Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro của các phân đoạn dịch chiết hoàng liên (coptis chinensis franch)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN BÍCH HẠNH

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM
ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA
CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT HOÀNG LIÊN
(COPTIS CHINENSIS FRANCH)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN BÍCH HẠNH

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM
ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA
CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT HOÀNG LIÊN
(COPTIS CHINENSIS FRANCH)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
(NGÀNH DƯỢC HỌC)

Khóa: QH.2012.Y
Người hướng dẫn: TS. BÙI THANH TÙNG

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình
của các thầy cô và các bạn. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin
trân trọng cảm ơn TS. Bùi Thanh Tùng – giảng viên bộ môn Dược lý –
Dược lâm sàng Khoa Y Dược - Trường Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận
tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và
hoàn thành nghiên cứu.
Trong quá trình thực hiện khóa luận, tôi nhận được rất nhiều sự giúp đỡ
từ các thầy cô phụ trách trong các phòng thí nghiệm của Khoa. Tôi xin chân
thành cảm ơn Khoa Y dược đã tạo mọi điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất,
các dụng cụ phòng thí nghiệm cho tôi có thể thực hiện tốt đề tài nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới toàn bộ thầy cô trong bộ môn
Dược lý – Dược lâm sàng cùng toàn thể các thầy cô Khoa Y Dược đã giúp đỡ,
trang bị cho tôi nhiều điều bổ ích và thực sự đó là những hành trang quý báu
giúp tôi thêm vững bước trên con đường đi sắp tới của mình.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt và ý nghĩa nhất tới ông bà,
bố mẹ, người thân và bạn bè đã luôn chỉ bảo, động viên, chia sẻ, sát cánh bên
tôi để tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Bích Hạnh


A
ACh

AChE
ACTI
BuOH
CV
DTNB
EtOAc
EtOH
HCl
HPLC
IC50
IU
MeOH
NXB
pH
RSD
SD
STT
TCL
UV

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Độ hấp thụ (Absorbance)
Acetylcholin
Enzym actylcholinesterase
Acetylthiocholine iodid
Butanol
Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation)
Acid 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic
Ethyl acetat
Ethanol

Acid hydro clorid
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)
Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%)
Đơn vị quốc tế (International Unit)
Methanol
Nhà xuất bản
Chỉ số đo hoạt động của ion hidro (Hydrogen power)
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)
Số thứ tự
Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)
Giá trị trung bình
Tia tử ngoại (Ultraviolet)


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Tên bảng
Bảng 3.1 Thành phần hỗn hợp phản ứng
Bảng 3.2 Giá trị IC50 của các phân đoạn dịch chiết từ Hoàng liên
chân gà và Berberin clorid

Trang
27
28


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) ................................... .4

Hình 1.2. Công thức cấu tạo một số chất trong thân rễ Hoàng liên .................... .7
Hình 1.3. Các vị trí hoạt động của enzym AChE................................................ 14
Hình 2.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn dược liệu Hoàng liên .............................. 20
Hình 2.2. Quá trình phản ứng diễn ra trong phương pháp đo quang sử dụng
thuốc thử Ellman ................................................................................................. 21
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình thử nghiệm tác dụng ức chế AChE in vitro .............. 23
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE in vitro .. 25
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym AChE của các
phân đoạn dịch chiết cây Hoàng liên chân gà ..................................................... 29
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym AChE của
Berberin clorid..................................................................................................... 29
Hình 3.3. Đồ thị Lineweaver-Burk cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH. ............ 31
Hình 3.4. Đồ thị Dixon cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH để xác định hằng
số ức chế Ki. ........................................................................................................ 31


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN.......................................................................... 3
1.1. Tổng quan về Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) – Họ
Hoàng liên (Ranunculaceae)........................................................................... 3
1.1.1. Đặc điểm thực vật ................................................................................... 3
1.1.2. Phân bố, trồng trọt và thu hái ............................................................... 4
1.1.3. Thành phần hóa học .............................................................................. 5
1.1.4. Bộ phận dùng ......................................................................................... 8
1.1.5. Tác dụng dược lý .................................................................................... 8
1.2. Tổng quan về nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym

Acetylcholinesterase in vitro .......................................................................... 13
1.2.1. Acetylcholin, enzym Acetylcholinesterase và giả thuyết về vai trò của
hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer .......................................................... 13
1.2.2. Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác
dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro ......................................... 15
CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 19
2.1. Nguyên vật liệu ........................................................................................ 19
2.1.1. Mẫu nghiên cứu ................................................................................... 19
2.1.2. Hóa chất, dung môi .............................................................................. 19
2.1.3. Máy móc, thiết bị và dụng cụ ............................................................... 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 19
2.2.1. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE ...................... 19
2.2.2. Phương pháp đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE...... 24
2.3. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................... 25


CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................. 27
3.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế AChE ............................................... 27
3.2. Kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE .............................. 30
3.3. Bàn luận .................................................................................................. 32
3.3.1. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in
vitro của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch) 32
3.3.2. Về kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym
Acetylcholinesterase của phân đoạn dịch chiết Hoàng liên. ............................ 33
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO


MỞ ĐẦU
Cuộc sống hiện đại ngày càng phát triển cùng với đó cũng là sự gia

tăng của bệnh suy giảm trí nhớ - đặc biệt là Alzheimer không chỉ ở người cao
tuổi mà thậm chí người trẻ tuổi cũng mắc phải. Năm 2012, Tổ chức y tế thế
giới đã cảnh báo về mối lo ngại do bệnh này gây ra và đưa bệnh Alzheimer
vào vấn đề sức khỏe cộng đồng cần được ưu tiên [11]. Nghiên cứu cho thấy
có khoảng 35 triệu người mắc bệnh Alzheimer, thống kê tại châu Á có khoảng
gần 13 triệu người mắc bệnh Alzheimer, dự đoán đến năm 2050 con số này có
thể tăng lên đến 62,8 triệu người. Việt Nam có khoảng hơn 9 triệu người bị sa
sút trí tuệ mà dạng điển hình là Alzheimer. Đây được coi là căn bệnh nặng
nhất trong các nhóm bệnh sa sút trí tuệ, hiện nay là mối quan tâm hàng đầu
của những nhà lão khoa trên toàn thế giới cũng như ở nước ta khi tuổi thọ
trung bình ngày càng cao, số người mắc bệnh ngày càng nhiều [6].
Bệnh nhân bị Alzheimer sẽ bị giảm khả năng xét đoán, định hướng
không gian và thời gian, ngôn ngữ, tư duy nhận thức và hành động... ảnh
hưởng nặng nề đến chức năng và chất lượng cuộc sống, gây nhiều khó khăn
cho người bệnh, cho gia đình và xã hội.
Các thuốc điều trị Alzheimer chủ yếu gồm các thuốc ức chế
cholinesterase, thuốc kháng thụ thể N-methyl – D – Aspartat, thuốc tăng
cường hoạt tính serotonin. Ba nhóm thuốc này đa số là các thuốc tân dược, giá
thành còn tương đối cao và có nhiều tác dụng phụ không mong muốn. Do đó
nhu cầu nghiên cứu phát triển thuốc mới có nguồn gốc từ dược liệu để hỗ trợ
và điều trị Alzheimer là rất cần thiết.
Acetylcholinesterase (AChE) là enzym có mặt ở khe synap của hệ thần
kinh trung ương và có vai trò duy trì sự ổn định nồng độ của chất dẫn truyền
thần kinh Acetylcholin [8]. Với việc Whitehouse lần đầu tiên đưa ra giả
thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer vào năm 1982,
AChE cũng được xác định là một trong những đích phân tử đối với bệnh này.
Trên cơ sở đó, một vài phương pháp thử in vitro đã được xây dựng. Trong đó,
phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman được sử dụng khá phổ biến
trong các nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro. Đây cũng là
một hướng quan trọng và nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học

1


trên thế giới và trong nước, đặc biệt đối với các thuốc có nguồn gốc dược liệu
[27,34].
Theo Y học cổ truyền Trung Quốc, Hoàng liên là thân rễ phơi khô của
nhiều loại Hoàng liên chân gà như: Coptis chinensis Franch, Coptis teeta
Wall, Coptis teetoides C.Y Cheng, Coptis deltoidea C.Y Cheng et Hsisao,
Coptis quinquesecta… thuộc họ Hoàng liên – Ranunculaceae được biết đến
với nhiều công dụng như kháng khuẩn, chống virus, chống viêm... Ở Việt
Nam, Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) được dùng khá phổ biến
trong các bài thuốc với nhiều tác dụng tốt. Gần đây, một số nghiên cứu cho
thấy hợp chất berberin và một số alkaloid chiết xuất từ dược liệu có tiềm năng
ức chế enzym AChE cao mở ra hướng mới trong điều trị bệnh Alzheimer.
Nhận thấy, trong dịch chiết của Hoàng liên cũng có chứa một lượng lớn các
alkaloid đặc biệt là berberin có tiềm năng lớn trong nghiên cứu phát triển
thuốc mới từ dược liệu để phòng và điều trị bệnh thần kinh, suy giảm trí nhớ Alzheimer.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh giá tác dụng ức
chế enzym Acetylcholinesterase in vitro của các phân đoạn dịch chiết Hoàng
liên (Coptis chinensis Franch)” với mục tiêu:
Mục tiêu 1: Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE của các phân đoạn
dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch).
Mục tiêu 2: Đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE của phân
đoạn dịch chiết.

2


CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) –
Họ Hoàng liên (Ranunculaceae)
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Hiện nay có rất nhiều loài Hoàng liên chân gà được đưa vào sử dụng và
nghiên cứu như Coptis chinensis Franch, Coptis teeta Wall, Coptis deltoidea
C.Y.Cheng et Hsiao, Coptis quinqueseeta. Họ Hoàng liên: Ranunculaceae.
Hoàng liên: Coptis chinensis Franch, là một cây thuốc thuộc loại quý
với nhiều tác dụng được dùng trong nhiều bài thuốc ở Việt Nam. Tên khác:
Hoàng liên chân gà, Xuyên liên, Phàng lình (H’Mông) [9]. Read Coptis
(Anh), Coptis savoyard (Pháp) [2,9] Gia liên (Trung Quốc) [9].
Hoàng liên: Coptis chinensis Franch là cây thân thảo, sống nhiều năm,
cao 10-25 cm. Thân rễ có màu vàng thường phân nhánh, lá có cuống dài mọc
tập trung ở gốc, lá dài và mảnh chia thành 3 thùy chính. Mép khía răng không
đều, thùy giữa gần giống tam giác cân xẻ thùy hình dạng lông chim, không
đều. Hai thùy bên giống nhau có cuống lá ngắn hơn thùy giữa. Lá có màu
xanh lục, nhẵn bóng, cụm hoa gồm 3-5 hoa mọc tụ trên 1 cuống chung dài
khoảng 25 cm. Hoa nhỏ có màu vàng, lá bắc nhỏ, bao hoa màu lục. Năm lá
đài có hình mác, 5 cánh hoa thon dài, hoa có khoảng 20 nhị. Lá noãn rời nhau
khoảng 8-12 noãn. Cây ra hoa từ tháng 10-12. Quả có màu đen từ tháng 12
đến tháng 4 năm sau, nhỏ, dài 6-7 cm, có cuống ngắn. Vào mùa xuân cây con,
chồi có thể tái sinh từ thân rễ [2,4,5,7,9].

