Thiết kế vector và bước đầu biểu hiện interleukin 7 ở cây thuốc lá

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE INTERLEUKIN 7 VÀ
BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN PROTEIN Ở CÂY THUỐC LÁ
Mã số: ĐH2014-TN05-01

Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Huy Hoàng

THÁI NGUYÊN - 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE INTERLEUKIN 7 VÀ
BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN PROTEIN Ở CÂY THUỐC LÁ
Mã số: ĐH2014-TN05-01

Xác nhận của tổ chức chủ trì
(ký họ tên, đóng dấu)

THÁI NGUYÊN - 2017

Chủ nhiệm đề tài

(ký, họ tên)


i
DANH SÁCH THÀNH VIÊN, ĐƠN VỊ THAM GIA ĐỀ TÀI
I. Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu
STT

Họ và tên

Đơn vị công tác

1

ThS. Nguyễn Huy Hoàng

Đại học Y Dược - ĐHTN

2

PGS. TS. Lê Văn Sơn

Viện Công nghệ Sinh học

3

TS. Phạm Bích Ngọc

Viện Công nghệ Sinh học

4

TS. Nguyễn Thu Hiền

Đại học Y Dược - ĐHTN

5

TS. Nguyễn Thị Thu Ngà

Đại học Sư phạm - ĐHTN

II. Đơn vị phối hợp chính
STT
1

Tên đơn vị
Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Họ tên người đại diện
PGS. TS. Chu Hoàng Hà


ii

MỤC LỤC

DANH SÁCH THÀNH VIÊN, ĐƠN VỊ THAM GIA ĐỀ TÀI .................... I
MỤC LỤC ....................................................................................................... II

DANH MỤC NHỮNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ........................... III
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................ IV
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................VII
THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................VII
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3
1.1. Interleukine 7 ........................................................................................ 3
1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các loại cytokine tái tổ hợp trong
y học..................................................................................................................7
1.2.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới............................. 7
1.2.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước............................... 9
1.3. Nghiên cứu biểu hiện interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá....10
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 15
2.1. Vật liệu.................................................................................................15
2.1.1. Vật liệu thực vật ............................................................................ 15
2.1.2. Các chủng vi khuẩn ....................................................................... 15
2.1.3. Các gene và vector ........................................................................ 15
2.1.4. Hóa chấ t và thiế t bi ̣máy móc........................................................ 15
2.1.5. Các loại mồi sử dụng trong nghiên cứu ........................................ 16
2.1.6 . Điạ điể m và thời gian nghiên cứu ................................................ 16
2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................17
2.2.1. Phương pháp thay đổi mã di truyền gene interleukin 7 tối ưu biểu
hiện ở thực vật ......................................................................................... 18


2.2.2. Thiết kế mồi .................................................................................. 19
2.2.3. Thiết kế vector chuyển gene mang gene interleukin 7 tái tổ hợp . 19
2.2.5. Phân tích các dòng chuyể n gen bằ ng kỹ thuật sinh ho ̣c phân tử .. 24
2.2.6. Tinh sạch protein tái tổ hợp interleukin 7 ..................................... 26
2.2.7. Đánh giá hoạt tính protein interleukin 7 tái tổ hợp ....................... 28

2.2.8. Phân tích thố ng kê kế t quả thực nghiệm ....................................... 29
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................... 30

3.1. Thay đổi mã di truyền gene interleukin 7 tối ưu biểu hiện ở thực vật30
3.2. Thiết kế vector chuyển gene interlukin 7 tái tổ hợp vào cây thuốc lá 32
3.2.1. Thiết kế vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP ............. 32
3.2.2. Thiết kế vector chuyển gene pCB301 35S/IL7-histag-cmyc100xELP .................................................................................................. 34
3.3. Biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá bằng
phương pháp Agro-infiltration......................................................................36
3.4. Đánh giá biểu hiện tạm thời protein IL-7 tái tổ hợp..........................39
3.5. Phân tích định lượng và tinh sạch protein IL-7 tái tổ hợp................39
3.6. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein IL-7 tái tổ hợp ..................44
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................. 46
4.1. Biểu hiện tạm thời protein interleukin 7 tái tổ hợp ở cây thuốc lá...46

