Đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro của cây nở ngày đất (gomphrena celosiodes mart)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

VŨ THỊ HOA

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM
XANTHIN OXIDASE IN VITRO
CỦA CÂY NỞ NGÀY ĐẤT
(GOMPHRENA CELOSIODES MART.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

VŨ THỊ HOA

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ
ENZYM XANTHIN OXIDASE IN VITRO
CỦA CÂY NỞ NGÀY ĐẤT
(GOMPHRENA CELOSIODES MART.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa: QH.2012.Y
Người hướng dẫn: ThS. ĐẶNG KIM THU
TS. BÙI THANH TÙNG

Hà Nội – 2017


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ quý báu
của các tập thể, các thầy cô giáo, bạn bè và những người thân của tôi.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Đặng Kim Thu,
người thầy đã hướng dẫn tận tình và quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện khóa luận. Tôi cũng chân thành biết ơn TS. Bùi Thanh Tùng
đã tận tình hướng dẫn, giải đáp những thắc mắc và giúp đỡ tôi trong quá
trình thực hiện đề tài.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám hiệu và các bộ môn
Khoa Y - Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
trong thời gian học tập và nghiên cứu
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:
Các thầy cô và anh chị kĩ thuật viên bộ môn Dược lý – Dược lâm
sàng,bộ môn Dược Liệu, bộ môn Y – Dược học cơ ở, Khoa Y-Dược, Đại học
Quốc Gia Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận.
Lời cuối cùng, tôi xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè, người thân - những
người đã ủng hộ, chia sẻ, động viên tôi những lúc khó khăn và giúp tôi hoàn
thành khóa luận này.
Hà Nội, tháng 5, năm 2017
Sinh viên
Vũ Thị Hoa

1


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. 1

MỤC LỤC ........................................................................................................ 2
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... 5
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ 6
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... 7
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 8
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN.......................................................................... 9
1.1. Tăng acid uric máu ................................................................................ 9
1.1.1. Sinh chuyển hóa acid uric ............................................................... 9
1.1.2. Vai trò của enzym XO trong sinh chuyển hóa acid uric ................. 9
1.1.3. Tăng acid uric máu ....................................................................... 10
1.2. Enzym XO và các chất ức chế enzym XO ............................................ 11
1.2.1. Enzym XO ...................................................................................... 12
1.2.2. Các thuốc có tác dụng ức chế enzym XO ...................................... 13
1.3. Nở ngày đất (Gomphrena Celosiodes Mart.)....................................... 17
1.3.1. Nở ngày đất ................................................................................... 17
1.3.2. Đặc điểm thực vật và phân bố ...................................................... 18
1.3.3. Thành phần hóa học ...................................................................... 18
1.3.4. Tác dụng dược lý ........................................................................... 19
1.4. Các phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro ......... 19

2


1.4.1. Phương pháp đo quang ................................................................. 20
1.4.2. Phương pháp đo áp ....................................................................... 21
1.4.3. Phương pháp đo sử dụng HPLC với detector huỳnh quang ......... 21
1.4.4. Một số phương pháp khác ............................................................. 21
CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 22
2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 22
2.1.1. Dược liệu nghiên cứu .................................................................... 22

2.1.2. Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu....................................................... 22
2.2. Phương tiện nghiên cứu ....................................................................... 23
2.2.1. Hóa chất và thuốc thử ................................................................... 23
2.2.2. Thiết bị và dụng cụ ........................................................................ 24
2.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 24
2.4. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 25
2.4.1. Nghiên cứu triển khai mô hình đánh giá tác dụng ức chế enzym
XO in vitro của dược liệu ........................................................................ 25
2.4.2. Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym XO in vitro của dịch chiết toàn
phần và các phân đoạn dịch chiết của cây Nở ngày đất ........................ 27
2.5. Phương pháp xử lí số liệu .................................................................... 30
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................. 31
3.1. Kết quả ................................................................................................. 31
3.1.1. Kết quả nghiên cứu triển khai mô hình đánh giá tác dụng ức chế
enzym XO in vitro của dược liệu ............................................................. 31

3


3.1.2. Kết quả nghiên cứu tác dụng ức chế enzym XO in vitro của dịch
chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết của cây Nở ngày đất ........ 35
3.2. Bàn luận ............................................................................................... 38
3.2.1. Về nghiên cứu triển khai mô hình đánh giá tác dụng ức chế enzym
XO in vitro của dược liệu ........................................................................ 38
3.2.2. Về nghiên cứu tác dụng ức chế enzym XO in vitro của dịch chiết
toàn phần và các phân đoạn dịch chiết của cây Nở ngày đất................. 39
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 1

4

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
STT

Tên viết tắt

Tên đầy đủ

1

ABTS

2,2’-azino-bis (3-ethybenzothiazolin-6-sulphonat)

2

AHP

2-amino-4-hydroxypteridin

3

DMSO

dimethyl sulfoxid

4

ETDA

ethylence diamine tetraacetic acid

5

FAD

dinucleotide adenine flavin

6

FDA

Cục quản lí Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ
(Food and Drug Administration)

7

HPLC

sắc kí lỏng hiệu năng cao (high-performance
liquid chromatography)

8

IC50

nồng độ ức chế 50% (the half maximal inhibitory
concentration)

9

IXP

isoxanthopterin

10

NSAIDS

11

OD

mật độ quang học

12

SOD

superoxide dismutase

13

XO

xanthin oxidase

thuốc chống viêm không steroid (non steroidial
anti inflammatory drugs)

