thiết kế vector và bước đầu biểu hiện protein tiểu đơn vị b độc tố không chịu nhiệt lt của etec trên vi khuẩn e.coli

Bộ giáo dục v đo tạo Bộ y tế
Trờng Đại học y h nội



Trịnh Thị Quế



thiết kế vector v bớc đầu biểu hiện protein
tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt
của etec trên vi khuẩn
e.coli




luận văn thạc sĩ y học





H nội - 2011
Bộ giáo dục v đo tạo Bộ y tế
Trờng Đại học y h nội



Trịnh Thị Quế

thiết kế vector v bớc đầu biểu hiện protein
tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt
của etec trên vi khuẩn
e.coli



Chuyên ngành : Hoá sinh
Mã số : 60.72.04


luận văn thạc sĩ y học

Ngời hớng dẫn khoa học:
TS. Trần Vân Khánh


H nội - 2011
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn
sâu sắc tới TS. Trần Vân Khánh - Phó giám đốc Trung tâm nghiên cứu
Gen-Protein, người thầy đã dành nhiều thời gian giúp đỡ, tận tình hướng
dẫn cho tôi ngày càng trưởng thành hơn trong học tập, nghiên cứu cũng như
trong cuộc sống.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS.
Tạ Thành Văn- Phó hiệu trưởng trường đại học Y Hà Nội, Giám đốc
Trung tâm nghiên cứu Gen- Protein, người thầy đã tận tâm vì học trò, đã

dạy cho tôi những kiến thức quý báu và đã tạo điều kiện cho tôi được tham
gia thực hiện đề tài:“Nghiên cứu quy trình sản xuất bộ sinh phẩm
immunoblotting chẩn đoán độc tố không chịu nhiệt (LT) của E.coli sinh độc
tố ở trên một số nhóm thực phẩm”
Tôi xin trân trọng cảm ơn:
Đảng ủy, Ban Giám hiệu, phòng Đào t
ạo Sau đại học trường Đại học Y
Hà Nội
Đảng ủy, Ban Giám đốc bệnh viện đa khoa tỉnh Hà Nam
PGS.TS Nguyễn Thị Hà người đã dành cho tôi những ý kiến vô cùng quý
báu để tôi tiến bộ hơn trong học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn
này.
Các thầy cô trong Bộ môn Hóa sinh, trường Đại học Y Hà Nội đã cho tôi
kiến thức trong quá trình học tập.
Tập thể các anh chị trong trung tâm nghiên cứu Gen – Protein trường
Đại h
ọc Y Hà Nội, đã hướng dẫn, sát cánh bên tôi khi thực hiện luận văn
này.
Các anh chị khoa xét nghiệm bệnh viện đa khoa tỉnh Hà Nam đã tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi trong học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới cha mẹ, chồng con, anh chị
em, bạn bè đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học
tập và làm luận văn.
Hà nội, ngày 14 tháng 10 năm 2011.
Bs TrÞnh ThÞ QuÕ

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm
Compartative
ELISA
ELISA cạnh tranh
DEC
Diarrheagenic Escherichia coli

(E coli sinh độc tố gây tiêu chảy)
E. coli
Escherichia coli
EAEC
Enteroadherent E.coli
(E.coli bám dính đường ruột)
EHEC
Enterohemorrhagic E.coli
(E.coli gây chảy máu đường ruột)
EIEC
Enteroinvasive E.coli
(E.coli xâm nhập đường ruột)
ELISA Enzym Linked Immuno Sorbent Assay
(kỹ thuật miễn dịch gắn enzym)
EltB Escherichia coli Heat Labile Toxin B
(tiểu đơn vị B độc tố
không chịu nhiệt của E.coli)
EPEC
Enteropathogenic E. col
(E. coli gây bệnh)
ETEC
Enterotoxigenic Escherichia coli
(E.coli sinh độc tố ruột)
LT Heat Labile Toxin (Độc tố không chịu nhiệt)
PBS Phosphate Buffer Saline-natri
(Dung dịch đệm phosphat)
PCR Polymerase Chain Reaction
Sandwich ELISA
ELISA kẹp chả
ST Heat Stable Toxin (Độc tố chịu nhiệt)

Stx Shiga toxin producing

















MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 11
Chương 1: TỔNG QUAN 13
1.1. Tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm 13
1.1.1. Trên thế giới 13
1.1.2. Ở Việt Nam 14
1.2. Ngộ độc thực phẩm do Escherichia coli 15
1.2.1. Vài nét về E.coli 15
1.2.2. Phân loại 17
1.2.3. Đặc điểm sinh học 18
1.2.4. Khả năng gây bệnh ở đường tiêu hóa 19
1.3. Ngộ độc thực phẩm do ETEC 23

