằng phƣơng pháp này
tạo ra một hỗn hợp gồm hai đồng phân quang học của axit lactic, quá trình phân
tách hai đồng phân này đòi hỏi chi phí khá lớn [14].
1.2.2.

Tổng hợp axit lactic bằng phương pháp sinh học

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đƣờng thành axit lactic nhờ vi sinh
vật, điển hình là vi khuẩn lactic. Lên men lactic là một trong những loại hình lên
men phát triển nhất trong tự nhiên.
Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lƣợng. Các phân tử ATP đƣợc
hình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất (lactose) sẽ đƣợc vi khuẩn giữ lại
trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi và sinh trƣởng của vi sinh vật. Các
sản phẩm của quá trình đƣợc đƣa vào môi trƣờng, trong đó có cả axit lactic. Kết quả
là hàm lƣợng axit lactic tích lũy trong môi trƣờng lên men ngày càng tăng, làm
giảm pH môi trƣờng và kéo theo những biến đổi lý hóa khác.

HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718

5


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Khi nồng độ của axit lactic đạt 2 – 3% sẽ ức chế hoạt động của các vi sinh
vật khác. Chính vì thế, lên men lactic đƣợc ứng dụng để sản xuất nhiều sản phẩm
khác nhƣ: sữa chua, bơ, dƣa chua [2]…
Lên men lactic thông thƣờng với cơ chất là Glucose và lên men trong điều
kiện yếm khí nhằm tạo ra lƣợng axit lactic là lớn nhất. Hiện nay, lên men lactic còn
sử dụng nhiều nguồn Carbon khác nhau không chỉ là đƣờng Glucose mà là nhiều
loại đƣờng khác nhƣ Xylose, Cellulobios (chiếm tỉ lệ lớn trong Biomass), Maltose,
Saccarose… và vi sinh vật lên men có thể là vi khuẩn, nấm men, nấm mốc…
Cơ chế lên men axit lactic từ đường Glucose:
B
A
Glucose

Glucose

ATP
ADP

ATP
ADP

Glucose-6-P

Glucose-6-P
NADH
NAD +

Fructose-6-P

6-Phosphogluconate

ATP
ADP

Fructose-1,6-biphosphate

CO2

Ribulose-5-P

Dihydroxyaxetone-P (DAP)

Xylulose-5-P

Glyceraldehyde-3-P

Acetyl-P

NAD +
NADH

1,3-Biphosphoglycerate

CoASH

P1

ATP
ADP

Ethanol

3-Phosphoglycerate
2-Phosphoglycerate

NADH
NAD +

CoASH
Ethanol

Phosphoenolpyruvate
ADP
ATP

Pyruvate

NADH
NAD +

NADH

NAD +

Lactate

Ethanol

Hình 1. 3. Quá trình lên men glucose ở vi khuẩn lactic [2]
A - Lên men đồng hình (con đƣờng EMP)
B - Lên men dị hình (con đƣờng Pentosophosphate)

HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718

6


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Lên men lactic đồng hình
Lên men lactic đồng hình là loại lên men lactic hầu nhƣ chỉ cho sản phẩm là
axit lactic (với sản phẩm trên 70% lactic). Trong lên men lactic đồng hình, sự hình
thành axit lactic trải qua hàng loạt giai đoạn trung gian với sự tham gia của các
enzyme tƣơng ứng. Giai đoạn đầu xảy ra quá trình hoạt hoá hexose với sự có mặt
của axit phosphoric để hình thành hexose-diphosphate, sau đó diễn ra sự cắt mạch
hexose để tạo nên triosophosphate (dihydroxyaxetone-P và glyceraldehyde-3P).
Hợp chất này biến thành pyruvate, và pyruvate là chất nhận H từ NADH để tạo
thành axit lactic.

Hình 1. 4. Sơ đồ chuyển hoá glucose thành axit lactic trong lên men đồng hình

Tổng cộng: 1Glucose + 2ADP + 2Pi

2 Lactate + 2ATP

Trong lên men lactic đồng hình không có sự hình thành khí CO2, đó là điểm khác
biệt so với lên men lactic dị hình [2].
Lên men lactic dị hình
Quá trình lên men lactic dị hình xảy ra trong trƣờng hợp vi khuẩn lactic thiếu
các enzyme chủ yếu của con đƣờng EMP nhƣ aldolase và triosophosphate
isomerase, nên giai đoạn đầu của sự phân giải glucose sẽ đi theo con đƣờng Pentoso
phosphate (PP) tức là qua các sản phẩm trung gian nhƣ 6-Phosphogluconolactone,
6-Phosphogluconate, và sau đó loại ra một CO2 để trở thành Ribuloso-5-P. Hợp
chất này bị cắt thành 2 phân tử glyceraldehyde-3P và acetyl-P. Hợp chất
triosophosphate sẽ qua một số phản ứng giống nhƣ lên men đồng hình để tạo thành
HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718