3


Hình 1.1. Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch)
1.1.2. Phân bố, trồng trọt và thu hái
 Phân bố
Hoàng liên là loại cây thân thảo mọc hoang trên các đỉnh núi cao.
Trong cuốn “Thần Nông bản thảo kinh” (Trung Quốc) có viết Hoàng

liên là cây thuốc quý cao cấp, được xếp vào loại thượng phẩm, cây mọc ở trên
núi Thái Sơn có nhiều ở vùng Tứ Xuyên, Kiến Bình, Hồ Nam, Hồ Bắc, Triết
Giang [13,14].
Ở Việt Nam, Hoàng liên là loại cây thuốc hiếm thường mọc hoang ở
vùng núi có độ cao từ 1500 – 2000 m trong các khu rừng có nhiều cây cổ thụ
rậm rạp, ở nơi nửa sáng, nửa tối.

4


 Trồng trọt
Ở Lào Cai, Hoàng liên mọc tại dãy Hoàng Liên Sơn (xã Tả Van, San
Sả Hồ, Lao Chải), Quảng Bạ (Hà Giang) [2,9]. Hoàng liên là cây ưa chỗ ẩm
mát, nhiệt độ thấp khoảng 20-250C. Muốn trồng Hoàng liên, chọn các quả già
nhưng chưa nứt vỏ. Đem quả về phơi cho nứt vỏ, chọn các hạt mập chắc rồi
reo ngay tránh để lâu làm mất khả năng mọc của hạt. Nếu chưa gieo ngay cần
trộn ủ hạt với đất lẫn cát ẩm. Trong vòng 1 tháng phải đem trồng nếu để lâu
hạt sẽ không nảy mầm.
 Thu hái
Thu hái Hoàng liên thường vào cuối thu đầu đông tháng 9-10, để chất
lượng dược liệu đạt cao nhất, để sang xuân chất lượng sẽ kém. Cây mọc từ 45 năm có thể được thu hoạch. Hoàng liên thu hái mang về rửa sạch, phơi hay
sấy khô là được [7].
1.1.3. Thành phần hóa học
Thân rễ Hoàng liên chứa hầu hết là các alkaloid (5 – 8%), trong đó chủ
yếu là berberin, worenin, jatrorrhizin, palmatin, coptisin, columbamin. Ngoài
ra còn có các alkaloid có nhân phenol, cũng như các alkaloid không có nhân
phenol.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phương pháp quang phổ tử
ngoại đã được dùng để xác định berberin hydrochlorid, palmatin clorid,
jatrorrhizin hydrochlorid, epiberberin, coptisin, columbamin và magnoflorin

trong các mô khác nhau (như phloem (libe), xylem (chất gỗ) và medulla (lõi))
và rizhome (thân rễ) của Coptis Chinensis Franch. Kết quả cho thấy khác biệt
đáng kể trong việc phân bố của 7 alkaloid trong các mô được kiểm tra, tổng
hàm lượng alkaloid trong xylem tương đối thấp so với hàm lượng trong
phloem, medulla và rhizome của Hoàng liên [47,48].
Berberin tinh khiết là dạng tinh thể kết tinh màu vàng, điểm nóng chảy
1450C, tan nhiều trong nước ở 200C, tan trong ethanol, ít tan trong clorofom,
benzen, không tan trong ether ethylic. UVmax 265, 243nm, pk = 2,47 [2-4].
Hàm lượng berberin trong Hoàng liên đạt 5-6% có khi tới 9% [9].
Theo quy định của Dược điển Việt Nam IV, Dược liệu phải chứa ít
nhất 3,5 % beberin (C20H18NO4. HCl) và 0,5% (C21H22NO4. HCl) palmatin
tính theo dược liệu khô kiệt [3].

