Nghiên cứu thành phần hóa học phần trên mặt đất của cây phong quỳ sapa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

PHẠM GIANG NAM

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT CỦA
CÂY PHONG QUỲ SA PA
(Anemone chapaensis Gagnep.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện: PHẠM GIANG NAM

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT CỦA
CÂY PHONG QUỲ SA PA
(Anemone chapaensis Gagnep.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa:

QH.2012.Y

Người hướng dẫn: PGS.TS. Phương Thiện Thương
Ths. Hà Thị Thanh Hương

Hà Nội – 2017


Lời cảm ơn
Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS.Phương Thiện Thương – Trưởng
phòng Hóa phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược liệu, Bộ Y tế và Ths. Hà Thị
Thanh Hương – Giảng viên Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền, Khoa Y
Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và
tạo điều kiện thuận lợi để em có thể nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn các anh chị nghiên cứu viên của phòng Hóa
phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá
trình làm thực nghiệm tại Viện. Em xin gửi lời cảm ơn tới anh Nguyễn Ngọc
Hiếu vì những chỉ bảo ân cần cho em khi thực hiện khóa luận này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Dược liệu –
Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đặc biệt là
thầy TS. Vũ Đức Lợi đã có những góp ý quý báu trong quá trình em hoàn
thành khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn đến chị Trịnh Thị Diệp Thanh vì những giúp đỡ
và đồng hành trong quá trình thực hiện quá luận này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến tất cả quý thầy cô trong Khoa Y Dược
đã dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong suốt 5 năm theo học tại trường.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, những người
đã luôn theo sát động viên, quan tâm và tạo điều kiện giúp con có thể hoàn
thành khóa luận này.
Hà Nội, ngày 31 tháng 05 năm 2017
Sinh viên

Phạm Giang Nam


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
APCI-MS: Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass Spectroscopy
CD3OD : methanol-d4 (NMR solvent)
DEPT: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
d : doublet
dd : double of doublet
ESI-MS : ElectroSpray Ionization Mass Spectroscopy
EtOAc : ethyl acetat
EtOH : ethanol
Hz: Hertz
MeOH : methanol
m/z : mass to charge ratio
mp: melting point
m: multiplet
NMR : nuclear magnetic resonance
PQL: cắn toàn phần
PQLH: cắn n-hexan
PQLE: cắn ethyl acetat
PQLD: cắn ethanol sau khi chạy qua cột Diaion
PQLW: cắn phân đoạn nước sau quá trình lắc chiết phân đoạn
q : quartet
s : singlet
SKLM: Sắc ký lớp mỏng
t : triplet


TT: thuốc thử

v/v : volume to volume ratio


DANH MỤC BẢNG, BIỂU
STT

Tên bảng

Trang

1

Bảng 3.1: Khối lượng các cắn phân đoạn dịch chiết Ethanol
phần trên mặt đất Phong quỳ Sa Pa

18

2

Bảng 3.2: Kết quả SKLM của 2 chất với 3 hệ dung môi

25


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
STT

Tên hình vẽ

Trang

1

Hình 1.1: Tiêu bản thực vật loài Anemone chapaensis
Gagnep

4

2

Hình 1.2: Một số saponin phân lập từ loài Anemone
raddeana Regel

5

3

Hình 1.3: Một số flavonoid phân lập từ chi Anemone

7

4

Hình 1.4: Một số coumarin phân lập từ chi Anemone

8

5

Hình 1.5: Một số hợp chất khác phân lập từ chi Anemone

9

6

Hình 2: Sơ đồ chiết tách phân đoạn

14

7

Hình 3.1: Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ phần trên mặt
đất loài Phong quỳ Sa Pa

17

8

Hình 3.2: Sắc ký đồ của cắn ethyl acetat (hệ III) ở các điều
kiện quan sát: UV254, UV365, sau khi phun thuốc thử dưới
ánh sáng trắng.

19

9

Hình 3.3: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl
acetat.

