Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dược liệu hy thiêm (Herba Siegesbeckia)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƢỢC

LÝ THỊ HẢI YẾN

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU TIÊU
CHUẨN HÓA DƢỢC LIỆU HY THIÊM
(Herba Siegesbeckiae)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Hà Nội – 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƢỢC

LÝ THỊ HẢI YẾN

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU TIÊU
CHUẨN HÓA DƢỢC LIỆU HY THIÊM
(Herba Siegesbeckiae)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC
Khóa: QH.2012.Y
Ngƣời hƣớng dẫn:
1.
2.

ThS Nguyễn Thị Phƣơng
TS Nguyễn Thị Thanh Bình

Nơi thực hiện:

Khoa Hóa phân tích tiêu chuẩn – Viện dƣợc liệu

Hà Nội – 2017

Hà Nội – 2017


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới ThS. Nguyễn
Thị Phƣơng và TS. Nguyễn Thị Thanh Bình ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn tận tình, chu
đáo, luôn động viên khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt thời
gian thực hiện khóa luận.
Em xin trân trọng cảm ơn ban lãnh đạo Viện Dƣợc liệu cùng tập thể cán bộ
phòng Hoá phân tích - tiêu chuẩn đã tạo điều kiện cho em đƣợc thực tập tham gia
nghiên cứu học hỏi tại Viện.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều
kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên em trong suốt quá trình học tập.
Trong suốt quá trình làm khóa luận và nghiên cứu tại Viện, em đã cố gắng nỗ
lực hết sức mình để hoàn thành bản khóa luận này. Tuy nhiên, do kiến thức còn hạn
hẹp và thời gian có hạn nên đề tài của em không tránh khỏi thiếu sót. Rất mong nhận
đƣợc sự góp ý của các thầy cô để khóa luận của em đƣợc hoàn thiện hơn.
Cuối cùng em xin kính chúc các thầy cô luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và thành
công trong công việc cũng nhƣ trong cuộc sống.

Hà Nội, tháng 06 năm 2017
Sinh Viên
Lý Thị Hải Yến


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................ 2
1.1 Vị trí phân loại của cây hy thiêm .............................................................................. 2
1.2 Đặc điểm thực vật của cây hy thiêm ......................................................................... 2
1.2.1 Phân bố, sinh thái ................................................................................................... 3
1.2.2 Thu hái và chế biến ................................................................................................ 3
1.3 Thành phần hóa học .................................................................................................. 4
1.3.1 Các diterpen ........................................................................................................... 4
1.3.2 Các dẫn chất sesquyterpen ..................................................................................... 4
1.3.3 Các dẫn chất của geranylnerol ............................................................................... 6
1.3.4 Các flavonoid ......................................................................................................... 6
1.3.5 Các steroid .............................................................................................................. 7
1.3.6 Một số hợp chất khác ............................................................................................. 7
1.4 Tác dụng dƣợc lý. ...................................................................................................... 7
1.4.1.1 Tác dụng chống viêm .......................................................................................... 7
1.4.1.2 Tác dụng chống oxi hóa ...................................................................................... 7
1.4.1.3 Tác dụng ức chế miễn dịch ................................................................................. 8
1.4.1.4 Tác dụng chống dị ứng ........................................................................................ 8
1.4.1.5 Độc với tế bào u sắc tố ........................................................................................ 8
1.4.1.6 Tác dụng trên chuyển hóa lipid ........................................................................... 8
1.4.1.7 Tác dụng kháng khuẩn ........................................................................................ 8
1.4.1.8 Tác dụng điều trị gout ......................................................................................... 9
1.4.1.9 Tác dụng khác ..................................................................................................... 9
1.5 Tính vị, công năng, công dụng .................................................................................. 9


1.5.1 Tính vị, công năng .................................................................................................. 9
1.5.2 Công dụng .............................................................................................................. 9
1.6 Tổng quan về darutosid ........................................................................................... 10
1.6.1 Công thức cấu tạo và tính chất lý hoá .................................................................. 10

1.6.2 Tác dụng của darutosid ........................................................................................ 11
1.6.3 Một số nghiên cứu định tính, định lƣợng darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm.......... 11
1.7 Tổng quan về phƣơng pháp sắc ký lỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao .................. 12
1.7.1 Vài nét về phƣơng pháp TLC áp dụng trong nghiên cứu định tính ..................... 12
1.7.2 Vài nét về phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ............................... 13
1.7.2.1 Nguyên tắc của phƣơng pháp HPLC ................................................................. 13
1.7.2.2 Điều kiện sắc ký phân bố hiệu năng cao ........................................................... 14
1.7.2.3 Các phƣơng pháp định lƣợng bằng HPLC ........................................................ 15
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 17
2.1 Nguyên vật liệu, phƣơng tiện nghiên cứu ............................................................... 17
2.2 Phƣơng tiện nghiên cứu .......................................................................................... 17
2.2.1 Thiết bị ................................................................................................................. 17
2.2.2 Dụng cụ ................................................................................................................ 18
2.2.3 Hóa chất................................................................................................................ 18
2.3 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 18
2. 3.1 Phân lập chất darutosid từ dƣợc liệu Hy thiêm ................................................... 18
2. 3.2 Định tính darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm bằng TLC ......................................... 19
2. 3.3 Xây dựng quy trình định lƣợng darutosid trong dƣợc liệu hy thiêm bằng HPLC ............. 19
2. 3.4 Thẩm định phƣơng pháp phân tích darutosid bằng HPLC.................................. 19
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................................... 19
2.4.1 Phƣơng pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thử..................................................... 19