1.3.1. Trên thế giới 23
1.3.2. Việt Nam 23
1.3.3. Bệnh cảnh lâm sàng và dịch tễ học của ngộ độ
c thực phẩm do
ETEC 24
1.4. Các phương pháp xác định E.coli 25
1.4.1. Phương pháp định danh kinh điển 25
1.4.2. Thử nghiệm tạo váng và gây ngưng kết hồng cầu 26
1.4.3. Phương pháp thử nghiệm trên động vật thực nghiệm 26
1.4.4. Phương pháp miễn dịch học 27
1.4.5. Phương pháp nuôi cấy trên tế bào 30
1.4.6. Kỹ thuật sinh học phân tử 31
1.4.7. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch: 36
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37
2.1. Đố
i tượng nghiên cứu 37
2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid 37
2.1.2. Hóa chất, máy móc và thiết bị 37
2.1.3. Môi trường và đệm 39
2.1.4. Cặp mồi sử dụng 40
2.2. Phương pháp nghiên cứu 41
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 41
2.2.2. Các phương pháp tiến hành nghiên cứu 41
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53
3.1. Khuyếch đại đoạn gen biến nạp EltB bằng kỹ thuật PCR 53
3.2. Nuôi cấy và tinh sạch plasmid pGEX và cắt bằng enzym giới hạn 53
3.3. Cắt đoạn gen EltB bằng các enzym giới hạn 54
3.4. Nối đoạn gen EltB vào vector pGEX 55
3.4.1. Kiểm tra đoạn gen biến nạp bằng kỹ thuật PCR 55
3.4.2. Kiểm tra đoạn gen biến nạp bằng kỹ thuật cắ

t enzym giới hạn 56
3.4.3. Kiểm tra đoạn gen biến nạp bằng giải trình tự gen 56
3.5. Biểu hiện protein tái tổ hợp EltB 58
3.5.1. Biến nạp plasmid pGEX-EltB vào tế bào biểu hiện protein
E.coli BL21 58
3.5.2. Biểu hiện protein tái tổ hợp EltB 59
3.5.3. Kiểm tra protein EltB bằng Western blot 60
Chương 4: BÀN LUẬN 61
4.1. Khuyếch đại đoạn gen biến nạp EltB bằng kỹ thuật PCR 61
4.1.1. Thiết kế mồi 61
4.1.2. Tách chiết DNA khuôn mẫu từ ch
ủng ETEC 62
4.1.3. Thực hiện phản ứng PCR 62
4.2. Nuôi cấy và tinh sạch plasmid pGEX 62
4.2.1. Lựa chọn vector tách dòng 62
4.2.2. Biến nạp đoạn gen EltB vào vector pGEX 63
4.3. Biểu hiện Protein tái tổ hợp EltB 64
4.3.1. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli khả biến bằng sốc nhiệt 64
4.3.2. Kiểm tra sự biểu hiện của protein tái tổ hợp EltB 66
4.4. Kiểm tra mức độ biểu hiện protein EltB bằng Western blot 66
KẾT LUẬ
N 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hình ảnh E.coli trên kính hiển vi điện tử 16
Hình 1.2. Khuẩn lạc E.coli trên môi trường thạch Endo và Mac-conkey 16
Hình 1.3. Các bước trong Sandwich ELISA. 29
Hình 2.1. Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu 41
Hình 2.2. Sơ đồ biến nạp EltB vào vector biểu hiện pGEX 44
Hình 3.1. Hình ảnh PCR khuếch đại gen EltB. 53
Hình 3.2. Hình ảnh plasmid pGEX sau khi đã được tinh sạch và cắt bằng enzym 54
Hình 3.3. Kiểm tra đoạn gen EltB sau cắt bằng enzym 54
Hình 3.4. Kiểm tra đoạn gen EltB sau khi biến nạp vào vector pGEX-13X

bằng kỹ thuật PCR 55

Hình 3.5. Sản phẩm kiểm tra đoạn gen biến nạp bằng enzym cắt giới hạn 56
Hình 3.6. Hình ảnh giải trình tự gen của đoạn gen biến nạp EltB 57
Hình 3.7. Sản phẩm kiểm tra biến nạp bằng kỹ thuật PCR 58
Hình 3.8. Protein tái tổ hợp từ vi khuẩn E. coli BL21 mang vector pGEX-LtB. . 59
Hình 3.9. Kiểm tra chất lượng protein EltB tái tổ hợp bằng kỹ thuật western
blotting 60











11

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm (ATVSTP) có liên quan trực tiếp hàng
ngày, thường xuyên, liên tục đến sức khỏe con người, ảnh hưởng lâu dài đến nòi
giống. Sử dụng thực phẩm không đảm bảo chất lượng, vệ sinh sẽ dẫn đến các
nguy cơ cao gây ngộ độc thực phẩm cấp tính và mạn tính. Không những thế, nó
còn ảnh hưởng đến sự phát triển kinh tế, xã hội, an ninh chính trị và quan hệ quốc
tế [13]. Theo thống kê của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật Mỹ thì
hàng năm trên thế giới có khoảng 1,3 tỷ người tiêu chảy trong đó có 70% nguyên