21

10

Hình 3.4: Sắc ký đồ của hợp chất 1, cắn ethyl acetat, hợp
chất 2 hệ I

22

11

Hình 3.5: Sắc ký đồ của hợp chất 1, cắn ethyl acetat, hợp
chất 2 hệ II

23

12

Hình 3.6: Sắc ký đồ của hợp chất 1, cắn ethyl acetat, hợp
chất 2 hệ III

24

13

Hình 3.7: Cấu trúc hóa học và phổ NMR của hợp chất 1

26

14

Hình 3.8: Cấu trúc hóa học và phổ NMR của hợp chất 2

28


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................... 2
1.1. Thực vật học ........................................................................................... 2
1.1.1. Vị trí phân loại chi Anemone ......................................................... 2
1.1.2. Số lượng loài và sự phân bố các loài thuộc chi Anemone ............. 2
1.1.3. Đặc điểm thực vật chi Anemone .................................................... 2
1.2. Thành phần hóa học chi Anemone ......................................................... 4
1.3. Công dụng và tác dụng ......................................................................... 10
1.3.1. Công dụng trong dân gian ........................................................... 10
1.3.2. Một số tác dụng dược lý đã được nghiên cứu của chi Anemone . 10
1.4. Vấn đề cần giải quyết ........................................................................... 11
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......... 12
2.1. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu .............................................. 12
2.1.1. Nguyên liệu................................................................................... 12
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu ............................................................... 12
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 13
2.2.1. Phương pháp chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn ................ 13
2.2.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học.............................................. 14
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................... 16
3.1. Kết quả chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn ................................... 16
3.1.1. Lấy mẫu và xác định hàm ẩm....................................................... 16
3.1.2. Chiết xuất ..................................................................................... 16

3.2. Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất trong phân đoạn ethyl
acetat từ dịch chiết phần trên mặt đất Phong quỳ Sa Pa. ............................ 18
3.2.1. Định tính cắn ethyl acetat bằng sắc kí lớp mỏng......................... 18
3.2.2. Phân lập một số hợp chất từ cắn ethyl acetat ........................... 19
3.2.3. Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập ........................................... 21
3.2.4. Xác định các hợp chất phân lập được ......................................... 25
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN .......................................................................... 29
4.1. Về chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn từ phần trên mặt đất Phong
quỳ Sa Pa ..................................................................................................... 29
4.2. Về phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất .................................... 29
KẾT LUẬN ................................................................................................. 32
KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với độ ẩm cao, lượng
mưa lớn, vì vậy thảm thực vật phát triển vô cùng phong phú với trên 12000
loài thực vật trong đó 4000 loài có khả năng sử dụng làm thuốc. Với hệ thực
vật đa dạng như vậy, chúng không những cung cấp nguồn thực phẩm dồi dào
mà còn cho chúng ta nguồn thuốc chữa bệnh quý giá. Xu hướng đi sâu nghiên
cứu và tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ các loài
thực vật làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút được sự quan tâm
của các nhà khoa học bởi ưu điểm của chúng là độc tính thấp, dễ hấp thu và
chuyển hóa trong cơ thể.
Chi Phong quỳ, họ Mao lương (Ranunculaceae), từ lâu được người dân
dùng rễ để điều trị viêm họng, sưng amydal, viêm gan, viêm túi mật, đau dạ
dày, lỵ, thiên đầu thống, bế kinh, đái ra máu, rắn cắn, đau răng, phong thấp
đau nhức, đòn ngã và giải độc ô đầu [1]. Cây Phong quỳ Sa Pa, tên khoa học