7


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

axit lactic, còn acetyl-P sẽ chuyển thành ethanol và có thể đƣợc chuyển hóa tiếp
thành axit axetic. Vì vậy trong lên men lactic dị hình ngoài axit lactic còn có CO2,
ethanol, axit axetic… Lƣợng sản phẩm phụ tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào
giống vi sinh vật, môi trƣờng dinh dƣỡng và điều kiện ngoại cảnh. Axit lactic
thƣờng chiếm 40% lƣợng đƣờng đã đƣợc tiêu thụ, axit suecinic 20%, rƣợu etylic
10%, axit acetic 10%, và các loại khí gần 20% [6].
Phƣơng trình tổng quát trong quá trình lên men dị hình:

C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + CH3COOH + C2H5OH + CO2
Việc xuất hiện D(-), L(+) hay DL- lactate phụ thuộc vào tính chuyên hóa
không gian của enzyme vận chuyển LDH và vào sự có mặt của một lactate
racemase. Cuối pha sinh trƣởng của vi khuẩn lactic, pH sẽ thấp và dao động tuỳ
theo loài vi khuẩn .
1.3. Giới thiệu về Biomass – nguồn cung cấp Xylose
Từ Biomass bao gồm từ “Bio” và “mas”, ban đầu đƣợc sử dụng trong lĩnh vực
của sinh thái học đơn giản đề cập đến tổng số động vật và thực vật. Từ sau khi có sự
xuất hiện của dầu khí, định nghĩa của thế giới đƣợc mở rộng hơn ngoài lĩnh vực
sinh thái học, nó còn bao gồm nghĩa “các nguồn tài nguyên sinh học nhƣ các nguồn
năng lƣợng”. Không có định nghĩa nghiêm ngặt của Biomass mà định nghĩa đó đến
từ một hoặc các lĩnh vực khác nhau. Từ quan điểm của nguồn tài nguyên năng
lƣợng, Biomass đƣợc định nghĩa là một thuật ngữ chung cho nguồn động vật và
thực vật và những phế thải phát sinh từ chúng (không bao gồm nguồn hóa thạch)
[36].
Biomass (sinh khối) là vật liệu sinh học từ cuộc sống hoặc các sinh vật gần đây
sống, phần lớn xuất hiện từ thực vật hoặc các vật liệu có nguồn gốc từ thực vật. Là
một nguồn năng lượng tái tạo – năng lượng sinh khối có thể được sử dụng trực tiếp
hoặc gián tiếp, có thể sử dụng ngay hoặc chuyển thành các dạng năng lượng khác
như nhiên liệu sinh học [36].

HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718

8


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

1.3.1. Phân loại
Biomass rất khác nhau và đƣợc phân loại theo 2 cách:
- Phân loại theo sinh học dựa trên kiểu tồn tại của Biomass trong tự nhiên
(giống nhƣ là phân loại theo sinh thái hoặc kiểu thảm thực vật).
- Phân loại theo sử dụng và ứng dụng nhƣ các nguồn tài liệu.
Phân loại theo sử dụng và ứng dụng thì Biomass không chỉ bao gồm các sản
phẩm thông thƣờng, chất thải nông nghiệp, rừng và ngƣ nghiệp mà còn bao
gồm cả sinh khối rừng.
1.3.2. Thành phần
Nguồn Biomass từ thực vật nhƣ rơm rạ, cây cỏ gỗ mục,… đƣợc đƣa vào sử dụng
nhiều hơn cả. Thành phần chính của chúng là lignocelluloses (chiếm khoảng 90%
chất khô) [36].
Trong lignocellulose có các polime chính đó là cellulose, hemicellulose và
lignin. Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đƣờng khác
nhau, trong khi lignin là một polymer dạng vòng đƣợc tổng hợp từ tiền
phenylpropanoid. Thành phần cấu tạo và phần trăm của các polymer này là khác
nhau giữa các loài. Hơn nữa, thành phần cấu tạo trong cùng một cây hay là các cây
khác nhau là khác nhau dựa vào độ tuổi, giai đoạn sinh trƣởng, phát triển của cây và
các điều kiện khác. Thông thƣờng, cấu trúc của lignocellulose gồm cellulose (35-50%),
hemicellulose (20-40%) và lignin (10-30%) [26].

