BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐỖ THỊ ANH CÚC
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------
ĐỖ THỊ ANH CÚC
HÓA HỮU CƠ
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH
HỌC CỦA RỄ CÂY CHÓC MÁU (SALACIA CHINENSIS L.) Ở
VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
HÓA HỌC
KHOÁ 2009
Hà Nội – Năm 2011
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------------------------------ĐỖ THỊ ANH CÚC
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA
RỄ CÂY CHÓC MÁU (SALACIA CHINENSIS L.) Ở VIỆT NAM
Chuyên ngành :
HÓA HỌC (NC)
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
HÓA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
1. PGS. TS VŨ ĐÀO THẮNG
2. TS. TRẦN THỊ MINH
Hà Nội – Năm 2011
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công
trình nào khác.
Ký tên
Đỗ Thị Anh Cúc
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS. TS. Vũ Đào
Thắng và TS. Trần Thị Minh đã tạo mọi điều kiện và hướng dẫn tôi trong suốt quá
trình thực hiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm các thầy cô giáo trong Bộ môn Hóa Hữu cơ – Viện
Kỹ thuật Hóa học – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã ủng hộ và tận tình giúp
đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Luận văn này được thực hiện với sự giúp đỡ của ThS. Đỗ Thị Nguyệt Quế,
Bộ môn Dược lực – Trường Đại học Dược Hà Nội.
Xin gửi lời biết ơn đến gia đình nhỏ của tôi, nơi đã cho tôi thêm niềm tin và
động lực để tập trung nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới đồng nghiệp và bạn bè,
những người đã luôn giúp đỡ, ủng hộ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập.
Tác giả
Đỗ Thị Anh Cúc
MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU
1
PHẦN I:
TỔNG QUAN
2
1.1
Khái quát về thực vật và tình hình nghiên cứu chi Salacia
2
họ Celastraceae
1.1.1
Thực vật chi Salacia
2
1.1.2
Tình hình nghiên cứu chi Salacia
2
1.2
Đặc điểm thực vật và tình hình nghiên cứu cây Chóc máu
5
(Salacia chinensis L.)
1.2.1
Đặc điểm thực vật
5
1.2.2
Tình hình nghiên cứu cây Chóc máu
6
1.3
Lớp chất triterpen
9
1.3.1
Triterpen khung friedelan
11
1.3.2
Triterpen khung taraxeran (friedooleanan)
12
PHẦN II:
THỰC NGHIỆM
14
2.1
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
14
2.1.1
Mẫu thực vật
14
2.1.2
Phương pháp nghiên cứu
14
2.1.3
Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
17
2.2
Chiết mẫu thực vật
18
2.2.1
Dịch chiết metanol
18
2.2.2
Dịch chiết etylaxetat
18
2.3
Thử hoạt tính tiểu đường
19
2.4
Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
19
2.5
Phân lập và tinh chế các chất từ cặn chiết etylaxetat của
19
rễ cây Chóc máu
2.5.1
Quy trình phân lập
19
2.5.2
Chất SC1
22
2.5.3
Chất SC2
23
2.5.4
Chất SC3
23
2.5.5
Chất SC4
24
PHẦN III:
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
25
3.1
Mẫu thực vật
25
3.2
Kết quả thử hoạt tính tiểu đường của cặn chiết etylaxetat từ rễ
25
cây Chóc máu
3.3
Kết quả thử hoạt tính kháng ví sinh vật kiểm định
26
3.4
Phân lập và xác định cấu trúc của các chất từ cặn chiết
26
etylaxetat
3.4.1
Phân lập chất
26
3.4.2
Xác định cấu trúc hóa học của chất SC1
28
3.4.3
Xác định cấu trúc hóa học của chất SC2
32
3.4.4
Xác định cấu trúc hóa học của chất SC3
36
3.4.5
Xác định cấu trúc hóa học của chất SC4
40
KẾT LUẬN
45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
46
PHỤ LỤC
53
KÝ HIỆU MỘT SỐ CHỮ VIẾT TẮT
CC
Sắc ký cột (Columm Chromatography)
TLC
Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)
EtOAc
Etylaxetat
T
0
n/c
ESI-MS
Nhiệt độ nóng chảy
Phổ khối phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass
Spetrometry)
EI-MS
Phổ khối va chạm electron (Electron Impact Mass Spetrometry)
1
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic
H-NMR
Resonance Spectroscopy)
13
C-NMR
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon (Cacbon-13 Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy)
DEPT
Phổ DEPT (Distortrionless Enhancement by Polarization Transfer)
IR (KBr) νmax(cm-1) Phổ hồng ngoại (Infrared Radiation)
J
Hằng số tương tác (Hz)
s
Singlet
d