nhân do sử dụng thực phẩm không an toàn [28]. Tại các nước đang phát triển,
mỗi năm có khoảng 1/3 dân số bị các bệnh do thực phẩm gây ra, trong đó
bệnh tiêu chảy là thường gặp nhất và gây tử vong khoảng 2,2 triệu người [23].
Ở Việt Nam ngộ độc thực phẩm là m
ột vấn đề đang được quan tâm hàng
đầu, theo ước tính của bộ Y tế, chỉ riêng năm 2001 đã có 4,2 triệu người bị
ngộ độc thực phẩm. Từ năm 2001-2006, cả nước ghi nhận được hơn 560.0000
ca tiêu chảy do ngộ độc thực phẩm, trong đó có 84 ca tử vong. Riêng trong 9
tháng đầu năm 2010 đã ghi nhận được hơn 750.000 ca tiêu chảy và 12 ca tử
vong liên quan đến thực phẩm. Tuy nhiên theo các chuyên gia thì số liệu
thựcph
ải gấp ít nhất 10 lần con số được công bố [6, 16].
Các bệnh liên quan đến thực phẩm hiện nay vẫn là một mối nguy cơ
chính tác động đến sức khỏe con người trên thế giới
[50]. Trong đó, vi khuẩn
E.coli sinh độc tố (Enterotoxigenic- ETEC) là một trong những nguyên nhân
gây bệnh tiêu chảy quan trọng cho trẻ em ở các quốc gia đang phát triển và
cho khách du lịch đến những vùng có dịch lưu hành. Thực phẩm và nước bị ô
nhiễm là những phương tiện lây truyền chủ yếu của loại vi khuẩn này. Các
mẫu xét nghiệm thực phẩm và nước thường có tỷ lệ ô nhiễm cao với ETEC ở
vùng có dịch lư
u hành [25,43]. Nhiễm trùng do ETEC thường xảy ra vào
những mùa nóng, ẩm ướt sẽ là những điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát
triển trong thực phẩm và nước. ETEC có khả năng sinh độc tố chịu nhiệt (heat

12

stable toxin-ST) và độc tố không chịu nhiệt (heat labile toxin-LT). Độc tố
không chịu nhiêt có cấu trúc và chức năng như độc tố tả (cholera toxin). Vì
vậy người bị nhiễm độc tố này sẽ bị tiêu chảy cấp tính với mức độ mất nước

trầm trọng. Trên thế giới nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và sản xuất thành
công protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B của độc tố LT của ETEC và s
ử dụng
protein tái tổ hợp này để thiết kế các bộ sinh phẩm chẩn đoán ETEC gây
bệnh bằng kỹ thuật ELISA và latex thu được kết quả tốt [29, 34]. Nguyên lý
của kỹ thuật là sử dụng protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B của độc tố LT gây
miễn dịch tạo kháng thể kháng LT, sau đó sử dụng kháng thể này để phát hiện
độc tố LT của ETEC.
Với điều ki
ện khí hậu nóng ẩm ở Việt Nam và sự thiếu hiểu biết về vệ
sinh an toàn thực phẩm của người dân nên ngộ độc thực phẩm do E. Coli sinh
độc tố chiếm tỷ lệ không nhỏ. Phương pháp nuôi cấy không thể phát hiện
được ETEC trong thực phẩm. Bởi vậy, việc sử dụng kỹ thuật PCR nhằm phát
hiện các gen mã hóa độc tố của các chủng ETEC trong thực phẩm đang đượ
c
quan tâm [29, 34, 38].
Một nghiên cứu ở Việt Nam của Nguyễn Thị Thanh Yến và cộng sự
năm 2005 tại viện Dinh dưỡng về ứng dụng kỹ thuật ELISA phát hiện khả
năng sinh độc tố LT của ETEC trong các mẫu thực phẩm đã được công bố
[21]. Tuy nhiên kỹ thuật này giá thành cao và phức tạp cho nên rất khó áp
dụng cho các phòng xét nghiệm thực phẩm ở tuyến cơ sở. Xuất phát từ thực
tiễn đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector và bước đầu
biểu hiện protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT của ETEC trên
vi khuẩn E.coli”. Đây là bước quan trọng cho nghiên cứu tiếp theo để sản
xuất bộ que thử nhanh nhằm chẩn đoán độc tố không chịu nhiệt (LT) của
ETEC ở trên một số nhóm thực phẩm.
Mục tiêu nghiên cứu:
1. Thi
ết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp EltB.
2. Biểu hiện và tinh sạch Protein EltB trong tế bào vi khuẩn E.coli BL21.


13

Chương 1
TỔNG QUAN

1.1. Tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm
1.1.1. Trên thế giới
Theo thống kê của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật Mỹ (Center
for Disease Control and Prevention - CDC) thì hàng năm trên thế giới có khoảng
1,3 tỷ người tiêu chảy trong đó có 70% nguyên nhân do sử dụng thực phẩm không
an toàn [28]. Tại các nước đang phát triển, mỗi năm có khoảng 1/3 dân số bị
các bệnh do thực phẩm gây ra, trong đó bệnh tiêu chảy là thường gặp nhất và
gây tử vong khoảng 2,2 triệu ng
ười [23].
Tại Úc, mỗi ngày có khoảng 11.500 người bị ngộ độc thực phẩm. Ở Mỹ
hàng năm ước đoán có khoảng 5 đến 6 triệu người bị mắc bệnh do nguyên
nhân ăn uống và hơn 9.000 trường hợp tử vong [12, 49].
Một nghiên cứu khác về bệnh từ thực phẩm bị ô nhiễm vi sinh vật gây bệnh
ở New - York Mỹ, phát hiện có sự gia tăng gấp 4 lần từ 1980 đến 1990 [18].