5


Trong cây, berberin tồn tại dưới dạng clohydrat. Hàm lượng alkaloid
thay đổi tùy theo vùng và thời kỳ sinh trưởng của cây. Ở Tứ Xuyên (Trung
Quốc), hàm lượng berberin cao nhất vào tháng 9 và 10, thấp nhất vào thời kỳ
cây ra hoa. Ngoài thân rễ, lá cũng chứa berberin, hàm lượng cao nhất ở lá già.
Ở Nhã Liên (Trung Quốc), hàm lượng berberin chứa 5% vào tháng 9-10. Lá
già chứa 2,5 – 2,8% berberin vào tháng 7-10 [4,7,9].
Ngoài ra, trong dịch chiết EtOH của Hoàng liên còn phân lập được 13 hợp
chất non-alkaloid như 7 hợp chất lignan, 3 phenylpropanoid đơn giản, 2 hợp chất
flavon và 1 hợp chất phenolic acid. Đó là các hợp chất: erythro-guaiacylglycerol8-O-4'-(coniferyl alcohol) ether, threo-guaiacylglycerol-8-O-4'-(coniferyl
alcohol) ether, (+)-pinoresinol, (+)-medioresinol, (+)-lariciresinol, (+)-5'methoxylariciresinol, (+)-isolariciresinol, chlorogenic acid, ferulic acid, Zoctadecyl caffeat, rhamnetin, wogonin, and vanillic acid [12].

6

Công thức cấu tạo của một số alkaloid phân lập từ thân rễ Hoàng Liên
thể hiện ở hình 1.2.

Hình 1.2. Công thức cấu tạo một số chất trong thân rễ Hoàng liên

7


1.1.4. Bộ phận dùng
Thân rễ (Rhizoma Coptidis) là những mẩu cong queo dài 3-5 cm, rộng
0,2 - 0,5 cm. Có nhiều đốt khúc khuỷu và phân nhánh, trông giống hình chân
gà nên được gọi là Hoàng liên chân gà. Mặt ngoài màu nâu mang vết tích của
rễ phụ và cuống lá. Thể chất cứng rắn, vết bẻ ngang không phẳng. Phần gỗ
màu vàng tươi, vị rất đắng lưu vị lâu trong miệng [2,7,9].
1.1.5. Tác dụng dược lý
 Tác dụng kháng khuẩn
Dịch chiết Hoàng liên và hoạt chất berberin đều có phổ kháng khuẩn rất
rộng. Nước sắc thể hiện tác dụng ức chế vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng
sau: Nồng độ 1:5120 có tác dụng với Shigella shiga; nồng độ 1: 2560 có tác
dụng với Shigella dysenteriae; nồng độ 1: 1640 có tác dụng với
Staphylococcus aureus [4,9].
Dung dịch berberin clohydrat được pha loãng tiến hành phản ứng in
vitro cho thấy: nồng độ 1:32000 có tác dụng ức chế đối với Vibrio cholerae;
nồng độ 1:16000 có tác dụng với Staphylococcus aureus; nồng độ 1:8000 có
tác dụng ức chế vi khuẩn đối với Shigella dysenteriae, Streptococcus viridans
[1,4,9].
Tiêm tĩnh mạch trên chó với berberin clohydrat liều lượng 19mg/kg đã
cứu sống được con vật bị nhiễm trùng huyết thực nghiệm gây ra bởi
Staphylococcus aureus [1,9].
Dịch chiết thô Hoàng liên có tác dụng ức chế ký sinh đường ruột

Blastocystis hominis rất mạnh với nồng độ 100 µg/ml [1].
Về cơ chế tác dụng kháng khuẩn: berberin có khả năng ức chế quá trình
phiên mã và dịch mã tạo ARN và protein ở vi khuẩn. Các chất vitamin B6,
nicotinamid, acid p – aminobenzoic đều có tác dụng đối kháng với berberin.
Có hiện tượng kháng thuốc xảy ra khi dùng dài ngày berberin sulfat trên các
bệnh liên quan đến các chủng tụ cầu vàng, liên cầu khuẩn tán huyết, trực
trùng lỵ, nhưng đối với bài thuốc có Hoàng liên như bài “Hoàng liên giải độc
thang” thì không có hiện tượng kháng thuốc, ngược lại tác dụng kháng khuẩn
lại mạnh hơn [7,9].
Dịch chiết nước Hoàng liên có khả năng ổn định phức hợp không bền
với enzym ADN topoisomerase I ở động vật có vú. Nghiên cứu cho thấy rằng

8


hai tiền chất epiberberin và gloenlandicin của berberin là những tiểu phân
hoạt động có hoạt tính phân tách ADN qua trung gian topoisomerase I; song 2
alkaloid này lại không phân tách AND qua trung gian topoisomerase II. Chỉ
có tiền chất berberrubin (alkaloid loại protoberberin) là chất đặc hiệu phân
tách ADN qua trung gian topoisomerase II in vitro.
Những kết quả này cho thấy alkaloid gốc berberin là nhóm hợp chất có
khả năng tạo phức không bền với topoisomerase I và II [30].
 Tác dụng kháng virus
Dịch chiết nước Hoàng liên thí nghiệm trên phôi gà có tác dụng ức chế
sự phát triển của virus cúm chủng PR8 [1].
Palmatine có trong Hoàng liên có khả năng ức chế không cạnh tranh
enzym protease NS2B-NS3 của virus West Nile (WNV), với IC50 là 96 µM,
không gây độc tính tế bào. Hơn nữa, palmatin cũng có thể ức chế virus
dengue và virus sốt vàng theo các liều lượng. Hợp chất này có thể được phát
triển để điều trị các nhiễm trùng do virus [21].