4.2. Tăng cường biểu hiện protein ở thực vật với ELP và tinh sạch mITC 47
KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ ............................................................... 50
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI....... 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 52
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 68


iii
DANH MỤC NHỮNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Ký tự

Nghĩa tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt

35S

Promoter CaMV 35S

A. tumefaciens

Agrobacteria tumefaciens

bp

Base pairs

Cặp bazơ

BSA

bovine serum albumin

Dung dịch protein chuẩn

cDNA

Complementary DNA

Complementary DNA

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

E.Coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

Axit ethylenediaminetetraacetic

Enzym-linked

Kỹ thuật phát hiện kháng nguyên

immunosorbent assay

trong mẫu xét nghiệm

ELISA
ELP

elastin-like peptide

hIL-7

human interleukin 7

interleukin 7 của người

HRP

Horseradish Peroxidase

Horseradish Peroxidase

IFN

Interferon

IL

Interleukin

IMAC

Immobilized Metal ion Affinity
Chromatography

kb

Kilo base

kDa

Kilo danton

mITC

membrane-based Inverse
Transition Cycling

Sắc kí ion cố định kim loại

Đảo ngược theo màng

OD

Optical Density

Mật độ quang

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

RNase

Ribonuclease

Enzyme ribonuclease

rpm

Revolutions per minute

Vòng/phút

scFv

Single-chain variable fragment

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis

TCR

T-cell receptor

Thụ thể kháng nguyên tế bào T

WT

Wild type

Chủng hoang dại


iv

DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Tên bảng

Trang

1.1

Một số cytokine tái tổ hợp biểu hiện ở thực vật

11

2.1

Trình tự mồi sử dụng trong đề tài

16

2.2

Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn

20

2.3

Thành phần phản ứng lai

20

2.4

Thành phần gel SDS-PAGE

25

3.1
3.2

Hiệu suất thu hồi protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp
mITC
Kết quả hoạt hóa dòng tế bào 2E8 bằng interleukin 7

43
45


v

DANH MỤC CÁC HÌNH
STT

Tên hình

Trang

1.1

Cấu trúc protein Interleukin 7 người

3

1.2

Thụ thể interleukin 7

4

2.1

Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

17

3.1

Trình tự gene interleukin 7 trước và sau khi thay đổi mã di truyền

31

3.2

Cấu trúc vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

32

3.3

3.4

3.5

3.6
3.7
3.8

3.9

Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gene
pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP
Kết quả điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gene
pCB301/IL7/100xELP
Kết quả kiểm tra vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP
bằng enzyme NcoI
Kết quả colony PCR bằng cặp mồi đặc hiệu
IL7_BamHI_F/IL7_BamHI_R
Kết quả cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn NcoI
Quá trình biến nạp pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào
cây thuốc lá
Kiểm tra biểu hiện protein IL-7 tái tổ hợp trong lá thuốc lá bằng
Western blot

33

35

36

37

38
39

40

3.10 Kết quả tinh sạch và định lượng protein IL-7 bằng phương pháp IMAC

41

3.11 Kết quả tinh sạch protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp mITC

43

3.12 Định lượng protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp lai miễn dịch

44

3.13 Hoạt tính sinh học của protein IL-7 tái tổ hợp

46


vi
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
Đơn vị: Trường Đại học Y Dược
THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Thông tin chung:
Tên đề tài: Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh
giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá
Mã số: ĐH2014-TN05-01

Chủ nhiệm: ThS. Nguyễn Huy Hoàng
Cơ quan chủ trì: Đại học Y Dược Thái Nguyên
Thời gian thực hiện: 2014 - 2017
2. Mục tiêu:
Thiết kế được vector chuyển gene thực vật mang gene interleukin 7 tái
tổ hợp.
Tạo được cây thuốc lá biểu hiện protein interleukin 7
3. Kết quả nghiên cứu:
Thiết kế được 2 cấu trúc vector chuyển gene và biểu hiện protein tái tổ
hợp ở thực vật.
Biểu hiện thành công protein ở thực vật bằng phương pháp Agroinfiltration.
Đã đánh giá được hoạt tính sinh học của protein IL-7 tái tổ hợp.
4. Sản phẩm:
4.1. Sản phẩm khoa học:
03 bài báo đăng các tạp chí khoa học.
4.2. Sản phẩm đào tạo:
Đào tạo 01 nghiên cứu sinh.


4.3. Sản phẩm ứng dụng
01 quy trình thiết kế vector tái tổ hợp mang gene mã hóa protein
interleukin 7 và sản phẩm vector tái tổ hợp.
01 quy trình biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn Agrobacterium.
01 quy trình biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật bằng phương pháp
Agro-infiltration.
5. Hiệu quả:
Khoa học công nghệ: Đề tài hoàn thành sẽ góp phần hoàn thiện các
phương pháp sản xuất protein interleukin 7 tái tổ hợp phục vụ trong y học
Thông tin: Cung cấp những thông tin về giá trị của các loại cytokin nói
chung và interleukin, trong đó có interleukin 7 nói riêng trong hệ thống miễn

dịch của con người
Đào tạo, bồi dưỡng nhân lực: Đào tạo 1 tiến sỹ sinh học
Nâng cao năng lực nghiên cứu của những người tham gia, đặc biệt với
chủ nhiệm đề tài.
Bổ sung 01 tài liệu tham khảo phục vụ cho việc nghiên cứu, giảng dạy
và học tập của học viên, sinh viên chuyên ngành Di truyền học.
6. Khả năng áp dụng và phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu:
Đề tài đã cung cấp quy trình biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp ở
cây thuốc lá chuyển gene trong quy mô phòng thí nghiệm, phục vụ cho mục
đích nuôi cấy thu sinh khối tế bào.
Bước đầu đánh giá được hoạt tính sinh học của protein interleukin 7 tái
tổ hợp thu được sau khi tinh sạch, là tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn.
Ngày 14 tháng 7 năm 2017
Cơ quan chủ trì
(ký, họ và tên, đóng dấu)

Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ và tên)


vii

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS

1. General information:
Project title: Research on expressing the recombinant interleukin 7
protein in plant culture systems
Code number: ĐH2014-TN05-01
Coordinator: Nguyen Huy Hoang, MA
Implementing institution: Thai Nguyen university of Medicine and

Pharmacy
Duration: from 2014 to 2017
2. Objective(s):
- Design the recombinant interleukin 7 encoded gene transferred the
plant culture systems culture systems.
- Generates tobacco expressing protein interleukin 7.
3. Research results:
- Design of two transgenic vector constructs and recombinant protein
expression in plants.
- Successfully expression of protein in plants by Agroinfiltration.
- The recombinant IL-7 protein was evaluated bioactivity
4. Products:
4.1. Scientific product:
03 articles published scientific journals.
4.2. Training product:
Train 01 doctoral.
4.3. Application product:
01 recombinant vector design process carrying genes encoding
interleukin 7 protein and recombinant vector product.
01 recombinant vector transformation process into Agrobacterium.


01 process of recombinant protein expression in plants by method
Agroinfiltration.
5. Effects:
Science and Technology: The completed project will contribute to the
improvement of the methods of recombinant interleukin 7 production in
medicine.
Information: Provides information on the value of cytokines and
interleukins, including interleukin 7 in particular in human immune systems.

Training and retraining of human resources: To train a doctoral in
biology.
Improve the research capacity of the participants, especially the leader.
Additional 01 reference material for the research, teaching and learning
of students, specialized students in Genetics.
6. Transfer alternatives of reserach results andapplic ability:
The subject has provided a process for expression of interleukin 7
recombinant protein in transgenic tobacco plants in a laboratory scale for cell
culture purposes.
Initial evaluation of the bioactivity of the recombinant interleukin 7
protein obtained after purification, is the premise for further research.


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay, khi chất lượng cuộc sống được nâng cao thì vấn đề chăm sóc
sức khỏe ngày càng được quan tâm, coi trọng. Tuy nhiên, hiện nay con người
đang phải đối mặt với rất nhiều bệnh nguy hiểm như HIV, AIDS, tiểu đường,
SARS, ebola v.v…. Trong khi đó, việc điều trị chủ yếu là sử dụng thuốc theo
từng giai đoạn diễn biến của bệnh nên tính hiệu quả không cao và chỉ mang
tính cầm cự.
Interleukine là một nhóm các cytokine được tìm thấy đầu tiên trong các
tế bào bạch cầu. Chức năng của hệ thống miễn dịch ở người phụ thuộc chủ yếu
vào các Interleukine. Trong đó, nhóm Interleukine 7 (IL-7) là một cytokine có
vai trò chính trong sự tăng trưởng của các dòng tế bào B và T [3]. Đây là những
dòng tế bào có chức năng quan trọng trong hệ miễn dịch của con người, cũng
là những tế bào đích tấn công của các virus, mầm bệnh khi xâm nhập vào cơ
thể con người.

Trong y học ngày nay, các protein có hoạt tính sinh học được sử dụng
rộng rãi để làm thuốc điều trị như các loại hormone, enzyme tái tổ hợp... Trước
đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein này chủ yếu là tách chiết
từ các bộ phận của động vật. Tuy nhiên, do nhu cầu ngày càng cao trong khi
nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thành lại đắt và dễ nhiễm các mầm
bệnh nguy hiểm cho con người. Do đó, việc tổng hợp protein tái tổ hợp được
đặt ra một cách cấp thiết.
Trong những thập niên gần đây, với những bước tiến lớn trong lĩnh vực
công nghệ sinh học phân tử, việc tổng hợp protein không còn khó khăn như
trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học. Mặc dù một số protein có thể tổng
hợp bằng con đường hoá học song phương pháp tổng hợp sinh học thể hiện tính