Doublet
m
Multiplet
dd
Double doublet
δ
Độ chuyển dịch hóa học (ppm)
ppm
Part per million
TMS
Tetramethylsilan Si(CH3)4
MIC
Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration)
IC50
Half Maximal Inhibitory Concentration
M
Giá trị trung bình của tập số liệu
SE
Sai số chuẩn (Standard Error)
P
Độ tin cậy thống kê
PHỤ LỤC HÌNH ẢNH, BẢNG BIỂU
Hình 1:
Hình 2:
Hình 3:
Hình 4:
Hình 5:
Hình 6:
Hình 7:
Hình 8:
Hình 9:
Hình 10:
Hình 11:
Hình 12:
Hình 13:
Hình 14:
Hình 15:
Hình 16:
Hình 17:
Hình 18:
Sơ đồ 1:
Sơ đồ 2:
Bảng 1:
Bảng 2:
Bảng 3
Bảng 4
Bảng 5
Bảng 6
Trang
Cây Chóc máu (Salacia chinensis), phần rễ
5
Sắc ký cột
22
Phổ IR của chất SC1
29
Phổ EI-MS của chất SC1
29
Phổ 13C-NMR của chất SC1
30
1
Phổ H-NMR của chất SC1
30
Phổ ESI-MS của chất SC2
32
Phổ IR của chất SC2
32
1
Phổ H-NMR của chất SC2
33
13
Phổ C-NMR của chất SC2
34
Phổ IR của chất SC3
36
Phổ ESI-MS của chất SC3
37
1
Phổ H-NMR của chất SC3
37
13
Phổ C-NMR của chất SC3
38
Phổ IR của chất SC4
40
Phổ ESI-MS của chất SC4
41
1
Phổ H-NMR của chất SC4
41
13
Phổ C-NMR của chất SC4
42
Thí nghiệm thử hoạt tính tiểu đường trên chuột
15
Quá trình chiết tách và phân lập chất từ rễ cây Chóc máu
21
Sự thay đổi glucose huyết trước và sau khi uống thuốc 4h trên
25
chuột thí nghiệm
Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cặn chiết
26
Các hằng số vật lý của các chất phân lập được từ cặn chiết
28
EtOAc của rễ cây Chóc máu
31
Dữ liệu phổ 13C-NMR của SC1 và so sánh với kết quả tài liệu
13
Dữ liệu phổ C-NMR của SC2 và so sánh với kết quả tài liệu
35
13
Dữ liệu phổ C-NMR của SC3 và so sánh với kết quả tài liệu
39
Bảng 7
Dữ liệu phổ 13C-NMR của SC4 và so sánh với kết quả tài liệu
43
LỜI MỞ ĐẦU
Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới ẩm gió mùa nên có hệ thực vật rất phong
phú, đa dạng với hơn 12.000 loài, bao gồm hơn 300 họ và 1200 chi, trong đó có đến
3830 loài được dùng làm thuốc. Nguồn thực vật phong phú này đã cung cấp cho con
người các sản phẩm thiên nhiên có giá trị. Các sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính
sinh học có ứng dụng rất lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuộc sống, đặc biệt
dùng làm thuốc chữa bệnh. Các loài thuốc thảo mộc ít gây tác dụng phụ và ít độc
hại cho người sử dụng. Chúng được dùng như tác nhân điều trị trực tiếp, làm chất
dò sinh hóa để làm sáng tỏ nguyên lý dược học của con người hoặc làm chất mẫu,
chất dẫn đường để phát hiện và phát triển các loài thuốc mới. Chính vì vậy, việc
nghiên cứu thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của các cây thuốc có ý
nghĩa quan trọng cho việc sử dụng một cách hợp lý và có hiệu quả nhất nguồn tài
nguyên thiên nhiên này.
Trong họ Dây gối (Celastraceae), chi Salacia là một chi lớn và phân bố khá
rộng rãi. Thực vật thuộc chi này đã được nghiên cứu khá nhiều trên thế giới, đây là
chi có tiềm năng lớn về khai thác để làm thuốc chữa bệnh. Cây Chóc máu có tên
khoa học là Salacia chinensis L., chi Salacia, họ Celastraceae đã được sử dụng
trong dân gian để chữa một số bệnh như tiểu đường, trợ tim, ung thư, viêm
khớp…Trên thế giới loài cây này thu tại Thái Lan và Ấn Độ đã được quan tâm
nghiên cứu về mặt hóa học và hoạt tính sinh học [11], [22], [29]. Ở Việt Nam, cành
và lá của cây Chóc máu cũng đã được quan tâm nghiên cứu [6], [7], [8].
Để góp phần nghiên cứu một cách hệ thống và đầy đủ về thành phần hóa học
và hoạt tính sinh học của cây Chóc máu Việt Nam, đề tài: “Nghiên cứu thành phần
hóa học và hoạt tính sinh học của rễ cây Chóc máu (Salacia chinensis L.) ở Việt
Nam” đã được chúng tôi chọn nghiên cứu nhằm đóng góp một phần nhỏ vào các
nghiên cứu về các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học, góp phần làm sáng tỏ
công dụng của cây Chóc máu và định hướng khai thác, sử dụng loài cây hữu ích
này.
1
PHẦN I. TỔNG QUAN
1.1. Khái quát về thực vật và tình hình nghiên cứu chi Salacia họ Celastraceae
1.1.1. Thực vật chi Salacia
Theo thống kê, họ Dây gối (Celastraceae) có khoảng 15 chi và 79 loài, trong
đó chi Salacia có 14 loài, phần lớn các chi của họ này có mặt tại khu vực nhiệt đới.