5


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzym XO
và cơ chất xanthin lên sự hình thành acid uric ................................................ 26
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzym XO và cơ chất xanthin
lên sự hình thành acid uric .............................................................................. 31
Bảng 3.2. Khả năng ức chế enzym XO in vitro của Allopurinol ................... 34
Bảng 3.3. Kết quả định tính flavonoid trong dịch chiết ethanol toàn phần và
các phân đoạn dịch chiết của cây Nở ngày đất. .............................................. 35
Bảng 3.4. Khả năng ức chế enzym XO in vitro của dịch chiết toàn phần và các
phân đoạn dịch chiết cây Nở ngày đất ở các nồng độ khác nhau ................... 36

6


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ chuyển hóa purin................................................................... 10
Hình 1.2. Cấu trúc enzym xanthin oxidase. .................................................... 12
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học Allopurinol .......................................................... 14
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của Febuxostat (TMX-67, TEI-6720)................. 15
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của Quercetin ...................................................... 17
Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của Luteolin ........................................................ 17
Hình 2.1. Cây Nở ngày đất.............................................................................. 22
Hình 2.2: Quy trình chiết xuất dược liệu. ....................................................... 23
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình thí nghiệm.............................................................. 29
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzym XO và cơ chất
xanthin lên hiệu suất phản ứng........................................................................ 32

Hình 3.2. Khả năng ức chế enzym XO in vitro của Allopurinol .................... 34
Hình 3.3. Khả năng ức chế enzym XO in vitro của dịch chiết toàn phần và các
phân đoạn dịch chiết Nở ngày đất ở các nồng độ khác nhau .......................... 37

7


ĐẶT VẤN ĐỀ
Xanthin oxidase (XO) là một enzym có cấu trúc phức tạp, được biết
đến cách đây hơn 100 năm và được xem là enzym chìa khóa trong chuyển hóa
purin. Enzym XO xúc tác cho phản ứng oxy hóa hypoxanthin thành xanthin
và phản ứng oxy hóa xanthin thành acid uric. Đây là hai phản ứng trong giai
đoạn cuối cùng của quá trình chuyển hóa các base purin trong cơ thể [29]. Bất
kì tác động nào ảnh hưởng đến hoạt động của xanthin oxidase cũng ảnh
hưởng đến sự tạo thành acid uric.
Acid uric là sản phẩm thoái giáng cuối cùng của nucleoprotein có chứa
nhân purin. Tăng acid uric máu được xác định là yếu tố nguy cơ của gút [24].
Nồng độ acid uric máu càng cao thì nguy cơ mắc gút càng lớn [33]. Bất kì yếu
tố nào làm tăng quá trình tổng hợp hoặc giảm sự thải trừ acid uric đều có thể
làm tăng nồng độ acid uric máu [24]. Vì vậy, việc sử dụng các chất ức chế
enzym XO để cản trở hình thành acid uric trong cơ thể là một mục tiêu mà
các nghiên cứu đã và đang hướng tới trong phòng và điều trị bệnh gút.
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu phát triển thuốc điều trị tăng acid
uric máu. Bên cạnh việc phát triển các thuốc tổng hợp hóa học, thực vật và
dược liệu cũng là một nguồn nguyên liệu lớn được quan tâm giúp quá trình
điều trị tăng acid uric máu. Cây Nở ngày đất có tên khoa học là Gomphrena
celosiodes Mart., họ Dền (Amranthaceae). Người ta đã tìm thấy các hợp chất
phenolic, flavonoid, saponin, sterol, terpen, tannin và coumarins trong thành
phần hóa học của cây Nở ngày đất [12]. Nhiều nghiên cứu cũng đã chỉ ra khả
năng chống oxy hóa, khả năng ức chế cao đối với lipid peroxidation của acid

linoleic [12][54]. Tại một số vùng người dân đã sử dụng cây Nở ngày đất để
điều trị bệnh gút. Tuy nhiên, hiện nay chưa có nghiên cứu khoa học nào được
công bố về tác dụng điều trị bệnh gút cũng như khả năng ức chế enzym XO
của cây Nở ngày đất.
Trên thực thế đó, để góp phần sàng lọc nhằm tìm kiếm các dược liệu có
khả năng ức chế XO, bước đầu trong quá trình xác định dược liệu tiềm năng
điều trị gút, đề tài nghiên cứu: “Đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthin
oxidase in vitro của cây Nở ngày đất (Gomphrena Celosiodes Mart.)” được
thực hiện với hai mục tiêu sau:
1. Triển khai được mô hình đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthin
oxidase in vitro của dược liệu.
2. Đánh giá được tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase của dịch chiết
toàn phần và các phân đoạn dịch chiết của cây Nở ngày đất.

8


CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. Tăng acid uric máu
1.1.1. Sinh chuyển hóa acid uric
Khi thủy phân hoàn toàn acid nucleic (acid deoxyribo nucleic, acid
ribonucleic) sẽ thu được các base (purin và pyrimidin), đường 5 carbon
(ribose và deoxyribose) và phosphat. Base purin gồm có adenin và guanin.
Các nguyên tử của nhân purin được đánh số từ 1 - 9, trong đó đáng chú ý nhất
là N9 - nơi liên kết với đường 5 carbon (pentose) [8].
Thoái biến purin (nucleotid):
- Sự thoái biến các purin có thể xảy ra ở mức độ base tự do, nucleosid và
nucleotid. Ở người, acid uric là sản phẩm cuối cùng của quá trình thoái biến
purin [14].
- Các purin nucleotid đầu tiên bị tách nhóm phosphat dưới tác dụng của