là Anemone chapaensis Gagnep, được Gagnepain miêu tả lần đầu tiên năm
1929 [7], tuy nhiên cho đến nay vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào về
thành phần hóa học và tác dụng của loài thực vật này.
Nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc khai thác, nghiên cứu và nâng cao
giá trị sử dụng loài dược liệu này, luận văn được thực hiện với đề tài: “Nghiên
cứu thành phần hóa học phần trên mặt đất của cây Phong quỳ Sapa (Anemone
chapaensis Gagnep.)” với mục tiêu:
1. Chiết xuất, phân lập được 2 hợp chất tinh khiết từ phần trên mặt đất
của loài Phong quỳ Sa Pa.
2. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Thực vật học
1.1.1. Vị trí phân loại chi Anemone
Chi Anemone thuộc họ Hoàng Liên (Ranunculaceae), bộ Hoàng Liên
(Ranunculales), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc Lan
(Magnoliophyta).
1.1.2. Số lượng loài và sự phân bố các loài thuộc chi Anemone
1.1.2.1. Trên thế giới
Chi Anemone gọi là chi Phong quỳ, hay còn gọi là Dã miên hoa gồm
khoảng 120 loài được phân bố rộng khắp trên toàn cầu, tập trung tại vùng ôn
đới Bắc, Ấn Độ, Nepal, Nam Trung Quốc, Nhật Bản và Bắc Việt Nam [2].
Chi Anemone gồm có một số loài đã được nghiên cứu rộng rãi trên thế
giới như:
- Anemone raddeana Regel
- Anemone taipaiensis W.T. Wang
- Anemone tomentosa (Maxim.) Pei

- Anemone rivularis Glacier
1.1.2.2 Ở Việt Nam
Chi Anemone ở Việt Nam có 05 loài: A. Japonica, A. Rivularis, A.
Chapaensis, A.Polilanei, A. Sumatrana [1].
1.1.3. Đặc điểm thực vật chi Anemone
Chi Anemone, họ Hoàng Liên (Ranunculaceae): Cây thảo sống nhiều
năm, gốc thành củ, có thân rễ hoặc mọc thành bụi. Lá mọc so le, bị chia cắt
sâu nhiều hay ít. Hoa đều, đơn độc hay thường thành tán có một bao chung
gồm 3 lá chét. Đài dạng cánh, có màu trắng, vàng, đỏ hoặc lam, 5 - 10 phiến;
tràng không có; nhị nhiều, lá noãn có vòi nhụy. Quả bế, đơn hạt, rời, tập hợp
thành đầu [2].
2


A.japonica (Thunb.) Sieb et Zucc – Phong quỳ Nhật: Cây thảo cao từ
80cm-1m, bậm, có lông mềm. Lá chụm ở gốc, có cuống dài đến 8mm, có lông
mịn; lá chét 3-5 hay rõ ràng có 3-5 thùy, có lông mịn ở trên, có lông dài ở
dưới, dạng tim, đường kính 15-20cm. Bao chung có 3 lá giống với những lá ở
thân nhưng tiêu giảm hơn. Cụm hoa gồm 3-4 hoa trắng, có cuống hoa dài 5cm
hay hơn; hoa rộng 3-4cm; lá đài hoa rộng 1,5cm, nhị nhiều, lá noãn có nhụy.
Quả bế đầy lông len, có cuống khá dài, có vòi nhụy ngắn [1].
A.rivularis Buch. Ham. ex DC – Phong quỳ bò hay phong quỳ suối:
Cây thảo cao 30-40cm, mang 1-3 tầng nhánh mang hoa. Lá đa dạng ở gốc
thân, do 3 lá chét xoan rộng, không lông, lá trên thân hẹp. Bao chung do 3 lá
bắc xẻ, nhọn; hoa có 5-8 lá đài xoan, cao 1,5cm, mặt trong trắng, mặt ngoài
lam; nhị nhiều, lá noãn có vòi nhụy. Quả bế cao 12mm, có mỏ cong [1].
A.chapaensis Gagnep. – Phong quỳ Sapa: Cây thảo, sống nhiều năm,
thường mọc thành bụi, cao từ 10-30 cm. Thân rễ hình trụ màu nâu đen, nạc,
đường kính 2-4 cm, mang các rễ phụ nhỏ. Thân non màu tím, phủ nhiều lông
nhỏ trắng mịn, chuyển sang màu xanh lúc già; lông che chở tập trung chủ yếu

