Nghiên cứu khả năng phân hủy microcystin của vi khuẩn nước sphingomonas

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

Lê Thị Huệ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY MICROCYSTIN CỦA VI
KHUẨN NƯỚC Sphingomonas

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

Hà Nội – Năm 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

Lê Thị Huệ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY MICROCYSTIN CỦA VI KHUẨN
NƯỚC Sphingomonas

Chuyên ngành : KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
1. TS. Nguyễn Thị Hoài Hà

Hà Nội – Năm 2014


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành chương trình cao học và viết luận văn này, ngoài sự nỗ lực của
bản thân, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ, động viên và góp ý nhiệt tình của
nhiều tập thể và cá nhân.
Qua đây, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Khoa học và Công
nghệ Môi trường - Đại học Bách Khoa Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt
cho tôi những kiến thức quý báu, bổ ích và giúp đỡ tôi trong suốt khóa học vừa qua
cũng như tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn người hướng dẫn khoa học:
TS. Nguyễn Thị Hoài Hà - Phòng Sinh học Tảo - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh
học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn và
giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đặng Minh Hằng - Viện Khoa học và Công
nghệ Môi trường - Đại học Bách Khoa Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện để
tôi thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn Th.S Phạm Thị Bích Đào cán bộ Phòng sinh học
Tảo, nhóm tác giả đề tài mã số: 01C-09/01-2012-2 và các cán bộ Viện Vi sinh vật và
Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện, tận tình giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình làm luận văn vừa qua..
Nhân đây, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè cùng các
anh, chị, em đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, đã nhiệt tình đóng
góp ý kiến để luận văn của tôi thêm hoàn thiện.
Mặc dù tôi đã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt tình và
năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận
được những đóng góp quý báu của quý thầy cô và các bạn.
Hà Nội, tháng 03 năm 2014.

Học viên

Lê Thị Huệ
Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

i


Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU..................................................................................................................................................................... 2
Chương 1. TỔNG QUAN........................................................................................................................................ 5
1.1. Tảo lam Microcystis............................................................................................................................................ 5
1.2. Độc tố mcirocystin (MC) ................................................................................................................................... 8
1.2.1. Đặc điểm, cấu trúc của microcystin.............................................................................................................. 8
1.2.2. Độc tính của microcystin...............................................................................................................................11
1.2.2.1. Ảnh hưởng độc hại của microcystin lên các loài động vật thủy sinh ..................................................13
1.2.2.2. Ảnh hưởng độc hại của microcystin lên cơ thể người...........................................................................14
1.3. Loại bỏ MC hòa tan trong các quá trình xử lý nước.....................................................................................15
1.3.1. Quang phân .....................................................................................................................................................15
1.3.2. Quá trình khử bằng ozon...............................................................................................................................15
1.3.3. Khử bằng clo...................................................................................................................................................15
1.3.4. Lọc bằng carbon hoạt tính.............................................................................................................................17
1.3.5. Lọc chậm .........................................................................................................................................................19
1.3.6. Phân hủy sinh học MC ..................................................................................................................................21
1.4. Vi khuẩn phân hủy MC....................................................................................................................................21
1.4.1. Vi khuẩn dị dưỡng Sphingomonas.............................................................................................................21
1.4.2. Cơ chế phân hủy độc tố microcystin của Sphingomonas ........................................................................24
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................................................26

2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................................................................26
2.1.1. Đối tượng và thời gian nghiên cứu...............................................................................................................26
2.1.2. Hóa chất ...........................................................................................................................................................26
2.1.3. Môi trường nuôi cấy.......................................................................................................................................26
2.1.4. Máy móc, dụng cụ..........................................................................................................................................27
2.2. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................................................................27
2.2.1. Phân lập VKDD từ nước hồ nở hoa............................................................................................................27
2.2.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá........................................................................................................27
2.2.2. 1. Nhuộm Gram..............................................................................................................................................27
2.2.2.2. Phản ứng Catalase.......................................................................................................................................28
2.2.2.3. Phản ứng Oxidase .......................................................................................................................................29
2.2.3. Phân loại 16S rDNA......................................................................................................................................29
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu enzyme protease ...............................................................................................31
2.2.4.1. Nuôi VKDD để thu nhận enzyme ..........................................................................................................31
2.2.4.2. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến ..............................................................31
2.2.4.3. Điện di protease trên gel polyacrylamit có SDS (SDS-PAGE) theo phương pháp Heusen và
Dowdle [27] ...................................................................................................................................................32
2.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi đến sự phân hủy microcystin......................................33
2.2.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ..............................................................................................................................33
Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

ii


Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

2.2.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ microcystin.......................................................................................................33
Xác định hàm lượng microcystin trên máy quang phổ.......................................................................................34
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.........................................................................................................35
3.1. Khảo sát mức độ phú dưỡng trong hồ Hoàn Kiếm......................................................................................35

3.2. Sàng lọc và tuyển chọn VKDD phân hủy microcystin từ nước hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội ....................36
3.2.1. Phân lập các chủng VKDD từ nước hồ Hoàn Kiếm...............................................................................36
3.2.2. Sàng lọc VKDD có khả năng phân hủy độc tố microcystin ...................................................................39
3.2.3. Đặc điểm sinh học và hình dạng tế bào của VKDD S1..........................................................................42
3.2.3.1. Đặc điểm hình thái tế bào của VKDD S1..............................................................................................42
3.2.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng của VKDD S1 .................................................42
3.2.4. Xác định trình tự đoạn gen 16S rDNA của VKDD S1 .........................................................................45
3.3. Nghiên cứu enzyme phân hủy độc tố microcystin của Sphingomonas sp., S1 .......................................48
3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease ...................................................................................................48
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease...........................................................................................49
3.3.3. Độ bền với nhiệt theo thời gian xử lý ở 60oC .............................................................................................51
3.3.4. Ảnh hưởng của các chất ức chế đặc hiệu đến hoạt tính enzyme protease .............................................52
3.3.5. Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính enzyme protease...................................................................53
3.3.6. Phân tích thành phần protease bằng điện di................................................................................................54
3.4. Khả năng phân hủy MC của VKDD Sphingomonas sp., S1 ....................................................................56
3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................................................................................56
3.4.2. Ảnh hưởng của số lượng vi khuẩn...............................................................................................................59
3.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ microcystin..........................................................................................................60
KẾT LUẬN...............................................................................................................................................................63
KIẾN NGHỊ..............................................................................................................................................................64
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................................................................65
PHỤ LỤC 1...............................................................................................................................................................69

Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

iii


Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên đầy đủ

Các chữ viết tắt
BOD

Biochemical oxygen dermand - Nhu cầu oxy sinh học

COD

Chemical oxygen demand - Nhu cầu oxy hóa học

DO

Oxygen demand – Hàm lượng oxy hòa tan

DNA

Deoxyribonucleic acid

DMSO

Dimethyl Sulfoxide

EDTA

Ethylen diamine tetraacetic acid
Median lethal dose – Liều lượng gây chết 50% số sinh vật
thí nghiệm