 Tác dụng kháng nấm, đơn bào gây bệnh
Hoàng liên có tác dụng kháng một số loài nấm gây bênh ngoài da với
dịch chiết nước từ dược liệu này pha loãng 1:30 đã chứng tỏ tác dụng.
Quan sát dưới kính hiển vi berberin với nồng độ 1:5000 cho chuột nhắt
trắng đã được gây nhiễm amip uống với liều lượng 50 mg/kg có tác dụng ức
chế sinh trưởng của amip gây bệnh.
Dịch chiết Hoàng liên cho thấy tác dụng chống đơn bào Trypanosoma
cruzi gây bệnh Chagas với IC50 khá thấp là 1,7 µg/ml; và không gây độc cho
tế bào [36].
 Tác dụng trên đường tiêu hóa
Hoàng liên có tác dụng chống loét đường tiêu hóa. Nghiên cứu cho
chuột cống trắng uống dich chiết alkaloid của Hoàng liên có tác dụng ức chế
nhẹ loét dạ dày thực nghiệm do stress. Bằng đường tiêm dưới da trên chuột
cống trắng berberin có tác dụng ức chế hình thành vết loét và hiện tượng chảy
máu dạ dày trong mô hình gây loét do thắt môn vị [9].
Dịch chiết từ Hoàng liên có tác dụng làm tăng nhẹ sự phân tiết dịch
nước bọt, dịch vị, dịch mật và tăng cường hoạt động của ruột, dạ dày từ đó
kích thích tiêu hóa, có lợi cho đường tiêu hóa [4,7].

9


Nghiên cứu cho thấy, dịch chiết nước của thân rễ Hoàng liên có tác
dụng ức chế Helicobacter pylori (H.pylori), ngăn ngừa và phòng tránh các
bệnh liên quan đến loét dạ dày- tá tràng; có so sánh với berberin và dịch
chiết Hoàng bá (Cortex Phellodendri). Tác dụng ức chế enzym urease tiết
ra bởi H.pylori và urease của đậu jack của dịch Hoàng liên cao hơn Hoàng
bá và berberin (với giá trị IC50 nhỏ hơn hẳn). Sự ức chế không cạnh tranh
của Coptis chinensis Franch có sự tương quan nồng độ và thời gian, có khả
năng giải ức chế bằng glutathion được cho là do sự tương tác của các hợp

chất trong dịch chiết với nhóm sulfhydryl của vị trí hoạt động trên enzym
urease [32,51].
 Tác dụng chống viêm
Coptisin, thành phần chính của Coptis chinensis Franch, đã cho thấy
khả năng ức chế mạnh sản xuất oxit nitơ (NO) bằng cách ức chế protein và
các biểu hiện mARN của enzym tổng hợp oxi nitric (iNOS) trong
lipopolysaccharid (LPS) kích thích các đại thực bào RAW 264.7. Coptisin
cũng ức chế sản xuất các cytokin gây viêm là interleukin-1β (IL-1β) và
interleukin-6 (IL-6) bằng cách ức chế sự biểu hiện mARN của cytokin; đồng
thời ức chế sự thoái hoá của protein ức chế nhân tố nhân κBα (IκBα) và
phosphoryl hóa yếu tố điều chỉnh tín hiệu ngoại bào (ERK), c-Jun NH2terminal kinase (JNK), p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK), và
phosphoinositide 3-kinase/Akt (PI3K/Akt). Coptisin cũng ức chế sự xuất hiện
của TNF-α và NO trong các mô viêm ở chuột thí nghiệm.
Các kết quả này cho thấy coptisin trong Hoàng liên ức chế sự viêm LPS
bằng cách ngăn chặn sự kích hoạt yết tố nhân κB, MAPK và PI3K / Akt trong
các đại thực bào có tác dụng chống viêm đặc hiệu [19,45].
Dịch chiết thân rễ Coptis chinensis Franch kích hoạt tế bào MOLT-4,
Th1, MAPK giúp tăng cường miễn dịch trong viêm, đóng vai trò như các chất
bổ trợ, bổ sung để điều trị trong suy giảm hệ thống miễn dịch [20].
 Tác dụng chống oxy hóa
Dịch chiết ethanol hoa cây Hoàng liên cho thấy khả năng làm tăng
lượng superoxid dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathion (GSH)
trong tế bào giúp trung hòa các gốc tự do có tác dụng chống oxy hóa mạnh cả
in vitro và in vivo [46].

10


Jatrorrhizin chứng tỏ khả năng chống oxy hóa do độc tính của hydrogen
peroxid gây ra ở tế bào não chuột thí nghiệm [39].