ở cành non và ở các mấu thân, mang lá tập trung ở gốc. Lá có cuống dài 1015 cm, mềm, có nhiều lông màu trắng mịn; mọc từ thân rễ và các mấu của
thân có bẹ lá to ôm lấy thân. Phiến lá hình tim chia 3 thùy, các thùy không
tách rời mà liền nhau ở gốc lá, mỗi thùy lại chia thành các thùy nhỏ, mép có
răng cưa tròn. Lá có 3 gân chính, mỗi gân chính lại toả ra thành nhiều gân phụ
nhỏ hình chân vịt. Cụm hoa xim 2 ngả. Trục mang hoa cao từ 30-40 cm;
cuống hoa dài 6-7 cm; lá đài 6-7, dài 2-3,5 cm; tràng 5, rời, đầu tà hay lõm,
dài 2-3 cm, rộng từ 1-1,5 cm, màu trắng đến hồng nhạt phủ nhiều lông trắng
mịn, tiền khai hoa luân xen; nhị nhiều, rời, màu vàng, mọc ở đế của hoa, chỉ
nhị dài 3-4 mm, bao phấn đính gốc dài khoảng 1 mm, nứt dọc; lá noãn không
lông, không có vòi nhụy, đầu nhụy màu vàng. Rễ hình trụ, nhỏ, đường kính từ
1-2 mm. Quả bế không cọng, không lông, dài 4-5 mm, khi chín bung ra nhiều
hạt nhỏ. Hạt dài khoảng 2-3 mm, mang nhiều lông dài màu trắng. Hoa tháng
6-9, quả tháng 8-10 [2, 30].
Theo Gagnepain:
3


- Loài này khác với loài A.begoniifolia ở 3 đặc điểm: đài hoa gần như
không có lông; bao phấn hình elip, thuôn dài và phần đầu của quả bế đột ngột
co lại, hơi uốn cong. [7]

Hình 1.1: Tiêu bản thực vật loài Anemone chapaensis Gagnep [30]
- Loài này khác với loài A.howellii ở 4 đặc điểm: lá không có lông
cứng; lá bắc xung quanh cụm hoa lớn hơn 4-5 lần; số lượng cuống hoa thường
5-9, rất hiếm 3-4; bao phấn dài hơn [7].
- Loài này khác với loài A.bicolor ở 2 đặc điểm: số lượng cuống hoa
nhiều hơn và nhụy hoa bé hơn [7].
1.2. Thành phần hóa học chi Anemone
Chi Anemone là chi thực vật đã được sử dụng và nghiên cứu rộng rãi tại
nhiều nơi trên thế giới. Thành phần hóa học chủ yếu trong chi này là các

saponin [22, 26, 27]. Ngoài ra, một số báo cáo còn cho thấy sự hiện diện của

4


các flavonoid[10], coumarin [9], diterpenoid glycosid [9], lactone [22], tinh
dầu và chất béo [22], và một số hợp chất khác.
Các saponin
Cho đến nay, đã có trên 100 saponin được phân lập từ chi Anemone,
trong đó chủ yếu là các dẫn xuất mang bộ khung olean hoặc hederagenin [22,
26, 27].

Hình 1.2: Một số saponin phân lập từ loài Anemone raddeana Regel

Oleanolic acid

R1

R2

R3

R4

H

CH3

H

H

Raddeanoside R1

α-L-Rha(1→4)α-L-Ara

CH3

H

H

Raddeanoside R2

β-D-Glc(1→2)α-L-Ara

CH3

H

H

Raddeanoside R12 α-L-Rha(1→2)α-L-Ara

CH2OH

H

H

Raddeanoside R21 α-L-Rha(1→2)α-L-Ara

CH2OH α-L-Rha(1→4)- βD-Glc(1→6)- βD-Glc
5

H


Leonloside D

β-D-Glc(1→4)α-L-Ara

Hederacholichiside α-L-Rha(1→2)F
[β-D-Glc(1→4)]α-L-Ara

CH3

α-L-Rha(1→4)- βD-Glc(1→6)- βD-Glc

OH

CH3

α-L-Rha(1→4)- βD-Glc(1→6)- βD-Glc

OH

Các flavonoid
Năm 2010, H.B Hu và các cộng sự đã phân lập được 8 flavonoid khác
nhau từ rễ loài Anemone tomentosa [10].