2.4.2 Phân lập darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm............................................................. 19
2.4.2.1 Phƣơng pháp phân lập darutosid trong dƣợc liệu hy thiêm .............................. 19
2.4.3 Phƣơng pháp xác định cấu trúc darutosid ............................................................ 21
2.4.4 Phƣơng pháp định tính dƣợc liệu hy thiêm bằng TLC ......................................... 21
2.4.5 Xây dựng quy trình định lƣợng darutosid trong dƣợc liệu hy thiêm bằng phƣơng
pháp HPLC ..................................................................................................................... 21
2.4.6 Thẩm định phƣơng pháp phân tích darutosid bằng HPLC................................... 22

2.4.6.1 Tính chọn lọc của phƣơng pháp ........................................................................ 22
2.4.6.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) ................................ 22
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ, BÀN LUẬN ......................................................................... 25
3.1 Chiết xuất và phân lập ............................................................................................. 25
3.1.1 Chiết xuất cao phân đoạn từ Hy thiêm ................................................................. 25
3.1.2 Phân lập ................................................................................................................ 26
3.1.3 Xác định cấu trúc hoá học của HT1 ..................................................................... 27
3.1.4 Xác định độ tinh khiết của darutosid ................................................................... 30
3.2 Xây dựng phƣơng pháp định tính chất darutosid bằng phƣơng pháp sắc kí lớp
mỏng (TLC).................................................................................................................... 30
3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng chất darutosid bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) .................................................................................................... 32
3.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký ..................................................................................... 32
3.3.1.1 Lựa chọn pha tĩnh .............................................................................................. 32
3.3.1.2 Chọn bƣớc sóng phân tích ................................................................................. 32
3.3.1.3 Khảo sát dung môi pha động ............................................................................ 32
3.3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu. .............................................................................. 34
3.4 Thẩm định phƣơng pháp ......................................................................................... 37
3.4.1 Tính thích hợp của hệ thống ................................................................................. 37


3.4.2 Tính chọn lọc ........................................................................................................ 39
3.4.3 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ). ................... 39
3.4.4 Xây dựng đƣờng chuẩn và xác định khoảng tuyến tính. ...................................... 40
3.4.5 Thẩm định độ lặp lại............................................................................................. 41
3.4.7 Thẩm định độ thu hồi. .......................................................................................... 43
3.5 Bàn luận................................................................................................................... 44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................
PHỤ LỤC...........................................................................................................................

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
But

Butanol

DĐVN

Dƣợc điển Việt Nam

DMC

Dichloromethane

EtOAC

Ethyl acetat

EtOH

Ethanol

MeOH

Methanol

Hex

Hexan

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquyd Chromatography)

IR

Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantitation)

M

Khối lƣợng phân tử ( MaSKĐ)

MS

Phổ khối (MaSKĐ Spectroscopy)

NMR

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

RSD

Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative standard devition)

Rf

Hệ số lƣu

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

TLC

Sắc lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

UV

Phổ tử ngoại (Ultra violet)


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất HT1 và darutosid
theo tài liệu tham khảo.
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát chƣơng trình gradient

33

Bảng 3.3: Các thông số khảo sát chƣơng trình gradient

34

Bảng 3.4: Khảo sát phƣơng pháp chiết mẫu

35

Bảng 3.5: Khảo sát thời gian chiết mẫu

36

Bảng 3.6: Khảo sát số lần chiết mẫu

37

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống

38

Bảng 3.8: Kết quả xác định LOD và LOQ

40

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính

40

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp

42

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp

43

Bảng 3.12: Hàm lƣợng darutosid trong 3 mẫu dƣợc liệu hy thiêm

44


DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ
Trang
Hình 1.1: Cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., Asteraceae)

2

Hình 1.2: Một số ent- pimaran và ent- kauran phân lập từ S. orientalis

4

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của một số dẫn chất sesquyterpen lacton

5

nhóm germancranlid phân lập từ S. orientalis
Hình 1.4: Công thức cấu tạo của một số dẫn chất sesquyterpen lacton
nhóm melampolid