LD50
MC

Microcystin

MC-LR

Leucine and arginine in the positions of X and Z of
microcystin

MC-RR

Arginine and arginine in the positions of X and Z of
Microcystin

MC-YR

Tyrosine and arginine in the positions of X and Z of
Microcystin

Ophe

O –Phenanthroline

PCMB

p- Chloromer curibenzoate

PCR

Polymerase chain reaction – Phản ứng trùng hợp

PMSF
PP1 và PP2A

Phenyl methyl sulfonyl fluoride
Protein Photphataza 1 và 2A

RNA

Ribonucleic acid

rRNA

Ribosomal ribonucleic acid

SS
SDS

Suspended solids – Các chất lơ lửng
Sodium Dodecyl Sulphate

VKDD

Vi khuẩn dị dưỡng

WHO

World Heath Organisation – Tổ chức y tế thế giới

Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

iv


Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của microcystin đến cá [28] ....................................................... 12
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của 5 chủng VKDD phân lập từ hồ Hoàn Kiếm............ 37
Bảng 3.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của 5 chủng VKDD phân lập từ hồ Hoàn Kiếm 38
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease của Sphingomonas sp., S1 ........... 48
Bảng 3.4. Sự thay đổi hoạt độ protease của Sphingomonas sp., S1 theo nhiệt độ......... 50
Bảng 3.5. Sự thay đổi hoạt độ protease của Sphingomonas sp., S1 theo thời gian . xử lý
ở 60oC............................................................................................................. 51
Bảng 3.6. Nồng độ microcystin còn lại với sự phân hủy của VKDD Sphingomonas sp.,
S1 ở các nhiệt độ khác nhau. ......................................................................... 57
Bảng 3.7. Nồng độ microcystin còn lại với sự phân hủy của VKDD Sphingomonas sp.,
S1 có số lượng vi khuẩn khác nhau ............................................................... 59
Bảng 3.8. Lượng microcystin còn lại với sự phân hủy của VK Sphingomonas sp., S1 ở
các nồng độ MC khác nhau............................................................................ 61

Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

v


Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Microcystis tạo thành váng dày nổi trên mặt nước [27] ................................. 5
Hình 1.2. Tập đoàn tế bào Microcystis (×40) .................................................................. 5
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc hóa học của microcystin [11] .............................................. 9
Hình 1.4. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – LR [46] ..................................... 10
Hình 1.5. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – RR [46] ..................................... 10
Hình 1.6. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – YR [46] .................................... 11
Hình 1.7. Vi khuẩn dị dưỡng Sphingomonas dưới kính hiển vi điện tử [45] ............... 22
Hình 1.8. Con đường phân hủy microcystin bằng Sphingomonas [39] ........................ 25
Hình 2.1. Địa điểm thu mẫu hồ Hoàn Kiếm - Địa điểm A [47]. ................................... 26
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc chủng VKDD S1 ........................................................... 37
Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc chủng VKDD S2 ........................................................... 37
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc chủng VKDD S3 ........................................................... 38
Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc chủng VKDD S4 ........................................................... 38
Hình 3.5. Hình thái khuẩn lạc chủng VKDD S5 ........................................................... 38
Hình 3.6. Khả năng phân hủy MC của 7 VKDD phân lập từ hồ Hoàn Kiếm ............... 41
Hình 3.7. Hình dạng tế bào VKDD S1 dưới kính hiển vi điện tử (SEM×60.000) ....... 42
Hình 3.8. Động thái sinh trưởng VKDD S1 .................................................................. 43
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến VKDD S1 ......................................... 43
Hình 3.10. Ảnh hưởng của pH lên VKDD S1 .............................................................. 44
Hình 3.11. DNA tổng số của VKDD S1........................................................................ 45
Hình 3.12. Sản phẩm PCR nhân đoạn gene 16S rDNA của VKDD S1 ........................ 45
Hình 3.13.Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự 16S rDNA của
VKDD S1, S2 và các loài có quan hệ họ hàng gần (2*) ................................ 47
Hình 3.14. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease ở Sphingomonas sp.,S1 .............. 49
Hình 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease ở Sphingomonas sp.,S1 ...... 50

Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

vi

Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

Hình 3.16. Sự biến đổi hoạt độ protease của Sphingomonas sp., S1 theo thời gian xử lý
ở 60oC .......................................................................................................... 51
Hình 3.17. Ảnh hưởng của chất ức chế đặc hiệu nhóm đến hoạt độ protease của
Sphingomonas sp.,S1 ................................................................................... 53
Hình 3.18. Ảnh hưởng của các ion kim loại hóa trị hai đến hoạt độ protease
Sphingomonas sp.,S1(3*) ............................................................................... 54
Hình 3.19. Điện di trên gel polyacrylamit 10% có SDS và gelatin 0,1% các protease
của Sphingomonas sp., S1 ........................................................................... 55
Hình 3.20. Điện di trên gel polyacrylamit 10% có SDS và gelatin 0,1% các protease
của Sphingomonas sp., S1 được khôi phục bởi ion Ca2+ ............................. 55
Hình 3.21. Điện di trên gel polyacrylamit 10% có SDS và gelatin 0,1% các protease
của Sphingomonas sp., S1 được khôi phục bởi ion Mg2+(3*) ....................... 56
Hình 3.22. Sự phân hủy microcystin bởi VKDD Sphingomonas sp. S1 ở
nhiệt độ 10, 15, 20, 25, 30 và 35°C ............................................................. 58
Hình 3.23. Tốc độ phân hủy sinh học microcystin bởi số lượng VKDD Sphingomonas
sp. S1 khác nhau .......................................................................................... 59
Hình 3.24. Phân hủy sinh học microcystin bởi VKDD Sphingomonas sp., S1 nồng độ
MC khác nhau (1, 10, 20 và 50 µg/ml) ........................................................ 61
PHỤ LỤC
Hình 1. Biến động pH trung bình của mẫu nước hồ Hoàn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 ...... 2
Hình 2. Biến động DO trung bình của mẫu nước hồ Hoàn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 ..... 3
Hình 3.Biến động COD trung bình của mẫu nước hồ Hoàn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 .. 4
Hình 4. Biến động BOD5 trung bình của mẫu nước hồ Hoàn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 . 5
Hình 5. Biến động NH4+ trung bình của mẫu nước hồ Hoàn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 ... 6
Hình 6. Biến động NO2- trung bình của mẫu nước hồ Hoàn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 .. 6
Hình 7. Biến động NO32- trung bình của mẫu nước hồ Hoàn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 .. 7
Hình 8. Biến động PO43- trung bình của mẫu nước hồ Hoàn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012 .. 8

Hình 9. Biến động SS trung bình của mẫu nước hồ Hoàn Kiếm tháng 3, 4, 5/2012...... 8

Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

vii


Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

MỞ ĐẦU
Hiện nay, trên thế giới xử lý độc tố vi tảo lam trong thời kỳ nở hoa nước đang
được các quốc gia quan tâm đặc biệt. Đã có không ít các công trình nghiên cứu hiện
tượng nở hoa nước và giảm thiểu tác hại của độc tố tảo lam gây độc, tuy nhiên kết quả
vẫn còn ở các mức độ khác nhau. Hồ Hoàn Kiếm_ địa danh nổi tiếng của thủ đô là một
hồ nông, kín, chất lượng nước thay đổi dẫn tới sự suy giảm một số loài vi tảo đặc hữu,
đồng thời gia tăng mật độ của vi tảo lam sinh độc tố và gây nên những lo ngại về môi
trường cho khu hệ động thực vật sống trong hồ.
Trong số các loài vi tảo lam gây nở hoa nước hồ Hoàn Kiếm, Microcystis
aeruginosa Kutzing là loài bắt gặp thường xuyên và phổ biến nhất. Microcystis
aeruginosa chứa độc tố thuộc nhóm hepatotoxin (độc tố gan) cấu tạo từ các peptid
mạch vòng có tên gọi là microcystin (MC) [27,43]. Chúng là các heptapeptide mạch
vòng có chứa 1 amino acid đặc hiệu (Adda) chuỗi bên. Cho đến nay, đây là những
dạng cấu trúc đặc biệt chỉ gặp ở microcystin. Microcystin có hơn 90 đồng phân, chúng
khác nhau ở các nhóm methyl (R1 và R2) và 2 amino acid (ở vị trí X và Z) bên trong
chuỗi. Từ đó dẫn đến sự khác nhau về cấu trúc bậc 4, tính độc cũng như các đặc tính ưa
nước hoặc kỵ nước. Có 4 loại độc tố MC-YR, MC-RR, MC-YA, MC-LR, trong đó
MC-LR phổ biến và có tính độc cao nhất. Khi vào gan, microcystin sẽ ức chế
hepatocyte protein photphat PP1 và PP2A, từ đó gây ra siêu phosphoryl hoá
cytokeratin và dẫn đến sự phá vỡ các vi sợi, thoát dịch tế bào và chảy máu gan động
vật. Sự tiếp xúc lâu dài với nồng độ microcystin thấp trong nước uống làm ảnh hưởng

đến các cấu trúc tế bào, quá trình nguyên phân dẫn đến kích thích gây ung thư gan ở
người. Năm 1989, WHO đã triệu tập một nhóm chuyến gia Quốc tế để có cái nhìn tổng
quan nhất về lĩnh vực này và đưa ra mức giới hạn nồng độ độc MC-LR trong nước
uống là 1,5g/l. Song công bố gần đây nhất, mức giới hạn MC-LR trong nước uống
được làm tròn xuống một chữ số là 1,0g/l, để đảm bảo sức khoẻ con người.
Microcystin thường tích luỹ trong nội quan tế bào hoặc dưới dạng tự do trong
nước. Việc loại bỏ microcystin trong nước có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp
khác nhau trong đó phương pháp sinh học đang được thế giới quan tâm. Xử lý
microcystin trong nước bằng vi khuẩn dị dưỡng (VKDD) bản địa sẽ không làm thay
Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

2


Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

đổi thành phần loài qua đó giúp giảm thiểu nguy cơ suy giảm đa dạng sinh học. Ngoài
ra, việc tìm ra VKDD bản địa có khả năng phân hủy microcystin cao sẽ mở ra triển
vọng xử lý microcystin tại nguồn, giảm thiểu sự lưu hành của độc tố này, giảm nguy cơ
đối với sức khỏe con người và hệ sinh thái. Từ những yếu tố trên cho thấy, xử lý
microcystin bằng biện pháp sinh học mang tính bền vững cao.
Với mong muốn góp thêm một công cụ trong xử lý độc tố tảo lam ở hồ Hoàn
Kiếm, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng phân hủy microcystin của vi
khuẩn nước Sphingomonas”. Luận văn này được thực hiện trong khuôn khổ đề tài
cấp Thành phố Hà Nội “Nghiên cứu xây dựng quy trình phân hủy độc tố microcystin
của tảo lam Microcystis aeruginosa bằng vi khuẩn dị dưỡng nhằm bảo vệ nước hồ
Hoàn Kiếm, Hà Nội” mã số đề tài: 01C-09/01-2012-2, chủ nhiệm đề tài TS. Nguyễn
Thị Hoài Hà.
A. Mục tiêu
Tìm và tuyển chọn vi khuẩn dị dưỡng (VKDD) Sphingomonas trong nước hồ

Hoàn Kiếm, đánh giá khả năng phân hủy độc tố microcystin của chúng.
B. Nội dung
Luận văn gồm các phần mở đầu, kết luận, kiến nghị và 03 chương nội dung:
Tổng quan, phương pháp nghiên cứu, kết quả và thảo luận. Kết quả được trình bày
trong chương 3, trong đó:
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tảo lam Microcystis
1.2. Độc tố mcirocystin (MC)
1.3. Loại bỏ MC hòa tan trong các quá trình xử lý nước
1.4. Vi khuẩn phân hủy MC
Để viết phần tổng quan tác giả đã nhận được sự chỉ dẫn, góp ý nhiệt tình, tận
tâm của người hướng dẫn khoa học TS. Nguyễn Thị Hoài Hà, Th.S Phạm Thị Bích
Đào, nhóm tác giả đề tài 01C-09/01-2012-2 và các thành viên của phòng Sinh học Tảo,
Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Nội dung phần
tổng quan tác giả đã trình bày có mang tính kế thừa đề tài 01C-09/01-2012-2.

Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

3


Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trình bày các phương pháp được tác giả sử dụng trong quá trình nghiên cứu.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát và đánh giá mức độ phú dưỡng của hồ Hoàn Kiếm (Bảng 1 phụ lục 2)
tác giả kế thừa kết quả của nhóm tác giả đề tài 01C-09/01-2012-2;
3.2. Sàng lọc và tuyển chọn VKDD phân hủy microcystin từ nước hồ Hoàn Kiếm, Hà
Nội: tác giả phân lập tuyển chọn được 5 chủng VKDD từ nước hồ HOàn Kiếm có khả