2

tối ưu và thực tiễn cao. Thực tế hiện nay phương pháp này đã được áp dụng
rộng rãi không những để tổng hợp một số loại protein làm thuốc như insulin,
hormone tăng trưởng v.v…. mà còn để tổng hợp rất nhiều hợp chất khác trong
khi nguồn nguyên liệu hạn chế hoặc con đường tổng hợp hoá học gặp khó khăn.
Hiện nay, biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật đang được quan tâm
nghiên cứu vì những ưu điểm vượt trội so với các hệ thống biểu hiện khác như
chúng có thể sinh trưởng trên môi trường tương đối đơn giản, protein được tiết
ra môi trường nhiều hơn phần tích luỹ trong tế bào nên việc thu hồi và tinh sạch
dễ thực hiện, đặc biệt protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật an toàn cho con
người hơn so với các protein có nguồn gốc từ các hệ thống nuôi cấy khác do
các mầm bệnh và virus thực vật không phải là tác nhân gây bệnh ở người.
Nhằm mục đích nâng cao chất lượng điều trị bệnh theo hướng sử dụng
liệu pháp sinh học và góp phần hoàn thiện các phương pháp nghiên cứu sản
xuất các cytokine nói chung và interleukine 7 nói riêng một cách tối ưu. Căn
cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương pháp khả thi, chúng

tôi quyết định lựa chọn thực hiện đề tài luận án: “Thiết kế vector chuyển gene
interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Thiết kế được vector chuyển gene thực vật mang gene interleukin 7.
Tạo được cây thuốc lá biểu hiện protein interleukin 7
3. Nội dung nghiên cứu
Tối ưu mã di truyền gene interleukin 7 biểu hiện ở thực vật.
Thiết kế gen mã hóa interleukine 7 tái tổ hợp vào vector chuyển gen phù
hợp với hệ thống nuôi cấy thực vật.
Chuyển cấu trúc gen vào cây thuốc lá
Phân tích, đánh giá chất lượng interleukine 7 tái tổ hợp thu được.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Interleukine 7
IL-7 gồm một chuỗi glycoprotein xoắn 4α, có khối lượng phân tử 17,4
kDa và được ổn định bằng gốc N - glycosyl hóa hoặc O - glycosyl hóa và cầu
nối disulfide nội phân tử [102]. Ở người, gen hIL-7 có kích thước 33Kb, gồm
có 6 exon và 5 intron nằm trên nhiễm sắc thể số 8, ở vị trí 8q21.13. Cấu trúc
phân tử của hIL-7 được giữ vững ngay cả khi nồng độ pH có sự biến động mạnh
(2,1 - 8,0) [18]. Tuy nhiên, hIL-7 sẽ mất hoạt tính sinh học khi bổ sung 2mercaptoethanol, điều này cho thấy tầm quan trọng của các liên kết disulfide
có trong cấu trúc phân tử hIL-7 [7].

Hình 1.1. Cấu trúc protein hIL-7
(Nguồn: Wikipedia, 2017) [98].
hIL-7 lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1988 bởi công ty Immunex
[58] và cDNA được nhân bản đầu tiên vào năm 1989 [59]. hIL-7 có vai trò quan
trọng trong hệ bạch huyết do có khả năng thúc đẩy sản sinh các tế bào bạch cầu

lympho ở chuột bị nhiễm bệnh [54], [55].
hIL-7 chủ yếu được sản xuất bởi tuyến ức [58], [99]. Ngoài ra, các tế bào
khác như các tế bào tủy [26], nội mạc ruột [97] và tế bào sừng trên da [31] cũng
có thể sản xuất IL-7. Gần đây, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hIL-7 còn được


4

sản xuất bởi các tế bào nguyên bào sợi lưới (FRC) trong vùng tế bào T của hạch
bạch huyết [47].
hIL-7 có hai thụ thể (IL-7 receptor) là IL-7Rα và thụ thể γc. Trong đó,
thụ thể IL-7R (CD127) cũng là thụ thể của các lymphopoietin mô đệm tuyến
ức (TSLP) [107] và chuỗi  (CD132) là thụ thể của IL-2, IL-9, IL-15 và IL-21
[15], điều này cho thấy mối quan hệ chặt chẽ giữa các cytokine trong hệ miễn
dịch người [22]. Trong khi thụ thể c thường thấy ở các tế bào tạo máu thì IL7R lại thấy ở trên bề mặt các tế bào bạch huyết. Gen mã hóa cho protein thụ
thể hIL-7 nằm ở vị trí 5p13 trên nhiễm sắc thể số 5, gần với vị trí của thụ thể
hormone tăng trưởng prolactin và một gen ức chế ung thư tế bào bạch cầu có
đặc điểm tín hiệu tương tự như thụ thể IL-7 [31].
Trọng lượng phân tử của protein thụ thể IL-7 là 80 kDa. Chuỗi γc là
thành phần chức năng và có vai trò góp phần làm tăng liên kết giữa hIL-7 và
IL-7 receptor. Protein IL-7Rα tồn tại ở hai dạng: dạng liên kết với màng và
dạng hòa tan. Các đồng vị màng (p64) cũng được liên kết với IL-2Rγc [31].