Đặc điểm chung của thực vật thuộc họ này là thường tồn tại dưới dạng cây to hoặc
cây nhỡ, mọc đứng hoặc mọc trườn bò, cành đôi khi có gai, lá mọc đối hay mọc
cách, thường dai, không có lá kèm, hoa lưỡng tính, thường họp thành xim. Mọc rải
rác trong rừng thưa, rừng thứ sinh, ra hoa tháng 2, 3.
Khu vực phân bố của chi Salacia chủ yếu ở các vùng nhiệt đới như Việt
Nam, Mianma, Thái Lan, Lào, Campuchia, Trung Quốc [1], [2], [3].
1.1.2. Tình hình nghiên cứu chi Salacia
Các loài thuộc chi Salacia đã được quan tâm nghiên cứu nhiều về thành phần
hóa học cũng như hoạt tính sinh học có tác dụng chữa bệnh tiểu đường, trợ tim, ung
thư, kháng viêm [10], [14], [17], [22].
Trong những năm gần đây bệnh tiểu đường được coi là một trong những căn
bệnh mang tính toàn cầu. Với mục đích tìm kiếm những cây thuốc và những hợp
chất có nguồn gốc thiên nhiên điều trị bệnh tiểu đường có độ an toàn và hiệu quả
điều trị cao, ít tác dụng phụ khi được sử dụng trong thời gian dài, những nghiên cứu
về các loài trong chi Salacia đang thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa
học trong và ngoài nước.
Từ năm 1967, V. Krishman và S. Rangaswami đã phát hiện ra cây Salacia
prinoides, một loại cây bụi ở Ấn Độ có tác dụng chữa bệnh tiểu đường [51], do đó
đã nghiên cứu từ rễ cây Salacia prinoides và phân lập được 6 chất. Nhưng đến năm
1973, bằng phương pháp nhiễu xạ tia X, D. Rogers và D.J. Williams mới xác minh
được cấu trúc một chất mới là dẫn xuất đibrom của triterpen và một dẫn xuất của
khung friedelan là 25,26-Oxidofriedelan-1,3-dion (1) [17].
Năm 1999, từ dịch chiết methanol của rễ cây thuốc Salacia oblonga ở Ấn
Độ, Hiashi Masuda và cộng sự đã công bố tác dụng ức chế sự tăng glucozơ huyết
2
thanh trong sacarozơ và maltozơ ở chuột, do đó có thể chữa được bệnh tiểu đường
và tìm ra chất mới kotalagenin 16-axetat (2) [22].
30
29
20
19
27
12
O
1
2
3
17
11
O
Br
Br
18
A
4
H
9
13
H
8
10
5
24
23
25
6
E
O
14
26
H
30
21
12
O
28
11
9
1
16
2
15
3
7
O
1
8
10
4
23
5
7
6
24
21
18
22
13
17
14
16
26
25
20
19
27
22
29
15
OH
28
O
C
CH3
O
2
Các nghiên cứu cho thấy ba cây thuốc thuộc loài Salacia là Salacia oblonga,
Salacia reticulate và Salacia chinensis đều có chung hoạt chất là salacinol và có tác
dụng trên bệnh tiểu đường [22]. Tác dụng của salacinol tương tự như acarbose, một
dược phẩm được cho phép sử dụng trong điều trị bệnh tiểu đường ở Nhật Bản (có
tên biệt dược là Glucobay, Bayer), thông qua hoạt tính ức chế men α- glucosidase
trong dịch ruột. Những thuốc điều trị bệnh tiểu đường theo đường uống hiện nay
gồm 3 nhóm:
+ Nhóm thuốc kích thích sự tăng tiết insulin của tế bào β tụy tạng (nhóm Sulfony
lureas).
+ Nhóm thuốc cải thiện chống lại sự giảm insulin: nhóm thiazolidinedione và
biguanide.
+ Nhóm ức chế men α - glucosidase:
Trong đó nhóm ức chế men α – glucosidase là nhóm thuốc được sử dụng khá
phổ biến, được lựa chọn ưu tiên do không có tác dụng làm hạ đường huyết trên cơ
địa bình thường và có hiệu lực làm hạ đường huyết bị gia tăng sau khi ăn no so với
lúc đói. Nhóm thuốc này thường được sử dụng phối hợp với chế độ ăn uống và vận
động trên các bệnh nhân bệnh tiểu đường [20], [22].
Năm 2001, Yosikawa và cộng sự đã phân lập từ rễ cây Salacia reticulate
được Mangiferin (3), 3-catechins, 2-catechin trùng hợp Epicatechin (4),
Epigallocatechin (5), Metylepigallocatechin (6), Epiafzelechin (4b→8)-(-)-4’-O-
3
Metylepigallocatechin (7), Epicatechin-(44b→8)-(-)-4’-O-Metylepigallocatechin
(8), Salacinol (9), Kotalanol (10), và đã kiểm tra được hoạt tính sinh học của chúng,
đó là khả năng ức chế chống lại một vài cacbon hydat chuyển hóa enzym (maltozơ,
isomaltozơ, α-amylozơ, và men khử aldozơ). Mangiferin còn được tìm thấy trong
các cây Salacia oblonga, Salacia chinensis và Salacia prinoides [30].