 Tác dụng trên tim, hạ huyết áp
Tiêm dưới da dịch chiết nước của Hoàng liên hoặc berberin trên súc vật
thí nghiệm có tác dụng làm hạ huyết áp nhất thời; chế phẩm điều chế từ
Hoàng liên đã loại bỏ berberin cũng có tác dụng làm hạ huyết áp trên chuột
cống trắng [1].
Thành phần palmatin và coptisin trong dịch chiết Hoàng liên có tác
dụng bảo vệ và giảm tổn thương tế bào cơ tim thông qua việc làm bền vững ty
thể màng, giảm kích thước vùng bị nhồi máu, giải phóng malondialdehyd
(MDA), tăng superoxid dismutase (SOD) [28,49,52].
 Tác dụng phòng xơ vữa động mạch, giảm béo phì
Trên thỏ thí nghiệm được nuôi bằng chế độ ăn uống có lượng
cholesterol cao, dịch chiết nước Hoàng liên dùng bằng đường uống có tác
dụng làm cho tỷ lệ cholesterol toàn phần/lipid trở về giá trị bình thường
[4,9,24].
Berberin trong dịch chiết Hoàng liên có khả năng làm tăng sự biểu hiện
của enzym adipose triglycerid lipase (ATGL) và hormone-sensitive lipase
(HSL) đẩy nhanh quá trình phân giải triacylglycerol (TG) ở mô mỡ, có tác
dụng đáng kể trong giảm béo phì [16,29].
Trong dịch chiết Hoàng liên chứa Jatrorrhizin hydrochlorid (JH) được
nghiên cứu có khả năng ức chế hình thành lipid và tăng cường oxy hóa lipid
trong gan chuột thí nghiệm [43].
 Tác dụng hạ đường huyết
Dịch chiết Hoàng liên làm giảm khả năng kháng insullin của tế bào
trong mô hình chuột Wistar bị đái tháo đường týp II gây ra bởi chế độ ăn giàu
chất béo và tiêm streptozotocin thông qua con đường ức chế c-Jun N terminal
kinase [24,37].
 Tác dụng trên hệ thần kinh
Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng Hoàng liên cũng có tác dụng an thần,
chống trầm cảm, stress, tác dụng tốt trên hệ thần kinh. Berberin, jatrorhizin và
palmatin được phân lập từ dịch chiết MetOH của Hoàng liên Coptis chinensis

11


Franch có tác dụng ức chế MAO (monoaminoxidase- enzym xúc tác quá trình
phân hủy chất dẫn truyền thần kinh monoamin).
Jatrorrhizin ức chế không cạnh tranh MAO-A và B ở ty thể của tế bào
não chuột với giá trị IC50 lần lượt là 4 và 62 µM. Berberin chỉ ức chế cạnh
tranh với giá trị IC50 là 126 µM. Trong khi palmatin không có khả năng ức
chế mặc dù nồng độ dùng là 200 µM [31,39].
Dịch chiết Hoàng liên cho thấy khả năng tăng tiết và tăng hoạt tính của
enzym tyrosin hydroxylase kích thích nơ-ron thần kinh trong mô hình in vitro
và in vivo ở bệnh Parkinson gây ra bởi MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6tetrahydropyridin)[41].
Trong mô hình gây stress oxy hóa tế bào thần kinh bằng tertbutylhydroperoxid (t-BOOH), dịch chiết nước Hoàng liên nồng độ 100 µg/ml
cho thấy khả năng tăng sự sống sót của tế bào, giảm tỷ lệ tế bào tự chết theo
chương trình (apoptosis) và tăng hoạt lực của ty thể trêng màng; tác dụng bảo
vệ tế bào thần kinh [40].
Hiện nay có một số nghiên cứu mới chứng minh tác dụng ức chế
enzym Acetylcholinesterase của dịch chiết toàn phần Hoàng liên in vitro cải
thiện tình trạng suy giảm trí nhớ và tiến tới điều trị bệnh Alzheimer [17,26].
 Tác dụng chống ung thư
Hoạt chất berberin phân lập từ chiết xuất Hoàng liên cho thấy tác dụng
chống ung thư trên đích tác dụng ephrin-B2, ức chế tế bào khối u ZR-75-30
phát triển và dự di căn của chúng [43]. Trong nghiên cứu trên tế bào ung thư
tuyến tiền liệt in vitro, berberin cho thấy tác dụng ức chế sự ra tăng tế bào ưng
thư thông qua khả năng kích thích quá trình tế bào tự chết theo chương trình
apoptosis hoặc ngừng chu trình tế bào bằng cách ức chế tín hiệu của yếu tố
tăng trưởng biểu bì EGFR (epidermal growth factor receptor) [50].
Trong thành phần dịch chiết Hoàng liên chứa jatrorrhizin hydrochlorid
có tác dụng chống u ác tính trên da do có khả năng ức chế tăng sinh tân mạch

máu ở tế bào u ác tính di căn ở tế bào người C8161 in vitro [35].
 Độc tính
Berberin ít độc. Trên người uống một lần 2 g, chưa phát hiện có triệu
chứng ngộ độc [1]. Bài tiết rất nhanh, một phần qua nước tiểu, một phần bị

12


chuyển hóa trong cơ thể [7]. Hiện chưa có nghiên cứu chứng minh độc tính
của Hoàng liên chân gà lên cơ thể người.
1.2. Tổng quan về nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym
Acetylcholinesterase in vitro
1.2.1. Acetylcholin, enzym Acetylcholinesterase và giả thuyết về vai
trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer
1.2.1.1. Acetylcholin
Acetylcholin (ACh) là chất trung gian hóa học có mặt trong phần lớn
các khe synap thần kinh trung ương, thần kinh thực vật, thần kinh-cơ.
Acetylcholin tìm thấy ở hành não, cầu não, thân não, não trung gian, thể vân
và vỏ não mới (nhiều nhất ở vùng vận động). Trong tủy sống, các hạch thần
kinh thực vật, các tận cùng thần kinh tiếp xúc với cơ quan ngoại vi đều chứa
ACh.
Acetylcholin được tổng hợp từ cholin và acetyl Coenzym A do enzym
cholin acetyl transferase xúc tác phản ứng, sau đó, được lưu giữ ở vị trí cuối
dây thần kinh, trong các túi. Các chất trong túi được giải phóng khi vị trí cuối
dây thần kinh bị khử cực và khi đó ACh được giải phóng vào khe synap và
gắn với thụ thể. ACh sau khi được giải phóng có thời gian bán thải rất ngắn vì
sự có mặt của enzym AChE. Đây là enzym thủy phân dây nối este trong phân
tử ACh tạo ra cholin và acid acetic. Cholin sau đó được thu nhận lại vào tế
bào thần kinh để tổng hợp ACh. Do đó, những chất có tác dụng ức chế AChE
sẽ kéo dài thời gian tồn tại và thời gian tác dụng của ACh [8,11].