Hình 1.2. Thụ thể interleukin 7
(Nguồn: Wikipedia, 2017) [98]


5

Janus kinase-3 (Jak3) gắn chọn lọc với các chuỗi c [89] trong khi Jak1

gắn với IL-7R [76]. Sự đột biến ở chuỗi c [13], [20], [64] hoặc Jak3 [9], [62],
[70] gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải trầm trọng ở người, đặc
trưng bởi sự thiếu hụt lympho T và NK [63]. Khi hIL-7 gắn với IL-7R mang
theo chuỗi c liên kết với Jak1 và Jak3, điều này làm hoạt hoá kinase và
phosphoryl hoá các vị trí Y449 quan trọng trên IL-7R [33]. Sau đó, các thụ
thể trở thành điểm bám cho protein Stat5 qua sự tương tác SH2phosphothyrosine để thực hiện các chức năng. Các tiểu đơn vị p85 của
PI3Kinase liên kết trực tiếp với Y449 phosphoryl hoá thông qua vùng SH2. Các
PI3K được đưa qua màng tế bào và hoạt hoá các gen PDK1 và Akt [85]. Akt
sau đó sẽ phosphoryl hoá gen điều tiết chuyển hoá tế bào, sự tiến triển của chu
kì tế bào như GSK3, P27. hIL-7 điều khiển quá trình này bằng việc phosphoryl
hoá GSK3, làm ngăn cản quá trình phosphoryl hoá các phân tử tín hiệu của tế
bào -catein, cản trở sự suy thoái và kết hợp với các yếu tố phiên mã khác như
TCF/LEF-1, giúp một số gen được biểu hiện [57].
hIL-7 có tính đặc hiệu cao với IL-7 receptor. Sweeney và cộng sự đã
chứng minh yếu tố DAB389 gây độc tế bào chỉ hoạt động với tế bào có IL-7
receptor, điều này rất có ý nghĩa trong vấn đề trị liệu nhằm chống lại các khối
u ác tính mang IL-7 receptor. Sự biểu hiện của IL-7 receptor cũng có thể được
coi là mục tiêu điều trị trong các khối u ác tính [90].
Tuy nhiên, hIL-7 cũng được chứng minh có khả năng tạo ra các tín hiệu
khác khi truyền thông tin trong các tế bào không có sự xuất hiện của IL-7R bởi
khả năng đặc hiệu với các thụ thể bề mặt khác như Flt-3 và c-kit [26].
Hoạt tính sinh học của hIL-7
hIL-7 có chức năng chủ yếu là hỗ trợ cho sự tăng trưởng và chống lại các
yếu tố phá hủy các tế bào lympho B và lympho T, thúc đẩy sự tăng trưởng của
tế bào lympho B gốc [104] và kích thích tế bào lympho B và lympho T phát


6

triển [7], [18]. hIL-7 giúp tăng cường sự phát triển của tế bào thực bào tự nhiên

và thúc đẩy sự tăng trưởng và khác biệt của các dòng tế bào lympho T [71],
[75], [86], đồng thời tăng cường hệ thống, kích thích sự hoạt động của bạch cầu
đơn nhân máu ngoại vi [7]. hIL-7 có thể tăng tốc độ sản sinh bạch huyết trong
trạng thái giảm bạch cầu lympho như ở những bệnh nhân AIDS [26], [64] hoặc
sau khi hóa trị liều cao hoặc xạ trị [57, [57].
Morrissey (1991) đã chỉ ra rằng tế bào lympho T đáp ứng với phorbal
myristate acetate trong thụ thể của hIL-7 thay vì trải qua quá trình apoptosis.
Apoptosis hay quá trình chết của tế bào theo một chu trình là một quá trình
phức tạp của các hoạt động thông qua trung gian hoặc mất yếu tố tăng trưởng
cytokine cần thiết hoặc do sự tham gia của một thụ thể chết với TNF. Ví dụ khi
loại bỏ p53 ở gen ức chế khối u trong Rag-1-/- ở chuột, quá trình apoptosis bị
chặn lại, tế bào lympho T ban đầu sẽ sống sót lâu hơn mà không có một chức
năng TCR cụ thể [54]. Do đó, nhiều khả năng đây là một chức năng quan trọng
của hIL-7 để ngăn chặn tế bào gốc từ tuyến ức trải qua quá trình apoptosis.
Cytokine sử dụng chuỗi γc trong các thụ thể của chúng, chẳng hạn như IL-2,
IL-4, IL-9 và IL-15 để có thể tồn tại trong điều kiện nhất định. hIL-7 có thể
duy trì khả năng tồn tại của tế bào bằng cách ngăn cản yếu tố “gây chết” hoặc
kích hoạt yếu tố “thúc đẩy sự sống” [55].
Mặt khác, hIL-7 có thể hoạt hóa các tế bào T chống lại quá trình
apoptosis bằng cách nâng cao mức độ hoạt động của các protein chống
apoptosis như Bcl-2 và Bcl-XL [7], [22]. Ngoài ra, hIL-7 ngăn chặn tế bào chết
bằng cách ức chế một số protein pro-apoptosis như Bid, Bad hoặc Bax [57,
[37], [67] và có thể hoạt động như một đồng yếu tố với gen V, D, J tái tổ hợp
để thực hiện các phản ứng của các chuỗi TCR trong sự hiện diện của hIL-7 tái
tổ hợp [97]. Đặc biệt, hIL-7 cũng đóng góp vào quá trình cân bằng nội môi của
tế bào T CD8+ ở các tế bào lymphopenic và có thể thay thế cho sự thiếu hụt của
IL-15 [83]; làm tăng khả năng sinh kháng thể chống ung thư [72].