HO
O
HO
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
3
R1
OR2
OH
OR1
HO
O
OH
HO
OH
O
OCH3
OH
R2
HO
O
OH
OH
OH
OH
OH
4: R1 = R2 = H
7: R1 = R2 = H
5: R1 = H, R2 = OH
8: R1 = OH; R2 = H
6: R1 = CH3; R2 = OH
OH
OH
HO
HO
OH
HO
SO3-
HO
OH
O
O
S
SO3-
HO
HO
9
S
10
OH
HO
4
OH
1.2. Đặc điểm thực vật và tình hình nghiên cứu cây Chóc máu (Salacia
chinensis L.)
1.2.1. Đặc điểm thực vật
Cây Chóc máu hay còn gọi là chóp máu hay chóp mào, chóc máu tàu, có tên
khoa học là Salacia chinensis L. thuộc chi Salacia, họ dây gối (Celastraceae).
Hình 1: Cây Chóc máu, phần rễ
Cây Chóc máu là loài cây bụi đứng hoặc trườn cao 1-2m, cành nhỏ có cạnh,
màu đỏ nhạt sau đen dần. Lá mọc đối, phiến hình bầu dục hay hình trứng hẹp hoặc
hình trứng ngược, dài 5-11cm, rộng 3-5cm, đầu hơi nhọn, mép nguyên hay có răng
cưa, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới màu nâu, gân bên 6-7 đôi, lá kèm nhỏ. Hoa
nhỏ, màu vàng nhạt, gồm 2-6 cái ở nách lá, có mùi thơm, cuống hoa dài 6-10mm,
địa mật to hình cốc, cao khoảng 1mm, cánh hoa cao 6mm, nhị ba ô, mỗi ô có 2
noãn, quả mọng hình cầu hay hình trứng hoặc hình quả lê, cao 1-1,5cm, khi chín có
màu đỏ tím, một hạt. Mọc rải rác trong rừng thứ sinh, rừng thưa, sinh cảnh hở.
Thường ra hoa từ tháng 12 đến tháng 3 năm sau, có quả vào tháng 2 ÷ 5 [4].
Cây phân bố ở Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Lào, Thái Lan, Malaysia,
Indonesia, Philippin và Việt Nam (yếu tố địa lý nhiệt đới châu Á). Ở nước ta, cây
5
mọc tự nhiên, rải rác ở các rừng thứ sinh, rừng thưa, đồi cây bụi thuộc các vùng
trung du ven biển từ Nghệ An, Quảng Trị đến Thừa Thiên Huế. Ngoài ra, đã từng
phát hiện ở Lạng Sơn, Bắc Giang, Quảng Ninh, Ninh Bình, Đồng Nai, Kiên Giang,
An Giang. Ở vườn quốc gia Bạch Mã đang bảo tồn nguồn gen này.
Cây Chóc máu có vị chát, tính ấm, có tác dụng khu phong, trừ thấp, thông
kinh, hoạt lạc. Dân gian dùng rễ sắc để uống chữa viêm khớp, phong thấp, đau lưng,
cơ thể suy nhược [2]. Nước sắc của thân cây có tác dụng hỗ trợ phẫu thuật giúp cho
bệnh nhân trung tiện, trợ tim, kháng khuẩn [2]…Trong các bài thuốc dân gian của
các nước như Ấn Độ, Thái Lan,…các loài thuộc chi Salacia nói chung và cây
Salacia chinensis L. được dùng để chữa bệnh tiểu đường.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu cây Chóc máu
Trong những năm gần đây, cây Chóc máu (Salacia chinensis L.) có nguồn
gốc tại Ấn Độ và Thái Lan đã được các nhà khoa học Nhật Bản nghiên cứu nhiều.
Năm 2002, Yoshikawa và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng sinh lý của cây
Salacia chinensis L. từ Ấn Độ và đã chỉ ra tác dụng chữa bệnh tiểu đường và an
thần [11]. Các flavonoid là epigallocatechin, epicatechin và catechin phân lập được
từ loại này đã được thử hoạt tính sinh học, kết quả cho thấy men khử andozơ có tác
dụng ức chế lên thủy tinh thể của chuột, flavon và flavonol tại vị trí 7-hydroxyl và
bán catechin tại (3’,4’-dihydroxyl) có tác dụng mạnh. Tại 5-hydroxyl không có hoạt
tính; tại 3-hydroxyl và 7-O-glucozit tác dụng khử mạnh; tại 3 liên kết đôi thì làm
tăng hoạt tính sinh học nhiều. Như vậy, flavon và flavonol bán catechin có tác dụng
sinh học mạnh hơn rất nhiều so với bán pyrogallol (3’,4’,5’-trihydroxyl) [21], [51].
Từ cặn chiết n-butanol và methanol từ thân của loài Salacia chinensis L. ở
Thái Lan, các hợp chất như salacinol, magiferin, và các friedelan-triterpen,
eudesman-secquiterpen đã được phân lập. Các cặn chiết n-butanol và methanol của
thân cây Chóc máu này đã được thử hoạt tính, kết quả cho thấy cặn chiết n-butanol
có khả năng làm giảm lượng đường trong máu [29].
Ba triterpen có bộ khung của friedelan có tên là salason A (11), B (12), C
(13), một chất mới có bộ khung norfriedelan là salaquinol A (14) và một
6
secquitecpen có bộ khung eudesman là salasol A (15), đã được phân lập từ dịch
chiết methanol 80% của thân cây Salacia chinensis ở Thái Lan vào năm 2003.