5’- nucleotidase. Từ adenylat (adenosin monophosphat) sẽ tạo thành
adenosin, chất này tiếp tục khử amin thủy phân thành inosin bởi adenosin
deaminase. Inosin tiếp tục bị thủy phân tạo thành base hypoxanthin và
Dribose. Hypoxanthin tiếp tục bị oxy hóa thành xanthin rồi thành acid uric,
bởi xanthin oxidase.
- Thoái biến của guanosin monophosphat cũng tạo nên sản phẩm cuối là
acid uric. Guanosin monophosphat đầu tiên bị thủy phân tạo thành nucleosid
là guanosin. Guanosin bị phân cắt thành guanin, tiếp theo guanin khử amin
thủy phân thành xanthin và biến đổi thành acid uric nhờ xanthin oxidase.
- Ở người acid uric được đào thải ra nước tiểu. Nó còn là sản phẩm bài
tiết ở loài nguyên sinh, chim, loài nhai lại, côn trùng và một số động vật khác
[16].
1.1.2. Vai trò của enzym XO trong sinh chuyển hóa acid uric
XO là enzym có vai trò quan trọng trong việc hình thành acid uric.
Acid uric là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa các nuleooprotein
có chứa nhân purin trong cơ thể. Các purin được tạo ra chuyển hóa thành
hypoxanthin và xanthin, dưới tác dụng của XO, các hợp chất này bị oxy hóa
thành acid uric. Bất kì tác động nào ảnh hưởng đến hoạt động của XO cũng
ảnh hưởng đến sự tạo thành acid uric [15]. Qúa trình chuyển hóa base purin
trong cơ thể được miêu tả trong Hình 1.1

9


Hình 1.1. Sơ đồ chuyển hóa purin
Dựa vào mối liên quan mật thiết giữa nồng độ acid uric máu và enzym
XO đối với bệnh gút, cho nên ức chế enzym XO là một trong những cơ chế
chính mà các thuốc điều trị gút đang hướng tới.
1.1.3. Tăng acid uric máu
Tăng acid uric máu là khi nồng độ acid uric vượt quá giới hạn tối đa

của độ hòa tan của urat trong dung dịch có cùng nồng độ natri như huyết
tương, cụ thể là: > 420 µmol/L ở nam và > 360 µmol/L ở nữ [53].
Dựa trên cơ chế bệnh sinh, tăng acid uric có thể do:
Tăng tổng hợp acid uric máu: có thể do ăn nhiều thức ăn có chứa
purin, tăng tổng hợp purin nội sinh, tăng thoái biến nucleotid
hoặc phối hợp.
- Giảm bài tiết acid uric qua thận: có thể do giảm lọc ở cầu thận,
giảm tiết urat ở ống thận hoặc phối hợp.
- Phối hợp cả 2 nguyên nhân trên.
Tăng tổng hợp acid uric máu:
- Tăng acid uric máu tiên phát: không rõ nguyên nhân, thiếu
enzym hypoxanthin- guanin- phosphoribosyl- transferase (một
-

10


phần hay toàn bộ), tăng hoạt tính enzym 5- phosphoribosyl- 1pyrophosphat synthase.
- Tăng acid uric máu thứ phát: ăn quá nhiều thức ăn chứa purin,
tăng tái tạo nucleoid, tăng thoái hóa adenosin triphosphat, bệnh
dự trữ glycogen, bệnh cơ nặng.
Giảm bài tiết acid uric máu:
- Giảm bài tiết acid uric máu tiên phát: không rõ nguyên nhân.
- Giảm bài tiết acid uric máu thứ phát: suy thận, ức chế bài tiết
urat ở ống thận, tăng tái hấp thu urat ở ống thận.
- Cơ chế xác định rõ: tăng huyết áp, cường chức năng tuyến cận
giáp, một số thuốc làm tăng acid uric máu, bệnh thận do nhiễm
độc chì.
Tăng acid uric máu do nguyên nhân phối hợp:
- Lạm dụng rượu, thiếu oxy và giảm bão hòa oxy tổ chức, thiếu

hụt glucose- 6- phosphat, thiếu hụt fructore- 1- phosphataldolase [4].
Tăng acid uric máu là nguyên nhân của nhiều bệnh lý, nó được biết đến
là yếu tố nguy cơ quan trọng của bệnh gút, sự lắng đọng của các tinh thể urat
ở khớp gây ra viêm khớp gút, ở thận nguy cơ dẫn đến sỏi thận và các bệnh lý
thận. Ngoài ra, tăng acid uric máu còn liên quan đến nhiều bệnh lý khác nhau.
Một số nghiên cứu cho thấy tăng acid uric máu có liên quan đến bệnh gan
nhiễm mỡ không do rượu, tiền sản giật ở thai phụ, suy thận mãn tính, bệnh
tim mạch nhất là bệnh mạch vành, tăng huyết áp nguyên phát ở trẻ em và
người lớn, rối loạn lipit máu, xơ vữa động mạch cảnh, kháng insulin, đái tháo
đường týp 2...[10]
1.2. Enzym XO và các chất ức chế enzym XO
Năm 1902, Schardinger tìm ra rằng, trong sữa có chứa một loại enzym
có khả năng oxy hóa aldehyd axit, kèm theo việc giảm xanh methylen, enzym
này sau đó enzym này thường được gọi là "Schardinger enzym" [48].
Năm 1922, Morgan và cộng sự tìm thấy trong sữa có chứa một loại
enzym có khả năng oxy hóa xanthin và hypoxanthin, với mức giảm đồng thời
của O2 đến H2O2, và enzym này được gọi là XO [29].
XO là một enzym có cấu trúc phức tạp, được xem là chìa khóa của
chuyển hóa purin. Là enzym xúc tác cho phản ứng chuyển hypoxanthin và
xanthin thành urat. Sự tăng XO liên quan đến nhiều cơ chế bệnh sinh nên hiểu
biết về enzym, động học và kiểm soát enzym là thực sự cần thiết. Tuy nhiên,
do cấu trúc phức tạp và sự phân bố đặc biệt trong các mô, các chức năng của
enzym này vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ [29].