6

Hình 1.5: Công thức cấu tạo của một số dẫn chất geranylnerol

6

Hình 1.6: Công thức cấu tạo 2 flavonoid phân lập từ S. orientalis

7

Hình 1.7: Công thức cấu tạo của darutosid

10

Hình 2.1: Dƣợc liệu hy thiêm

17

Hình 3.1: Sắc ký đồ darutosid phân lập đƣợc

30

Hình 3.2: Sắc ký đồ của 4 hệ dung môi

31

Hình 3.3 : Sắc ký đồ chƣơng trình gradient

34

Hình 3.3: Khảo sát tính phù hợp của hệ thống

38

Hình 3.4: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thêm chuẩn

39

Hình 3.5: Đƣờng chuẩn và phƣơng trình hồi quy tuyến tính của
darutosid

41

Sơ đồ 3.1: Tóm tắt quy trình chiết cao hy thiêm

25

Sơ đồ 3.2: Tóm tắt quy trình phân lập darutosid trong cao ethyl acetat từ

27

dƣợc liệu hy thiêm


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hy thiêm có tên khoa học là Siegesbeckia orientalis L., thuộc họ cúc
(Asteraceae). Cây còn có tên gọi khác là cỏ đĩ, chó đẻ hoa vàng. Loài cây của châu Á
và châu Đại Dƣơng. Ở nƣớc ta, hy thiêm mọc hoang nhiều ở nhiều tỉnh phía Bắc từ
Cao Bằng tới Nghệ An và các tỉnh Tây Nguyên. Ngƣời ta thƣờng sử dụng phần trên
mặt đất cây hy thiêm phơi khô hoặc sấy khô để làm dƣơc liệu. Theo y học cổ truyền,
hy thiêm có vị cay, đắng; tính mát; có tác dụng bổ huyết, hoạt huyết, trừ thấp, giảm
đau, lợi gân xƣơng… [5]. Cây đƣợc dùng để dùng trị phong thấp, tê bại nửa ngƣời, đau
nhức xƣơng khớp, kinh nguyệt không đều, mụn nhọt lở ngứa, rắn căn, ong đốt [5].

Trong y học Trung Quốc, hy thiêm đƣợc dùng phối hợp với các cây thuốc khác để điều
trị ung thƣ và chảy máu não kèm theo chứng liệt. Ở Ấn Độ, hy thiêm đƣợc coi là có tác
dụng chữa các vết hoại thƣ và đau nhức [8].
Các nghiên cứu về thành phần hóa học của hy thiêm (Siegesbeckia orientalis)
cho thấy loài này có các nhóm chất nhƣ: diterpen (darugetinol, darutosid, ent-12α,16epoxy-2β,15α,19 trihydroxypimar-8-ene…), các dẫn chất nhóm sesquyterpen lacton
nhóm germacranolid nhƣ (orientin, orientalid…), nhóm melampolid; các flavonoid
(nhƣ 3,7-dimethylquercetin, rutin); các steroid (β -sitosterol, stigmasterol…); dẫn chất
của geranyl nerol; thymohydroquynon dimethyl ether; acid cafeic… [5]
Hiện nay, ở nƣớc ta hy thiêm đã và đang đƣợc sử dụng rất nhiều để làm thuốc
trong y học cổ truyền. Vị thuốc hy thiêm đã đƣợc đƣa vào DĐVN IV, tuy nhiên chƣa
có chỉ tiêu định tính, định lƣợng hợp chất trong cây và phần định tính chƣa có chất đối
chiếu. Do vậy, để nâng cao giá trị sử dụng và nâng cấp tiêu chuẩn dƣợc liệu hy thiêm,
đề tài “Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu hy thiêm (Herba Siegesbeckia)” đã
đƣợc thực hiện với các mục tiêu:
-

Phân lập darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm.

- Định tính, định lƣợng darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm bằng phƣơng pháp sắc ký
lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao.

1


CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1 Vị trí phân loại của cây hy thiêm
Siegesbeckia orientalis L. có vị trí phân loại nhƣ sau trong giới thực vật [9]:
Nghành Ngọc lan (Manoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliosida)
Phân Lớp Cúc (Asteridae)

Bộ Cúc (Asteraceae)
Họ Cúc (Asteraceae)
Chi Siegesbeckia
1.2 Đặc điểm thực vật của cây hy thiêm
Cây hy thiêm có tên khoa học là Siegesbeckia orientalis L., thuộc họ Cúc
(Asteraceae) (Hình 1.1) [1-3].
Tên khác: Cỏ đĩ, chó đẻ hoa vàng [1-3].

Hình 1.1: Cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., Asteraceae)