Ở Trung Quốc năm 1998 có 292.000 người bị ngộ độc thực phẩm do
virus viêm gan A làm tử vong 9 người. Năm 1999 xảy ra 591 vụ ngộ độc thực
phẩm với 17.971 người mắc, chết 108 người. Nguyên nhân chính là do thực
phẩm bị ô nhiễm vi sinh vật là 8.505 trường hợp, do hóa chất là 9.506 trường
hợp, thực vật hoặc động vật có chất độc là 2.719 trường hợp. Phần lớn các
trường hợp ngộ độc x
ảy tại các căng tin là 7.529 trường hợp [10]. Một thống
kê trong 10 năm xác định các yếu tố nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm tại
Trung Quốc cho thấy 93,24 % là nguyên nhân vi sinh vật, chỉ có 6,76% bởi

các yếu tố hóa học [24].

14

Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật ngày càng gia tăng ở các quốc gia đang
phát triển và ở cả các quốc gia đã phát triển, đăc biệt là E.coli. Ở Nhật Bản năm
1996 có khoảng 800 người bị nhễm bệnh do Enterohaemorrhagie E.coli [5].
Bằng chứng gần đây nhất là vụ dịch ngộ độc thức ăn do E. coli týp huyết
thanh O104: H4 thuộc nhóm E. coli gây chảy máu (Enterohemorrhagic E.coli,
EHEC) xảy ra ở
một số quốc gia châu Âu, đặc biệt là ở Đức với hàng ngàn ca mắc
và hàng chục ca tử vong. Mặc dù không tìm ra nguồn gốc chính xác của vụ dịch
nhưng nhiều thực phẩm như dưa chuột, giá đỗ được xác định là một trong các yếu
tố nguy cơ gây ra vụ dịch này. Điều này cho thấy ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn
vẫn là mối lo ngại lớn tác động đến sức kh
ỏe cộng đồng ngay cả đối với các quốc
gia phát triển như liên minh châu Âu.
1.1.2. Ở Việt Nam
Tình trạng ô nhiễm thực phẩm đang diễn ra khá phổ biến trên cả nước,
chủ yếu là do ô nhiễm mầm bệnh sinh học và hóa chất [6]. Tại Hà Nội, tỷ lệ
thức ăn đường phố ô nhiễm vi khuẩn cao (46,7%) [6]. Điều tra tại thành phố
Hồ Chí Minh cho thấy 100% các mẫu thực phẩm đượ
c kiểm tra như bánh mì,
thịt nguội, thịt quay, dưa muối… không đảm bảo về mặt vệ sinh thực phẩm về
mặt vi sinh [5]. Tại Hải Phòng có 76,4% thực phẩm không đạt tiêu chuẩn vệ
sinh, trong đó tỷ lệ không đạt vệ sinh của thức ăn đường phố là 92,9%. Có tới
85% mẫu thực phẩm ăn ngay tại các chợ không đạt tiêu chuẩn về vi sinh với
số lượng vi khuẩn có trong thự
c phẩm vượt mức cho phép nhiều lần, kể các vi
khuẩn gây bệnh nguy hiểm [16]. Không chỉ ở các thành phố lớn, tình trạng

nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm còn diễn ra phổ biến ở rất nhiều
địa phương khác trên cả nước [6].
Cùng với tình trạng ô nhiễm thực phẩm, ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam
xảy ra cũng rất thường xuyên. Theo thống kê chưa đầy đủ c
ủa Cục ATVSTP,
từ năm 2000 đến năm 2007 trung bình mỗi năm có khoảng 181 vụ ngộ độc

15

thực phẩm xảy ra với khoảng 5.211 người mắc và khoảng 48 ca tử vong. Tỷ
lệ mắc ngộ độc thực phẩm trung bình là 6,05/100.000 dân, tỷ lệ chết là
0,06/100.000 dân/ năm. Tuy nhiên trên thực tế do chưa có hệ thống giám sát
đến cơ sở, việc thống kê báo cáo còn chưa được thiết lập nên số ca ngộ độc
thực phẩm thực tế hàng năm còn cao hơn rất nhiều. Theo ước tính của tổ chứ
c
y tế thế giới (WHO), ngộ độc thực phẩm hàng năm ở Việt Nam khoảng trên 8
triệu ca. Ngoài tình trạng ngộ độc thực phẩm cấp tính, ngộ độc thực phẩm
mạn tính cũng đang diễn ra khá phức tạp. Ngộ độc thực phẩm mạn tính
thường ít được chú ý vì biểu hiện lâm sàng không dữ dội như ngộ độc cấp
tính. Tuy nhiên, hậu quả của ngộ độ
c thực phẩm mạn tính còn nguy hiểm hơn
nhiều, dẫn đến biết bao hệ lụy cho sức khỏe cộng đồng.
Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người
tử vong, trong đó có 3 vụ ngộ độc lớn từ 30 người trở lên. Số người bị ngộ
độc là 323 người với 242 người nhập viện (Dinh dưỡng.com.vn)
Nguyên nhân chính là do vi sinh vật (gồm 4 nhóm vi khuẩn chính là
Salmonella, Streptoccocus, E.Coli và
Staphylococcus); do độc tố tự nhiên và
hóa chất. Có 5/18 vụ ngộ độc không xác định được nguyên nhân do không lấy
được mẫu thực phẩm lưu tại cơ sở.