11


1.2.1. Enzym XO
1.2.1.1. Nguồn gốc, phân bố
Enzym XO được tìm thấy ở nhiều loài động vật có vú, chim, côn trùng

và vi khuẩn [16]. Trong các loài động vật có vú, XO được tìm thấy ở nhiều
mô và cơ quan như gan, ruột, thận, tim, phổi, não, huyết tương...nhưng nồng
độ cao nhất là ở gan và ruột. XO cũng được tìm thấy ở bề mặt các tế bào nội
mô của bò, lợn nhà và cả bề mặt của tế bào nội mô gan chuột [16][29]. Ở
người, XO được tìm thấy trong hầu hết các tế bào của cơ thể, tuy nhiên nó có
nhiều nhất trong tế bào gan và các tế bào ruột [11].
1.2.1.2. Tính chất lý hóa
XO có khối lượng phân từ 290 kDa. Bị ức chế bởi các ion kim loại
nặng, ure cũng như rất nhiều purin, pyrimidin và các hợp chất dị vòng khác
như purin-6-aldehyd, 2-amino-4-hydroxypteridin-6-andehyd.....pH tối ưu của
XO là 4,7 [7]. EDTA, histidin được cho vào quá trình chiết xuất enzym để
bảo vệ nó trong suốt quá trình phản ứng [42].
1.2.1.3. Cấu trúc và cơ chế hoạt động
Cấu trúc
XO thuộc nhóm molypden-protein có chứa một molypden, một
dinucleotid adenin flavin (FAD), các trung tâm của các loại ferredoxin trong
mỗi hai tiểu đơn vị độc lập chứa hai sắt- lưu huỳnh (2Fe-2S) [11][13]. Phần
phụ molybden bao gồm một dẫn xuất pterin hữu cơ, 2 nguyên tử lưu huỳnh
của molybdopterin, 2 nguyên tử oxi và 1 nguyên tử lưu huỳnh khác [29].
Hình 1.2:

Hình 1.2. Cấu trúc enzym xanthin oxidase.
A. Molybdopterin
B. Molybden cofactor
Cơ chế hoạt động
XO xúc tác quá trình oxy hóa của hypoxanthin để thành xanthin và sau
đó thành acid uric [18][20]. Hoạt động này xảy ra tại trung tâm molybden của
XO. Trong sự tái oxi hóa của XO, oxy phân tử đóng vai trò như chất nhận e,
12

sản xuất gốc superoxid và hydrogen peroxid. Trong các phản ứng này, các
gốc superoxid anion (O2-) và H2O2 được hình thành [35]. Các gốc superoxid
anion chuyển đổi tự nhiên hoặc dưới ảnh hưởng của enzym superoxid
dismutase (SOD) chuyển đổi thành hydrogen peroxid và oxy. Những phản
ứng này có thể được viết như sau [26]:

Hypoxanthin + O 2 + H 2O 
 Xanthin + H 2O 2
Xanthin + 2O 2 + H 2O 
 Acid uric + 2O•-2 + 2H +
Xanthin + O 2 + H 2O 
 Acid uric + H 2O 2
2O•-2 + 2H + 
 H 2O2 + O2
1.2.2. Các thuốc có tác dụng ức chế enzym XO
Hiện nay, gút trở thành một bệnh phổ biến và đã có nhiều nghiên cứu
đã được tiến hành nhằm tìm ra các loại thuốc mới ứng dụng trong điều trị.
Thuốc chống viêm và thuốc hạ acid uric máu là hai loại thuốc chính trong
điều trị gút hiện nay. Phần lớn các chỉ định điều trị theo 3 hướng và mục đích
chính sau:
-

Điều trị hạ urat, đó là nền tảng của điều trị gút, vì tăng acid uric máu
là thủ phạm sinh lí bệnh học chính.
Điều trị hạ urat dự phòng để giảm thiểu cơn viêm gút cấp trong giai
đoạn đầu điều trị.
Điều trị cơn gút cấp bằng kháng viêm thích hợp. Bệnh nhân thường
chỉ được điều trị cho cơn gút cấp mà không quản lí sự tăng acid uric
máu cơ bản dẫn đến lắng đọng urat liên tục mà biểu hiện như bệnh

cứng khớp, tổn thương khớp và viêm mãn tính [36]. Thuốc chống
viêm như colchicin hay NSAIDs được dùng chủ yếu điều trị gút cấp
[3].

Tuy nhiên, ở nghiên cứu này, đề cập chính đến sử dụng thuốc hạ acid
uric máu để điều trị gút. Có 2 con đường để giảm nồng độ acid uric máu trong
cơ thể, một là tăng đào thải, hai là giảm tổng hợp acid uric. Thuốc tăng đào
thải acid uric có nhược điểm là tác dụng hạ acid uric không cao và dễ gây sỏi
tiết niệu [50]. Hiện nay, các nhà nghiên cứu chú ý đến cơ chế tổng hợp acid
uric từ xanthin và hypoxanthin dưới xúc tác của XO và nhận ra rằng ức chế
XO sẽ ức chế quá trình tổng hợp acid uric và làm giảm nồng độ acid uric
máu. Đã có một số thuốc ức chế XO được sử dụng khá phổ biến trong trong
lâm sàng.

13


1.2.2.1. Các thuốc tân dược
 Allopurinol
Allopurinol (1,5-dihydro- 4H-pyrazolo [3,4-d] pyrimidin-4-one) (Hình
1.3) bước đầu đã được tổng hợp với mục tiêu để tạo ra các tác nhân chống
ung thư mới vào giữa năm 1950 bởi Falco, nhưng nó đã được tìm thấy có hoạt
tính ức chế XO, giảm acid uric huyết thanh [5].

