Phương pháp Phân Tích Công Cụ Lí thuyết chung về sắc kí Sắc kí cột Sắc kí lớp mỏng

Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

I. LÝ THUYẾT CHUNG VỀ SẮC KÍ
1. Khái niệm và đặc điểm chung của phương pháp sắc kí
1.1. Khái niệm
Sắc kí là phương pháp tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân bốkhác
nhau của chúng giữa pha động và pha tĩnh.
+ Pha tĩnh: có thể là chất rắn hoặc chất lỏng. Pha lỏng tách riêng các hợp chất
trong một hỗn hợp nào đó là nhờ vào tính chất hấp thu của nó.
* Pha tĩnh là chất rắn: thường là alumin hoặc silica gel đã được xử lý, nó có
thể được nạp nén vào trong một cột (vd: sắc kí cột hở ở áp suất thường hoặc
sắc kí ở áp suất cao), hoặc được tráng thành một lớp mỏng, phủ lên trên bề
mặt một tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm nhựa (vd: sắc kí lớp mỏng).
* Pha tĩnh là chất lỏng: có thể là chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chất
mang rắn hoặc một chuỗi dây cacbon dài được gắn (bằng một nối hóa trị) lên
trên chất mang rắn. Vd: trong sắc kí giấy, pha tĩnh là nước (nước này do sợi
cellulose của tờ giấy đã hấp thu); Hoặc trong sắc kí giấy, pha tĩnh là một chất
lỏng có tính bền nhiệt, kém bay hơi, được tẩm phủ lên những hạt rắn có lỗ
rỗng.
+ Pha động: có thể là chất lỏng hoặc chất khí.
* Pha động là chất lỏng:thường dùng trong sắc kí giấy, sắc kí lớp mỏng, sắc
kí cột. Trong trường hợp này chất lỏng được gọi là dung môi giải ly.
* Pha động là chất khí: thường là trong kĩ thuật sắc kí khí. Trong trường hợp
này, chất khí được gọi là khí mang hoặc khí vectơ.
1.2. Đặc diểm chung
Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và
pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan,…). Trong các
hệ thống sắc kí chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc kí.
Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá
trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha
tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái

lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc kí so với các chất
tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất
qua quá trình sắc kí.

Trang 1/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

2. Cơ sở của phương pháp sắc kí
Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha
động và tĩnh. Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau của các chất,
nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi
dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc
kí.
Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị
hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng
phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:

n = n∞

bC
1 + bC

(1)

Trong đó: n - lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng
n∞ - lượng cực đại của chất
b – là hằng số
C – là nồng độ của chất bị hấp phụ

Theo Langmuir, trên bề mặt của vật rắn có những vị trí có năng lượng bé phân
bố trên toàn bề mặt, ta gọi số vị trí hay n∞ các phân tử chất bị hấp phụ từ dung dịch
hay dòng khí có thể bị hấp phụ lên bề mặt vật rắn tại các điểm này.
Trong miền nồng độ đủ bé thì hiện tượng hấp phụ có thể trở nên tuyến tính. Khi C
đủ bé để cho bC< 1 và 1+ bC ≈ 1thì (1) trở thành:
n = n∞bC = KC

(2)

Đây là phương trình hấp phụ tuyến tính hay còn gọi là phuong trình henry.
Miền nồng độ của chất hấp phụ tuân theo định luật hấp phụ tuyến tính (miền
Henry).
Cho dù cơ chế của hiện tượng hấp phụ, trao đổi chất giữa hai pha động và tĩnh
có thể khác nhau nhưng hệ quả cuối cùng vẫn là hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ
và sự trao đổi chất nói chung tuân theo định luật hấp phụ langmuir hoặc định luật
hấp phụ Henry.
3. Phân loại các phương pháp sắc kí
Có nhiều tiêu chí để phân loại các phương pháp sắc kí, trong đó tiêu chí được
sử dụng nhiều nhất là phân loại theo hệ pha:
Trang 2/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng
SK khí – rắn
Sắc kí khí
SK khí – lỏng
SK điện di mao quản
PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÍ

SK phân bố lỏng – lỏng

HPLC

SK rắn – lỏng
Sắc kí lỏng
SK giấy
SK phẳng
SK lớp mỏng

Ngoài ra, còn có các cách phân loại sau:
-

-

Phân loại dựa trên đặc trưng của các pha động, pha tĩnh:
+ Sắc kí cột

+ Sắc kí giấy

+ Sắc kí lỏng

+ Sắc kí khí.

Phân loại dựa trên bản chất của hiện tượng xảy ra trong quá trình tách chất:
+ Sắc kí hấp thu

+ Sắc kí trao đổi ion.

+ Sắc kí phân chia

+ Sắc kí lọc gel

4. Pic sắc kí vàcác thông số đặc trưng của sắc kí
4.1. Pic sắc kí
• Sắc đồ:
Sắc đồ là dường biểu diễn sự

C

phụ thuộc của tính hiệu đo trong

D

quá trình tách vào thời gian. Mỗi
dãy (band) trên sắc đồ được gọi là
pic, mỗi peak ứng với một cấu tử
được tách ra.Để tính toán hàm

A’

A

B

h’

F

G

B’

h

E

C

pic.Một sắc đồ có thể có nhiều

F’

lượng chất phân tích, tính toán
diện tích pic sắc kí là chính xác

V

Hình 23.2. Các đặc trưng của phân tích sắc kí

nhất.
Tín hiệu đo phụ thuộc vào detector.
Trang 3/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

Trong phương pháp phân tích sắc kí, người ta thường dùng phương pháp rửa giải.
Trong phương pháp rửa giải, pha động (khí hay lỏng) thoát ra khỏi cột được phân tích
liên tục. Dựa vào kết quả phân tích, người ta xây dựng đồ thị hệ tọa độ: nồng độ chất
nghiên cứu C và thể tích V của pha động chảy qua cột. Nếu gọi A’ là lúc đưa dung

dịch mẫu (hoặc hỗn hợp mẫu phân tích), A là lúc xuất hiện cấu tử không bị hấp phụ
lên cột, còn B là lúc xuất hiện chất phân tích, đường A’AB và phần kéo dài của nó là
đường BF được gọi là đường không hay đường chân.Đường cong DBF là pic sắc kí
(hay đỉnh sắc kí).
Píc sắc kí được đặc trưng bằng chiều cao, diện tích và vị trí của pic. Đường cong
pic sắc kí thường có thể mô tả bằng phương trình toán học:
C=
Trong đó:

Cmax e −( v−vo )

2

/ 2 µ 2C

(3)

v – thể tích pha động
Vo – thể tích pha động ứng với Cmax
µ c – độ lệch chuẩn bằng độ rộng nửa pic ứng với:

C max
= e1 / 2
C

(4)

Chiều cao của pic (tỉ lệ với Cmax) được tính bằng giá trị h hay h’ (hình 23.2).h’
chính là khoảng cách tính từ đường chân đến giao điểm của các tiếp tuyến vẽ từ điểm
uốn của đường cong. Độ rộng của pic được tính bằng khoảng cách giữa hai điểm trên

đường cong ứng với nửa chiều cao h (CE = W0,5 ). Tuy nhiên cũng còn nhiều cách tính
độ rộng của pic khác nhau. Người ta có thể chọn độ rộng của pic là khoảng cách của
các điểm uốn (µ u) hay khoảng cách B’F’ là khoảng cách giữa các giao điểm của các
đường tiếp tuyến tại điểm uốn với đường chân (B’F’ = Wh ).
Người ta có thể xác định mối liên quan giữa các đại lượng này:
W0,5 = 2.36 µ c ; µ u = 0.850 µ 0,5 - 2 µ c

(5)

µ K = 1.700 µ c ;
4.2. Các thông số đặc trưng của phương pháp sắc kí sau
• Các thông số thời gian và thông số pic:
-

Thời gian chết (dead tim) to: thời gian cần thiết để pha động (dung môi) chạy
qua cột.