Mới đây nhất, ngày 30/12, có 461 công nhân thuộc 4 công ty trên địa
bàn quận 12 và huyện Hóc Môn, TP.HCM đã lần lượt phải nhập viện cấp cứu
vì ngộ độc thực phẩm (Dinh dưỡng .com.vn)
1.2. Ngộ độc thực phẩm do Escherichia coli (E.coli)
1.2.1. Vài nét về E.coli
E.coli do tác giả Eschirich phân lậ
p từ phân người năm 1885. E.coli ký
sinh trong đại tràng người và một số động vật. Sau khi trẻ ra đời khoảng 3
giờ, người ta đã thấy E.coli trong đại tràng và từ đó nó sống suốt đời với cơ

16

thể vật chủ. Chúng góp phần tiêu hóa thức ăn, phân giải muối mật, sản xuất
một số sinh tố, giữ thăng bằng vi khuẩn chí ở ruột và chiếm khoảng 80% tổng
số vi khuẩn hiếu khí ở đại tràng.



Hình 1.1. Hình ảnh E.coli trên kính hiển vi điện tử

Khuẩnlạc E. coli
thạch Endo
Khuẩnlạc E. coli
trên thạch Mac-conkey

Hình 1.2. Khuẩn lạc E.coli trên môi trường thạch Endo và Mac-conkey

17

1.2.2 Phân loại

Có nhiều cách phân chia loài E.coli nhưng cách phân loại theo týp huyết
thanh là hay được dùng hơn cả. Cách phân loại này dựa trên cấu trúc kháng
nguyên khác nhau có trên bề mặt tế bào vi khuẩn.
- Kháng nguyên O là quyết định kháng nguyên quan trọng nhất. Bản chất
là lipopolisaccarid nằm trên vách tế bào vi khuẩn. Có 171 loại kháng nguyên
O đã được xác định, trong đó có một số kháng nguyên có phản ứng chéo với
các vi khuẩn khác [35, 45].
- Kháng nguyên K là kháng nguyên bề mặt. Kháng nguyên K nằm bên
ngoài kháng nguyên O. Người ta đã xác định được khoả
ng 80 loại kháng
nguyên K [9, 35].
- Kháng nguyên H là kháng nguyên lông có bản chất hóa học là protein.
Có 56 loại kháng nguyên lông khác nhau đã được xác định [9, 35].
Dựa trên các kháng nguyên O, K và H người ta đã phân biệt được trên
700 týp huyết thanh khác nhau của E.coli
Phân loại dựa vào sự ly giải bởi phage đặc hiệu có khoảng 50 týp phage
Phân loại dựa vào tính chất gây bệnh chia làm 5 loại [22].
- EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột
- EHEC ( Enterohemorrhagic E.coli): E.coli gây chảy máu đường ruột
- ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh
độc tố ruột
- EIEC (Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập đường ruột
- EAEC (Enteroadherent E.coli) E.coli bám dính đường ruột



18

1.2.3. Đặc điểm sinh học
1.2.3.1. Hình thái học

- E.coli là trực khuẩn kích thước trung bình 1-3µ x 0,5µm, đứng riêng rẽ
hoặc đôi khi thành đôi. Trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ: trong
môi trường có kháng sinh), vi khuẩn có thể dài như sợi chỉ.
- Bắt mầu Gram (-)
- Di động bằng hệ thống lông xung quanh thân hoặc không di động.
- Có thể có vỏ.
1.2.3.2. Tính chất nuôi cấy
- Là loại hiếu khí hay hiếu kỵ khí tùy tiện.
- Nhiệt độ thích h
ợp 37
o
C nhưng có thể mọc ở 40
o
C và sống được ở
nhiệt độ từ 5-40
o
C
- pH 7,4.
- E.coli phát triển dễ dàng trên môi trường nuôi cấy thông thường, một
số có thể phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng.
- Ở những điều kiện thích hợp E.coli phát triển rất nhanh, thời gian phân
chia thành một thế hệ mới khoảng 20 đến 30 phút.
- Trong môi trường lỏng (như canh thang) sau 3-4h E.coli đã làm đục
nhẹ môi trường, sau 24h làm đục đều dưới đáy ống có thể có cặ
n.
- Trên môi trường đặc sau khoảng 8-10h, dùng kính lúp có thể thấy được
khuẩn lạc. Sau 24h đường kính khuẩn lạc khoảng 1,5mm, hình thái khuẩn lạc
điển hình là dạng S (tròn, lồi, ướt, màu xám, bề mặt sáng bóng, bờ đều)
nhưng cũng có thể gặp dạng M (nhầy) hoặc dạng R (khô, nhăn nheo).