2


Cây thảo, sống hằng năm, cao 30 – 90 cm, phân nhiều cành nằm ngang, có
lông. Lá mọc đối, hình tam giác hay hình quả trám, dài 4 – 10 cm, rộng 3 – 6 cm,
cuống ngắn, phiến lá men theo cuống, đầu nhọn, mép có răng cƣa không đều và đôi khi
chia 2 thùy ở phía cuống, 3 gân chính mảnh, mặt dƣới có lông [8].
Cụm hoa có cuống dài 1 – 2 cm, mảnh, có lông, là một đầu có đƣờng kính 6 – 7
cm; 5 lá bắc ngoài to, hình thìa, có lông dính, lá bắc trong hình trái xoan ngƣợc, đầu
cụt, hoa màu vàng; 5 cái ngoài là hoa cái hình lƣỡi, những hoa khác lƣỡng tính, hình
ống, không có mào lông; tràng có lƣỡi ngắn, chia 3 thùy, ống có lông, nhị 5, có tàu
nhọn rất ngắn [8].
Quả bế, hình trứng, có 4 – 5 cạnh, tròn ở đỉnh, gốc thuôn dần, nhẵn, màu đen
[5].
Mùa ra hoa: tháng 4 – 5 đến tháng 8 – 9, mùa quả: tháng 6 – 10 [5].
1.2.1 Phân bố, sinh thái
Chi Siegesbeckia L. hiện có 2 loài ở Việt Nam là hy thiêm và hy thiêm núi [8].
Hy thiêm phân bố ở vùng có khí hậu cận nhiệt đới và nhiệt đới: Trung Quốc,
Nhật Bản, Thái Lan, Lào, Indonesia, Philippines, Australia. Ở Việt Nam, cây phân bố
chủ yếu ở vùng núi và trung du phía Bắc nhƣ Hà Giang, Lai Châu, Sơn La, Lào Cai,

Yên Bái, Tuyên Quang, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Cao Bằng, Lạng Sơn, Hòa Bình,
Thanh Hóa, Nghệ An [8].
Cây ƣa sáng và ƣa ẩm, thƣờng mọc tập trung trên đất ẩm ở các bãi sông, ruộng
hoang, ruộng trồng ngô và ven đƣờng đi. Hằng năm cây con mọc từ hạt vào tháng 4 –
5. Cây sinh trƣởng nhanh và ra hoa ngay cuối mùa hè hoặc đầu mùa thu, sau lụi tàn vào
đầu mùa đông. Vỏ quả có lông dính, dễ dàng phát tán nhờ con ngƣời và động vật [8].
1.2.2 Thu hái và chế biến
Phần trên mặt đất của cây đƣợc thu hái vào tháng 4 – 6 lúc cây sắp ra hoa hoặc
mới có ít hoa. Cắt cây có nhiều lá, loại bỏ lá sâu, lấy phần ngọn dài khoảng 30 – 50 cm
đem phơi hay sấy khô [3,5]. Dƣợc liệu còn nguyên lá khô không mọt, không vụn nát là
tốt [8].

3


1.3 Thành phần hóa học
1.3.1 Các diterpen
Các nghiên cứu về thành phần hoá học của cây hy thiêm cho biết thành phần
hóa học chính của Siegesbeckia orientalis L. là các diterpen có cấu trúc ent-pimaran và
ent-kauran [5].

Hình 1.2: Công thức cấu tạo một số ent- pimaran và ent- kauran phân lập từ S.
orientalis
1.3.2 Các dẫn chất sesquyterpen
Hy thiêm còn có các dẫn chất sesquiterpen lacton nhóm germancranlid và nhóm
melampolid [5].

4

Dẫn chất sesquyterpen lacton nhóm germancranlid
Năm 1991, C. Zdero cùng các cộng sự đã phân lập đƣợc 4 dẫn chất
sesquiterpen lacton nhóm germancranlid từ S. orientalis. Đến năm 2015, nhóm các
nhà khoa học Trung Quốc đã tách thêm đƣợc 10 dẫn chất cùng nhóm [19,24].
1.4.1

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của một số dẫn chất sesquiterpen lacton nhóm
germancranlid phân lập từ S. orientalis
Dẫn chất sesquyterpen lacton nhóm melampolid
4 dẫn chất sesquiterpen lacton nhóm melampolid đƣợc phân lập bởi C. Zdero
cùng các cộng sự vào năm 1991 [27].

1.4.2

5


Hình 1.4: Công thức cấu tạo của một số dẫn chất sesquiterpen lacton nhóm
melampolid
1.3.3 Các dẫn chất của geranylnerol
Một số dẫn chất của geranylnerol đƣợc tách ra từ cây hy thiêm [27].

Hình 1.5: Công thức cấu tạo của một số dẫn chất geranylnerol
1.3.4 Các flavonoid
Hai hợp chất flavonoid đƣợc phân lập từ S.orientalis đó là 3,7dimethylquercetin và rutin [5]

6


Hình 1.6: Công thức cấu tạo của 2 flavonoid phân lập từ S. orientalis

1.3.5 Các steroid
Các steroid đƣợc phân lập từ cây S. orientalis là β-sitoterol, stigmasterol,
stigmasterol 3-O-β-D-glucopyranosid [5].