Trong những năm gần đây, ACh được thấy có liên quan tới nhiều chức
năng khác bên cạnh chức năng dẫn truyền thần kinh. Trong đó, ACh được
xem là có liên quan đến sự tiến triển của bệnh viêm dây thần kinh và quá trình
sản sinh sợi amyloid, những đặc điểm điển hình được thấy trong tế bào não
của bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer [33].
1.2.1.2. Enzym Acetylcholinesterase
AChE, với vai trò thủy phân ACh, là một protêin có hình elip chứa một
rãnh sâu, được gọi là hẻm. Quá trình thủy phân ACh được xúc tác bởi AChE
diễn ra ở đáy của hẻm enzym theo cơ chế khá phức tạp. Ở đáy của hẻm, nơi
xảy ra sự thủy phân cơ chất ACh, có 4 vị trí hoạt động chính là vị trí este hóa,

13


vị trí oxy-anion, vị trí anion và túi acyl [27]. Những vị trí hoạt động này của
AChE được minh họa ở hình 1.3.

Hình 1.3. Các vị trí hoạt động của enzym AChE
AChE là một trong những enzym thủy phân nhanh nhất. Hoạt tính của
nó mạnh gấp khoảng 10 lần so với serin protease hoặc butyrylcholinesterase
(enzym thủy phân ACh chủ yếu ở tế bào thần kinh đệm) ở cùng điều kiện
nhiệt độ và pH [23].
1.2.1.3. Giả thuyết về vai trò hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer
AChE chủ yếu có mặt trong hệ thần kinh trung ương, xúc tác thủy phân
chất dẫn truyền ACh. Quá trình này cần thiết để chuyển tế bào thần kinh hệ
cholinergic từ trạng thái hoạt động sang tình trạng nghỉ [8,27]. Ở bệnh nhân
Alzheimer thấy có sự giảm trầm trọng nồng độ chất dẫn truyền thần kinh
ACh. Tình trạng này gây suy giảm khả năng nhận thức đối với người bệnh.
Giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic trong bệnh Alzheimer được đưa ra lần
đầu tiên vào năm 1982 bởi tác giả Whitehouse và cộng sự. Sau đó, giả thuyết

này nhanh chóng trở thành động lực cho quá trình nghiên cứu theo hướng cải
thiện chức năng hệ cholinergic trên bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer. Theo giả
thuyết này, những chất ức chế sự hoạt động của AChE làm tăng nồng độ và

14


thời gian hoạt động của ACh ở synap thần kinh từ đó cải thiện triệu chứng
bệnh [15,33].
1.2.2. Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc
tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro
Nghiên cứu sàng lọc là giai đoạn đầu của quá trình nghiên cứu phát
triển thuốc mới. Giai đoạn này thường tiến hành đánh giá hoạt tính của một
lượng lớn các mẫu thử. Vì vậy, những phương pháp được lựa chọn để sử dụng
ở giai đoạn này phải là những phương pháp có thể tiến hành đồng thời nhiều
mẫu, lượng mẫu cần ít, cho kết quả nhanh và chi phí thấp. Phương pháp thử in
vitro đáp ứng được tất cả những yêu cầu đó. Đối với nghiên cứu sàng lọc tác
dụng ức chế AChE in vitro, có 2 phương pháp thường được sử dụng là
phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman và phương pháp sử dụng thuốc thử
muối Fast Blue B.
1.2.2.1. Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman
Trong số những phương pháp được sử dụng để nghiên cứu sàng lọc tác
dụng ức chế AChE in vitro, phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman được xây
dựng và ứng dụng sớm nhất. Hiện nay, phương pháp này vẫn được sử dụng
khá phổ biến ở nhiều nghiên cứu cùng hướng. Trong đó, phương pháp đo
quang được sử dụng nhiều hơn phương pháp sắc ký lớp mỏng. Phương pháp
này sử dụng cơ chất là acetylthiocholin iodid (ATCI) và thuốc thử là 5,5’dithiobis - nitrobenzoic acid (DTNB).
 Phương pháp đo quang
Phương pháp của Ellman dùng để xác định hoạt tính của enzym
cholinesterase dựa vào đo quang được tác giả này mô tả lần đầu tiên vào năm

1961[18,33]. Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất ATCI bị thủy phân nhờ
xúc tác của cholinesterase tạo thiocholin. Thiocholin phản ứng với thuốc thử
DTNB giải phóng ra hợp chất 5-thio-2-nitrobenzoic acid màu vàng. Hợp chất
này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 412
nm.
Sau đó, nhiều nghiên cứu sàng lọc về tác dụng ức chế AChE in vitro
khác tiếp tục được thực hiện. Tuy nhiên, so với phương pháp gốc được công
bố bởi Ellman, phương pháp được triển khai trong các nghiên cứu sau đó đều
có một số thay đổi về: nguồn gốc và hoạt độ của enzym, loại đệm sử dụng,