19

- Trên môi trường thạch dinh dưỡng tạo các khuẩn lạc tròn ướt (dạng S)
màu trắng đục. Để lâu các khuẩn lạc trở nên khô nhăn (dạng R). Kích thước
khóm 2-3mm.
- Trên thạch máu: Có chủng tan huyết β, có chủng tan huyết dạng α.
- Trên môi trường chẩn đoán chuyên biệt như thạch Endo tạo ra các
khuẩn lạc tím có ánh kim.
- Trên môi trường Macconkey, SS tạo các khuẩn lạc màu hồng đỏ do vi
khuẩn E.coli có khả năng lên men đường lactose
- Trên các môi trường
đường: Lên men sinh hơi lactose, glucose,
galactose. Lên men không đều saccarose và không lên men dextrin, glycogen.
1.2.3.3. Tính chất sinh vật hóa học
Phản ứng Indol dương tính, Methyl Red (phản ứng MR) dương tính,
Voges-Proskauer (phản ứng VP) âm tính và Citrat âm tính, H
2
S âm tính, hoàn
nguyên nitrat thành nitrit, Lysine decarboxylaza dương tính.
1.2.4. Khả năng gây bệnh ở đường tiêu hóa
E.coli là vi khuẩn gây bệnh cơ hội.
Hiện tại người ta đã xác định được 5 loại E.coli có khả năng gây tiêu
chảy: ETEC , EPEC , EHEC, EIEC, EAEC.
♦ E.coli sinh độc tố ruột (ETEC)
Để gây được bệnh tiêu chảy, E.coli đòi hỏi phải có hai yếu tố độc lực đó là:
+ Khả năng bám và cư ngụ ở niêm mạc ruột.
+ Khả năng sản sinh ra độc tố.
• Các yếu tố bám dính:
- Khả năng bám và cư ngụ của ETEC vào tế bào màng nhầy biểu mô ruột
non là điều kiện quan trọng trong quá trình gây bệnh. Quá trình này được thực

hiện qua một số các yếu tố trung gian gọi là CFA (Colonization Factor
Antigen “yếu tố kháng nguyên cư ngụ”) hoặc các yếu tố kháng nguyên trên bề

20

mặt E.coli (E.coli surface antigen). Các CFA này có bản chất là protein và
chúng có tính kháng nguyên mạnh, có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của
một số loài khác nhau [37, 39, 47].
- Cho đến nay người ta đã phát hiện ra một số loại CFA khác nhau như CFA
I, CFA II, CFA III, CFA IV. CFAII được mô tả như một yếu tố kháng nguyên
lông riêng biệt có chứa 1 hoặc 2 kháng nguyên lông bề mặt [37, 39, 47].
- Các CFA còn liên quan chặt chẽ với các yếu tố độc lực LT (Heat Labile
Toxin) và ST(Heat Stable Toxin): CFA I và CFA II liên quan với LT và ST hoặc
chỉ
ST đơn thuần, CFA III liên quan với chủng ETEC chỉ sản xuất LT [37].
- Các yếu tố CFA được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid và plasmid
này cũng mã hóa cho các độc tố LT và ST [37, 39, 47].
- Các nghiên cứu về dịch tễ học thấy rằng CFA I, CFA II và CFA IV xuất
hiện khoảng 75% trong các chủng ETEC gây bệnh ở người trên thế giới [35].
● Độc tố của ETEC
ETEC gây tiêu chảy nhờ hoạt động của độc tố ruột không chịu nhiệ
t LT
(Heat Labile Toxin) và độc tố ruột chịu nhiệt ST (Heat Stable Toxin). Một
chủng E.coli có thể chỉ có LT, chỉ có ST hoặc cả 2 loại độc tố này.
◘ Độc tố không chịu nhiệt LT
LT là một protein có tính kháng nguyên mạnh, mang tính chất của một
ngoại độc tố. Cấu trúc và chức năng gần giống với độc tố của vi khuẩn tả
(cholera toxin). Có 2 loại độc đố LT là LT I và LT II, chúng không có phản
ứng miễn d
ịch chéo với nhau. Độc tố LT I thường sinh ra ở các chủng ETEC

gây bệnh cho người và động vật. Còn độc tố LT II hiếm khi được phát hiện
trên các chủng ETEC phân lập được ở trên người. Tuy nhiên độc đố LT II
không liên quan đến bệnh trên cả người và động vật. Do vậy, thuật ngữ LT
dùng để ám chỉ LT I.

21

LT là độc tố có trọng lượng phân tử thấp 86 kDa, bao gồm 28 kDa tiểu
đơn vị A và 11,5 kDa 5 tiểu đơn vị B (LTB). Khả năng bám dính của tiểu đơn
vị B vào thụ thể GM1 trên niêm mạc ruột non sẽ cho phép độc tố này xâm nhập
vào bên trong của tế bào niêm mạc ruột. Tiểu đơn vị A mang hoạt tính enzym
gồm 2 peptid

A
1
và A
2
nối với nhau bởi cầu nối disulfide [32, 42, 46].
Cơ chế gây tiêu chảy của LT: Sau khi 5 tiểu đơn vị B giúp độc tố bám
vào tế bào biểu mô ruột thì phần A được đẩy vào bên trong tế bào. Peptid A1
có hoạt tính enzym ADP- ribosyltransferase và chuyển một nửa phân tử ADP-
ribosyl từ NAP tới tiểu đơn vị A của protein gắn GTP. Gs làm hoạt hóa
enzym adenylate cyclase. Khi enzym adenylate cyclase hoạt hóa thì AMPc
nội bào tăng lên dẫn đến ức chế hấp thu Na
+
ở tế bào niêm mạc ruột có lông,
tăng bài tiết Cl
-
vào lòng ruột, gây tăng nhanh áp lực thẩm thấu trong lòng
ruột. Hậu quả là một lượng lớn nước từ trong tế bào được kéo ra ngoài lòng