năng phân hủy MC. Định danh được 2 VKDD thuộc chi Sphingomonas
- Mục 3.2.4. Xác định trình tự đoạn gen 16S rDNA và định danh VKDD S1, S2
tác giả tham gia cùng Th.S.. Phạm Thị Bích Đào, TS. Nguyễn Thị Hoài Hà
3.3. Nghiên cứu enzyme phân hủy độc tố microcystin của Sphingomonas sp., S1:
Nghiên cứu tính chất, hoạt độ protease của enzyme VKDD Sphingomonas sp., S1
- Mục 3.3.5. Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính enzyme protease của
Sphingomonas sp., S1
- Mục 3.3.6. Phân tích thành phần protease bằng điện di tác giả tham gia cùng
Th.S. Phạm Thị Bích Đào, TS. Nguyễn Thị Hoài Hà
3.4. Khả năng phân hủy MC của VKDD Sphingomonas sp., S1
Các kết quả tác giả trình bày trong luận văn đã được sự đồng ý cho phép của
chủ nhiệm và nhóm tác giả đề tài mã số 01C-09/01-2012-2.
Trong quá làm luận văn tác giả tiến hành thí nghiệm cùng nhóm đề tài 01C09/01-2012-2 và nhận được sự giúp đỡ của TS. Nguyễn Thị Hoài Hà, Th.S Phạm Thị
Bích Đào cùng các thành viên trong nhóm đề tài 01C-09/01-2012-2.
Luận văn đã sàng lọc, tuyển chọn được 5 chủng vi khuẩn dị dưỡng có khả
năng phân hủy microcystin từ nước hồ Hoàn Kiếm, trong đó có 2 chủng thuộc chi
Sphingomonas; Nghiên cứu tính chất, hoạt độ protease của enzyme VKDD
Sphingomonas sp., S1 và khả năng phân hủy độc tố microcystin của VKDD
Sphingomonas sp., S1 được phân lập từ nước hồ Hoàn Kiếm.
Từ kết quả thu được, luận văn góp phần tạo tiền đề cơ sở cho các nghiên cứu
sâu hơn để xử lý độc tố microcystin trong hồ Hoàn Kiếm nói riêng và các thủy vực
ngoài tự nhiên nói chung.
Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

4


Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Tảo lam Microcystis
Trong các loài tảo lam sinh ra microcystin thì Microcystis là loại thường gặp
nhất trong các thủy vực. Chi Microcystis khác với các chi khác của tảo lam ở đặc điểm
cơ thể là một tập đoàn gồm nhiều tế bào dính, giống nhau, nằm trong một bọc nhày,
mắt thường có thể nhìn thấy tập đoàn như những hạt trứng cá lơ lửng trong nước. Đó là
những tập đoàn có kích thước từ 40 – 250μm, gồm nhiều tế bào hình cầu hợp lại [43].

Hình 1.1. Microcystis tạo thành váng dày
nổi trên mặt nước [27]

Hình 1.2. Tập đoàn tế bào Microcystis
(×40)

Tế bào của chi Microcystis tồn tại trong nước như những sinh vật phù du.
Microcystis thuộc chi không có khả năng cố định nitơ của tảo lam. Khi nở hoa thì tạo
thành những lớp váng nổi trên mặt nước, được lan rộng ra bởi gió, bền vững trên một
vùng nhất định và chiếm ưu thế trong suốt cả năm. Các tế bào của Microcystis rất đơn
giản và có thể thay đổi trong suốt các giai đoạn sinh trưởng khác nhau. Các đặc điểm
siêu cấu trúc dường như khá tương đồng cho tất cả các loại hình thái [27]. Thành tế bào
được chia thành 3 phần, tạo thành 3 dạng tầng peptidoglycan. Đó là các tầng có tác
dụng bảo vệ phía ngoài, sàng lọc phân tử, bẫy các ion và phân tử, thúc đẩy quá trình
bám dính của tế bào. Nó cũng là lớp vỏ vững chắc, là các khung để định dạng và duy
trì hình dạng tế bào [27].
Các hạt trong nội bào hầu như chứa toàn bộ các vật chất dự trữ của tế bào
Micorocystis. Các không bào khí là một điểm đặc trưng của chi Microcystis, chức năng
chính của không bào là làm cho tế bào nổi lên, thích nghi với sự thay đổi của các điều
Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

5

Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

kiện môi trường trong cột nước. Không bào được phát triển từ các cấu trúc có hình nón
đôi nhỏ, những cấu trúc này được tạo thành từ quá trình mã hóa protein phức tạp bởi
các gen ở trong nhân. Bề mặt các không bào cho phép các khí ngoại bào thấm qua tự
do cho đến khi thành phần các khí nội bào và ngoại bào cân bằng nhau. Không bào khí
là những cấu trúc rắn chắc, chiếm thể tích lớn trong tế bào, có thể giảm đi khi áp suất
thấp, còn khi áp suất cao hơn thì chúng bị vỡ ra và khi đó tế bào mất đi khả năng nổi
lên. Microcystis sinh sản theo hình thức phân đôi tế bào. Sự sinh sản của Microcystis
chỉ được nhận thấy khi có sự phân rã của các tế bào ban đầu, trong các tập đoàn tảo nhỏ
và cả trong các tế bào đơn.
Các điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng phát triển của tảo lam dẫn đến sự nở
hoa của Microcystis trong nước là sự kết hợp của các yếu tố: điều kiện chiếu sáng đầy
đủ, nhiệt độ nước phù hợp (khoảng 15 – 30ºC), pH của nước có giá trị từ trung tính đến
kiềm (pH = 6 – 9), nước trong các thủy vực bị tù đọng, thủy vực trong tình trạng nước
thiếu oxy, hàm lượng chất dinh dưỡng cao, hàm lượng N và P lớn, trong điều kiện gió
nhẹ hoặc không có gió dẫn đến sự phân tầng nước trong thủy vực. Nước chứa các loài
Microcystis gây độc thường có mùi tanh, sinh khối của Microcystis sau khi sấy khô có
mùi tanh hắc.
Các hợp chất trong tảo lam là các chất giàu hoạt tính sinh học, nó có thể là các
chất gây cản trở sự phân bào, chống ung thư, ức chế enzyme, kháng sinh, chống virus
và chống nấm. Vi tảo lam được biết đến nhiều nhất trong vai trò là chất tạo ra độc tố
gây ra các ảnh hưởng có hại đối với con người. Các độc chất tảo lam có thể được phân
loại thành 3 nhóm lớn theo cấu trúc hóa học như sau: các peptid vòng, các alkaloid và
các lipopolysaccharide. Tuy nhiên, các độc chất cũng có thể được phân loại thành 5
nhóm lớn dựa vào các đặc tính sinh lý, các cơ quan, bộ phận, các tế bào chịu tác động
ban đầu, bao gồm: các chất độc thần kinh, các chất độc gan, các chất độc tế bào, các
chất độc da, các chất kích thích và các chất độc đường tiêu hóa [8,10,43].
Phân tích mẫu nước của hồ Hòa Kiếm Hà Nội xác định được 35 taxon loài

thuộc 26 chi trong đó:Tảo lam (Cyanophyta): 10 chi, 12 loài; Tảo lục (Chlorophyta):
12 chi, 19 loài; Tảo silic (Diatomae): 2 chi, 2 loài; Tảo mắt (Euglenophyta): 2 chi, 2

Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

6


Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

loài [3]. Trong đó, các vi tảo lam thuộc chi Microcystis là những bộ chỉ thị ô nhiễm và
là vi tảo gây nở hoa nước ở hồ Hoàn Kiếm.
Loại bỏ tế bào tảo lam trong các quá trình xử lý nước
Một cách đơn giản để giảm thiểu tối đa microcystin trong thủy vực là loại bỏ
các tế bào tảo lam trong phạm vi xử lý nước lớn bằng cách sử dụng các vật cản hạn chế
sự di chuyển của các váng hoặc các dụng cụ vớt để thu gom lượng lớn tế bào. Có
những phương pháp khác để loại bỏ các tế bào tảo lam, được thiết kế để giảm sự phá
vỡ tế bào và giải phóng độc chất. Quá trình xử lý nước sử dụng sự kết tụ (sự động tụ/sự
kết tủa bông) và lọc là có hiệu quả trong loại bỏ các tế bào tảo lam, nhưng các MC hòa
tan được giải phóng từ các tế bào, không được loại bỏ một cách hiệu quả bởi những
phương pháp này [16]. Các chất hóa học tốt nhất cho sự kết tụ là những chất ngăn ngừa
sự phá vỡ tế bào và giải phóng độc chất vào nước. Sự kết tụ liên quan đến việc làm mất
tính ổn định của các thành phần, như là các tế bào tảo lam, bằng cách trung hòa sự trao
đổi bề mặt của chúng, tạo ra sự kết tụ trong một lượng lớn các tế bào. Các chất hóa học
như các hợp chất của bazơ – Fe và bazơ – Al được sử dụng [12]. Chow đã chứng minh
rằng sự kết tủa bông sử dụng FeCl3 không gây phá vỡ các tế bào tảo lam, hoặc làm tăng
hàm lượng MC hòa tan đối với Microcystis aeruginosa và Anabaena circinalis[16].
Hơn nữa, hàm lượng tối ưu của những hợp chất hóa học này trong việc loại bỏ các tế
bào tảo lam mà không làm vỡ tế bào, và gia tăng hàm lượng độc chất ngoại bào [19].
Lọc là một bước quan trọng trong loại bỏ các tế bào tảo lam và các thành phần

vật chất tảo lam. Hầu hết thiết bị lọc thường sử dụng các thành phần như là cát thô,
than antracid nghiền nhỏ, hoặc granit. Phương pháp lọc cát nhanh được sử dụng sau khi
thực hiện quá trình đông tụ, lưu giữ khoảng 14% các tế bào tảo lam được loại bỏ, lọc
chậm có thể loại bỏ tới hơn 85% các tế bào tảo lam cũng như là một lượng đáng kể các
chất độc của chúng, như MC-LR, MC-RR và MC-YR (tốc độ loại bỏ từ 43 đến 99%)
[14]. Tuy nhiên, trong một vài trường hợp xử lý nước có nhiều thực vật có thể lọc mà
không kết hợp cùng keo tụ, và các tế bào tảo lam, nếu có mặt với hàm lượng cao, có
thể gây tắc hệ thống lọc [12]. Đầu lọc không đủ thô để chống lại sự tắc nghẽn một cách
nhanh chóng, sẽ không giữ lại hiệu quả các tế bào tảo lam, trong khi đó đầu lọc tốt đủ
để giữ lại các tế bào sẽ gây tắc nghẽn nhanh chóng trong thời gian ngắn sử dụng. Do
Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

7


Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

đó, phương pháp chỉ lọc thôi thì không được khuyến nghị sử dụng trong việc loại bỏ
các tế bào tảo lam [12].
Tuyển nổi, là một phương pháp xử lý nước thay thế để làm lắng đọng, là
phương pháp hiệu quả đối với việc loại bỏ các vật chất kết tủa, keo tụ ở mật độ thấp,
bao gồm cả các tế bào tảo lam. Tuyển nổi không khí hòa tan (DAF) là một trong những
phương pháp thường được sử dụng để loại bỏ 40-80% tế bào tảo lam [12].
Sự loại bỏ được thực hiện bằng cách sục khí ở áp suất khí quyển trong một bể
tuyển nổi tạo ra một dòng bong bóng nhỏ, tham gia vào làm huyền phù các vật chất
hoặc các tế bào, tạo ra sự trôi nổi hoặc tạo thành các váng nổi trên bề mặt trên các thủy
vực, tại nơi mà chúng có thể sau đó được loại bỏ bằng các thiết bị vớt [16].
1.2. Độc tố mcirocystin (MC)
1.2.1. Đặc điểm, cấu trúc của microcystin
Microcystin (MC) là các peptid vòng, có chứa 7 amino acid, cấu trúc hóa học

(hình 1.3) là vòng (-D-Ala1-X2-D-MeAsp3-Z4-Adda5-D-Glu6-Mdha7). Trong đó, X và
Z là các L-amino acid (như Leucine (L), Arginine (R), Tyrosine (T), Alanine (A), hoặc
Methionine (M)), D-MeAsp là acid D-erytho-β-methylaspartic và Mdha là Nmethyldehydroalanin,

Adda

biểu

thị

3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-

phenyldeca-4,6-dienoic acid [8,11].
Sự thay đổi trong cấu trúc là sự thay đổi vị trí của tất cả 7 amino acid, nhưng sự
thay đổi lớn nhất là sự thay thế của L-amino acid tương ứng ở vị trí 2 và 4, và sự tách
methyl của D-MeAsp và Mdha tương ứng ở vị trí 3 và 7 [8,35]. Các vị trí được thay thế
ở trên tạo ra các chất độc khác nhau trong họ MC. Có hơn 90 biến thể của MC, bao
gồm các biến thể chứa các amino acid và các nhóm thay thế. Trọng lượng phân tử của
MC trong khoảng từ 900 đến 1100 Daltons (trọng lượng phân tử).

Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

8


Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

Hình 1.3. Mô hình cấu trúc hóa học của microcystin [11]
Bốn loại MC được xem xét chính có nhóm amino acid khác nhau ở vị trí X và
Z. MC được đặt tên theo chữ cái viết tắt của các amino acid X và Z ở vị trí thay thế

tương ứng. Các độc tố MC phổ biến nhất là MC – LR, MC – RR và MC –YR. Trong
đó, MC – LR là chất được nghiên cứu nhiều nhất và có tính độc mạnh.
Bảng 1.1. Các amino acid xuất hiện trong cấu trúc của microcystin [11]
Các loại độc tố

Amino acidvị trí X

Amino acid vị trí Z

Trọng lượng phân tử

Microcystin LA

Leucine (L)

Alanine (A)

910,06

Microcystin YR

Tyrosine (Y)

Arginine (R)

1045,19

Microcystin RR

Arginine (R)

Arginine (R)

1038,2

Microcystin LR

Leucine (L)

Arginine (R)

995,17

Hầu hết độc tố MC là những loại có chứa L-amino acid kỵ nước. Sự thay thế
các L-amino acid kỵ nước trong các vị trí X bởi các L-amino acid kỵ nước khác
(alanine, phenylanine hoặc tryptophan) duy trì tính độc, nhưng sự thay thế bởi các
amino acid ưa nước (như arginine) sẽ làm giảm đáng kể độc tính. Các MC có các phần
phân cực (ưa nước) trong các vị trí của các amino acid thay thế, như MC-RR (arginineLê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

9


Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

arginine) và MC-M(O)R (methionine sulfoxyde, arginine), có độc tính thấp nhất. Sự
thay đổi trong những phần còn lại có thể hoặc không ảnh hưởng đến tính độc [8,35,43].