-

Thời gian lưu (Retention time) tR: thời gian cần thiết để cấu tử đưa vào hệ sắc kí
được tách ra với nồng độ cực đại.

Trang 4/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

-

Thời gian lưu của cấu tử n (tRn): được xác định dựa trên sắc đồ, được tính từ

thời điểm bắt đầu chạy sắc kí đến đỉnh pic tương ứng của cấu tử n.

-

Thời gian lưu tịnh (Net retention time) t’R: được tính bằng hiệu số giữa thời
gian lưu với thời gian chết (t’R = tR - to).

-

Độ lệch tiêu chuẩn σt: là nửa bề rộng của pic tại điểm uốn của pic.

-

Bề rộng nửa pic ứng với nửa chiều cao pic kí hiệu là W0,5: W0,5 = 2.354 σt

-

Bề rộng nền pic kí hiệu là Wh: Wh = 4 σt

Khi pic đối xứng có dạng đường phân bố gauxơ, các giá trị σt, W0,5, Wh xác định
được dựa trên đường phân bố lý thuyết gauxơ.
Các thông số to, tR, tR’ có thể chuyển tính theo thể tích. Khi đó các giá thị tương
ứng là: thể tích chết Vo, thể tích lưu VR, thể tích VR’. Trên hình 23.2, đoạn AG tương
ứng với thể tích lưu thu gọn (hay thể tích lưu quy đổi), cong A’G là thể tích lưu chung.
Nếu độ dài của đoạn A’G là l thì thời gian lưu tR sẽ là: tR =
trong đó :

l
,
U

U – vận tốc chuyển động của băng ghi.

Thể tích lưu VR tỉ lệ với thời gian lưu tR: VR = tR ω , trong đó: ω - vận tốc thể tích
của pha động (dung dịch hay khí mang) chạy qua cột.
Thể tích lưu thu gọn V’R ứng với đoạn AG được xác định bằng hệ thức:
VR’ = VR – V0
trong đó:

V0 – tỉ lệ với đoạn A’A có độ dài tương ứng là lo
V0 – đặc trưng cho thể tích lưu của cấu tử không bị hấp phụ hay còn gọi

là thể tích “chết”.
Tích số của thể tích lưu thu gọn V’R với hệ nén J (cho sắc kí khí) được gọi là thể
tích lưu hiệu quả Vhq:
Với hệ số nén:

Vhq = V’RJ.
J=

3 ( P1 / Po ) 2 − 1
.
2 ( P1 / Po ) 3 − 1

P1 và Po là áp suất của khí mang khi vào cột và ra khỏi cột.
Một đặc trưng quan trọng khác của phương pháp sắc kí khí là thể tích lưu riêng
tuyệt đối Vm. Vm được tính theo công thức:
Vm =
trong đó:

Vhq 273.16
.
m
TK

(6)

m – khối lượng của chất hấp phụ
Trang 5/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

Tk – nhiệt độ của cột.
Vm không phụ thuộc các tham số hình học của cột và có thể dùng để đặc trưng cho
hệ thống chất hấp phụ - khí hấp phụ. Tuy nhiên đại lượng này cũng thay đổi theo một
số nguyên nhân ngẫu nhiên.
Một đại lượng khác ít chịu ảnh hưởng của yếu tố ngẫu nhiên hơn là thể tích lưu
tương đối. Theo định nghĩa, thể tích lưu tương đối là tỉ số giữa thể tích lưu riêng tuyệt
đối với thể tích tương ứng của một chất được chọn làm chất chuẩn:
Vmj

Vtđ =
trong đó:

(7)

Vmc

Vtđ – thể tích lưu tương đối

Vmj – thể tích lưu tuyệt đối của chất nghiên cứu
Vmc – thể tích lưu tuyệt đối của chất chọn làm chuẩn.

Giá trị thể tích lưu tương đối có thể tìm được trong các sổ tay.
• Hệ số phân bố k:
Cân bằng của cấu tử trong hệ sắc kí được mô tả bằng phương trình đơn giản sau:
X pha động

X pha tĩnh

Hằng số cân bằng cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hệ số phân bố,
được tính như sau:
k=

CT
CĐ

Trong đó: CT là nồng độ cấu tử trong pha tĩnh
CĐ là nồng độ cấu tử trong pha động
Hệ số k phụ thuộc vào bản chất pha động, pha tĩnh và bản chất chất phân tích.
• Khả năng tách (k’):
Khả năng tách (capacity factor) k’ được biểu diễn theo hệ thức:
k’ =

t ' R t R − tO t R
=
= -1
tO
tO
tO

(8)

Giá trị k’ nhỏ thì khả năng tách kém, k’ lớn khả năng tách tốt:
k’~ 0, tR~to: chất ra sớm, cột không có khả năng giữ chất lại
k’ càng nhỏ (tR càng nhỏ): các mũi chất ra nhanh, khả năng tách kém
k’ càng lớn (tR càng lớn): chất bị giữ trong cột càng lâu, thời gian phân tích càng
dài nên mũi sắc kí có khả năng bị tù.
Trang 6/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

Khoảng k’ lí tưởng là từ 2 đến 5 nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp thì có
thể chấp nhận giá trị k’ từ 1 đến 20.
• Độ chọn lọc (α):
Độ chọn lọc (selectivity) α được biểu diễn theo hệ thức:
α=

k '2 t R 2 − tO
=
k '1 t R1 − t O

(9)

Đại lượng (α) nói lên khả năng tách giữa hai cấu tử lân cận nhau trên sắc đồ.
Cấu tử 1 tách khỏi cấu tử 2 khi đó phải có k’2 ≠ k’1.Điều đó có nghĩa khi giá trị α ≠
1, cấu tử 1 và 2 tách khỏi nhau trong quá trình sắc kí.Giá trị α càng khác 1 thì 2 cấu tử
tách được ra khỏi nhau càng tốt.
• Số đĩa lý thuyết N:

Đại lượng đặc trưng cho hệ thống tách là số đĩa lý thuyết N. Đĩa lý thuyết được
định nghĩa là miền mà cân bằng động của nồng độ cấu tử trong pha tĩnh và pha động
được thiết lập. Số đĩa lý thuyết được hiểu là nếu tổng độ dài của cột L được chia thành
các phần có độ dài H thì số đĩa lý thuyết được tính theo biểu thức N = L/H. Dựa trên
sắc đồ nếu pic là đường phân bố gauxơ thì số đĩa lý thuyết cho các pic có thời gian lưu
đủ lớn được tính theo biểu thức sau:
N=

t R2

t R2
t R2
= 5.54 2 = 16 2
σ t2
W0,5
Wh

(10)

• Độ phân giải (R):
Độ phân giải (R) nói lên mức độ tách các cấu tử khỏi nhau trong một phép tách sắc
kí.Hai cấu tử được tách khỏi nhau càng triệt để thì độ phân giải càng cao.Độ phân giải
được đánh giá qua các đại lượng đặc trưng riêng là thời gian lưu và độ rộng pic.
Dựa vào các thông số hiển thị trên sắc đồ, độ phân giải (R) được tính theo biểu
thức:
R=

(t R 2 − t R1 ) 1,177(t R 2 − t R1 )
=
=

Wh1 + Wh 2
W0,51 + W0 ,52
2

(11)

Giá trị R nhỏ khả năng phân giải của hai cấu tử thấp. Thực nghiệm có thể tiến hành
tách, xác định với giá trị R thấp nhất bằng 0,5. Giá trị R lý tưởng trong khoảng 1 – 1,5.
Với R>1,5 khả năng tách tốt nhưng đòi hỏi nhiều thời gian.
Độ phân giải R phụ thuộc vào thông số k’, độ chọn lọc α và số đĩa N của cột tách.