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học Allopurinol
Tác dụng và cơ chế tác dụng:
Thuốc làm giảm nồng độ acid uric máu. Ngoài ra, thuốc làm tăng bài
xuất các tiền chất của acid uric qua nước tiểu [2].
Allopurinol ức chế XO, ngăn chặn sự tổng hợp urat từ xanthin và
hypoxanthin do đó làm giảm acid uric máu. Trong quá trình ức chế enzym

XO, Allopurinol được hydro hóa thành alloxanthin (oxypurinol), chúng phối
hợp chặt chẽ với các trung tâm Mo đã bị khử tạo thành phức hợp không hoạt
động [17]. Ở nồng độ thấp, Allopurinol là cơ chất và là chất ức chế cạnh tranh
của các enzym, ở nồng độ cao hơn, nó là chất ức chế không cạnh tranh [40].
Xét về dược động học, Allopurinol được hấp thu nhanh, đạt nồng độ
đỉnh trong huyết tương trong vòng 30 phút đến 60 phút sau khi uống. Khi sử
dụng Allopurinol, purin trong nước tiểu sẽ tồn tại ở 3 dạng acid uric và
hypoxanthin và xanthin. Mỗi chất có độ tan riêng do đó làm tăng lượng thải
trừ purin qua nước tiểu, giảm nồng độ urat và acid uric máu. Allopurinol làm
giảm acid uric máu dưới độ tan giới hạn nên hòa tan các hạt tophi và ngăn
ngừa sự tiến triển của viêm khớp mạn do gút [2].
Liều dùng:
Bắt đầu từ 100 mg/ngày ở bệnh nhân có chức năng thận bình thường;
bắt đầu từ 50 mg/ngày ở bệnh nhân suy thận mãn giai đoạn 2 hoặc tệ hơn; hầu
hết bệnh nhân dùng liều cao hơn 300 mg/ngày để đạt được mục tiêu urat
huyết thanh, liều tối đa được FDA phê chuẩn là 800 mg/ngày [51].
Ưu điểm:
Thuốc được dùng trong điều trị gút mạn và các trường hợp tăng acid uric
máu [2]. Thuốc có giá trị đặc biệt ở những bệnh nhân có tình trạng tăng acid
14


uric máu tổng hợp, bệnh nhân có tophi, bệnh nhân không đáp ứng với các
thuốc tăng đào thải acid uric và bệnh nhân có sỏi acid uric [50].
Allopurinol được dùng nhiều hơn các thuốc gây tăng thải acid uric máu
do có thể dùng được trên hầu hết các bệnh nhân, dùng một lần/ngày và tỷ lệ
gặp tác dụng không mong muốn ít [2]. Do thuốc làm tăng bài xuất các tiền
chất của acid uric qua nước tiểu nên tỉ lệ gây sỏi thận và cơn đau quặn thận ít
hơn [34].
Ngoài điều trị gút, Allopurinol còn dùng phối hợp điều trị thiếu máu cục

bộ, tổn thương mạch máu và suy tim mạn để cải thiện hoạt động bất thường
của nội mô và làm giảm các dấu hiệu stress oxy hóa [37][45].
Nhược điểm:
Các tác dụng phụ thường gặp nhất của Allopurinol là đau dạ dày, phản
ứng quá mẫn, phát ban da. Khoảng 2-5% người có phát ban nhẹ [51]. Các
phản ứng quá mẫn có thể xảy ra ngay cả sau nhiều tháng hoặc nhiều năm
dùng thuốc. Hội chứng quá mẫn với allpopurinol là tác dụng phụ hiếm gặp
(1:1000) nhưng có thể gây tử vong [51]. Các tác dụng này thường xảy ra ở
những người suy giảm chức năng thận, chưa được chỉnh liều. Allopurinol có
thể làm tăng tác dụng của cyclophosphamid và ức chế sự chuyển hóa của các
thuốc chống đông đường uống và làm giảm acid uric trong máu. Các triệu
chứng của quá mẫn Allopurinol bao gồm sốt, phát ban, viêm mạch máu, bạch
cầu ưa eosin, tăng bạch cầu, viêm gan và suy thận, thậm chí có thể dẫn đến tử
vong đặc biệt là ở những bệnh nhân cao tuổi bị suy thận dùng thuốc lợi tiểu
thiazid [36]. Bởi vậy cần chú ý khi tăng liều đối với bệnh nhân suy thận.
 Febuxostat
Febuxostat
(2-[3-cyano-4-(2-methylpropoxy)phenyl)-4-methylthiazol-5
carboxylic acid; TMX-67, TEI-6720) (Hình 1.4) là thuốc có tác dụng ức chế
chọn lọc XO được Liêm minh châu Âu sử dụng gần đây để điều trị tình trạng
tăng acid uric mạn có sự lắng đọng của các tinh thể urat.