Hình 1. 5. Cấu trúc lignocelluloses [36]
HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718

9


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Lƣợng lớn lignocellulose đƣợc thải ra từ các ngành lâm nghiệp, nông nghiệp,
công nghiệp giấy và gây ra ô nhiễm môi trƣờng. Tuy nhiên, lƣợng lớn các sinh khối
thực vật dƣ thừa đƣợc coi là rác thải có thể đƣợc biến đổi thành nhiều sản phẩm có
giá trị khác nhau nhƣ nhiên liệu sinh học, hóa chất, các nguồn năng lƣợng rẻ cho
quá trình lên men, bổ sung chất dinh dƣỡng cho con ngƣời và thức ăn cho động vật.
Bảng 1. 1. Các thành phần chính của lignocelluloses [36]
STT

Thành phần

Đặc điểm
- Thành phần chủ yếu của tế bào thực vật
- Không có giá trị dinh dƣỡng

1

Cellulose

- Có 1 số vi khuẩn trong dạ cỏ gia súc, động vật
nguyên sinh trong ruột mối có khả năng tạo
enzyme phân giải.
- Thủy phân tạo đƣờng 6C
- Thành phần chính của thành tế bào thực vật
- Là một polyphenol có cấu trúc mở

2

Lignin

- Có cấu trúc không gian 3 chiều, phức tạp, vô định
hình.
- Rất khó để tách và phân hủy.
- Là một polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng
hợp khoảng 70 – 200 đơn phân.
- Gồm cả đƣờng 6C (Glucose, Mannose, Galactose)

3

và đƣờng 5C (Xylose, Arabinose)

Hemicellulose

- Mạch chính đƣợc cấu tạo từ liên kết β-(14)
- Có mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vô định hình, vì
thế dễ bị thủy phân.
Trong các thành phần trên, Hemicellulose là nguồn chính để thu các loại đƣờng
Xylose. Hemicellulose hay còn gọi là polyose là một dị polime đƣợc cấu thành từ
HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718

10


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

các đƣờng pentose (xylose, ararbinose), các đƣờng hexose (mannose, glucose,
galactose) và các axit. Không giống nhƣ cellulose, hemicellulose không đồng nhất
về mặt hóa học. Hemicellulose của gỗ cứng chứa chủ yếu là xylan trong khi

hemicellulose của gỗ mềm lại chứa chủ yếu là glucomannan. Thông thƣờng, lƣợng
hemicellulose chiếm đến 15 – 30% trọng lƣợng khô của gỗ. Hemicellulose dễ bị
thủy phân bằng axit để tạo thành các thành phần monoe bao gồm glucose, galactose,
xylose, arabinose và một lƣợng nhỏ rhamnose, axit glucuronic, axit methyl
glucuronic.
Hemicellulose có thể tồn tại ở bốn loại cấu trúc là xylan, mannan, β-glucan với
hỗn hợp các mối liên kết và xyloglucan. Bốn nhóm này có sự thay đổi về cấu trúc
trong từng loại chuỗi, đƣợc phân theo vị trí hay loại liên kết của glycozit trong
mạng lƣới phân tử. Chuỗi chính của polyose có thể chứa chỉ một nhóm chức
(Homopolyme) nhƣ Xylan, hoặc hai hay nhiều đơn vị (Heteropolyme) nhƣ
Glucomannan [15]. Các đoạn cấu trúc cơ bản của hemicellulose đƣợc thể hiện ở
hình 1.7.
Xylan là một heteropolyme đƣợc tạo thành bởi một chuỗi các nhóm xylose liên
kết với nhau qua liên kết β-1,4-glycosidic và phân nhánh bởi các chuỗi hydrat
cacbon ngắn. Đa số phân tử xylan chứa nhiều nhóm ở trục chính và chuỗi bên. Các
gốc thay thế chủ yếu trên khung chính của xylan là các gốc acetyl, arabinosyl và
glucuronosyl. Các nhóm này có đặc tính liên kết tƣơng tác cộng hóa trị và không
hóa trị với lignin, cellulose và các polymer khác.

HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718

11


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

O-acetyl-4-O-methylglucurono-xylan

Arabino-4-O-methylglucurono-xylan (AMGX)

Arabino-xylooligosacarit(AXOS)

Arabinoxylan(AX)
Hình 1. 6. Các loại cấu trúc tiêu biểu của hemicelluloses [30]
Xylan có thể đƣợc chia thành homoxylan và heteroxylan bao gồm: Glucoroxylan,
(arabino) glucuronoxylan, (glucurono) arabinoxylan, arabinoxylan và tổ hợp
heteroxylan. Xylan khi hoàn toàn là homopolyme (tìm thấy ở tảo biển Palmariales

HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718

12


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

và Nemaliales), mạng lƣới của chúng bao gồm xylopyranose đƣợc liên kết bởi liên
kết β-1,3 hay hỗn hợp β-1,3 và β-1,4-glycosidic. Hỗn hợp Heteroxylan có mặt ở
trong ngũ cốc, hạt cây, mủ và nhựa cây có mạng lƣới β-1,4-D-xylopyranose gắn với
chuỗi mono và oligoglycosyl [30].
Khi thủy phân xylan, ta đƣợc monome là đƣờng Xylose.