Trang 7/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

R=

N α − 1 k '2
.
.
4
α 1 + k '2

(12)

Để tăng độ phân giải R, ta có thể:
-

Tăng giá trị khả năng tách k’, k’ phụ thuộc vào bản chất pha động, tức là phụ

thuộc vào nồng độ, lực ion và bản chất của cột.

-

Tăng số đĩa lý thuyết, tăng độ phân giải. Tuy nhiên thời gian phân tích phải kéo
dài vì làm chậm tốc độ dòng.

-

Tăng độ chọn lọc α. Là phương pháp hiệu quả nhất, thực hiện bằng cách chọn
cột thích hợp hơn hoặc thay đổi thành phần dung dịch giải hấp phụ.

5. Các lực liên kết trong hệ sắc kí
Trong hệ sắc kí có 3 thành phần chủ yếu quyết định sự tồn tài của hệ: chất phân
tích, pha tĩnh và pha động. Chúng tương tác với nhau, tạo nên sự phân bố cần thiết,
giúp cho sự di chuyển các chất phân tích dọc theo chiều dài cột với tốc độ khác nhau.
Vấn đề là 3 thành phần này tương tác như thế nào, bằng các lực liên kết nào mà kết
quả là các chất phân tích phân bố vào pha tĩnh ở mức độ khác nhau. Đó là do bản chất
của các thành phần trong hệ sắc kí nói trên. Chất phân tích có thể là ion, phân tử trung
hòa hay chất phân cực; Đối tượng tác động của nó có thể là ion, phân tử trung hòa hay
chất phân cực.Từ đó chúng tương tác với nhau bằng các lực liên kết khác nhau. Người
ta chia các lực liên kết đó thành 4 loại:
5.1. Lực liên kết ion
Trên bề mặt pha tĩnh có các trung tâm hoạt động là ion, đó các phân tử có khả năng
phân ly tạo thành các ion, tạo nên các trung tâm hoạt động ion. Chúng tham gia liên
kết với các ion chất phân tích trong dung dịch theo lực tương tác tĩnh điện gọi là liên
kết ion. Để giữ các anion chất phân tích, pha tĩnh cần có các trung tâm cation trên bề
mặt, và ngược lại, để giữ các cation chất phân tích thì bề mặt pha tĩnh cần có các trung
tâm anion.
Tương tự, pha động cũng có các trung tâm hoạt động là ion, chúng tham gia tương tác

với pha tĩnh và chất phân tích.
5.2. Lực phân cực
Trong phân tử chất phân tích, chất rửa giải trong pha động cũng như các phân tử
trên bề mặt pha tĩnh có các trung tâm phân cực. Chúng có thể là các lưỡng cực điện cố
định, cũng có thể là các lưỡng cực điện do cảm ứng. Chúng tham gia liên kết với các

Trang 8/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

phân tử phân cực khác bằng lực liên kết phân cực.Sự phân cực trong các phân tử đôi
khi rất nhỏ và sự chênh lệch về độ phân cực cũng rất nhỏ.Tuy nhiên sự chênh lệch này
là yếu tố rất quan trọng để độ bền liên kết khác nhau, đó là điều cần thiết để phân chia
chúng trong các phép tách sắc kí.
Ví dụ: các chất đồng phân o-, m-, p-cresol chỉ khác nhau về vị trí nhóm –CH3 trong
phân tử. Chính sự khác biệt này làm cho mật độ electron trong phân tử của các cresol
khác nhau, tạo nên sự khác biệt về độ phân cực, làm cho lực liên kết với pha tĩnh khác
nhau, từ đó có sự chệnh lệch về thời gian lưu trong quá trình sắc kí.
5.3. Lực phân tán
Lực này có bản chất điện, tuy nhiên không hề có cực điện trog mạng lưới phân tử,
cũng không liên quan tới phân tử lưỡng cực cảm ứng hay cố định.Tương tác phân tán
điển hình là giữa các mạch hiđrocacbon, nó là tương tác phân tử.
Ví dụ: n-heptan là chất lỏng chứ không phải khí vì sự tương tác giữa các phân tử là
lực phân tán đủ lớn để giữ chất này ở trạng thái lỏng. Để tách các hiđrocacbon người ta
có thể dùng hiđrocacbon khác làm pha tĩnh.
5.4. Lực tương tác đặc biệt
Lực tương tác đặc biệt là lực tạo thành do các liên kết hiđro, liên kết cho-nhận mà
có.
Như vậy, lực tương tác của các phân tử trong hệ sắc kí gồm: lực ion, lực phân cực,

lực phân tán và lực tương tác đặc biệt. Các lực này đối với các chất khác nhau có giá
trị khác nhau và quyết định đối với quá trình sắc kí.
6. Các cách tiến hành phân tích sắc kí
Tùy thuộc chế độ đưa mẫu vào hệ thống sắc kí cũng như thao tác tiến hành sắc kí,
người ta chia cách tiến hành sắc kí thành 3 loại:
6.1. Phương pháp tiền lưu
Đây là phương pháp sắc kí đơn giản nhất. Người ta cho hỗn hợp (ví dụ chỉ gồm 2
chất A và B) liên tục chảy qua cột có nạp sẵn chất hấp phụ. Người ta xác định nồng độ
các cấu tử trong dung dịch chảy ra khỏi cột và xây dựng đồ thị theo hệ tọa độ: nồng độ
cấu tử- thể tích dung dịch chảy qua cột. Đồ thị này thường gọi sắc đồ (đường cong
thoát).
Do các cấu tử bị hấp phụ lên cột, nên trước hết từ cột chỉ chảy ra dung môi. Sau đó
trong dung dịch thoát sẽ có cấu tử bị hấp phụ yếu hơn trên cột (ví dụ là cấu tử A), sau
đó đến phần dung dịch chứa hỗn hợp A + B. Do vậy mà phương pháp tiền lưu không
Trang 9/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