6


Hình 1.3: Một số flavonoid phân lập từ chi Anemone [10].

7


Các courmarin

Hình 1.4: Một số coumarin phân lập từ chi Anemone [9].
R1

R2

R3

R4

R5

4,5Dimethoxyl-7methylcoumar
in

OCH3

OCH3

H

CH3

H

4,7Dimethoxyl-5methylcoumar
in

OCH3

CH3

H

OCH3

H

Isofraxidin

H

H

OCH3

OH

OCH3

Fraxidin

H

H

OCH3

OCH3

OH

8


Một số hợp chất khác

Hình 1.5: Một số hợp chất khác phân lập từ chi Anemone [9, 22].
9


Cho đến nay, tại Việt Nam cũng như trên toàn thế giới, chưa có báo cáo
khoa học được xuất bản nào liên quan đến thành phần hóa học của cây phong
quỳ Sa Pa Anemone chapaensis Gagnep.
1.3. Công dụng và tác dụng
1.3.1. Công dụng trong dân gian
Chi phong quỳ được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để chữa các
bệnh về tim (phối hợp với các thuốc khác), điều trị viêm họng, sưng amydal,
viêm gan, viêm túi mật, đau dạ dày, lỵ, thiên đầu thống, bế kinh, đái ra máu,
rắn cắn, đau răng, phong thấp đau nhức, đòn ngã và giải độc ô đầu [1].

1.3.2. Một số tác dụng dược lý đã được nghiên cứu của chi Anemone
1.3.2.1. Tác dụng chống khối u
Năm 2008, nhóm nghiên cứu của Wang và cộng sự đã công bố các báo
cáo thử nghiệm tác dụng ức chế khối u của các saponin phân lập từ rễ loài
Anemone raddeana. Kết quả cho thấy raddeanoside R2 và R3, eleatheroside K
và hederasaponin B có tác dụng ức chế tế bào ung thư dạ dày BGC823 và
dòng tế bào bạch cầu người K562 rất mạnh. Raddeanoside R3 cho tác dụng tốt
với cả thử nghiệm in vitro và in vivo [20, 24, 25].
1.3.2.2. Tác dụng kháng vi sinh vật
Liu và cộng sự (1988) báo cáo rằng phần tinh dầu dễ bay hơi, lactone,
và saponin từ thân rễ của A. raddeana có khả năng ức chế các liên cầu
Streptococcus gây bệnh ở người, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi,
Shigella, và Staphylococcus aureus [14]. Ở thử nghiệm in vitro, anemonin
cho thấy hoạt tính kháng nấm, với nồng độ ức chế tối thiểu đạt 15 μg/mL
[31].
1.3.2.3. Tác dụng chống viêm
Saponin chiết xuất từ các loài thuộc chi Anemone có tác dụng ức chế
phản ứng viêm bàn chân chuột gây bời carrageenan, formaldehyde và dextran.
Trong đó, raddeanoside R1 có tác dụng đáng kể trên mô hình gây viêm bằng
carrageenan [23].
10