Ngoài ra, 6 hợp chất 3β, 22β-dihydroxyolean-12-en-29-oic axit, tingenon, tingenin
B, regeol A, triptocallin A, và mangiferin được tìm thấy có tác dụng ức chế của men
khử andozơ lên thủy tinh thể của chuột. Cũng từ cây này, nhóm tác giả trên đã phân
lập được thêm 2 friedelan-tritecpen mới là salason D (16) và E (17). Thân của cây
Salacia chinensis L.có nhiều ứng dụng rộng rãi: có tác dụng hỗ trợ phẫu thuật giúp
cho bệnh nhân trung tiện, điều kinh, bổ máu, trợ tim, kháng khuẩn, bệnh thấp khớp
và kích thích bài tiết sản dịch [31].
30
29
30
29
20
19
27
9
1
2
3
8
10
27
22
13
17
14
16
12
28
15
26
2
O
CH2OH
25
5
4
O
18
12
11
7
6
3
O
24
23
30
20
21
11
1
4
23
21
18
22
11
13
17
9
14
16
8
27
12
28
11
15
25
26
7
6
O
1
2
3
OH
8
19
21
18
22
13
17
14
16
10
26
7
6
OH
13
24
23
28
15
25
5
4
O
12
24
29 CH OH
2
20
9
10
5
19
30
O
O
20
27
12
1
HO
4
23
18
22
13
17
9
14
16
8
10
5
3
21
11
O
2
19
OH
1
10
2
28
3
4
7
26
O
15
27
9
11
7
9
6
11
12
O
AcO
O
13
14
15
30
29
12
9
2
3
O
1
4
23
5
21
18
22
16
30
7
12
25
28
15
1
2
CH2OH
OH
11
22
13
17
16
14
28
15
26 OH
CH2OH
16
24
10
17
4
O
23
5
24
13
22
18
17
14
7
16
28 CH2OH
15
8
6
21
26
9
3
6
24
7
6
19
HO
26
25
25
21
18
29
O
17
14
8
10
4
19
20
19
13
11
8
10
5
23
20
27
1
2
3
6
24
12
8
5
29
20
14
HO
15
25
30
OAc
O
OAc
27
18
Năm 2006, Nakamoto và cộng sự đã chiết xuất từ Salacia chinensis, Salacia
reticulate và Salacia oblonga ra chất có tính ngăn ngừa được sắc tố melamin làm
7
sạm da, có thể dùng làm kem trắng da, chống lão hóa da và đã được thử nghiệm trên
một số phụ nữ tình nguyện trong khoảng một thời gian, kết quả cho thấy những vết
tàn nhang, vét rám nắng và những đốm đen nhỏ trên da đều bị loại bỏ [35].
Năm 2007, lần đầu tiên ở Việt Nam loài Salacia chinensis L. đã bước đầu
được nghiên cứu về thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học. Các cặn
chiết n-hexan, etylaxetat và methanol của cành cây Chóc máu đã được thử hoạt tính
kháng vi sinh vật kiểm định. Kết quả cho thấy cặn chiết methanol, etylaxetat có hoạt
tính cao đối với chủng Staphylococcus aureus (Sa). Năm triterpen đã được phân lập
từ cặn chiết n-hexan của cành cây Chóc máu thu tại Thừa Thiên Huế, trong đó có
một triterpen mới là axit 28-hydroxy-3-oxo-30-lupanoic (18) và bốn tritecpen 3oxo-lupan-30-al (19); 29-nor-21α-H-hopan-3,22-dion (20); betulin (21); 21α-Hhop-22(29)-en-3β,30-diol (22). Đây là lần đầu tiên các triterpen khung hopan, lupan
được phân lập từ loài cây này [5], [6].
29
O
20
30
19
H
12
25
11
17
10
3
4
7
6
5
27
4
19
24
23
10
30
28 16
15
8
3
O
17
9
2
15
8
O
22
26
14
1
21
18
13
28
16
9
2
11
25
26
14
1
O
13
12
22
18
20
19
21
7
6
5
27
20
24
23
29
20
30
12
25
4
23
19
22
17
OH
26
16
12
25
28
5
24
6
7
2
27
21
4
23
27
17
28
16
12
11
30 CH2OH
9
9
10
5
6
7
2
15
8
3
HO
13
27
3
22
24
8
OCOCH3
20
21 22
18
26
14
1
15
8
11
29
20
29
9
10
3
HO
13
30
21
18
14
1
2
11
19
O
1
8
23
5
25
6
24
7
21
18
22
13
17
16
14
28
15
10
4
19
26
23
29
30
CH2OCOCH3
29
30
CH2OH
20
27
12
2
3
O
18
22
11
17
9
14
16
8
25
6
7
28
12
26
2
23
24
O
23
18
22
13
17
14
16
8
25
7
6
9
28
2
3
26
OH
24
12
11
15
10
4
21
9
1
5
19
11
27
OH
20
27
3
24
20
29
30
15
10
5
21
13
1
4
19
25
O
1
8
4
23
25
6
7
21
18
22
13
17
16
14
28
15
10
5
19
26
OH
24
26
Betulin hay 20(29)-lupen-3β,28-diol (21) là một hợp chất đặc trưng cho
khung lupan, được phân lập đầu tiên vào năm 1988. Đây là một triterpen có mặt
trong nhiều loài thực vật thuộc các họ khác nhau. Các nghiên cứu cho thấy betulin
thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên hai dòng tế bào ung thư HeLa và Hep-2 với
cùng giá trị IC50 là 40µg/ml, bên cạnh hoạt tính chống HIV (IC50 = 6,1µg/ml) còn
cho thấy Betulin có tác dụng bảo vệ gan và làm giảm khả năng gây độc của CdCl2 ở
nồng độ rất thấp 0,1µg/ml [18], [33], [53].