cho phép tách hoàn toàn các cấu tử ra khỏi nhau nên thực tế ít được dùng vào mục đích
phân tích các chất.
6.2. Phương pháp rửa giải
Trong phương pháp rửa giải, đầu tiên người ta cho v (ml) dung dịch chứa hỗn hợp
các cấu tử (ví dụ chỉ gồm 2 chất A và B, trong đó A có ái lực với cột nhỏ hơn B) chạy
qua cột. Các cấu tử A và b trong v (ml) trước hết sẽ bị giữ lại ở phần trên của cột. Sau
đó cho dung dịch rửa (thường là dung môi hòa tan các cấu tử và không bị pha tĩnh hấp
phụ) chảy qua cột. Lúc đó các cấu tử bị giữ ở phần trên của cột sẽ bị dung môi “rửa”
và đưa dần xuống phía dưới. Cấu tử A có ái lực với cột nhỏ hơn B nên chuyển động
xuống phía dưới nhanh hơn B. Nếu cột đủ dài và chế độ chảy của dung dịch rửa thích
hợp thì sau một thời gian cho chảy dung dịch rửa, các cấu tử sẽ tách ra thành từng

vùng, các vùng này sẽ tuần tự thoát ra khỏi cột, mỗi vùng lại được cách nhau bằng một
phần dung môi. Sau quá trình tách có sự giảm nồng độ cấu tử.
6.3. Phương pháp rửa đẩy
Trong phương pháp rửa đẩy, sau khi đưa mẫu vào cột, ta cho chảy qua cột một
dung dịch rửa chứa chất có ái lực với pha tĩnh lớn hơn các cấu tử cần tách. Các cấu tử
cần tách sẽ bị chuyển dần xuống phía dưới khi ta tiến hành quá trình rửa cột và tuần tự
thoát ra khỏi cột. Cấu tử thoát ra khỏi cột đầu tiên là cấu tử tương tác với pha tĩnh yếu
nhất, sau đó dần dần đến các cấu tử có ái lực với cột mạnh dần. Khác với phương pháp
rửa giải, nồng độ các cấu tử không giảm qua quá trình sắc kí.
Một nhược điểm quan trọng của quá trình rửa đẩy là rất khó phân biệt các phần
riên của các cấu tử trong dung dịch thoát, vì ở đây các phần dung dịch thoát chứa các
cấu tử riêng không thể tách khỏi nhau bằng các thể tích dung dịch rửa xác định.
7. Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc kí
Ngoài cơ chế hóa học xảy ra trong các quá trình sắc kí , còn có nhiều lí thuyết mô
tả một cách hình thức quá trình phân tích sắc kí nhưng người ta chú ý đến phương
pháp lí thuyết đĩa và lí thuyết động học. Dùng các lí thuyết này người ta có thể giải
thích một các tổng quát sự phân bố của các chất trong quá trình sắc kí.
7.1. Lí thuyết đĩa
Phương pháp lí thuyết đĩa đầu tiên được dùng để mô tả quá trình xảy ra trên cột
chưng cất. Đến năm 1942, Martin và Singe đề nghị áp dụng lí thuyết đĩa vào quá trình
chưng cất.

Trang 10/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

Theo lí thuyết đĩa, người ta tưởng tượng chia cột sắc kí theo chiều dọc của cột
thành nhiều lớp, mỗi lớp được gọi là đĩa. Trong mỗi đĩa, cân bằng vật chất được thiết
lập rất nhanh giữa pha động và pha tĩnh. Mỗi phần pha động mới được chia vào đĩa sẽ

làm dịch chuyển cân bằng và do đó có một phần vật chất được chuyển sang đĩa sau.Ở
đĩa này cân bằng mới được thiết lập và vật chất lại được chuyển cho pha sau nữa. Do
kết quả của các quá trình vừa mô tả, chất cần tách sẽ được chứa trong một số đĩa, trong
số đĩa này, các đĩa phần giữa có nồng độ cực đại so với các đĩa lân cận. Sự phân bố
nồng độ chất nghiên cứu dọc theo cột tuân theo phương trình:

C = Cmax e
Trong đó,

− ( x − xo ) 2 / 21H

(13)

x- khoảng cách từ đầu cộ đến điểm, tại đó nồng độ chất nghiên cứu bằng
C
xo- tọa độ của tâm dãy sắc kí
H - chiều cao tương đương của đĩa lí thuyết
l - chiều dài của lớp chất hấp phụ, tưởng tượng được chia thành n đĩa lí
thuyết.

theo đó: n =

l
H

(14)

Nếu tử của phân số trên số mủ của các phương trình (3) và (13) có cùng đơn vị đo
thì khi so sánh các phương trình này ta có: H=
n= (

l

µC

)2 .

µ C2
e

và số đĩa lí thuyết sẽ bằng:

(15)

Nếu chú ý đến phương trình (4) thì:
n = 5,55 (

l

µ 0,5

l
) 2 = 16 ( ) 2

ω

(16)

ω = µ K = B'F ' (trên hình 23.2)
Hiệu quả cột càng cao nếu chiều cao tương ứng của đĩa lí thuyết càng bé.

Lí thuyết đĩa cho phép tính toán các đặc trưng của quá trình sắc kí.
Tuy nhiên lí thuyết đĩa chỉ mang tính hình thức vì nó có tính gián đoạn, trong khi
quá trình sắc kí lại có tính liên tục. Lí thuyết đĩa cũng không chú ý đến các yếu tố khác

Trang 11/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

trong và ngoài cột ảnh hưởng đến sự giãn rộng của vùng sắc kí như kích thước hạt hấp
phụ, vận tốc pha động, sự khuếch tán…
7.2. Lí thuyết động học
Sự ra đời của lí thuyết động học đã bổ sung các thiếu sót của phương pháp lí thuyết
đĩa. Các đặc trưng của lí thuyết đĩa vẫn giữ nguyên ý nghĩa trong phương pháp lí
thuyết động học. Lí thuyết động học dựa vào mối liên quan của chiều cao tương đương
của đĩa lí thuyết với các yếu tố động học như quá trình khuếch tán, sự chậm thiết lập
cân bằng và tính không đồng đều của quá trình.
Chiều cao tương đương của lí thuyết đĩa phụ thuộc vận tốc dòng của pha động U
được mô tả bằng phương trình Van – Deemter:
H=A+
Trong đó:

B
+ CU
U

(17)

H

A,B,C – các hằng số
U – vận tốc của pha động.
CU

Hằng số A liên quan với tác dụng của
khuếch tán xoáy lại phụ thuộc kích thước hạt

B/U

hấp phụ và mật độ nhồi cột.
B liên quan với hệ số khuếch tán của phân
tử trong pha động và có chịu ảnh hưởng của
tác dụng khuếch tán dọc cột.

A
U

Hình 23.4. Sự phụ thuộc giữa chiều cao
đĩa lí thuyết tương đương với tốc độ.

C đặc trưng cho quá trình hấp phụ và giải hấp, quá trình chuyển khối và một số yếu
tố khác.
Ảnh hưởng của mỗi yếu tố thành phần của phương trình đến H phụ thuộc tốc độ
pha động: thành phần A có ảnh hưởng không thay đổi đối với H; thành phần B có ảnh
hưởng thực sự đến H khi tốc độ dòng bé. Khi tăng vận tốc pha động, ảnh hưởng của
thành phần C tăng, còn thành phần B giảm. Đường cong tổng hợp biểu diễn sự phụ
thuộc của H với vận tốc dòng của pha động có dạng một hyperbol. Với tốc độ dòng
không lớn, chiều cao H của đĩa lí thuyết trước hết giảm, sau đó lại tăng. Để tìm vận tốc
dòng tối ưu, ta lấy vi phân phương trình (17) theo U:
dH − B

=
+C
dU U 2

Cực tiểu xảy ra khi:

Trang 12/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

dH
=0
dU

Tức là khi vận tốc dòng tối ưu Utư:
Utư =

B
C

Thay giá trị Utư vào (3), ta tìm được chiều cao tối ưu của đĩa lí thuyết:
Htư = A + 2 BC

(18)

Vậy lí thuyết động học tạo cơ sở để tối ưu hóa quá trình sắc kí. Khi kết hợp (17) và
(18) ta thấy:
-

Đại lượng A trong phương trình không phụ thuộc vận tốc dòng.