Các nhóm nghiên cứu của Lu và cộng sự (2001), Yamashita và cộng sự
(2002) cũng báo cáo một loạt các saponin có tác dụng ức chế sự tạo thành gốc
superoxide, bao gồm: oleanolic acid, 3-acetyloleanolic acid, eleatheroside K,
raddeanoside R10, raddeanoside R12, raddeanoside R13, lupeol và betulin [15,
29].
1.3.2.4. Tác dụng an thần và giảm đau
Các raddeanoside có tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau trên

chuột gây bởi acetic acid. Protoanemonin cũng có tác dụng an thần (Wang &
cs. 1985) [23].
1.3.2.5. Tác dụng chống co giật và hoạt tính kháng histamin
Saponin chiết xuất từ Anemone có tác dụng giảm co giật ở chuột gây ra
bởi strychnine, nhưng không có tác dụng trên trên mô hình gây ra bởi theine.
Protoanemonin không những có hiệu quả trong thử nghiệm chống co thắt phế
quản gây ra bởi 0,01% histamine, mà còn chống lại sự co thắt hồi tràng của
lợn guinea cũng gây ra bởi histamine (Wang & cs. 1985) [23].
1.4. Vấn đề cần giải quyết
Theo tổng quan tài liệu, Phong quỳ Sapa là cây thuốc có ở Việt Nam và
một số nước trên thế giới nhưng chưa có nhiều nghiên cứu về thực vật, thành
phần hóa học và tác dụng dược lý. Trên cơ sở đó, chúng tôi đặt vấn đề nghiên
cứu thành phần hóa học của phần trên mặt đất cây Phong quỳ Sapa nhằm mục
tiêu tìm ra được những hoạt chất mới có ý nghĩa trong y học và cuộc sống.

11


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
Mẫu cây được thu hái khi đang ra hoa. Phần thân rễ và phần trên mặt
đất của cây được thu hái riêng, phơi hoặc sấy khô, đóng gói bảo quản nơi khô
ráo để làm thực nghiệm.
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu
Hóa chất và dung môi
- Các dung môi hữu cơ dùng trong chiết xuất và phân lập là dung môi
công nghiệp được cất lại, bao gồm: EtOH 96%, MeOH, n-hexan; ethyl acetat,
aceton, dicloromethan.
- Các dung môi tinh khiết: dimetylsulfoxid (DMSO), nước cất 2 lần.

- Hạt nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Sigma-Aldrich)
- Chất hấp phụ silica gel pha thường (cỡ hạt 63-200 μm, Merck), pha
đảo RP-18 (30-50 μm, Merck)
- Bản mỏng silica gel F254 tráng sẵn và RP-18 F254S tráng sẵn (Merck),
hiện màu bằng thuốc thử acid sulfuric 10%/ethanol và đốt nóng ở 110oC
Thiết bị, máy móc, dụng cụ
- Phổ khối MS đo trên máy HP 5989B (Viện Hóa học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam)
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR;
(Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

13

C-NMR; DEPT

- Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 10 lít.
- Dụng cụ thủy tinh: các loại cột đường kính từ 1-10cm, dài từ 30-100
cm; bình cầu ngoại dung tích 50 - 2000 mL; ống nghiệm, ống đựng mẫu
NMR, pipet chính xác…
Các dụng cụ thí nghiệm khác thuộc Viện dược liệu và Bộ môn Dược
học cổ truyền – Khoa Y dược Đại học Quốc gia Hà Nội.
12


2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn
Theo phương pháp chiết các lớp chất theo độ phân cực tăng dần của
dung môi.
Cao toàn phần và các phân đoạn được thử nghiệm tác dụng chống oxy
hóa nhằm sàng lọc ra phân đoạn có tác dụng tốt nhất để tiến hành các nghiên

cứu thành phần hóa học tiếp theo
Dược liệu đã xay thô được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt với dung
môi ethanol; cất thu hồi dung môi được cắn, hòa cắn vào nước, lần lượt lắc
phân đoạn với dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan; ethyl acetat).
Cất thu hồi dung môi các phân đoạn thu được cắn n-hexan (cắn Hx);
cắn ethyl acetat (cắn EtOAc).
Dịch chiết nước thu được sau khi lắc phân đoạn với ethyl acetat được
chạy 3 lần qua cột sắc ký Diaion HP-20. Cột được rửa giải bằng EtOH 96%
thu được 2 phân đoạn trong EtOH và H2O.
Cất thu hồi dung môi 2 phân đoạn này thu được cắn EtOH (ký hiệu cắn
EtOHn) và cắn H2O