Cũng trong nghiên cứu [8], từ dịch chiết n-hexan và etylaxetat của cành và lá
cây Chóc máu thu tại Quảng Bình, tác giả đã phân lập và xác định được cấu trúc
hóa học của 13 chất, đó là các tritecpen khung friedelan (gồm 8 chất: 21αaxetoxyfriedelan-3-on
(23);
dihydroxyfriedelan-3-on
(25);
29-axetoxyfriedelan-3-on
7α,29-dihydroxyfriedelan-3-on
(24);
(26);
7α,21α21α-30-
dihydroxyfriedelan-3-on (27); friedelan-3-on (28), friedelan-3β-ol (29), 14taraxeren-3β-on (30), axit 3,4-secofriedelan-3-oic (31)), betulin (21), quercitrin
(32), mangiferin (33) và daucosterol (34). Trong đó có hai chất mới là 7α,21αdihydroxyfriedelan-3-on (25) và 7α,29-dihydroxyfriedelan-3-on (26). Kết quả thử
hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định từ dịch chiết methanol và etylaxetat của cành
và lá cây Chóc máu cho thấy có hoạt tính mạnh đối với chủng Staphylococus aureus
(Sa).
1.3 Lớp chất triterpen
Terpenoid là một trong những lớp chất trao đổi thứ cấp tồn tại phổ biến trong
thiên nhiên và có cấu trúc đa dạng nhất. Các terpen được tạo thành từ các đơn vị
isopren (C5H8). Căn cứ vào số đơn vị isopren hợp thành người ta phân biệt các
9
monoterpen (10C), sesquiterpen (15C), diterpen (20C), sesterterpen (25C), triterpen
(30C), tetraterpen (40C) và polyterpen. Các triterpenoid hợp thành một nhóm rất
lớn các hợp chất thiên nhiên được phân bố rộng rãi trong thực vật. Cho đến đầu
những năm 70, đã có khoảng trên 500 triterpenoid tự nhiên được xác định cấu trúc.
30
29
30
29
30
HOH2C
12
3
O
4
18
22
13
17
9
14
16
8
25
28
9
25
5
4
O
27
24
17
14
16
12
28
9
2
6
28
24
23
4
HO
25
5
22
17
28
16
15
10
3
26
7
21
18
14
8
1
19
13
11
15
10
3
6
23
1
2
22
13
8
27
21
18
12
11
26
7
19
27
15
10
5
21
11
1
2
19
20
20
OH
20
27
29
26
7
6
29
24
23
OH
3'
30
29
2'
30
29
20
27
20
27
25
11
12
26
9
2
3
HO
23
1
4
19
21
18
22
13
17
14
16
O
28
HO
3
1
2
5
4'
O
5'
HO
HO
OH
4a
9a
1
8a
6
7
8
OH
1'
O
33
29
28
21
26
22
18
12
9
2
H
8
10
O
3
H
O
H
HO
OH
7
5
4
6
H
34
10
14
15
24
25
27
16
1
H
23
17
11
19
OH OH
20
13
4
3
5'
6'
O
1''
O
OH
5
9
OH
1'
H
OH
10a
4'
2
HO
O
4
2
2'
3'
CH3
31
3
O1
O
HO
HO
6'
10
5
OH
26
23
OH
6
16
24
30
9
28
8
7
7
17
6
4
6
24
HO
15
25
5
7
22
14
10
8
21
18
13
9
15
10
12
11
19
8
32
OH
Về mặt cấu trúc hóa học, các triterpenoid có công thức tổng quát C30Hn, được
tạo bởi 6 tiểu phân isopren hợp với nhau bởi 2 mảnh C15 nối với nhau ở giữa theo
cách nối đầu với đầu. Hợp chất hexa-en squalen (35) với cấu hình toàn trans là tiền
thân của tất cả các triterpenoid, với sự đóng vòng của Squalen theo các cấu dạng
khác nhau sẽ cho các tritecpen các khung khác nhau. Dưới đây trình bày khái quát
về một số khung triterpen đã được tìm thấy từ rễ cây chóc máu.
35
1.3.1. Triterpen khung friedelan
Các friedelan triterpen tồn tại khá phổ biến trong thiên nhiên. Về mặt cấu
trúc hóa học triterpen khung friedelan (36) có cấu tạo là hệ pentacylic (6-6-6-6-6).
Trong khung này, các nhóm thế thường là các nhóm metyl ở các vị trí C-4β, C-5β,
C-9β, C-13α, C-14β, C-17β, C-20α và β.