-

Khi vận tốc dòng lớn, thành phần CU sẽ trở nên rất lớn, độ hiệu quả của cột sẽ
kém do các chất không kịp trao đổi và cân bằng trao đổi chưa kịp thiết lập.

-

Nếu vận tốc dòng quá bé thì số hạng B/U sẽ trở nên lớn, nghĩa là vùng sắc kí bị
giãn rộng.

-

Vận tốc dòng tối ưu trong sắc kí lỏng thường bé hơn trong sắc kí khí 104 lần
nên trong sắc kí lỏng thời gian phân tích kéo dài hơn sắc kí khí. Hiện nay nhờ kĩ
thuật sắc kí lỏng cao áp, ta có thể tăng vận tốc dòng mà hiệu quả tách vẫn tốt vì
có thể tăng chiều dài của cột.Ngoài các yếu tố vừa nêu còn có các yếu tố khác là
yếu tố ngoài cột làm giãn rộng vùng sắc kí.

-

Độ tập trung của mẫu khi đưa vào cột (hoặc trên giấy, trên lớp mỏng) ở lớp đầu
cột, nếu mẫu đưa vào càng loang rộng thì càng bị giãn rộng.

-

Sự phụ thuộc của hệ số phân bốvào nồng độ chất. Điều này thường xảy ra với
sắc kí lỏng, làm cho pic sắc kí không còn đối xứng khi tăng nồng độ. Do đó
không nên tách sắc kí với các dung dịch có nồng độ quá lớn.

8. Các thiết bị dùng trong phương pháp sắc kí
Các thiết bị dùng cho sắc kí giấy, sắc kí lớp mỏng thường khá đơn giản, có thể tự
lắp ráp ở các phòng thí nghiệm hóa học bất kì. Với các loại sắc kí khác, các theit61 bị
có thể khá phức tạp nhưng thông thường có một số bộ phận chính sau đây: bộ nạp
mẫu, cột sắc kí và detectơ. Ngoài ra trong thiết bị còn có cấu trúc để nạp khí mang
hay dung môi, bộ chuyển đổi các xung của detectơ thành các chỉ số đo cần thiết.
- Bộ nạp mẫu cho phép lấy chính xác lượng mẫu đưa vào cột sắc kí. Một trong các
yêu cầu chính của bộ phận nạp mẫu là phải đảm bảo lặp lại về kích thước mẫu và giữ
Trang 13/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

được điều kiện nạp mẫu vào cột không thay đổi.Bề mặt bên trong bộ nạp mẫu phải
không có các tác dụng hấp phụ, cũng như các hoạt động xác tác làm thay đổi thành
phần mẫu phân tích.Với các chất khí, chất lỏng, người ta thường dùng loại bơm đặc
biệt, có thể lấy các thể tích mẫu từ một phần đến hàng chục microlit.Không hiếm
trường hợp, người ta sử dụng bơm tiêm y tế để lấy mẫu và đưa mẫu vào hệ thống sắc
kí.
- Các quá trình tách sắc kí thường được thực hiện trên cột sắc kí. Các cột sắc kí rất
đa dạng về hình dáng, kích thước và vật liệu chế tạo. Người ta thường dùng loại cột
thẳng, cột dạng xoắn…Chiều dài cột có thể từ một, vài mét đến hàng chục mét. Đường
kính trong của cột có thể từ vài milimet đến hàng chục milimet. Tùy thuộc tính chất hệ
thống phân tích, vật liệu chế tạo cột có thể là thép, đồng thau, thủy tính từ… Vật liệu
chế tạo cột phải bền hóa học, trơ đối với thành phần của mẫu phân tích…
Các chất hấp phụ nhồi vào cột phải có những yêu cầu sau: có tính chọn lọc cần
thiết đối với thành phần mẫu nghiên cứu, có độ bền cơ học, bền hóa học và trơ hóa học
với các cấu tử trong mẫu phân tích. Trong thực tế người ta thường dùng nhôm oxit,
silicagel, than hoạt tính, các polime xốp trên cơ sở polistyrol, đivinylbenzen và zeolit

tổng hợp… Việc chọn chất hấp phụ tùy thuộc trạng thái tập hợp của các pha, các
phương pháp sắc kí và các yếu tố khác.
Đối với sắc kí khí thì nhiệt độ rất có ảnh hưởng đến quá trình tách, vì vậy cột sắc kí
khí thường phải được ổn nhiệt.Thông thường trong sắc kí khí nhiệt độ thường được
giữ ở nhiệt độ phòng, nhưng cũng có trường hợp phải ổn nhiệt ở 0oC hoặc ở nhiệt độ
cao hơn nhiệt độ phòng.
Trong sắc kí giấy, sắc kí lớp mỏng và vài dạng sắc kí khác, giấy và lớp mỏng, các
chất hấp phụ được trải thành lớp mỏng để làm chức năng của cột sắc kí.
- Người ta dùng detectơ để phát hiện sự thay đổi thành phần của các chất thoát ra
khỏi cột (hoặc là chất khí hoặc là dung dịch). Chỉ số của detectơ thường được chuyển
thành tín hiệu điện và được ghi lại bằng các máy chỉ thị thích hợp. Các đặc trưng quan
trọng của detectơ là độ nhạy, giới hạn dò tìm, quán tính và phạm vi phụ thuộc tuyến tín
giữa cường độ tín hiệu với nồng độ. Detectơ có thể làm việc theo kiểu vi phân phản
ánh sự thay đổi tức thời của nồng độ hoặc theo kiểu tích phân chỉ sự thay đổi tổng
cộng của nồng độ sau một khoảng thời gian nào đó.

Trang 14/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

+ Trong các detectơ tích phân để phân tích khí, chất khí thoát ra khỏi cột sẽ
được hấp thu nhờ một dung dịch thích hợp, sau đó hoặc phân tích dung dịch hấp thụ
hoặc đo thể tích khí còn lại không bị hấp thụ.
+ Các detectơ kiểu vi phân bao gồm loại detectơ làm việc theo kiểu dẫn nhiệt,
theo mật độ, theo độ dẫn điện, theo độ dẫn nhiệt của ngọn lửa, ngọn lửa ion hóa và các
loại detectơ ion hóa khác…
Việc chọn detectơ phụ thuộc tính chất của hệ nghiên cứu, trạng thái tập hợp của các
pha và các đặc điểm khác của hệ.
9. Các ứng dụng chung của phương pháp sắc kí