Stigmasterol

Stigmasterol 3-O-β-Dglucopyranosid

1.3.6 Một số hợp chất khác
Thymohydroquynon dimethyl ether, acid cafeic… cũng đƣợc tìm thấy ở cây hy
thiêm [5].
1.4 Tác dụng dƣợc lý.
1.4.1

Tác dụng chống viêm

Trên chuột cống trắng cho thấy cao lá hy thiêm có tác dụng ức chế khá mạnh
viêm cấp tính trên mô hình gân phù bàn chân chuột và ức chế viêm mạn tính, gây teo
tuyến ức chuột cống non. Ngoại ra còn giảm tỷ lệ γ- globulin trong trong huyết thanh
khi phối hợp trong bài thuốc gồm hy ,thiêm, mộc qua, thiên niên kiện và ngƣu tất
[3,15].
1.4.2

Tác dụng chống oxi hóa
Dịch chiết methanol và ethyl acetat của hy thiêm có tác dụng chống oxi hóa (đặc

biệt là dịch chiết methanol) [23]. Hy thiêm chống oxi hoá trên gốc tự do OH● và O2-● .

7

Trên anion O2-●, dịch chiết nƣớc có tác dụng mạnh, còn trên OH● phân đoạn butanol có
hiệu quả cao. Đặc biệt, khi nghiên cứu sâu về cơ chế chống oxi hoá trên O2-●, có tác giả
còn thấy, phân đoạn butanol chống oxi hoá mạnh trên dịch treo mô não đồng thể và
màng hồng cầu [15].
Ngoài ra, Boyle SP cùng các cộng sự (2000) và Uma Devi P (2006) đã chứng
minh đƣợc trong cây hy thiêm có chứa orientin, rutin… có tác dụng chống oxi hóa của
bởi cơ chế các làm sạch các gốc tự do nhƣ superpoxid hoặc tạo ra chelat với kim loại
màu… [22,23].
1.4.3

Tác dụng ức chế miễn dịch

Dịch chiết ethanol hy thiêm làm giảm nồng độ IgG, IgG1, IgG2b và làm ức chế
miễn dịch khi tiến hành thực nghiệm ở in vivo và in vitro trên chuột nhắt trắng với liều
thử nghiệm 0,25; 0,5 mg và 1,0 mg/ngày trong vòng 28 ngày [25].
1.4.4

Tác dụng chống dị ứng

Nhờ ức chế sản xuất IgE từ lympho B mà dịch chiết hy thiêm có tác dụng chống
dị ứng. Hơn nữa hy thiêm có hoạt tính kháng histamin và kháng acetylcholine thể hiện
ở tác dụng làm giảm biên độ co thắt cơ trơn ở ruột cô lập gây bởi histamin và
acetycholin [12].
1.4.5

Độc với tế bào u sắc tố

Kirenol và pubetalin đƣợc phân lập từ phân đoạn ethyl acetat thể hiện độc tính
rất mạnh đối với dòng tế bào u sắc tố B16 ở chuột [27].

1.4.6

Tác dụng trên chuyển hóa lipid

Nghiên cứu trên chuột thí nghiệm cho thấy hy thiêm làm tăng lipid máu. Điều
này đƣợc thể hiện bằng việc gây giảm ở cả 3 chỉ số: cholesterol máu, tỷ số β/α
lipoprotein máu và mức lipid toàn phần trong máu động vật thí nghiệm [8]. Thành
phần rutin trong hy thiêm đƣơc chứng minh là có tác dụng trên chuyển hóa lipid ở
chuột béo phì [20].
1.4.7

Tác dụng kháng khuẩn

Rutin trong hy thiêm có hoạt tính kháng khuẩn (trên chủng vi khuẩn gram
dƣơng) và kháng nấm (nhƣng không có tác dụng trên nấm Candida albicans) [6].

8


1.4.8

Tác dụng điều trị gout

Cao toàn phần hy thiêm với liều 600 mg/kg/ngày, liên tục trong 5 ngày có tác
dụng làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh chuột nhắt trắng thực nghiệm trên mô
hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat, tỷ lệ giảm so với lô gây tăng là 30,0% [9].
Trong số các cao phân đoạn chiết xuất từ cao toàn phần hy thiêm, phân đoạn nbutanol thể hiện tác dụng hạ acid uric huyết thanh ƣu thế nhất trên mô hình gây tăng
acid uric cấp ở cả chuột nhắt trắng và chuột cống trắng cũng nhƣ khả năng ức chế
xanthin oxidase in vitro [9].
Phân đoạn n- butanol hy thiêm với liều 120 mg/kg/ngày uống liên tục trong 5

tuần có khả năng làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh chuột nhắt trắng trên mô hình
gây tăng acid uric mạn tính, tỷ lệ giảm so với lô chứng bệnh là 27,4% [9].
1.4.9