ruột để cân bằng áp lực thẩm thấu giữa trong và ngoài tế bào, gây tiêu chảy
dạng xuất tiết [32, 42, 46].
◘ Độc tố chịu nhiệt ST
ST có trọng lượng phân tử thấp, cấu trúc của độc tố này có chứa nhiều
cystein liên kết với nhau bằng các cầu nố
i disulfide nhờ đó độc tố ST bền
vững với nhiệt độ. Có 2 loại độc tố ST, chúng khác nhau về cấu trúc và cơ chế
hoạt động là STa và STb. Gen mã hóa cho 2 lớp này thường nằm trên
plasmid, cũng có khi nằm trên transposon. Độc tố ST hoàn chỉnh chứa 18-19
acid amin, trọng lượng phân tử 2 kDa. Receptor của STa là enzym trên màng
gai là Guanyl cyclase(GC-C). Khi STa gắn với GC-C trên tế bào biểu mô ruột,
kích thích hoạt động của GC làm tăng GMPc. GMPc hoạt động giống AMPc. STb
chứa 48 acid amin, trọng lượ
ng phân tử 5,1 kDa. STb làm mất nhung mao hoặc teo
một phần nhung mao ruột [42].

22

- Những dòng E.coli có cả 2 loại nội độc tố LT và ST sẽ gây ra tiêu chảy
trầm trọng và kéo dài.
♦ E.coli gây bệnh đường ruột EPEC (Enteropathogenic E.coli):
Gồm các týp thường gặp O26:B6, O44, O55:B5, O112:B11, O124,
O125:B5, O142 và là nguyên nhân gây tiêu chảy ở trẻ em dưới 2 tuổi.
♦ E.coli xâm nhập đường ruột EIEC (Enteroinvasine E.coli)
Những E.coli của nhóm này bám lên niêm mạc và làm tróc niêm mạc gây
loét niêm mạc do đó gây tiêu chảy có đờm lẫn máu (giống Shigella). Các
chủng này có thể lên men hay không lên men đường lactose và có phản ứng
lysin decarboxylaze âm tính. Thường gặp các týp O125, O157, O144…
♦ E.coli gây chảy máu đường ruột EHEC (Enterohemorrhagic E.coli)
Vừa gây tiêu chảy vừa là nguyên nhân gây viêm đại tràng xuất huyết

(hermorrhagic colilic) và làm tổn thương mao mạch gây hiện tượng sưng phù
(ederma) rất nguy hiểm đến tính mạng do vi khuẩn E. coli thuộc nhóm này có
khả năng sinh độc tố stx (shiga toxin producing) như độc tố shiga của vi
khuẩn Shigella dysenteriae týp 1 gây độ
c tế bào. Độc tố này là nguyên nhân
gây ra viêm ruột chảy máu và hội chứng tan máu và urê huyết (HUS). Nhóm
EHEC bao gồm các týp: O26, O11, O104, O113, O145 và O157. Theo báo
cáo của trung tâm kiểm soát bệnh truyền nhiễm (CDC) thì trong những năm
gần đây E.coli O157:H7 chiếm khoảng 70% các vụ dịch ngộ độc do nhóm
EHEC (theo CDC, Center for Disease Control and prevention của Mỹ). Với
chủng E. coli O104:H4, từ trước đến nay chỉ gây ra các trường hợp mắc bệnh
lẻ tẻ và không gây dịch lớn, tuy nhiên trong thời gian vừa qua các týp huyết
thanh này
đã gây dịch với hàng ngàn trường hợp mắc bệnh và tử vong ở tại
Đức và một số quốc gia của liên minh châu Âu như đã trình bày ở bên trên.

23

1.3. Ngộ độc thực phẩm do ETEC
1.3.1. Trên thế giới
Trên thế giới, khoảng 210 triệu ca mắc và 380.000 ca tử vong, xảy ra
chủ yếu ở trẻ em do ETEC, theo số liệu của tổ chức Y tế thế giới. ETEC là
nguyên nhân phổ biến nhất gây tiêu chảy ở những nguời đi du lịch. Thực
phẩm và nước bị ô nhiễm - những phương tiện lây truyền chủ yếu của loại vi
khuẩn này. Các mẫu xét nghiệm thực phẩm và nước thường có tỷ lệ ô nhiễm
cao với ETEC ở vùng có dịch lưu hành. Nhiễm trùng do ETEC thường xảy ra
vào những mùa nóng, ẩm ướt sẽ là những điều kiện thuận lợi để vi khuẩn phát
triển trong thực phẩm và nước.
ETEC là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tiêu chảy ở trẻ
em các nước đang phát triển nhưng không phải là yếu tố chính gây tiêu chảy ở

trẻ em các nước phương Tây. ETEC là một tác nhân quan trọng gây tiêu chảy
ở người Âu châu, nhưng lại không quan trọng bằng EAEC ở người Á châu.
Các chủng ETEC thường kết hợp với 2 hội chứng lâm sàng chính là sự tiêu
chảy ở trẻ em mới thôi bú mẹ ở các nước phát triển và sự tiêu chảy ở những
người đi du lịch.
1.3.2. Việt Nam
Ở Việt Nam, E.coli là một trong những căn nguyên quan trọng gây tiêu
chảy ở trẻ em đặc biệt là trẻ em dưới 5 tuổi [4]. Theo báo cáo của chương
trình quốc gia giám sát tính kháng thu
ốc của các vi khuẩn gây bệnh thường
gặp (1988 – 1994) thì E.coli đứng thứ hai (sau S.aureus) về tỉ lệ phân lập
được tính chung tất cả các loại bệnh phẩm ở nước ta.
Một số nghiên cứu đã được tiến hành nhằm tìm hiểu vai trò gây bệnh của
ETEC tại viêt nam cho thấy: khoảng 5-8% các trường hợp tiêu chảy ở trẻ em
dưới 5 tuổi là do ETEC. Kỹ thuật ELISA cũng đã được áp dụng để
phát hiện