Hình 1.4. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – LR [46]

Hình 1.5. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – RR [46]

MC rất bền và không bị tác động bởi các phản ứng hóa học thông thường như:
phản ứng thủy phân, phản ứng oxy hóa – khử, dưới các điều kiện được tìm thấy trong
hầu hết các thủy vực tự nhiên. Những chất độc này bị phân hủy chậm ở nhiệt độ cao
(khoảng 40oC hoặc 104oF) cùng với pH trong khoảng thấp hơn 1 hoặc cao hơn 9. Các
Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

10


Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

phản ứng thủy phân chỉ xảy ra nhanh khi trong điều kiện phòng thí nghiệm khi thêm
HCl 6M và nhiệt độ cao [43].

Hình 1.6. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – YR [46]
1.2.2. Độc tính của microcystin
MC thuộc nhóm độc tố gan (hepatotoxin), gây xuất huyết gan. Hầu hết các nhận
biết về độc tính của MC là dựa trên những nghiên cứu trên chuột nhắt và chuột cống,
thí nghiệm được tiến hành bằng cách tiêm MC – LR qua màng bụng chuột, hoặc tiêm
trực tiếp vào khoang bụng chuột. Trong các nghiên cứu này, MC gây chết động vật thí
nghiệm chỉ trong vài giờ. Tổn thương gan và sự phá hủy tế bào được quan sát bằng
kính hiển vi sau 20 phút khi tiêm vào động vật thí nghiệm một liều MC gây chết. Trong
vòng 1 giờ, tế bào bị phá vỡ, mất đi các liên kết và cấu trúc bình thường của gan [28].
Các nghiên cứu dịch tễ đã chỉ ra rằng, tiếp xúc với MC trong thời gian dài có
thể gây ra ung thư gan. Trong số các MC, MC-LR là chất độc mạnh, vì vậy tổ chức Y
tế Thế giới (WHO) đã đưa ra mức nồng độ tối đa đối với MC – LR trong nước uống là
1μg/L. Giá trị LD50 _liều lượng gây chết 50% sinh vật thí nghiệm của MC – LR đối với
chuột nhắt thí nghiệm được xác định trong khoảng 25 đến 150 µg/kg trọng lượng cơ
thể (tiếp xúc tiêm qua màng bụng). Giá trị LD50 đối với chuột nhắt trong thí nghiệm
tiếp xúc qua đường tiêu hóa (uống nước) là 5000 µg/kg trọng lượng cơ thể, đối với một

Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

11


Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

chủng chuột nhắt khác thì giá trị LD50 được xác định là 10900 µg/kg trọng lượng cơ
thể, và giá trị cao hơn đối với chuột cống [22].
Chưa nhận thấy MC bị thủy phân trong dạ dày bởi men peptidaza, nhưng một
lượng lớn đáng kể MC – LR đã vượt qua sự ngăn cản của các men trong hệ tiêu hóa để
được hấp thụ vào. LD50 của một số loại MC khác như MC-LA, -YR, -YM tương tự
như của MC-LR, nhưng LD50 của MC-RR cao hơn MC-LR khoảng 10 lần [22].
Một số nghiên cứu đã khuyến nghị rằng MC có khả năng thúc đẩy quá trình tạo
khối u, một số tác nhân có thể không gây ra ung thư nhưng kích thích sự phát triển của
một số khối u. Tháng 6/2006, Cơ quan nghiên cứu Ung thư (IARC) đã xác định rằng
“MC – LR có thể gây ung thư trên người”, nhưng “các chiết xuất của Microcystis
không được phân loại là chất gây ung thư đối với con người”. Tuy nhiên, các MC có
khả năng kích thích sự tăng trưởng của các tế bào ung thư [28].
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của microcystin đến cá [28]
Liều lượng
(µg/kg)

Số
lượng
liều

Thời gian
tiếp xúc (ngày)

Tổng liều
lượng
(µg/kg)

Cá chép
(lớn)

50

28

28

1400

Tổn thương
gan nặng

Cá chép
(chưa lớn)

400

1

1

400

Tổn thương gan
và thận nặng

Cá hồi

550

8

4

4400

Tổn thương
gan nặng

Cá rô

1150

8

4

9200

Tổn thương
gan nặng

Cá rô phi

1200

21

21

25200

Dấu hiệu ức chế
oxy hóa trong gan

Loại cá

Sự ảnh hưởng

MC gây độc theo cơ chế như sau:
MC ức chế protein nhân chuẩn serine/threonine photphotaza I và 2A (thành
phần quan trọng để duy trì cân bằng nội môi trong tế bào) qua tương tác với các nhóm
xúc tác nhỏ của các enzyme. Quá trình phosphoryl và dephosphoryl protein là một quá
trình liên tục thay đổi và là con đường quan trọng trong điều chỉnh hoạt động của
protein trong tế bào. Nó được xúc tác bởi men phosphataza và kinaza, do đó việc
Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

12


Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

không kiểm soát được sự ức chế các enzyme này có thể tác động đáng kể đến cân bằng

nội môi của tế bào. MC có ái lực mạnh đối với PP1 và PP2A. Cơ chế tương tác giữa
MC và PP1 và PP2A gồm 2 bước, đầu tiên chất độc liên kết để làm mất hoạt độ của
enzyme, sau đó hình thành các liên kết cộng hóa trị trong suốt thời gian dài phản
ứng[4].
1.2.2.1. Ảnh hưởng độc hại của microcystin lên các loài động vật thủy sinh
Tác hại đầu tiên khi tảo lam nở hoa làm giảm oxy hoà tan trong nước gây hiện
tượng động vật nổi đầu và chết. Khi nở hoa và chết, chúng sinh độc tố gây độc cho
động vật thủy sinh.Các chất độc ảnh hưởng tới hệ thần kinh, có thể gây chết hoặc gây
ra một số ảnh hưởng khác. Sự tồn dư các độc chất này trong cơ thể chúng gây ngộ độc
cho con người khi sử dụng những động vật thủy sinh làm thực phẩm. Đặc biệt các
động vật hai mảnh là những đối tượng hấp thu và tồn trữ các chất độc này nhiều nhất.
MC thông qua các lưới thức ăn thủy sinh, đi vào các loại cá, tôm, cua, sò, hến
cũng như những người tiêu thụ các loài này. MC không có trong mô của các động vật
có vỏ khi thời gian tiếp xúc là một vài tuần. Các loài vật nuôi, động vật hoang dã tiếp
xúc với MC thông qua nước uống có chứa tảo lam độc hoặc ăn phải các thảm tảo lam.
MC ở trong nước gây độc cho cá ở nồng độ khoảng vài μg/l, thậm chí mức
nồng độ dưới 1μg/l cũng có thể gây độc. Ở các vùng biển khi xảy ra sự nở hoa, nồng
độ MC trong nước đo được lên đến 25000μg/l. Cá thường ăn trực tiếp tảo lam độc hoặc
ăn gián tiếp các loài đã bị nhiễm độc tảo lam. Ở một mức độ thấp hơn, các loài cá có
thể hấp thụ trực tiếp MC từ trong nước. Ngoài ra, MC cũng có thể truyền từ cá mẹ sang
trứng. Gan cá là cơ quan chịu tác động chính khi bị nhiễm độc, MC cũng gây ức chế
hoạt động của protein photphataza, mà protein này có vai trò quan trọng trong quá trình
phát triển của phôi cá. Do khả năng giải độc của cá đối với MC kém nên chúng dễ bị
chết khi nồng độ MC tăng lên.
Trong tự nhiên, cá có thể bị chết sau khi đã tiếp xúc với MC qua vài ngày hoặc
vài tuần. Một số nghiên cứu đã nhận thấy sự tổn thương gan nghiêm trọng trong cá sau
khi uống MC có chứa trong các tế bào tảo lam dạng đông khô.Các loại trai và động vật
phù du thu thập từ những khu vực tảo lam nở hoa có chứa nồng độ MC khoảng từ 2500
Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