Ngày nay phương pháp sắc kí được ứng dụng để tiến hành tách phân li, phân tích
nhiều hợp chất khác nhau, vô cơ cũng như hữu cơ. Trong việc phân tích các hợp
chấthữu cơ, phương pháp sắc kí đóng vai trò chủ đạo.
Dùng phương pháp sắc kí người ta có thể tiến hành tách và phân tích nhiều hỗn
hợp phức tạp.Người ta cũng có thể dùng phương pháp sắc kí để phân tích các chất rắn
khi đưa chúng về trạng thái lỏng (hòa tan vào dung môi thích hợp), hoặc trạng thái khí
(gia nhiệt).
Việc phân tích định tính hoặc định lượng các chất theo phương pháp dựa vào các
đặc trưng lưu của quá trình sắc kí. Tính phổ biến của các phương pháp sắc kí ngày
càng gia tăng khi kết hợp sắc kí với phương pháp khối phổ hoặc một phương pháp xác
định thích hợp khác.
Sắc kí phân bố lỏng – lỏng được sử dụng đặc biệt hiệu quả để phân tích các hợp
chất có tính chất hóa học gần giống nhau như các amino axit.
Trong phân tích hữu cơ và hóa sinh đặc biệt có ý nghĩa là phương pháp sắc kí giấy,
là một phương pháp sắc kí rất đơn giản và có độ nhạy cao.
Phương pháp sắc kí lớp mỏng có độ lặp lại cao, ứng dụng để xác định các chất
trong các đối tượng tự nhiên, trong dược phẩm, các mẫu hóa sinh và nhiều đối tượng
khác.
Phương pháp sắc kí trao đổi ion là phương pháp thích hợp cho việc tách và phân
tích các hỗn hợp các ion phức tạp. Đây cũng là phương pháp làm giàu các chất vi
lượng và có thể áp dụng vào quy mô tách, làm giàu công nghiệp.
Để ứng dụng phương pháp sắc kí vào việc phân tích vật chất điều quan trọng là cần
chọn một sơ đồ thích hợp cho quy trình tiến hành các quá trình sắc kí.
Trang 15/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

10. Sơ đồ tách và phân tích
Chất nghiên

cứu

Dễ bay
hơi

SK Khí
– hấp
phụ

SK khí
– lỏng

Khó
bay
hơi

Gia
nhiệt
mạnh

Sắc kí
khí

Phân
cực

Sắc kí
lỏng

SK

Thuận
pha

Phân
cực yếu

Không
phân cực

Phân
cực
mạnh

SK
Ngược
pha

Bị
ion
hóa

SK trao đổi
ion

II.

SK
Thuận
pha

SK
Ngược
pha

Không
bị ion
hóa

SK ngược
pha

SẮC KÍ CỘT (COLUMN CHROMATOGRAPHY)
Sắc kí cột (sắc kí cột hở) được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển.Pha tĩnh

thường là những hạt có kích thước tương đối lớn (50-150 µm), được nạp trong một cột
bằng thủy tinh. Mẫu chất cần phân tách được đặt ở phần trên đầu cột, phía trên pha
tĩnh (có một lớp bông thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung
môi giải ly được đặt phía trên cao. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột,
được hứng vào những lọ đặt ngay ống dẫn ra của cột.
Hệ thống như thế thường làm cho sự tách chậm, hiệu quả thấp so với sắc kí
lỏng hiệu năng cao (HPLC). Tuy vậy, sắc kí cột có những ưu điểm như pha tĩnh và các
dụng cụ thí nghiệm rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với một lượng mẫu lớn.

Trang 16/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

1. Lựa chọn chất hấp thu và dung môi để khởi đầu giải ly
Trong loại sắc kí cột với pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chất không phân

cực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực giải ly sau.
Với hai phân tử không phân cực, phân tử có trọng lượng phân tử lớn sẽ có tính
phân cực mạnh hơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển ra khỏi
cột chậm hơn so với phân tử nhỏ, và cũng có khi nó còn ở lại lâu trong cột hơn so với
vài phân tử tuy có tính phân cực nhưng có trọng lượng phân tử nhỏ.
Các loại hợp chất có tính phân cực tăng dần được trình bày trong bảng 1.
Bảng II.1: Các loại hợp chất có tính phân cực tăng dần.
Loại hợp chất
Hydrocarbon

Thứ tự giải ly ra khỏi cột
Nhanh, với dung môi không phân cực

Alcen

↓

Eter

↓

Halocarbon R-X

↓

Hợp chất thơm

↓

Ceton

↓

Aldehyd

↓

Ester

↓

Alcol

↓

Amin

↓

Acid carboxylic

↓

Các hợp chất kiềm mạnh

Chậm nhất, cần dung môi phân cực

1.1. Chọn chất hấp thu để nhồi cột
Chọn một cách độc đoán tùy vào tính phân cực của mẫu chất cần phân tích.Với
những hợp chất rất phân cực, nên sử dụng sắc kí trao đổi ion hoặc săc kí lọc gel. Còn

bình thường thì sử dụng sắc kí hấp thu.
Trang 17/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

1.2. Chọn dung môi bắt đầu cho quá trình sắc kí cột
Trước khi triển khai sắc kí cột, nhất thiết phải sử dụng sắc kí lớp mỏng để dò
tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp, với các bước như sau:
Bước 1: Mẫu cần sắc kí được hòa tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp, với
nồng độ 10mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A).
Bước 2: Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2,5 x 10 cm. Chấm lên những tấm bản
này, mỗi tấm một chấm khoảng 2-5 µl dung dịch (A).
Bước 3: Mỗi bản mỏng được triển khai với một loại dung môi dung ly khác
nhau, kế đó hiện hình các vết trên bản bằng đèn UV hoặc các thuốc thử. Với đơn dung
môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào phù hợp. Từ kết quả đó, cố gắng tìm một hỗn
hợp dung môi trong đó một dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực, ví dụ:
hexan : etyl acetate.
Bước 4:
* Với hỗn hợp mẫu chất là kết quả của một phản ứng tổng hợp hữu cơ
(hỗn hợp chứa 2 – 3 hợp chất), hãy chọn hệ dung môi nào mà có thể đẩy hợp chất cần
quan tâm lên ở vị trí trên bản với Rf = 0,2.
* Đối với mẫu cao thô chiết xuất từ cây cỏ, (cao có chứa nhiều hợp chất
từ không phân cực đến rất phân cực), chọn dung môi giải ly đầu tiên là dung môi có
thể đẩy vết ít phân cực nhất của cao chiết, lên vị trí ở bản với Rf = 0,5 và chọn dung
môi chấm dứt sắc kí cột là dung môi có thể đẩy vết phân cực nhất của cao chiết, lên
vị trí ở bản với Rf = 0,2.
Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp, có thể áp dụng hệ dung môi này cho
sắc kí cột.
Lưu ý:

* Phải sử dụng pha tĩnh của sắc kí lớp mỏng và của sắc kí cột giống nhau.
* Dung môi để giải ly cột là hệ dung môi đã chọn trong phần thực nghiệm nêu
trên, nhưng phải chỉnh tỉ lệ dung môi sao cho có tính kém phân cực một ít so với hệ
dung môi đã chọn. Bởi vì chất hấp thu, ví dụ silicagel, tráng trên bản mỏng là loại
silicagel dùng cho sắc kí lớp mỏng, với cỡ hạt nhuyễn mịn, lại được phun xịt tráng lên