Tác dụng khác

Ngoài các tác dụng trên, dịch chiết phân đoạn ethyl acetat và n-butanol cây hy
thiêm đƣợc chứng mình còn có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ cổ tử cung
hela in vitro [18]. Rutin có thể làm giãn mạch, hạ áp, hạ đƣờng huyết [20].
1.5 Tính vị, công năng, công dụng
1.5.1 Tính vị, công năng
Hy thiêm có vị cay đắng, tính mát, quy vào 2 kinh can và thận, có tác dụng khử
phong, trừ thấp, hoạt huyết, chỉ thống, lợi gân cốt [8].
1.5.2 Công dụng
Hy thiêm đƣợc dùng để điểu trị phong thấp, nhức xƣơng, yếu chân, bán thân bất
toại, gân cốt nhực lạnh, lƣng gối tê dại [5], khớp sƣng nóng đỏ và đau nhức, đau lƣng,
mỏi gối. mụn nhọt lở ngứa, kinh nguyệt không đều. Ngày dùng 8 – 16 g, dạng thuốc
sắc, cao mềm hoặc hoàn tán. Dùng riêng hoặc phối hợp với các vị thuốc khác nhƣ gối
hạc, cỏ xƣớc, củ cốt khí. Còn dùng giã đắp tại chỗ chữa nhọt độc, ong đốt, rắn cắn. cây
có tác dụng phụ gây nôn nếu dùng tƣơi, uống nhiều [8].
Trong y học Trung Quốc, hy thiêm dùng phối hợp với cây thuốc khác để điều trị
ung thƣ và chảy máu não kèm theo chứng liệt. Dùng toàn cây dƣới dạng nƣớc sắc, liều
một lần là 10 g. Ở Ấn Độ, hy thiêm đƣợc coi là có tác dụng chữa các vết loét hoại tử và

9


các chứng đau nhức. Nƣớc ép cây tƣơi đắp lên vết thƣơng, khi khô tạo thành một lớp
phủ ngoài giống nhƣ véc ni. Cồn thuốc hy thiêm đƣợc dùng ngoài cùng với glycerin để
chữa bệnh herpes loang vòng và một số bệnh nhiễm ký sinh trùng. Hy thiêm đƣợc dùng

để chữa thấp khớp và cơn đau thận. Nó đƣợc coi là có tác dụng trợ tim, làm ra mồ hôi,
chống scorbut và tăng tiết nƣớc bọt. Còn đƣợc dùng làm thuốc trị giun sán. Cao nƣớc
hy thiêm có tác dụng độc đối với một số loại gián [8].
Ở Madagasca, hy thiêm đƣợc dùng với tác dụng gây liền sẹo ở bên ngoài và bên
trong cơ thể (đối với loét ống tiêu hóa) [8].
Ở Nepal, dịch ép rễ để trị vết thƣơng [8].
Ở Nigeria, cao toàn cây có tác dụng kháng khuẩn trị tổn thƣơng da, bệnh phong,
giang mai, bệnh hoa liễu và nấm da, làm thuốc tẩy và chống nôn [8].
1.6 Tổng quan về darutosid
1.6.1 Công thức cấu tạo và tính chất lý hoá

Hình 1.7: Công thức cấu tạo của darutosid
- Tên
IUPAC:
2R,3R,4S,5S,6R)-2-[[(2R,4aS,4bR,7S,10aS)-7-[(1R)-1,2dihydroxyethyl]-1,1,4a,7-tetramethyl-3,4,4b,5,6,9,10,10a-octahydro-2H-phenanthren- 2yl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol
-

Công thức phân tử của của darutosid: C26H44O8

-

Khối lƣợng phân tử: M= 484.62

-

Trạng thái vật lý: Bột màu trắng

-

Tan trong MeOH

10


1.6.2 Tác dụng của darutosid
Hy thiêm chứa hàm lƣợng lớn darutosid. Tại các hòn đảo Reunion và Mauritius,
nó đƣợc biết đến bởi đặc tính chữa bệnh lành vết thƣơng bên ngoài nhanh và làm dịu
viêm [22].
Darutosid là một diterpenoid đƣợc phân lập từ Siegesbeckia orientalis, đƣợc
chứng minh là có đặc tính chống viêm trong thí nghiệm in vivo (ức chế đƣờng
lipoxygenase trong tổng hợp prostaglandin, ức chế collage-nase, chống lại chứng phát
ban do tia cực tím) [22].
Ngoài ra, darutosid còn có tác dụng phục hồi vết thƣơng và tái tạo mô bằng cách
sinh tổng hợp collagen. Đối với da bị rạn (tổn thƣơng bề mặt da do sự giãn nở bất
thƣờng của lớp hạ bì trong thời gian mang thai hoặc thay đổi cân nặng, làm cho chất
elastin trong các mô liên kết có thể giảm hoặc mất) thì darutosid có khả năng tái cấu
trúc các vết rạn, tăng sinh collagen, giúp hồi phục da [22].
Một thử nghiệm in vivo đánh giá hiệu quả chống căng da của một loại kem chứa
1.0 % darutosid trên 14 tình nguyện viên nữ (21- 42 tuổi) có vết rạn trên bụng, đùi,
hông, ngực… Kết quả cho thấy nếu sử dụng kem mỗi ngày hai lần trong bốn tuần liên
tiếp thì 7 trong số 14 tình nguyện viên nhận thấy vết rạn đƣợc làm đầy, kích thƣớc thu
nhỏ dần đồng thời độ nhạy cảm giảm, cải thiện độ đàn hồi của da [22].
1.6.3 Một số nghiên cứu định tính, định lƣợng darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm
HPLC
1.6.3.1 Định tính
Hiện nay, chƣa có dƣợc điển nào quy định chuyên luận định tính darutosid trong
dƣợc liệu hy thiêm.
1.6.3.2 Định lƣợng
Trên thế giới chƣa có dƣợc điển nào quy định chuyên luận định lƣợng darutosid
trong dƣợc liệu hy thiêm. Một số công trình nghiên cứu định lƣợng darutosid từ loài

này đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp [16]:
-

Detector UV ở bƣớc sóng 210 nm, cột (4,6 x 250 mm), cỡ hạt 5 µm.