29
30
30
29
20
27
12
H
H
9
3
25
4
22
27
12
17
16
9
2
26
3
7
O
36
24
4
22
27
12
O
28
16
14
10
15
8
25
21
18
2
26
7
3
6
37
24
23
O
11
13
9
14
10
5
4
21
18
22
26
7
6
OH
38
24
29
29
27
12
11
O
3
O
10
24
CHO
23
6
7
12
O
17
16
2
3
26
OH
39
O
23
22
9
14
16
20
27
12
28
11
15
8
25
9
2
7
6
24
18
17
10
5
21
13
1
4
19
11
28
15
8
25
5
22
13
1
4
21
18
14
9
2
19
27
26
40
O
30
29
20
20
28
16
15
8
25
19
17
1
23
30
30
29
20
17
1
5
19
13
11
28
6
23
30
20
15
8
5
18
14
1
10
21
13
11
2
19
3
HO
1
8
23
5
25
7
21
18
22
13
17
16
14
28
15
10
4
19
26
6
24
29
Người ta đã phân lập được các triterpen khung friedelan từ những loài thực
vật thuộc các họ: Celastraceae (chi Salacia, Catha, Elaeodendron, Kokoona,
11
Prionostemma,
Acanthothammus…),
Cucurbitaceae
(Momordica),
Buxaceae
(Pachysandra), Euphorbiaceae (Euphorbia, Phyllanthus)…[43].
Bốn triterpen khung friedelan là 1-friedelen-3-on (37), friedelan-1,3-dion7α-ol (38), friedelan-1,3-dion-24-al (39), và 7,24-oxido-friedelan-1,3-dion (40) đã
được Tewari và cộng sự phân lập và xác định cấu trúc hóa học lần đầu tiên vào
những năm 70 từ loài Salacia prenoisdes D.C [46], [47].
Năm 2000, từ Vitis trifolia, J.K. Kundu và cộng sự đã phân lập và xác định
được cấu trúc của epifriedelanol (friedelan-3β-ol) (29). Đã thử hoạt tính sinh học
của chất (29) và nhận thấy khả năng chống ung thư của hợp chất này [23].
Năm 2001, S.A. Vieira Filho và cộng sự đã phân lập được hai tritecpen mới
từ lá của cây Austroplenckia populnea (Celastraceae) đó là 3,4-seco28hydroxyfriedelan-3-oic acid (41) và 3,4-secofriedelan-3-oic acid (42) [41].
30
20
27
O
12
R
HO
O
2
5
4
22
13
17
9
14
16
10
3
21
18
11
1
COOH
19
15
8
25
7
28
26
6
24
23
23
41: R = OH
42: R = H
43
Năm 2003, từ rễ của cây Phyllanthus oxyphyllus, Somyote Suttivaiyakit và
cộng sự đã phân lập được axit 29-nor-3,4-seco-friedelan-4(23),20(30)-dien-3-oic
(43) có tác dụng chống oxy hóa mạnh [44].
1.3.2. Triterpen khung taraxeran (friedooleanan)
Tương tự như khung friedelan, cấu trúc hóa học của các triterpen khung
taraxeran (44) cũng là hệ 5 vòng (6-6-6-6-6). Trong khung này các nhóm thế
(thường là các nhóm metyl) ở các vị trí 4α,β, 8β, 10β, 13α, 17β, 20α,β. Cấu hình
12
taraxeran có dạng: trans-trans-trans-cis. Cấu hình giữa khung A/B là trans, B/C:
trans, C/D: trans, D/E: cis.
30
29
20
27
12
11
25
26
9
2
3
1
21
18
22
13
17
14
16
28
H
H
COOH
15
10
5
4
19
8
H
7
6
H
23
44
24
45
Các tritecpen khung taraxeran được tìm thấy trong một số loài: Bosistoa
brassi (Rutaceae) [37], Tamarix aphylla (Tamaricaceae) [31]…
Seco-3,4-taraxeron (45) phân lập từ cặn clorofooc của lá loài Alchornea
latifolia có hoạt tính gây độc tế bào trên 2 dòng Hep-G2 và A-431 [52].
Năm 1997, từ loài Adhatoda vasica Nees, Atta-Ur-Rahman và cộng sự đã
phân lập được một tritecpen mới khung taraxeran, đó là 3α-hydroxy-D-friedoolean5-en (46) và epitaraxerol (47) [12]. Một nghiên cứu khác đã phát hiện ra khả năng
chữa bệnh alzheimer của hợp chất (47) có hoạt tính ức chế AchE với giá trị IC50 là
79µM [38].
20
20
19
27
25
11
13
26
9
2
3
HO
23
1
4
10
5
14
H
22
12
17
16
25
H
8
7
11
28
26
2
H
3
HO
46
23
21
18
22
H
17
16
28
14
1
4
19
13
9
15
6
24
27
21
18
12
30
29
30
29
10
5
H
6
24
8
15
7
47
Như vậy, đã có 17 chất được phân lập và xác định cấu trúc từ cành và lá của
cây Chóc máu Việt Nam. Luận văn này sẽ tìm hiểu về thành phần hóa học của rễ
cây Chóc máu và bước đầu thăm dò về hoạt tính chữa tiểu đường từ rễ của loài cây
này.