Trang 18/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

bản bằng áp lực lớn nên có độ chặt chẽ lớn. Trong khi đó chất hấp thu do ta tự nạp cột
trong phòng thí nghiệm là loại silicagel dung cho sắc kí cột, với cỡ hạt lớn hơn, lại
được nạp vào cột ở áp suất thường nên có tính lỏng lẻo hơn.
2. Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách đối với kích thước cột
Muốn tách chất dược tốt, các kết quả thực nghiệm cho thấy có mối liên quan
giữa lượng mẫu chất cần tách đối với kích thước cột.
2.1. Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách và lượng chất hấp thu sử dụng
Các khảo sát thực nghiện cho thấy muốn tách chất tốt thì trọng lượng chất hấp
thu phải lớn hơn 25 – 50 lần trọng lượng của mẫu cần sắc kí. Tuy nhiên, với những
hỗn hợp các hợp chất khó tách riêng thì cần sử dụng số lượng chất hấp thu nhiều hơn
(lớn hơn 100 – 200 lần), còn với các hỗn hợp dễ tách thì có thể sử dụng lượng chất hấp
thu ít hơn.
Vì thế, trước khi tiến hành sắc kí, phải dự đoán rằng với một lượng mẫu chất
muốn tách (x gam) phải cần bao nhiêu lượng chất hấp thu, sao cho chất hấp thu chiếm
một chiều cao phù hợp trong cột mà cột vẫn còn chỗ để chứa dung môi. Với lượng
chất hấp thu cụ thể, phải đi tìm một cột sắc kí với kích thước phù hợp.
2.2. Tỉ lệ giữa chiều cao chất hấp thu trong cột và đường kính trong của cột sắc
kí
Các khảo sát thực ngiệm cho thấy, muốn tách chất tốt, chiều cao của chất hấp

thu nạp trong cột cần đạt tỉ lệ: chiều cao chất hấp thu: đường kính trong của cột
vào khoảng 10:01.
3. Nạp chất hấp thu vào cột
Chất hấp thu phải được nạp trong cột một cách đồng nhất để hạn chế những gãy
xéo, bất thường.
Trong sắc kí cột, dung môi chảy ra ngoài nhờ trọng lực, nên nếu sử dụng hạt
hấp thu có cỡ hạt quá mịn, cột sẽ quá chặt chẽ, dung môi không thể chảy ra khỏi cột.
Để có thể có một vận tốc chảy chấp nhận được, kích cỡ hạt hấp thu phải lớn hơn 150
µm.
Có 2 kiểu nạp chất hấp thu vào cột: nạp sệt và nạp khô.
3.1. Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột

Trang 19/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

Rót dung dịch sệt vào đầu cột
ngang qua một phễu có đuôi dài

Thanh cao su khỏ nhẹ
lên thành cột

Chất hấp thu đang
lắng xuống đáy cột

Dung môi liên tục
chảy ra khỏi cột

Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá. Nếu phần đầu ra của cột không có

miếng thủy tinh xốp để chặn thì có thể dung một bông thủy tinh để chặn, tiếp theo phủ
các lên để có được một mặt bằng phẳng.
Chất hấp thu được nạp vào cột ở dạng sệt được chuẩn bị như sau:
- Trong một becher đã có chứa sẵn dung môi (loại dung môi ít phân cực nhất
được dung cho quá trình bắt đầu giải ly cột), cho chất hấp thu vào becher, đều đặn,
mỗi lần một lượng nhỏ, vừa rót vừa khuấy nhẹ đều. Không được thực hiện ngược lại
nghĩa là rót dung môi vào chất hấp thu bởi vì chất hấp thu gặp dung môi sẽ phát nhiệt,
có thể làm chất hấp thu vón cục, sẽ không đồng nhất. Lượng dung môi phải vừa đủ để
dung môi không bị quá sệt khiến cho bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng không
được quá lỏng.
- Dùng một phễu lọc có đuôi dài, đặt trên đầu cột, rót hỗn hợp sệt vào cột, vừa
mở nhẹ khóa ở bên dưới cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để
bên dưới cột, dung môi này được sử dụng lại để rót trả lại lên đầu cột.

Trang 20/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

- Tiếp tục rót chất sệt vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng một
thanh cao su khỏ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều trong cột.
- Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột vài ba lần để
việc nạp cột được chặt chẽ, cho đến khi thấy chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất.
Lưu ý trong quá trình nạp cột, không được để cho đầu cột bị khô, nghĩa là luôn luôn
phải có dung môi phủ trên phần đầu cột.
- Sau khi nạp xong, mặt thoáng chất hấp thu phải nằm ngang. Nếu mặt thoáng
không nằm ngang, phải cho dung môi thêm cao lên trên phần đầu cột, dùng đũa thủy
tinh khuấy đão nhẹ phần dung môi gần sát mặt thoáng, làm xáo trộn một phần chất hấp
thu ở trên đầu cột, để yên, chất hấp thu lắng xuống từ từ tạo nên một mặt thoáng bằng
phẳng.

Đối với loại chất hấp thu có thể trương nở, cần có thời gian để chúng trương nở.
Thường người ta thêm đủ lượng dung môi để làm thành hỗn hợp sệt và để yên suốt
một đêm, hôm sau thêm dung môi vào để hỗn hợp sệt có thể rót chảy, để rót vào cột.
3.2. Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột
Dùng kẹp để giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi loại kém phân cực
nhất có thể vào khoảng 2/3 chiều cao cột. Ngang qua một phễu lọc có đuôi dài, cho
chất hấp thu ở dạng bột khô vào thẳng trong vột, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa
cho vào vừa khõ nhẹ vào thành cột. Khi lớp chất hấp thu đạt được chiều cao khoảng 2
cm trong cột, thì mở nhẹ khóa bên dưới cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một
becher trống để bên dưới cột, dung môi này được sử dụng để rót trả lại lên đầu cột.
Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột vài ba lần đến khi
thấy chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất.
Cả 2 cách nhồi cột đều cho kết quả tốt nếu thực hiện việc nạp cột một cách
cẩn thận. Trong trường hợp sau khi nạp xong, quan sát thấy có nhiều bọt khí, có những
“bất thường” trong cột thì phải xả hết cột và nạp lại từ đầu.
4. Đặt mẫu chất cần tách lên đầu cột sắc kí
4.1. Nạp mẫu chất ở dạng dung dịch
Nếu mẫu ở dạng lỏng, có thể cho trực tiếp lên đầu cột sắc kí. Nếu mẫu ở dạng
rắn, hòa tan mẫu chất vào một lượng nhỏ dung môi khởi đầu cho sắc kí cột.