15


nồng độ dung dịch cơ chất và thuốc thử… cũng như tỷ lệ phối hợp của chúng
vào hỗn hợp phản ứng.
 Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Trên cơ sở phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman, phương
pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) đã được phát triển. Ở phương pháp này, sau khi
bản mỏng được triển khai, hỗn hợp gồm dung dịch thuốc thử DTNB và cơ
chất ATCI được phun lên bản mỏng, sau đó mới phun dung dịch enzym.
Những chất gây ức chế AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền
vàng [10].
Một trong những hạn chế của phương pháp TLC là có thể gặp phải hiện
tượng dương tính giả, hiện tượng vết màu trắng xuất hiện trên bản mỏng
không phải do tác dụng ức chế AChE. Để khắc phục hạn chế này, bên cạnh
bản mỏng thử phải tiến hành làm thí nghiệm với một bản mỏng khác (bản đối
chiếu). Các bước tiến hành trên bản đối chiếu tương tự như trên bản thử chỉ
khác ở giai đoạn phun thuốc thử hiện màu. Đối với bản thử, hỗn hợp dung
dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun trước, sau đó mới phun
dung dịch AChE. Với bản đối chiếu, dung dịch thuốc thử DTNB được phun

trước, sau đó hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất ATCI và dung dịch AChE được
phun sau. Cách bố trí thử nghiệm như trên nhằm đảm bảo những vết màu
trắng xuất hiện trên cả hai bản là những vết cho phản ứng dương tính giả.
1.2.2.2. Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B
So với phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman, số lượng nghiên cứu sử
dụng phương pháp này để sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro khá hạn
chế. Phương pháp này sử dụng cơ chất là α-naphthyl acetat và thuốc thử là
muối Fast Blue B (muối O-dianisidin bis(diazotized) zinc double).
 Phương pháp đo quang
Thử nghiệm đo quang sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B được công
bố lần đầu tiên bởi tác giả Van Asperen K. vào năm 1962 [7]. Nguyên tắc của
phương pháp: cơ chất α-naphthyl acetat bị thủy phân bởi enzym esterase giải
phóng chất α-naphthol. Chất này sau đó phản ứng với thuốc thử muối Fast
Blue B tạo thành sản phẩm màu diazo. Hợp chất này được xác định bằng cách
đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 600 nm. Tuy nhiên, sau đó, không
có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp này để nghiên cứu sàng lọc tác

16


dụng ức chế AChE in vitro và một trong số đó là nghiên cứu của tác giả Di
Giovanni S. [15]. Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu của tác giả
này có một số thay đổi so với phương pháp của tác giả Van Asperen về:
nguồn gốc và hoạt độ của enzym, hóa chất để bất hoạt enzym và nồng độ
dung dịch cơ chất.
 Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Muối Fast Blue B cũng được sử dụng như một thuốc thử trong phương
pháp TLC để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro và được phát
triển bởi Marston năm 2002. Ở phương pháp này, sau khi bản mỏng được triển
khai, dung dịch enzym được phun lên bản mỏng. Sau đó, hỗn hợp gồm dung dịch

cơ chất α-naphthyl acetat và dung dịch thuốc thử muối Fast Blue B được phun lên
bản mỏng. Những chất gây ức chế AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên
nền màu tím sẫm [15].
Cũng giống phương pháp BTLC sử dụng thuốc thử Ellman, phương
pháp TLC sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B cũng có thể gặp phải hiện
tượng dương tính giả. Để loại trừ các vết dương tính giả, một bản mỏng đối
chiếu tương tự với bản mỏng thử được triển khai. Sau đó, các dung dịch αnaphthol và muối Fast Blue B được phun lên bản mỏng mà không có dung
dịch enzym. Nếu xuất hiện vết màu trắng thì vết đó là vết dương tính giả.
Bên cạnh 2 phương pháp được trình bày ở trên, phương pháp điện di
mao quản cũng đã được sử dụng để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế
AChE in vitro trong nghiên cứu của Tang Z. M. (2007) [38]. Tuy nhiên, mới
chỉ có rất ít nghiên cứu sử dụng phương pháp này được công bố. Lý do là bởi
phương pháp này đòi hỏi phải có trang thiết bị phù hợp với thao tác thử
nghiệm tương đối phức tạp. Ngoài ra, hạn chế về số lượng mẫu thử được đánh
giá ở mỗi lần thao tác máy cũng góp phần cản trở việc ứng dụng phương pháp
điện di mao quản trong nghiên cứu sàng lọc.
Như vậy, Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) có chứa một
lượng cao các alkaloid đặc biệt là berberin cho thấy tác dụng khả quan trên
enzym AChE để tiến tới điều trị các bênh thần kinh sa sút trí tuệ rất đáng quan
tâm. Tuy nhiên các nghiên cứu về tác dụng tiềm năng này của Hoàng liên còn
khá ít trong khi nhu cầu về thuốc điều trị và dự phòng bệnh Alzheimer càng
tăng. Đây cũng là cơ sở khoa học để hình thành ý tưởng của đề tài này.

17