-

Tốc độ dòng: 1.0 mL/phút.
Pha động: nƣớc - acetonitril (1 : 9 v/v)

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 10,0000 mg darutosid, hoà tan trong 10
mL methanol để thu đƣợc dung dịch chuẩn có nồng độ 1mg/mL, sau đó tiến hành pha
11


loãng để đƣợc các dung dịch có nồng độ từ 1-20 µg/mL.
- Dung dịch thử: Cân 10 mg cao khô chiết từ methanol thô, thêm 10mL
methanol sau đó ly tâm trong vòng 20 phút. Lấy phần dịch vào bình định mức 10 mL.
Lặp lại quy trình này 4 lần, kết hợp dịch lọc. Cuối cùng thu đƣợc dung dịch có nồng độ
1 mg/mL
1.7 Tổng quan về phƣơng pháp sắc ký lỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.7.1 Vài nét về phƣơng pháp TLC áp dụng trong nghiên cứu định tính
-

Nguyên tắc:

Quá trình tách bằng TLC đƣợc thực hiện trên một lớp mỏng gồm các hạt kích thƣớc
đồng nhất đƣợc kết dính trên một giá đỡ bằng thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo. Lớp mỏng
kết dính là pha tĩnh. Các hạt trong pha tĩnh làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố,
hấp thụ, trao đổi ion... Pha động là những hệ dung môi tƣơng tự phƣơng pháp HPLC.

Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của các chất là hệ số lưu giữ Rf. Trị số
của nó đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách
dịch chuyển của pha động:
Rf =
Trong đó:
dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm).
dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động ( đo trên cùng
đƣờng đi của vết, tính bằng cm).
Rf: Có giá trị giao động từ 0-1.
-

Pha tĩnh của TLC

Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thƣớc 10-30 µm đƣợc trải đều và kết dính
thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ hình vuông. Pha tĩnh thông
dụng nhất hay dùng là silica gel, ngoài ra cũng có thể sử dụng nhôm oxyd, cellulose,
polyamid hay các loại silica gel pha đảo.
-

Pha động:

Pha động của TLC phụ thuộc vào cơ chế sắc ký, để tăng cƣờng sức rửa giải thƣờng
kết hợp 2 hoặc nhiều dung môi với nhau. Nguyên lý chi tách dựa vào hệ số phân bố giữa 2
12


pha. Dƣới đây là 1 số gợi ý chung nhất cho dung môi pha động:
 Dung môi cần có độ tinh khiết cao.
 Cần điều chỉnh sức rửa giải của pha động để trị số Rf nằm trong khoảng 0,2
– 0,8 đạt độ phân giải cực trị.

 Chất phân tích dạng ion hay phân cực đƣợc rửa giải tốt bằng dung môi phân
cực nhƣ hỗn hợp n-butanol – nƣớc. Thêm một ít acid acetic hoặc amoniac vào nƣớc sẽ làm
tăng độ tan của base hoặc acid tƣơng ứng.
 Khi dùng silica gel hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực của
pha động sẽ quyết định tốc độ di chuyển của chất phân tích và trị số Rf của chúng. Nếu
thêm một ít dung môi ít phân cực nhƣ ether ethylic vào dung môi không phân cực nhƣ
methylebnzen sẽ làm tăng đáng kể trị số Rf .
-

Đánh giá kết quả.
 Vết chất cần phân tích trên bản mỏng khi soi đèn UV hoặc phun thuốc thử

hiện màu phải đƣợc nhìn thấy rõ, tách rời với các vết tạp.
 Trị số Rf phải nằm trong khoảng 0,2-0,8.
 So sánh trị số Rf của chất chuẩn với các chất trên mẫu phân tích.
1.7.2 Vài nét về phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Nguyên tắc của phƣơng pháp HPLC
HPLC là một kỹ thuật phân tích trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột
chứa các hạt pha tĩnh nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dƣới áp suất cao. Tốc độ di
chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa 2 pha, tức là liên quan đến
ái lực tƣơng đối của chất này đối với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi
1.7.2.1

cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc phát hiện bởi
detector.
Có 4 kỹ thuật HPLC cơ bản: Sắc ký phân bố, hấp phụ, trao đổi ion và rây phân tử
(loại cỡ). Trong phạm vi khóa luận này, tôi xin trình bày cụ thể về kỹ thuật sắc ký phân bố.
1.7.2.2
Điều kiện sắc ký phân bố hiệu năng cao
- Pha tĩnh:

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách hỗn hợp gồm nhiều
thành phần. Đó là chất rắn xốp, có kích thƣớc nhỏ, đƣờng kính 3 – 10 µm, có độ phân cực
khác nhau. Pha tĩnh đƣợc cấu tạo từ các nhóm chức khác nhau ghép hóa học trên giá mang,
13


thƣờng là các hạt silica. Tùy theo bản chất pha tĩnh, ngƣời ta phân ra hai loại:
 Sắc kí pha thuận: Pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực nhƣ triethylen
glycol; pha động là các dung môi hữu cơ ít phân cực nhƣ: n-hexan, toluen, isopropyl ether.
Trong sắc kí pha thuận, chất ít phân cực nhất đƣợc rửa giải đầu tiên. Khi tăng độ phân cực
của pha động, thời gian lƣu giảm dần.
 Sắc kí pha đảo: pha tĩnh là các silica gel đã đƣợc alkyl hóa, ít phân cực.
Trong sắc ký pha đảo, các chất phân cực nhất đƣợc rửa giải đầu tiên, khi tăng độ phân cực
của pha động thời gian lƣu tăng lên.
-

Pha động trong HPLC:

Pha động là dung môi rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột sắc kí. Pha động có
thể là dung môi hữu cơ, hoặc hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định. Trong sắc kí pha
thuận, pha động là các dung môi hữu cơ ít phân cực nhƣ: n-hexan, benzen, chloroform…
Trong sắc kí pha đảo, pha động là hệ dung môi hữu cơ phân cực nhƣ: methanol,
acetonitril… hay hỗn hợp của chúng.
-

Detector trong HPLC

Detector là bộ phận dùng để phát hiện các chất sau khi đƣợc tách riêng và rửa giải
ra khỏi cột sắc kí. Một chất khi đi qua detector sẽcho tín hiệu đáp ứng khác biệt với nền
pha động, qua đó cho phép đánh giá, định tính, định lƣợng các thành phần trong mẫu phân

tích. Tùy thuộc vào tính chất lý hóa của đối tƣợng chất cần phân tích, detector sẽ đƣợc lựa
chọn thích hợp để những chất này có đáp ứng với detector. Các loại detector thƣờng đƣợc
sử dụng trong HPLC bao gồm: detector tử ngoại khả kiến (UV-VIS), detector hiện đại
thuộc loại này là detector mảng diod (DAD); detector huỳnh quang; detector độ dẫn,
detector khối phổ.
Các phƣơng pháp định lƣợng bằng HPLC
Nguyên tắc của các phƣơng pháp định lƣợng bằng HPLC là nồng độ của chất tỷ lệ
với chiều cao và diện tích píc của chất đó thể hiện trên sắc ký đồ.
1.7.2.3

Có 4 phƣơng pháp định lƣợng đƣợc sử dụng trong sắc ký:
-

Phƣơng pháp chuẩn ngoại.

-

Phƣơng pháp chuẩn nội.

-

Phƣơng pháp thêm chuẩn.

-

Phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích.
14


Khóa luận đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp chuẩn ngoại.

Phƣơng pháp chuẩn ngoại là phƣơng pháp định lƣợng cơ bản, trong đó cả mẫu
chuẩn và mẫu thử đều đƣợc tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. So sánh diện tích (hoặc
chiều cao) píc của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) píc của mẫu chuẩn sẽ tính đƣợc
nồng độ các chất cần phân tích trong mẫu thử.
Có 2 phƣơng pháp là chuẩn hóa 1 điểm và chuẩn hóa nhiều điểm.
-

Chuẩn hóa 1 điểm: Chọn nồng độ mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ mẫu thử.
Tính nồng độ mẫu thử theo công thức:
CX = CS
Trong đó: CX là nồng độ mẫu thử
CS là nồng độ mẫu chuẩn
SX là diện tích của píc mẫu thử
SKĐ là diện tích của píc mẫu chuẩn

-

Chuẩn hóa nhiều điểm: cần tiến hành qua những bƣớc sau:

 Chuẩn bị một dãy chuẩn với nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Các đáp
ứng thu đƣợc là các diện tích (hoặc chiều cao) của píc ở mỗi điểm chuẩn.
 Vẽ đồ thị biểu diễn sự tƣơng quan giữa diện tích píc (hoặc chiều cao) với
nồng độ của chất chuẩn.
 Sử dụng đoạn tuyến tính của đƣờng chuẩn để tính toán nồng độ của chất thử.
Có thể tính toán dựa theo 2 cách:
- Áp dữ kiện diện tích (hoặc chiều cao) píc của chất thử vào đƣờng chuẩn sẽ suy ra
đƣợc nồng độ của nó.
- Xây dựng phƣơng trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều
cao) của píc với nồng độ của chất cần xác định.
Y = a + bCX

Trong đó: Y là diện tich píc
a là giao điểm của đƣờng chuẩn với trục tung
b là độ dốc của đƣờng chuẩn
15