13


Dược liệu
chiết với EtOH
Dịch chiết EtOH
thu hồi dung môi, hòa thành nhũ dịch trong H2O
lắc phân đoạn với n-hexan
thu hồi dung môi
Phân đoạn n-hexan

Phân đoạn H2O
lắc phân đoạn với EtOAc

(thử tác dụng)
thu hồi dung môi
Phân đoạn EtOAc
(thử tác dụng)

Phân đoạn H2O
sắc ký cột Diaion Hp-20
rửa giải bằng EtOH 96%

thu hồi dung môi
Phân đoạn EtOHn

Phân đoạn H2O

Hìnhtác2:dụng)
Sơ đồ chiết tách phân đoạn (thử tác dụng)
(thử
2.2.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học
2.2.2.1. Phân lập các hợp chất chính
Sau khi tiến hành sàng lọc tác dụng sinh học của các mẫu phân đoạn
dịch chiết trong dung môi có độ phân cực khác nhau chiết xuất từ mẫu nghiên
cứu, lựa chọn những phân đoạn có hoạt tính tốt nhất cho quá trình phân lập
hợp chất tiếp theo. Quá trình nghiên cứu phân lập hợp chất từ các phân đoạn
đã chọn chủ yếu sử dụng phương pháp sắc ký cột. Các phân đoạn trong quá
trình phân lập được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng
cao.
2.2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất

14


Xác định cấu trúc của các chất phân lập được dựa trên phân tích kết quả
phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và
so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố.

15


CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn
3.1.1. Lấy mẫu và xác định hàm ẩm
Phong quỳ được thu hái ngày 24/05/2015 tại đèo Hoàng Liên (Ô Qui
Hồ, ở độ cao 1500 đến 1800 m), thuộc huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai. Mẫu được
xác định tên khoa học là Anemone chapaensis Gagnep bởi TS. Đỗ Thị Xuyến,
bộ môn Thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà
Nội, số hiệu tiêu bản 02 (Phụ lục 03). 02 tiêu bản hiện được lưu giữ tại Phòng
Bách thảo thực vật (HNU), Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự
nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, 01 tiêu bản lưu trữ tại bộ môn Dược liệu Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
Phần trên mặt đất được cắt khỏi toàn cây Phong quỳ Sa Pa, sử dụng
làm mẫu nghiên cứu. Mẫu được sấy ở 60oC đến khô, cắt nhỏ, bảo quản trong
túi nilon kín, để nơi khô ráo, thoáng mát.
Lấy khoảng 2g mẫu nghiên cứu đã làm nhỏ để xác định độ ẩm. Bật máy
đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 130oC. Trải đều mẫu nghiên cứu lên đĩa cân,
đậy đĩa cân và khởi động máy. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần lấy kết quả trung
bình.
Độ ẩm mẫu nghiên cứu xác định được là 9,52%.
3.1.2. Chiết xuất
Mẫu nghiên cứu sau khi làm nhỏ được ngâm chiết với EtOH 96% ở
nhiệt độ phòng (chiết 3 lần, mỗi lần 4 ngày). Dịch chiết được gộp lại và cất
loại cồn nước dưới áp suất giảm đến cắn để thu được cắn toàn phần, ký hiệu
là PQL. Với 3 kg Phong Quỳ thu được 201,74g cắn toàn phần.
Hòa cắn toàn phần PQL với một lượng vừa đủ nước nóng 60oC. Sử
dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng chiết lần lượt với các dung môi là n-hexan
và ethyl acetat. Các phân đoạn dịch chiết được cất thu hồi dung môi tới cắn để

được kí hiệu lần lượt là PQLH, PQLE. Dịch nước còn lại được chạy 3 lần qua
cột sắc ký Diaion HP-20, sau được rửa giải bằng EtOH 96% thu được 2 phân
đoạn tan trong EtOH và H2O, ký hiệu lần lượt là PQLD và PQLW.
16