7

Hiện nay, hIL-7 được nghiên cứu ứng dụng nhiều trong điều trị bệnh như
bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính [35], [80], bệnh cúm A [4], một số bệnh
tự miễn [14]; được sử dụng là yếu tố chỉ thị một số bệnh như viêm đường mật
cấp tính [88], ung thư đại trực tràng (CRC) [44], bệnh viêm gan B [105] v.v…
đã thu được nhiều kết quả khả quan.
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CÁC LOẠI
CYTOKINE TÁI TỔ HỢP TRONG Y HỌC
1.2.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới
Cytokine đầu tiên được phát hiện là interferon vào năm 1957, là một
cytokine có hoạt tính chống virus. Trong những thập niên vừa qua, các nghiên
cứu và hiểu biết về vai trò sinh lý cũng như sinh lý bệnh của cytokine đã đạt
được những thành tựu đáng kể. Cytokine tham gia vào rất nhiều quá trình sinh
học trong cơ thể như tạo phôi, sinh sản, tạo máu, đáp ứng miễn dịch, viêm.
Ngoài ra, các phân tử này cũng đóng vai trò quan trọng trong các bệnh lý như:
bệnh tự miễn, nhiễm trùng huyết, ung thư, các bệnh lý viêm mạn tính (viêm đại
tràng mạn, bệnh Crohn, viêm đa khớp dạng thấp, bệnh vảy nến...), viêm gan
siêu vi, nhiễm HIV v.v... Các cytokine cũng được sử dụng là các tác nhân trị
liệu (yếu tố tạo khóm tế bào hạt được sử dụng trong huyết học) hay là các đích
điều trị (như TNF trong bệnh Crohn, viêm đa khớp dạng thấp v.v...).
Vì vậy hiện nay, việc nghiên cứu và sử dụng các loại cytokine tái tổ hợp
đang mở ra một hướng điều trị tích cực mới trong y học. Hàng loạt các cytokine
khác nhau đã được nghiên cứu, sản xuất và thử nghiệm trong điều trị lâm sàng
như: hIL-2, hIL-7, IFN-, G-CSF, GM-CSF, hIL-11 và EPO [45], [50]. Ngoài
ra, còn có một số loại cytokine khác đã được sử dụng nhưng còn hạn chế do
chưa kiểm soát được khả năng thải loại cũng như các hiệu ứng phụ khác như
TNF-, hIL-12 v.v…
Các loại cytokine có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu
và không đặc hiệu, do đó các hướng nghiên cứu hiện nay tập trung vào tác dụng

8

điều trị của cytokine như là một tác nhân dược lý hoặc đích tác động theo bốn
hướng chính:
Dùng các chất đối vận với các cytokine được xem là có vai trò gây bệnh.
Sử dụng các kháng thể kháng cytokine như kháng thể kháng TNF  trong điều
trị nhiễm trùng huyết hoặc ức chế hIL-6 trong viêm đa khớp dạng thấp v.v…
Dùng các cytokine để kích thích các hoạt động sinh lý của cơ thể:
erythropoietin trong điều trị thiếu máu, các yếu tố kích thích tạo khóm trong
điều trị giảm bạch cầu v.v…
Sử dụng cytokine trong liệu pháp điều hoà miễn dịch, tự miễn dịch. hIL6, hIL-7 được xác định như một yếu tố biệt hóa tế bào B, đóng một vai trò quan
trọng trong sự phát triển của các tế bào B huyết tương sản xuất kháng thể. hIL6 kích hoạt tế bào B qua hoạt tính của chúng trên các nguyên bào huyết tương
và gần đây đã cho thấy gián tiếp kích hoạt tế bào B sản xuất kháng thể bằng
cách hoạt hóa các tế bào T CD4 có đặc tính hỗ trợ tế bào B thông qua sự sản
xuất IL-21 v.v…
Dùng cytokine trong điều trị nhiễm virus, bệnh ung thư: điều trị viêm
gan bằng interferon, hIL-12 [27], [38], điều trị ung thư bằng hIL-2 v.v…
Một số thành tựu trong nghiên cứu và ứng dụng cytokine trong điều trị
bệnh như: hIL- 11 và hIL-3 được sử du ̣ng để điều trị bệnh thrombocytopenia
do chúng có khả năng kích thích sự ta ̣o thành tiể u cầ u [82]. hIL-2 được sử dụng
để điều trị một số bệnh ung thư như ung thư biểu mô, ung thư mạch bạch huyết,
đặc biệt là ung thư thận và da; hIL-7 được ứng dụng giúp hồi phục mạch bạch
huyết sau khi phẫu thuật, sử dụng trong các bệnh suy giảm hệ miễn dịch như
HIV/AIDS do có khả năng bảo vệ và thúc đẩy sản sinh các tế bào bạch cầu
lympho T CD4+ và T CD8+. hIL-12 được sử dụng để làm tá chất cho sản xuất
vaccine [6], [8].
Interferon là một nhóm trong số các nhóm chính của cytokine cũng có
nhiều nghiên cứu và ứng dụng trong y học. Từ năm 1991, FDA đã đồng ý cho