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của Febuxostat (TMX-67, TEI-6720)
Tác dụng và cơ chế tác dụng:
Febuxostat ức chế hoạt động của enzym thông qua việc khóa liên kết
của enzym với cơ chất [25]. Thuốc làm hạ acid uric máu bằng cách ức chế
chọn lọc XO. Febuxostat không có nhân purin. Không giống như oxypurinol
15

chỉ gắn chặt với dạng khử XO, Febuxostat gắn với cả dạng khử và dạng oxy
hóa của enzym. Febuxostat gắn với kênh dài và hẹp dẫn đến molyden-pterin
làm che khuất vị trí gắn của cơ chất, từ đó ức chế hoạt động của enzym XO
[28].
Liều dùng:
Bắt đầu ở mức 40 mg/ngày, không điều chỉnh liều lượng cần thiết cho
người suy thận hoặc suy gan nhẹ và vừa, FDA phê chuẩn liều tối đa là 80
mg/ngày, mặc dù 120 mg/ngày có thể được yêu cầu của một số bệnh nhân
(liều này được chấp nhận ở các nước khác) [51].
Ưu điểm:
So với Allopurinol, Febuxostat ức chế XO và làm giảm nồng độ acid
uric máu hiệu quả hơn trong cả thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng [14].
Febuxostat có thể được sử dụng ở bệnh nhân suy thận mà không cần chỉnh
liều. Chưa đủ dữ liệu về việc sử dụng ở những bệnh nhân có độ thanh thải
creatinin <30 mL/phút hoặc suy gan nặng. Febuxostat có thể làm tăng nồng
độ theophylin [13].
Nhược điểm:
Thuốc có thể có một số tác dụng không mong muốn như gây rối loạn
chức năng gan, đau đầu, buồn nôn, chóng mặt. Ngoài ra, thuốc có thể gây các
nguy cơ về bệnh tim mạch [25].
Khoảng 2-5% người có xuất hiện phát ban, có thể xảy ra bất thường men
gan, không đủ cơ sở dữ liệu để sử dụng cho những bệnh nhân có CrCl <30
mL/phút hoặc suy gan nặng.
Hơn nữa, Febuxostat là thuốc mới, chưa có nhiều kinh nghiệm sử dụng
trên lâm sàng. Vì vậy, cần tiếp tục nghiên cứu các tương tác thuốc và tác dụng
không mong muốn của thuốc [46].
1.2.2.2. Các chất có nguồn gốc từ dược liệu
 Quercetin
Quercetin (2- (3,4-dihydroxyphenyl) -3,5,7- trihydroxychromem-4-one)
(Hình 1.5) là một flavonoid được chiết xuất từ dược liệu và đã được chứng

minh ức chế hoạt động của enzym XO in vitro và in vivo. Quercetin được tìm
thấy trong nhiều loại cây thiên nhiên, trong nhiều sản phẩm thực
phẩm...Trong những năm gần đây, quercetin được nghiên cứu rộng rãi trên
thế giới do nó có hoạt tính mạnh so với các loại flavonoid khác [55][5].

16


Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của Quercetin
Quercetin được tổng hợp chủ yếu bằng phương pháp thủy phân rutin.
Đã có nghiên cứu chỉ ra tác dụng ức chế enzym XO của quercetin [55]. Hiện
nay, trên thị trường đã có nhiều sản phẩm chứa quercetin được sử dụng trong
lâm sàng để điều trị gút.
 Luteolin
Luteolin (2- (3,4-Dihydroxyphenyl) - 5,7-dihydroxy-4-chromenone)
(Hình 1.6) là một flavon được tìm thấy trong nhiều loài thực vật như cần tây,
ớt xanh,... Luteolin được chứng minh có hoạt tính ức chế mạnh trên enzym
XO theo cơ chế ức chế cạnh tranh. Luteolin có khả năng liên kết với enzym
XO tại vị trí Molybdopterin làm thay đổi cấu trúc enzym XO, làm mất khả
năng xúc tác của enzym XO trong phản ứng chuyển hóa purin [55,56].

Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của Luteolin
1.3. Nở ngày đất (Gomphrena Celosiodes Mart.)
1.3.1. Nở ngày đất
Nở ngày đất hay còn goi là Cúc bách nhật đất có tên khoa học là
Gomphrena Celosiodes Mart., họ Dền (Amranthaceae).
 Vị trí phân loại.
Theo các tài liệu [1], vị trí của chi Gomphrena trong hệ thống phân
loại thực vật dược như sau:

17


Ngành Thực vật hạt kín Angiosperms
Lớp Thực vật hai lá mầm Eudicots
Phân lớp thực vật hai lá mầm Core eudicots
Bộ cẩm chướng Caryophyllales
Họ Amranthaceae
Chi Gomphrena
Loài Gomphrena Celosiodes
1.3.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
Đặc điểm thực vật
Cây thân thảo, sống lâu năm, cao 40-50 cm, mọc nằm hoặc đứng, phân
nhánh nhiều, rễ cái to. Thân có rãnh sâu, có lông nằm. Lá không có cuống, có
nhiều lông màu trắng nằm ở mặt dưới. Cụm hoa hình trụ rộng 1 cm, dài 2-3
cm, lá bắc 5-6 mm. Hoa trắng, 5 lá đài, 5 nhị dính thành ống, bầu hình trứng,
quả hộp chứa nhiều hạt màu nâu [1].
Phân bố
Gomphrena Celosiodes Mart. có nguồn gốc từ châu Mỹ, phát triển trên
một số nước như Argentina, Bolivia, Brazil, Paraguay, Uruguay. Được du
nhập sang châu Á (Bhutan, Indonesia, Philippines, Singapore, Sri Lanka,
Papua New Guinea, Taiwan, Thailand), châu Phi (Botswana, Ghana, Lesotho,
Namibia, RSA, Swaziland) và Úc.
Tại Việt Nam, tìm thấy Gomphrena Celosiodes Mart. mọc rải rác ở khắp
mọi nơi, nhưng tập trung chủ yếu là các tỉnh miền trung, Tây Nguyên và Tây
Nam Bộ.
1.3.3. Thành phần hóa học
Theo wikipedia Nở ngày đất chứa nhiều flavonoides glycosidea,
flavones, gomphrenol giúp làm giảm các triệu chứng sốt, cảm cúm do virut
gây ra, giúp ức chế các acid uric trong máu, thải trừ độc tố.