13


Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

- 2900 và 13700μg MC/kg trọng lượng cơ thể [23]. Những trường hợp tử vong ở một
số loài chim liên quan đến sự nở hoa của tảo lam độc được nhận thấy ở Mỹ và Canada
vào đầu những năm 1990. Ở California, các loài chim trú đông tại vùng biển Salton bị
nhiễm độc MC có tỷ lệ chết cao. Mức nồng độ MC tìm thấy trong nhiều xác chim
tương đồng với mức nồng độ chất này gây chết chuột thí nghiệm. Ngộ độc MC cũng
gây tử vong và bệnh tật của các loài cò xanh ở vịnh Chesapeake [21].
1.2.2.2. Ảnh hưởng độc hại của microcystin lên cơ thể người
Con đường xâm nhập phổ biến nhất của MC vào trong cơ thể con người là qua
đường tiêu hóa, do trực tiếp sử dụng các loại nước và thực phẩm bị nhiễm bẩn (các sản
phẩm nông nghiệp, cá, tôm và các động vật thân mềm), hoặc gián tiếp tiêu thụ thông
qua các động vật khác đã ăn phải và tích lũy các loài tảo lam độc. Ngoài ra, MC có thể
đi vào cơ thể con người qua con đường hô hấp khi trong không khí có các hạt nước
chứa độc chất khi tham gia các hoạt động liên quan đến nước [21]. Quy trình xử lý
nước không thể loại bỏ hết được MC có mặt trong nguồn cung cấp nước uống được lưu
trữ trong hồ chứa.
Các triệu chứng khi nhiễm độc cấp tính MC: khó thở, đau bụng, gây ra các phản
ứng trên da, và nặng hơn là tổn thương gan. Tảo lam hoặc MC có thể gây ra các mụn
nước, mề đay hay nổi ban ngoài da. Khi nuốt phải các nước nhiễm độc, có thể gây ra
các bệnh về tiêu hóa như: đau bụng, tiêu chảy, buồn nôn, cũng có thể đau đầu và dẫn
tới sốt nặng. Khi hít thở phải những hạt nước hoặc hơi có chứa MC trong không khí có
thể bị chảy nước mắt, nước mũi, ho, đau họng, và một số triệu trứng giống như bệnh
hen suyễn hoặc dị ứng.Tiếp xúc vớilượng lớn MC có thể gây ra tổn thương gan.
MC đã từng gây ra nhiều vụ ngộ độc cấp tính, vụ nhiễm độc MC gây tử vong
nổi tiếng nhất xảy ra ở Brazil vào năm 1996, 116 trong số 131 bệnh nhân ở Caruaru,
Brazil đã bị rối loạn thị giác, buồn nôn, nôn mửa, yếu cơ sau khi lọc máu. Một trăm

người bị ảnh hưởng sau đó đã bị suy gan cấp tính và 52 người cuối cùng đã chết vì các
triệu chứng của căn bệnh, bây giờ được gọi là "Hội chứng Caruaru" [5].

Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

14


Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

1.3. Loại bỏ MC hòa tan trong các quá trình xử lý nước
Quá trình xử lý nước chung như đông tụ, keo tụ, lắng đọng và lọc không hoàn
toàn loại bỏ các MC hòa tan [19]. Chỉ những quá trình xử lý nước như quang phân, khử
ozon, lọc bằng carbon hoạt tính và khử bằng clo có thể loại bỏ hoàn toàn các MC hòa
tan từ nước.
1.3.1. Quang phân
MC tương đối bền vững khi bị chiếu bằng ánh sáng mặt trời nhưng lại bị bẻ gãy
nhanh chóng bằng tia cực tím (UV) với sự hấp thụ cực đại ở bước sóng 238-254 nm.
MC-LR, MC-YR và MC-YA được loại bỏ bằng tác nhân ánh sáng như xúc tác oxy
nguyên tử, bức xạ UV và các chất xúc tác bán dẫn titan dioxyd (TiO2). Các chất độc
này được phân hủy nhanh chóng với thời gian bán hủy ít hơn 5 phút[33]. Tốc độ phản
ứng phụ thuộc mạnh vào sự có mặt của lượng xúc tác TiO2 (0-5g/l). Đánh giá xử lý
trong nước hồ và nước cất cho thấy hiệu quả tốt khi sử dụng nước hồ. Quá trình có tính
khả thi trong nước tự nhiên, mặc dù sự gia tăng mức độ xúc tác (lên đến 5 g/l). Một số
các nghiên cứu đã sử dụng thành công quá trình xúc tác quang học để loại bỏ các MC
trong nước [26].
1.3.2. Quá trình khử bằng ozon
Ozon bền vững với 3 nguyên tử (O3), là một trong những chất oxy hóa mạnh
nhất và được sử dụng rộng rãi trong loại bỏ các chất bẩn hữu cơ và vô cơ trong xử lý
nước (như: các kim loại nặng, phenol và thuốc trừ sâu) và trong khử hoạt tính của các

vi sinh vật (như vi khuẩn và virut) [13]. Do đó, quá trình khử trung gian bằng ozon với
nồng độ 0,5 g/l là cần thiết để loại bỏ các hợp chất độc bao gồm các MC trong nước
[19]. Tuy nhiên, khi liều lượng ozon không đủ sẽ tạo ra các sản phẩm phụ như bromat,
từ phản ứng của ozon với các muối của brom trong tự nhiên sẽ gây ra ảnh hưởng bất lợi
với sức khỏe (như tạo khối u trong các loài động vật) [16].
1.3.3. Khử bằng clo
Khử trùng bằng clo là một trong những bước chủ yếu trong quá trình xử lý nước
[6]. Khử trùng bằng clo, có hiệu quả và kinh tế, thường được sử dụng để khử trùng
nước uống, nước tiêu dùng. Clo phản ứng với phân nửa chất tương tự, giống như ozon
Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