β-1,4-linkage

Hình 1. 7. Phân tử xylan và cơ chế chuyển đổi sang Xylose [30]
1.3.3. Các bước tổng quát để sản xuất axit lactic từ nguyên liệu Biomass
Mặc dù có rất nhiều thuận lợi trong việc xác định và khả năng thực hiện, nhƣng

quá trình thƣơng mại hóa ứng dụng sinh khối thực vật trong sản xuất axit lactic vẫn
còn gặp nhiều vấn đề khó khăn. Quá trình sinh hóa để biến đổi cấu trúc sinh khối
thực vật thành các loại đƣờng mono nhƣ: glucose, xylose, arabinose và mannose đòi
hỏi một vài quá trình với những bƣớc thực hiện đƣợc thiết kế tính toán kỹ lƣỡng
[22]. Quá trình chuyển hóa để sản xuất axit lactic từ thực vật bao gồm 4 bƣớc chính.
1. Tiền xử lý: bẻ gãy các khối cấu trúc của thực vật thành những cấu trúc nhỏ
hơn thuận lợi cho bƣớc xử lý tiếp theo
2. Thủy phân bằng enzyme: cắt các cấu trúc polymer của thực vật thành những
cấu trúc nhỏ hơn cho quá trình lên men nhƣ: glucose và xylose, đây là sản phẩm
chính của quá trình thủy phân.
3. Lên men: quá trình trao đổi chất tạo thành axit lactic nhờ vi khuẩn lactic

HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718

13


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

4. Thu hồi và tinh sạch sản phẩm: tinh sạch axit lactic theo những phƣơng pháp
đã đƣợc ứng dụng và thƣơng mại hóa.
Sinh khối thực vật

Quá trình tiền xử lý:
Hóa học/ Vật lý

Lignin

Thủy phân thành
Hemicellulose

Cellulose

Thủy phân
bằng enzyme
Chủ yếu là Pentose

Chủ yếu là glucose

Quá trình lên men
Thu hồi và tinh sạch
Axit lactic
Hình 1. 8. Sơ đồ tổng hợp axit lactic từ sinh khối thực vật [22]
Hiện nay, việc ứng dụng Glucose làm cơ chất trong nuôi vi sinh vật là phổ biến
tuy nhiên nguồn C dồi dào và chiếm tỉ lệ khá lớn trong Biomass là Xylose vẫn chƣa
đƣợc quan tâm nhiều, đặc biệt là trong nghiên cứu sự phát triển của vi khuẩn.
Vì vậy đề tài này nghiên cứu sâu hơn về sự sinh trƣởng và phát triển của các loài
vi khuẩn lactic từ Biomass, tập trung nhiều vào các loại cơ chất mới là Xylose.

HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718

14


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

1.4. Lên men axit lactic từ đƣờng Xylose
1.4.1. Giới thiệu về nguồn đường Xylose
Xylose là loại đƣờng đầu tiên đƣợc tách ra từ gỗ, vì vậy nó còn đƣợc gọi là
đƣờng gỗ [39].
Xylose đƣợc phân loại là một monosaccharide của nhóm aldopentose, có nghĩa là
nó có năm nguyên tử carbon và một nhóm formyl. Nó có nguồn gốc từ
hemicellulose, một trong những thành phần chính của Biomass.
1.4.1.1. Công thức hóa học
 Công thức phân tử: C5H10O5
 Công thức tổng quát: HOCH2(CH(OH))3CHO
Giống nhƣ hầu hết các loại đƣờng, nó có nhiều đồng phân cấu trúc khác nhau,
phụ thuộc vào điều kiện. Với nhóm carbonyl tự do, nó là một loại đƣờng khử [39].
- Trong tự nhiên thƣờng có 2 dạng: mạch vòng và mạch thẳng.
- Đối với dạng mạch thẳng, ngƣời ta chia đồng phân dạng D và L (đồng phân về
cấu hình) và thêm dấu (+) hay (–) để chỉ cực quay sang trái hoặc phải.

(1)

(2)

(3)

Hình 1. 9. Cấu tạo đƣờng Xylose [39]
(1) D–Xylose

;

(2) L–Xylose

(3) Xylose dạng mạch vòng

HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718

15