Trang 21/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

Dung dịch mẫu có nồng độ càng đậm đặc càng tốt, vì như thế lớp dung dịch này
nằm thành một lớp mỏng trên đầu cột.
Thực hiện việc nạp mẫu lên cột như sau:
- Mở khóa cho dung môi chảy ra khỏi cột, để hạ mức dung môi trong cột xuống
sao cho vừa sát với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột. Mặt thoáng của chất hấp thu

lúc này phải nằm ngang đều.
- Đóng khóa lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu cột. Muốn nạp mẫu, sử dụng một
pipette để hút dung dịch mẫu chất, đặt đầu của pipette gần sát với mặt thoáng của chất
hấp thu trong cột, vừa bóp vừa rây pipette dọc quanh thành trong của cột, cho dung
dịch chất chảy ra dọc theo thành trong của cột, chạm xuống bề mặt của chất hấp thu.
- Mở khóa bên dưới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu
được thấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột, cần canh chừng không cho chất hấp thu ở
dầu cột bị khô.
- Dùng pipette cho một lượng nhỏ dung môi mới lên đầu cột, tranh thủ dùng
dung môi này để rửa sạch thành ống mà nãy giờ dung dịch mẫu chất đã trây dính trên
thành cột. Lại mở khóa cho dung môi chảy ra. Lặp lại vài lần việc rửa thành cột như
thế để giúp cho dung dịch mẫu chất thấm sâu vào phần chất hấp thu ở phần đầu cột.
Lặp lại như thế cho đến khi cho một ít dung môi lên đầu cột, dung môi sẽ trong suốt
không màu (không bị lây màu của chất mẫu).
- Cho một lớp cát dày 3 – 6 mm dặt nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hấp thu để
bảo vệ mặt cột. Nếu không có cát, có thể sử dụng bông thủy tinh, bông gòn, giấy lọc
có đường kính bằng với đường kính trong của cột. Cẩn thận để không làm xáo trộn bề
mặt đang nằm ngay ngắn.
- Cuối cùng, cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu cho quá trình giải ly.
4.2. Nạp mẫu chất ở dạng bột khô
Nếu mẫu chất không tan trong dung môi loại dung môi lựa chọn để bắt đầu quá
trình sắc kí cột, vì đây là loại dung môi kém phân cực, thay vì phải hòa tan mẫu trong
dung môi phân cực có thể ảnh hưởng vào quá trình giải ly, có thể nạp mẫu “khô”.

Trang 22/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

Trong một bình cầu dùng để cô quay, mẫu cần sắc kí (M gam) được hòa tan

trong dung môi như etyl acetat hoặc methanol (50 x M gam), cho vào silicagel cỡ hạt
lớn (10 x M gam). Hỗn hợp này được cô quay chân không đến khi có bột silicagel khô,
bấy giờ, mẫu cần sắc kí đã được tẩm lên bề mặt của những hạt silicagel.
Đặt mẫu bột khô lên trên đầu cột, dùng một ít dung môi (loại lựa chọn để bắt
đầu quá trình sắc kí cột) thấm ướt phần bột silicagel. Cho một lớp cát dày 3–6 mm đặt
nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hấp thu để bảo vệ mặt cột. Cuối cùng, cho dung môi
vào đầy cột để bắt đầu cho quá trình giải ly.
5. Các kĩ thuật giải ly chất ra khỏi cột
Có thể tiến hành giải ly cột nhờ vào trọng lực, hoặc nhờ vào việc cho một dòng
khí nén nitơ lên trên đầu cột, hoặc nhờ vào lục hút đặt tại đầu ra của cột, hoặc dùng
máy bơm để bơm dung môi giải ly đi vào đầu cột với những lực mạnh có thể điều
chỉnh.
5.1. Nhờ vào trọng lực (trong kĩ thuật sắc kí cổ điển)
Các hạt gel nạp cột phải có kích thước >60 µm.
Nếu sử dụng những hạt gel có kích thước nhỏ hơn, dung môi ra khỏi cột rất
chậm, và cần phải nhờ đến một lực để có thể ra khỏi cột.
5.2. Sử dụng lực đẩy (trong sắc kí chớp nhoáng)
Nhờ sử dụng một áp lực để đẩy dung môi đi ngang qua pha tĩnh nên trong sắc
kí chớp nhoáng, có thể sử dụng những hạt gel có kích thước 40 – 63 µm, nhỏ hơn loại
sử dụng trong sắc kí cột cổ điển. Loại cột dùng cho sắc kí chớp nhoáng phải có thành
dầy, với lớp che chắn bên ngoài để tránh khi sử dụng áp suất cao, cột có thể bị nổ vỡ.
Quan sát cột trước khi sử dụng xem có những vết rạn nứt trên thành cột hay không.
Chỉnh dòng chảy tốt nhất ở vận tốc 5 cm/phút.

Trang 23/43


Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

Kiểm soát vận tốc

dòng chảy

Không khí nén
hoặc Nitrogen

Dung
môi
giải
ly

Mẫu chất
Chất hấp thu
Máy bơm

Dung môi
giải ly
Mẫu chất
Chất hấp thu
5.3. Sử dụng lực hút (trong sắc kí nhanh – cột khô)
Có thể sử dụng một máy bơm hút tạo cân
không ở đầu ra của cột. Kĩ thuật này cũng có thể
làm tương tự như trên, nhưng việc thu lấy dung
môi giải ly có phần kém thuận tiện vì phải ngưng
tạo chân không, tháo thiết bị để rót dung môi ra.
Tuy vậy, kĩ thuật này an toàn hơn.
Máy bơm hút

Trang 24/43

Phương pháp Phân Tích Công Cụ - Lí thuyết chung về sắc kí-Sắc kí cột-Sắc kí lớp mỏng

6. Dung môi giải ly và kĩ thuật tăng dần tính phân cực cho dung môi giải ly
Những dung môi loại tiêu chuẩn thương phẩm thường có lẫn một ít tạp chất,
nhất là các dung môi loại hydrocarbon thường chứa nhiều tạp chất hơn những dung
môi khác. Chỉ cần dung môi có lẫn một ít tạp chất, độ phân cực của dung môi đã thay
đổi đáng kể. Vì thế cần chưng cất dung môi trước khi sử dụng.
Trong sắc kí cột, có khi chỉ cần sử dung đơn dung môi, đôi khi sử dụng hỗn hợp
dung môi. Có 2 kiểu giải ly: giải ly sử dụng dung môi đơn nồng độ và giải ly với dung
môi có tính phân cực tăng dần (tăng dần theo kiểu bậc thang hoặc kiểu tăng dần tuyến
tính).
6.1. Giải ly sử dụng dung môi đơn nồng độ (isocratic)
Chỉ sử dụng đơn dung môi hoặc hỗn hợp dung môi nhưng trong hỗn hợp tỉ lệ
giữa các thành phần không thay đổi, để giải ly cho đến khi việc tách chất hoàn tất.
6.2. Giải ly có nồng độ tăng theo kiểu bậc thang (stepwise)
Đôi khi, việc sử dụng một loại dung môi sẽ chỉ giải ly ra khỏi cột một số cấu tử
nhất định nào đó. Nếu muốn đuổi những cấu tử còn nằm ở đầu cột ra khỏi cột, phải
dùng một dung môi có lực mạnh hơn. Trong quá trình sắc kí, cần thay nhiều loại dung
môi khác nhau, có lực mạnh tăng dần.
Muốn tăng tính phân cực cho bất kì dung môi nào, nhất thiết phải tăng chậm:
thêm từ từ mỗi lần vài phần trăm một dung môi mới có tính phân cực hơn dung môi cũ
đang sử dụng. Ví dụ: đang giải ly với hexan, muốn chuyển sang etyl acetat, sẽ pha etyl
acetat vào hexan theo tỉ lệ 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 50% và 100% etyl acetat.
Nếu tăng tính phân cực nhanh, đột ngột sẽ làm gãy cột. Do alumin silicagel khi
được trộn với bất kì một dung môi nào cũng tạo ra nhiệt, nhiệt này làm cho dung môi
bốc hơi một cách cục bộ, hơi sinh ra tạo nên bọt khí làm nứt gãy cột. Cột gãy làm mất
đi sự liên tục của chất hấp thu và vì thế không tách chất tốt được.

Trang 25/43