9

sử dụng một số loại IFN để chữa một số bệnh do virus như HBV, HCV. Những
sản phẩm này gồm có interferon 2b (Intron A), interferon 2b (Roferon,
infergen) và peginterferon (PEG-IFN). Đặc biệt, IFN có thể được đưa vào cơ
thể bằng đường miệng với một liều lượng thấp hơn nhưng cho hiệu quả cao
hơn đường tiêm [11].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước
Trong bối cảnh hiện nay, Bộ Y tế rất khuyến khích việc nghiên cứu tự
sản xuất thuốc trong nước với giá thành rẻ và chất lượng tốt để chữa bệnh.
Cùng với những ưu điểm của các loại cytokine nói chung cũng như IL nói
riêng, ở Việt Nam đã và đang có một số công trình nghiên cứu, chuyển giao
công nghệ về việc sản xuất và ứng dụng các loại cytokine trong điều trị bệnh
cho con người.
Trong đó, nổi bật nhất là công trình nghiên cứu và sản xuất interleukin2 ứng dụng trong điều trị bệnh ung thư năm 2010 do PGS. TS. Trương Nam
Hải, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam thực hiện đã thu được protein hIL-2 tái tổ hợp có độ tinh sạch 95% và có
hoạt tính tốt, đang được triển khai sản xuất ở quy mô công nghiệp [1]. Điều này
mở ra triển vọng rất lớn đối với bệnh nhân ung thư, khi theo đánh giá của tổ
chức y tế thế giới WHO thì Việt Nam hiện đứng trong 50 nước top 2 của bản
đồ ung thư thế giới khi mỗi ngày có khoảng 315 người chết vì ung thư [100].
Ngoài ra, trung tâm Công nghệ sinh học TP. HCM đang tiến hành các
nghiên cứu về cytokine hIL-33, thuộc họ cytokine tiền viêm hIL-1 (IL-1β, IL1α, IL-1Ra, hIL-18, hIL-33) được phát hiện vào năm 2005. Cytokine hIL-33
giữ vai trò kích hoạt hệ thống miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thích ứng của
cơ thể chống lại tác nhân xâm nhiễm. Ức chế hoạt động của hIL-33 có thể là
liệu pháp tiềm năng cho việc điều trị các bệnh tự miễn như thấp khớp, hen
suyễn, dị ứng quá mẫn v.v…, hIL-33 là một cytokine ít được nghiên cứu trên
thế giới nhưng Việt Nam đã thành công trong việc thử nghiệm ứng dụng điều