Tại Ấn Độ, kết quả công trình nghiên cứu về tác dụng dược lý của
Gomphrena Celosiodes Mart. của 2 nhà khoa học Neha Sharma và Rekha
Vijayvergia đã chỉ ra rằng trong dịch chiết chứa nước và cồn của cây Nở ngày
đất có chứa tinh bột, protein và phenol. Nghiên cứu này đã chứng minh khả
năng kháng khuẩn của cây Nở ngày đất trên 3 chủng vi khuẩn Escherichia
coli, Pseudomonas aeroginosa và Staphylococcus aureus [49].
Tại Mỹ và Brazil, Ebana và cộng sự cũng đã có nghiên cứu chỉ ra dịch
chiết nước và cồn của cây Nở ngày đất có chứa alkaloid, sapoin, tannin,
glycosid, steroid, đường đơn và terpen. Còn De Moura và cộng sự cho thấy,
18


Nở ngày đất còn có chứa nhóm flavonoid và amino acid, những hợp chất
phytochemical này có khả năng thâm nhập vào các vách tế bào nấm, làm tăng
tác động ức chế sử tăng trưởng của nhiều chủng loại nấm [6].
1.3.4. Tác dụng dược lý
Theo tài liệu y học cổ truyền Việt Nam
Cây Nở ngày đất chỉ được dùng trong phạm vi dân gian chữa ho, cảm
cúm do viruts gây ra, giúp ức chế các Acid uric trong máu, thải các độc tố ra
ngoài, cây được dân gian sử dụng phổ biến và cũng chính từ bài thuốc đó mà
khoa học đã tìm ra dược tính từ cây ra làm thuốc. Trong dân gian, một số
người đã sử dụng tinh dầu từ lá giúp tán phong, tiêu viêm tốt cho phụ nữ sau
sinh. Hiện nay, trên thị trường, cây Nở ngày đất được bày bán khá nhiều với
công dụng điều trị gút [6].
Theo các tài liệu hiện nay
Khả năng kháng khuẩn: Nở ngày đất có tác dụng kháng một số vi
khuẩn gram dương như: Aspergillus niger với dòng vô khuẩn lớn nhất trong
điều kiện chuẩn là 25 ± 0,33; Sacccharomyces cerevisiae là 25 ± 0; Bacillus
cereus là 44 ± 0,234; B.megaterium là 44 ± 0,33; Staphylococcus aureus 44 ±
0,370. Với gram âm chúng tác dụng tốt với Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa, Salmonella typhi, Shigella boydii, Sh. Dysenteriae, Mimicus
Vibro, Vibro parahaemolyticus, S.paratyphi và cả với nấm Candida albicans.
Do vậy, cây Nở ngày đất có thể dùng cho viêm nhiệt mồm miệng, tưa lưỡi trẻ
em, đắp mụn nhọt [6].
Khả năng chống oxy hóa: với dịch chiết thô cây nở ngày đất bằng
chloroform, n-hecxan, cacbon tetrachclorid thì chiết với hecxan hiệu ứng
chống oxy hóa là mạnh nhất, thanh lọc cơ thể tốt nhất [6].
Ngoài ra, cũng có nghiên cứu đã chỉ ra tác dụng kháng nấm và diệt giun
sán ở cây Nở ngày đất [6].
Hiện nay, cây Nở ngày đất được bày bán khá nhiều trên thị trường với
công dụng điều trị gút, tuy nhiên vẫn chưa có nghiên cứu nào chứng minh về
công dụng này. Vì thế nhóm nghiên cứu chúng tôi quyết đinh tiến hành đề tài
nhằm đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của dịch chiết từ cây Nở
ngày đất.
1.4. Các phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro
Để đánh giá tác dụng ức chế XO, cần so sánh hoạt độ của enzym trong
môi trường có và không có chất khử. Dựa vào các nguyên tắc sau:
 Dựa vào sự giảm của các tác nhân oxi hóa.
 Dựa vào độ giảm cơ chất hay sự tạo thành của sản phẩm như acid uric
[23][47].
19


1.4.1. Phương pháp đo quang
1.4.1.1. Phương pháp đo quang dựa trên định lượng acid uric
Phương pháp đo quang dựa trên lượng acid uric tạo thành từ quá trình
oxy hóa xanthin dưới tác dụng xúc tác của XO theo phản ứng:
Xanthin oxidase
Xanthin + H2O2 + O2 
 Acid uric + H2O2

Sau đó xác định hoạt độ XO từ lượng acid tạo thành được đo ở bước
sóng 290 nm ở 25oC, pH= 7,5 hoặc pH= 8,0. Một đơn vị enzym được định
nghĩa là tổng lượng enzym sản xuất ra một 1 µmoL acid uric trong mỗi phút ở
nhiệt độ 25oC [44].
Quy trình đo thường được áp dụng với hỗn hợp thử bao gồm dung dịch
đệm và dung dịch enzym trong đệm được ủ trong 15 phút ở 37ºC. Sau đó,
thêm dung dịch cơ chất (xanthin). Tiếp tục ủ trong 30 phút ở nhiệt độ 37ºC.
Dừng phản ứng bằng acid HCl 1N. Mẫu trắng chuẩn bị tương tự nhưng
enzym cho vào sau khi đã cho HCl. Tiến hành đo quang để xác định độ hấp
thụ của từng mẫu [44].
+ Ưu điểm: thuận tiện, nhanh và nhạy đối với enzym tinh khiết (thường
dùng trong in vitro) [30].
+ Nhược điểm: không thể áp dụng phương pháp này để đo hoạt độ
enzym trong tổ chức vì có sự có mặt của uricase. Có thể khắc phục hạn chế
này bằng cách cho vào hỗn hợp thử kali oxanat 0,1 mM, acid uric tạo thành sẽ
không bị ảnh hưởng bởi uricase [30].
1.4.1.2. Phương pháp đo quang dựa trên chất ABTS (2,2’-azino-di(3ethylbenzthiazolin-6-sulphonat)
Phương pháp đo quang sử dụng ABTS (2,2’-azino-bis (3ethybenzothiazolin-6-sulphonat). Đây là một phương pháp mới sử dụng chất
màu ABTS như một chất hấp thụ mật độ quang thông qua việc sử dụng 2
enzym uricase và peroxidase. Dựa trên nguyên tắc phản ứng:
Xanthin oxidase
Hypoxanthin + 2H 2O + 2O2 
 Acid uric + 2H 2O2
Uricase
Acid uric + O2 
 Allantoin + H 2O 2 + CO 2
Peroxidase
H 2O2 + ABTSred 
 ABTSox + 2H 2O