15


Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

(liên kết đôi, hệ thống các than hoạt tính, và các amin trung tính) nhưng tốc độ phản
ứng thấp hơn so với ozon [30].
Nhóm nghiên cứu Himberg đã chứng minh rằng khử trùng bằng clo không có
hiệu quả trong việc loại bỏ các MC ra khỏi nước [15]. Điều này có thể là do các quá
trình xuất hiện ở một mức pH, ở mức mà hàm lượng clo tự do tương đối thấp [25].
Keijola và Himberg đã không ghi nhận các mức pH, nhưng Hoffman đã thực hiện
những điều tra ở mức pH 8,5. Ảnh hưởng của pH đối với sự khử các MC bằng clo đã
được điều tra xâu chuỗi bởi Nicholson và nhóm đồng nghiên cứu vào năm 1994.
Nicholson, Rositano và Burch đã chỉ ra rằng sự phân hủy MC-LR phụ thuộc
vào pH. pH dưới 8, clo lỏng xuất hiện trong sự tạo thành acid hypocloro với hàm lượng
15 mg/l, và có thể phân hủy MC-LR khi mà sự loại bỏ chất độc đã giảm đáng kể với
mức pH lớn hơn 8. Sự suy giảm độc chất cùng với tăng pH là do giảm hàm lượng acid
hypoclorơ (79% ở pH 7, 55%-pH 7,5; 28%-pH 8; 0.4%-pH 10, và 20ºC), là tác nhân
oxy hóa mạnh hơn nhiều so với ion hypoclorit. Một chú ý quan trọng, mức cho phép

sau 30 phút trong quá trình khử trùng theo thứ tự các bước phân hủy độc tố là lượng clo
dư tại mức thấp nhất là 0,5 mg/l [29].
Ảnh hưởng của clo lên sự phân hủy MC-LR và MC-RR, các độc tố dễ dàng
được phân hủy bởi sự kết hợp của clo với muối natri hypoclorit, sự phân hủy phụ thuộc
vào liều lượng clo tự do và pH. Trong suốt quá trình khử bằng clo, nhiều phản ứng từ
các sản phẩm phụ đã được tạo thành, một trong những phản ứng đó là phản ứng tạo
thành microcystin chứa 2 nhóm OH thông qua ion của muối clo ở tại vị trí liên hợp của
Adda, bằng phản ứng thủy phân. Các sản phẩm khác có thể là đồng phân lập thể của nó
hoặc các đồng phân về vị trí. Không có sản phẩm độc nào được phát hiện từ quá trình
khử MC-LR bằng clo. Mặc dù những kết quả này cho rằng khử trùng bằng clo ở liều
lượng clo thích hợp rất có hiệu quả đối với việc loại bỏ các MC, nhưng sự oxy hóa của
chính các tế bào bởi clo phải được phòng tránh, bởi vì nó thường gây ra sự giải phóng
các độc tố từ tảo lam và sự tạo ra các hợp chất halogen hữu cơ (như chloroform, các
trihalomethan khác (THMs), các acid haloacetic (HAAs)…) trong suốt quá trình xử lý
nước [34].

Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

16


Nghiên cứu khả nang phan hủ y microcystin củ a vi khuả n nước Sphingomonas

1.3.4. Lọc bằng carbon hoạt tính
Lọc bằng carbon hoạt tính là có hiệu quả nhất trong việc loại bỏ các gây nhiễm
bẩn hữu cơ từ nước [26]. Tại Mỹ, việc áp dụng lọc bằng carbon hoạt tính trong xử lý
nước đã được sử dụng trong loại bỏ các chất nhiễm bẩn không mong muốn như là các
hợp chất gây ô nhiễm mùi và vị, các loại thuốc trừ sâu và các hợp chất độc khác, bao
gồm MC từ nước [6]. Carbon hoạt tính có khả năng hấp phụ một khoảng rộng các hợp
chất bởi cấu trúc lỗ xốp của nó, với sự thay đổi rộng trong kích thước lỗ (các vi lỗ có

kích thước < 2nm, các lỗ trung bình 2-50nm và các lỗ lớn > 50nm). Sự hấp thu nội
phân tử trong các lỗ nhỏ nhất tạo ra các đơn vị hấp thụ, làm cho các phân tử lớn và nhỏ
của các chất nhiễm bẩn hòa tan được cô đặc và được lắng xuống từ dung dịch đi vào
trong các lỗ chứa các phân tử [6].
Hai dạng khác nhau của carbon hoạt tính: carbon hoạt tính dạng bột (PAC) và
carbon hoạt tính dạng hạt (GAC) được sử dụng trong xử lý nước cũng như là loại bỏ
các MC [41]. GAC được sử dụng rộng rãi trong các dòng thông qua các cột phản ứng,
trong khi PAC có thể được thêm trực tiếp vào nước trước để tạo sự đông tụ hoặc lọc
[25]. Tuy nhiên, GAC có các lợi hơn PAC như vòng đời của nó dài, khả năng hấp phụ
cao hơn, dễ dàng kiểm soát quá trình, thể hiện các tính chất của carbon hiệu quả hơn,
và có thể tái sử dụng carbon [17].
Carbon hoạt tính cũng như khử trùng bằng ozon là các công cụ xử lý nước tốt
nhất trong việc loại bỏ các MC trong nước [30]. Việc ứng dụng carbon hoạt tính trong
loại bỏ các độc tố tảo lam, bao gồm các MC được tạo ra bởi tảo lam M.aeruginosa, đã
được thực hiện bởi Hoffmann. Quá trình xử lý nước như đông tụ, keo tụ, lọc và khử
trùng bằng clo không còn hiệu quả khi dùng để loại bỏ các độc tố, khi đã sử dụng quá
trình xử lý nước với than hoạt tính nhưng sự loại bỏ phụ thuộc vào các mức liều lượng
của than hoạt tính. MC được loại bỏ bởi các bước xử lý đông tụ thông thường và thậm
chí việc thêm vào một lượng nhỏ PAC cùng với các hóa chất đông tụ không làm tăng
đáng kể hiệu quả loại bỏ các MC. Sự loại bỏ một cách đáng kể các độc tố đã được giữ
lại bởi GAC và khử trùng bằng ozon trong phòng thí nghiệm và các thí nghiệm ngoài
thực địa. 20mg/l PAC có thể giữ lại khoảng 90% các MC xử lý, kết hợp với xử lý đông
tụ và trầm tích hóa thông thường và khử trùng bằng ozon bước đầu và loại bỏ thành
Lê Thị Huệ 12B.KTMT.KH

17