24

khả năng sinh độc tố của các chủng ETEC cho thấy 14/221 (6,3%) các chủng
E. coli phân lập từ các bệnh nhân tiêu chảy cấp có sinh độc tố ruột. Thêm vào
đó các nghiên cứu sâu về E. coli sinh độc tố bằng các kỹ thuật sinh học phân
tử như phát hiện tỷ lệ mang gen độc tố của E. coli (bao gồm cả độc tố LT) của
các trường hợp tiêu chảy cấp tính của trẻ em. Hay việc phát hiện gen
độc tố
của E. coli ở các trang trại bò sữa cũng đã được tiến hành tại Việt Nam. Tuy
nhiên trong lĩnh vực Vệ sinh An toàn thực phẩm, phần lớn chúng ta mới áp
dụng các kỹ thuật nuôi cấy truyền thống để phát hiện mức độ ô nhiễm E. coli
trong thực phẩm các kết quả đều cho thấy mức độ ô nhiễm E. coli trong thực
phẩm ở Việt nam khá cao chiếm 50%-90% các m

ẫu xét nghiệm, tuy nhiên
chúng ta chưa có các thống kê về tình hình ô nhiễm của các E. coli gây bệnh
trong đó có ETEC, do vậy, trong tương lai, rất cần có những nghiên cứu sâu
hơn để đánh giá tỷ lệ lưu hành của các E. coli gây bệnh trong thực phẩm.
1.3.3.Bệnh cảnh lâm sàng và dịch tễ học của ngộ độc thực phẩm do ETEC
* Triệu chứng lâm sàng của ngộ độc thực phẩm do ETEC:
Bệnh tiêu chảy do ETEC thường bắ
t đầu đột ngột sau một thời gian ủ
bệnh ngắn 14- 50giờ. Biểu hiện lâm sàng là tiêu chảy toàn nước, không có
nhầy máu, ít khi có sốt và có nôn. Bệnh có thể diễn biến nhẹ, tự khỏi nhưng
cũng có thể diễn biến nặng giống tả.
*Dịch tễ học của ETEC
ETEC gây bệnh chủ yếu cho trẻ em và khách du lịch, thường gây ra các
vụ dịch nhỏ có tính chất lẻ tẻ. Có một s
ố vụ dịch tiêu chảy do ETEC đã được
miêu tả trong các y văn.
- Ở trẻ em ETEC gây tiêu chảy chiếm tỷ lệ 10-31 % [42].
- Người ta thấy rằng trong số những người đi du lịch bị tiêu chảy thì có
20 -40% là do ETEC.

25

- Bệnh thường xảy ra vào mùa nóng ẩm.
- Bệnh lây qua thực phẩm và ít gặp hơn ở nguồn nước bị nhiễm khuẩn.
Sự lây truyền qua thức ăn sam của trẻ cai sữa là rất quan trọng đối với nhiễm
bệnh ở trẻ nhỏ. Hiếm gặp bệnh lây trực tiếp qua tay bị nhiễm khuẩn [2, 35].
- Sự lưu hành của bệnh là nhiễm trùng gặp ch
ủ yếu ở các nước đang
phát triển. Ở các nước đang phát triển, trẻ em trong 3 năm đầu của cuộc đời
nhiều lần bị nhiễm trùng đường tiêu hóa do ETEC. Trẻ lớn và người lớn ít

gặp hơn [2, 35, 40]
1.4. Các phương pháp xác định E.coli
1.4.1. Phương pháp định danh kinh điển
- Bệnh phẩm phân được cấy trên môi trường ức chế chọn lọc cho các vi
khuẩn đường ruột như Endo, Mac- Conkey, DCL, SMAC. Vi
ệc xác định
E.coli dựa vào các tính chất sinh vật hóa học, nhưng chỉ khoảng 90% số
chủng E.coli lên men đường lactose, một số chủng DEC (Diarrheagenic
Escherichia coli: E.coli gây tiêu chảy) chủ yếu là các EIEC không có khả
năng lên men đường này. Test indole dương tính ở 99% chủng E.coli. Đây là
test đơn giản nhất để phân biệt E.coli với các thành viên khác trong họ vi
khuẩn đường ruột. Tiếp theo, định loại E.coli bằng kháng huy
ết thanh mẫu
đặc hiệu với các yếu tố kháng nguyên O, H, K. Tuy nhiên phương pháp này
thường chỉ có giá trị phân biệt E.coli với các thành viên khác trong họ vi
khuẩn đường ruột. Nó hầu như cũng không thể phân biệt giữa các DEC với
nhau và DEC với các E.coli trong hệ vi khuẩn chí ở đại tràng của người do
các tính chất sinh vật hóa học của nhiều DEC giống nhau và giống E.coli
không gây tiêu chảy [14, 35].
- Các chủng E.coli được định týp bằng các kháng huy
ết thanh mẫu [35].