Từ lượng ABTSOX tạo thành đo quang ở bước sóng 410 nm xác định
được hoạt độ XO.
+ Ưu điểm: Phương pháp này có độ nhạy khá cao, có thể xác định được
hoạt độ lên tới 20 U/mL và có thể áp dụng cho các bệnh lý huyết thanh khác
[39].

20


1.4.2. Phương pháp đo áp
Để xác định hoạt độ enzym có thể đánh giá sự khử của các chất nhận
electron là oxy, xanh methylen và cytochrom C. Phương pháp dựa trên
nguyên tắc đo tỉ lệ oxy tiêu thụ với cơ chất xanthin, oxy ở 37oC [23].
Quy trình đo được áp dụng với hỗn hợp gồm một lượng gan đã được
làm đồng nhất và ướp lạnh, đệm phosphat pH 8,6, dung dịch natri xanthat,
dung dịch KOH. Oxy tiêu thụ được đo áp ở 37oC [23].
1.4.3. Phương pháp đo sử dụng HPLC với detector huỳnh quang
Nguyên tắc dựa trên phản ứng oxy hóa 2-amino-4-hydroxypteridin
(AHP) thành isoxanthopterin (IXP) dưới sự xúc tác của XO. Lượng IXP tạo
ra được đo bởi hệ thống HPLC sẽ tỉ lệ với hoạt độ XO [47].
Trên thực nghiệm, có thể tiến hành phương pháp này như sau: hỗn hợp
phản ứng gồm đệm phosphat, dung dịch AHP, dung dịch 2,6diclorophenonlindophenol natri, enzym và nước đủ thể tích, hỗn hợp được ủ
trong 10 phút ở 37oC, dừng phản ứng bằng HClO4 và làm lạnh trong 10 phút.
Phổ huỳnh quang kích thích và phát xạ của IXP được đo ở 343 nm, 410 nm
[47].
+ Ưu điểm đơn giản và nhạy (nhạy hơn phương pháp huỳnh quang
thông thường khoảng 100 lần). Mặt khác, hỗn hợp phản ứng được phân tích
trực tiếp bởi HPLC không cần phải tách IXP như trong phương pháp phóng
xạ [47].

1.4.4. Một số phương pháp khác
Xác định hoạt động enzym bằng cách định lượng H2O2 được tạo ra
trong quá trình hydroxyl hóa xanthin bởi XO. Flavin được khử phản ứng với
O2 tạo thành H2O2.
Đo oxy tiêu thụ: Phản ứng xanthin/XO được nghiên cứu bằng cách đo
thời gian liên tục của oxy sử dụng bằng 1 điện cực chọn lọc [16].

21


CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Dược liệu nghiên cứu
Nguyên liệu là cây Nở ngày đất được thu hái tại Quảng Ngãi vào tháng
7 năm 2016, rửa sạch, sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi và bảo quản
trong túi nilon.
Mẫu nghiên cứu được Bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền, Khoa
Y Dược giám định tên khoa học là Gomphrena Celosiodes Mart., họ Dền
(Amranthaceae). Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Bộ môn Dược liệu & Dược
học cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

Hình 2.1. Cây Nở ngày đất
2.1.2. Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu
Chuẩn bị dịch chiết toàn phần ethanol

22


Cây Nở ngày đất (0,5 kg) sau khi rửa sạch, phơi khô được tiến hành
chiết xuất bằng dung môi ethanol 80% (3 lít x 3 lần) sử dụng thiết bị siêu âm

ở 40oC trong vòng 2 giờ. Gộp các dịch chiết ethanol sau đó lọc qua giấy lọc
và cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không thu
được cao chiết tổng ethanol (30 g).
Chuẩn bị các phân đoạn dịch chiết
Cao chiết được phân tán vào nước cất tỷ lệ 1:1 và chiết phân bố lần lượt
bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, ethyl acetat và nButanol (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 300 mL). Các phân đoạn được cất loại
dung môi dưới áp suất giảm thu được thu được phân đoạn tương ứng là nhexan, EtOAc và n-BuOH.
Quy trình chiết xuất dược liệu được thể hiện ở Hình 2.2.
Nở ngày đất
(Gomphrena Celosiodes Mart.) (0,5 kg)
Chiết EtOH 80% (3lít x 3 lần), 40oC/ 3h
Lọc dịch chiết, cô chân không

Cao khô (30 g)
+ H2O tỷ lệ 1:1
Chiết lần lượt n-hexan, EtOAc, BuOH, cô
chân không

Cao phân đoạn nhexan

Cao phân đoạn
EtOAc

Cao phân đoạn
BuOH

Hình 2.2: Quy trình chiết xuất dược liệu.
2.2. Phương tiện nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất và thuốc thử
- Thuốc đối chứng: Allopurinol (300mg ) của hãng Sigma.

23