10

trị hen suyễn ở chuột. Hiện nhóm nghiên cứu của trung tâm Công nghệ sinh
học TP. HCM đang hướng đến mục tiêu tạo ra thuốc trị bệnh tự miễn như các
loại thuốc ngoại nhập đang có mặt trên thị trường, từng bước tiến đến tự sản
xuất thuốc phục vụ cho nhu cầu trong nước [2].
1.3. NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN INTERLEUKIN 7 TÁI TỔ HỢP TRONG
CÂY THUỐC LÁ
Sự phát triển của công nghệ DNA tái tổ hợp và thực vật chuyển gen đã
tạo nền tảng cho việc sản xuất protein từ thực vật hoặc tế bào thực vật. Những
kết quả đầu tiên đã được công bố từ thập niên 80 của thế kỷ 20 [5]. Việc sản
xuất thành công hormone tăng trưởng của người trong cây thuốc lá và hạt hướng
dương [10]; albumin trong thuốc lá và khoai tây [87] đã cho thấy hệ thống nuôi
cấy thực vật có thể được sử dụng để sản xuất các protein của động vật có vú,
trong đó có con người.
Erythropoietin là một trong những cytokine đầu tiên được sản xuất bằng
tế bào thực vật. cDNA mã hóa erythropoietin của người được biểu hiện qua
promoter 35S của virus khảm súp lơ (CaMV) trong tế bào thuốc lá BY2, tuy
nhiên năng suất còn thấp, chỉ đạt 0,0026% tổng số protein tan [51].
Tiếp sau erythropoietin thì yếu tố GM-CSF của người cũng được tập
trung nghiên cứu, biểu hiện ở thực vật. Ban đầu, chúng được biểu hiện trong
thuốc lá [21],[46] và dịch treo tế bào lúa [39], [40], [84]. Để tăng năng suất, các
loại muối khoáng hoặc 5% (w/v) gelatin đã được bổ sung vào môi trường nuôi
cấy, giúp sản lượng của hệ thống đạt 129 mg/l. Ngoài biểu hiện trên cây thuốc
lá và tế bào lúa thì yếu tố GM-CSF còn được biểu hiện trên một số cây trồng
khác như: trong lá mía chuyển gen là 0,02% [95], trong lá thuốc lá khoảng
0,22% của protein tan tổng số [28], trong hạt giống lúa chuyển gen GM-CSF
tái tổ hợp tích lũy lên tới 1,3% của protein tan tổng số [79], đặc biệt hàm lượng
GM-CSF biểu hiện cao nhất là ở khoai tây lên tới 2% protein tổng số với lớp

vỏ protein biến đổi [106]. Trong hầu hết các trường hợp, các hoạt tính sinh học


11

của GM-CSF tái tổ hợp đã được chứng minh ở mức độ phòng thí nghiệm, và
trên cơ thể sống trong mô hình chuột [61].
Bảng 1.1. Một số cytokine tái tổ hợp biểu hiện ở thực vật
Cytokine

Cây

Đặc điểm của

Hàm lượng

biểu hiện

cassette biểu hiện

protein thu được

GM-CSF

Mía

GM-CSF

Thuốc lá

GM-CSF

Thuốc lá

GM-CSF

Lúa

Murine
GM-CSF
IL-2

Thuốc lá

Promoter Mubi-1 của ngô hoặc 0,02%
Scubi-9 của mía

protein

tan

tổng số [92].

Promoter Gt1, Gt3 (glutelin) và tín 0,005 - 0,03% protein
hiệu peptide, nos terminator

tan tổng số [77].

Promoter Gt1 và tín hiệu peptide, 1,3% protein tan tổng
nos terminator

số [78].

Promoter Gt3α, tín hiệu peptide 0,5 - 14 µg/hạt [41],
glutelin, nos terminator

[60].

Promoter RbcS1, tín hiệu peptide, 19 µg/g lá tươi;
KDEL

0,22% [28].

Khoai tây Promoter patatin, nos terminator

115

U/mg

protein

tổng số [69].
0,1% protein tổng số

IL-4

Thuốc lá,
khoai tây

ở thuốc lá; 0,08%

Promoter 35S, KDEL

protein tổng số ở
khoai tây [49].

Promoter 35S cùng trình tự tăng
IL-10

Thuốc lá cường,

ELP,

KDEL,

nos

terminator
IL-10

Thuốc lá

0,27%

protein

tan

tổng số [68].

(A). Promoter 35S CaMV, có hoặc (A). 7 ng/mg protein
không có his tag, peptide lục lạp

tổng số (không có his


12

(B). Promoter 35S CaMV, his tag, tag); 43 ng/mg (có his
peptide ty thể

tag).
(B). Không biểu hiện
[52].

IL-12

Thuốc lá Promoter 35S và terminator

IL-12

Cà chua

IL-13

Thuốc lá

40 ng/g [29].

Promoter 35s cùng trình tự

7,3 µg/g ở lá; 4,3 ng/g

tăng cường, 35S terminator

ở quả [30], [77].

Hai promoter 35S, KDEL, nos 0,15% protein tổng số
terminator

[91].
0,004

IL-18

Thuốc lá Promoter 35S, nos terminator

-

0,051%

protein tổng số, 351
ng/g [103].

IFN-α2b
IFN-α8

Khoai tây -

560 IU/g mô [65]

(A). Promoter 35S, nos terminator,
tín hiệu mục tiêu calreticulin
IFN-α2b

Cà rốt

(B).

Promoter

MLL,

nos

terminator, tín hiệu mục tiêu
calreticulin

(A). 26,8 x 103 U/g
FW của lá tươi
(B). 8,56 x 103 U/g
FW của rễ [48].

Biểu hiện
IFN-β

tạm thời
lá rau

Promoter 35S, nos terminator

3,1 x 104 IU/ml [34]

diếp
TNF-α

Khoai tây Promoter 35S, trình tự SEKDEL
Promoter 35S cùng hai trình tự

FGF8b

Thuốc lá tăng cường, 35S terminator,
c-myc, his, KDEL

15 µg/g mô [66]
4,1% protein tổng số
[73].