13
PHẦN II. THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Mẫu thực vật
- Rễ cây Chóc máu được thu hái tại Đồng Hới - Quảng Bình vào tháng 11
năm 2009.
- Tên cây do CN. Ngô Văn Trại – Viện Dược liệu, Bộ Y tế giám định đó là
Salacia chinensis L., thuộc chi Salacia, họ Dây gối Celastraceae.
- Nội dung nghiên cứu:
1. Phân loại và chiết mẫu thực vật trong các dung môi từ không phân cực đến
phân cực.
2. Thử hoạt tính tiểu đường các cặn chiết từ rễ cây Chóc máu.
3. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cặn chiết từ rễ cây Chóc máu.
4. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số chất trong rễ cây Chóc
máu.
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu
2.1.2.1. Thu hoạch và xử lý mẫu thực vật
Mẫu thực vật thu hái về, đem chặt nhỏ, phơi và sấy khô ở 30÷400C, xay nhỏ.
Bột rễ cây (3000g) được ngâm chiết bằng methanol (80%) 3 lần (24h/lần) ở nhiệt độ
phòng. Dịch chiết methanol được cất loại dung môi, sau đó thêm nước và chiết bằng
etylaxetat. Cất loại dung môi bằng máy cô quay giảm áp thu được các cặn chiết
tương ứng.
2.1.2.2. Các phương pháp sắc ký để phân lập các chất từ cặn chiết
Phân lập các hợp chất tinh khiết từ cặn chiết bằng phương pháp sắc ký cột
(CC) kết hợp với sắc ký bản mỏng (TLC).
2.1.2.3. Các phương pháp xác định cấu trúc của các chất phân lập được
Cấu trúc của các chất phân lập ra được xác định bằng sự kết hợp giữa các
phương pháp vật lý (t0n/c) và các phương pháp phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối
va chạm (EI-MS), phổ khối ion hóa bằng bụi electron (ESI-MS), phương pháp phổ
cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR và DEPT).
14
2.1.2.4. Phương pháp thử hoạt tính tiểu đường
* Nguyên tắc: Chuột nhắt trắng được nuôi ổn định glucose huyết trong điều
kiện phòng thí nghiệm 3 – 5 ngày. Cho chuột uống thuốc một liều duy nhất trong
ngày. Định lượng glucose huyết vào các thời điểm: trước và sau khi uống thuốc 4h.
Song song tiến hành lô chứng (cho uống dung môi pha thuốc) để so sánh.
So sánh kết quả định lượng glucose huyết trước và sau khi uống thuốc 4h để
kết luận thuốc có tác dụng hạ glucose huyết ở chuột bình thường hay không.
Uống thuốc hoặc dung môi pha thuốc
Nuôi ổn định
3 - 5 ngày
0h
Định lượng
glucose huyết
4h
Giờ
Định lượng
glucose huyết
Sơ đồ 1: Thí nghiệm thử hoạt tính tiểu đường trên chuột
* Phương pháp định lượng glucose huyết:
Đường huyết của chuột thí nghiệm được đo bằng máy đo đường huyết
Johnson & Johnson kèm theo kit thử tương ứng.
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng oxy hóa glucose thành axit gluconic được
xúc tác bởi enzym glucose oxidase (GOD) theo phản ứng (1):
Glucose + H2O + O2
GOD
Acid gluconic + H2O2
(1)
H2O2 tạo thành sẽ oxy hóa O-Dianisidin để tạo thành phức chất có màu vàng nâu
theo phản ứng (2).
O-Dianisidin + H2O2
Phức hợp màu vàng nâu + H2O (2)
Cường độ màu được xác định bằng phương pháp đo quang tương ứng với
lượng glucose trong máu cần định lượng.
15
Máu đem định lượng glucose huyết là máu tĩnh mạch toàn phần được lấy từ
đuôi chuột (bỏ đi giọt máu đầu tiên).
Phương pháp xử lý số liệu: số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê
với sự trợ giúp của phần mềm Excel. Sự khác nhau có ý nghĩa thống kê khi P< 0,05.
Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình cộng/trừ sai số chuẩn (M ±
SE).
2.1.2.5. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật
Để sàng lọc các hợp chất có hoạt tính kháng sinh, các mẫu chiết được tiến
hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật trên phiến vi lượng 96 giếng theo phương pháp
hiện đại của Vanden-Bergher và Vlietnek.
Quá trình thử được tiến hành theo 2 bước như sau:
Bước 1: Sàng lọc sơ bộ, tìm chất có hoạt tính.
Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính kháng vi
sinh vật kiểm định bao gồm: Ampicilin đối với vi khuẩn Gram (+), Tetracylin đối
với vi khuẩn Gram (-), Nystasin đối với nấm men.
Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm:
- Vi khuẩn Gram (-): Salmonella enterica (Se), Escherichia coli (Ec),
Pseudomonas aeruginosa (Pa).
+ Salmonella enterica (Se) là vi khuẩn gây nên bệnh thương hàn hiểm nghèo,
là vi trùng thực khuẩn Gram (-), tăng trưởng nhanh nhất ở nhiệt độ 370C, nhiệt độ
cơ thể.
+ Escherichia coli (Ec) thuộc nhóm trực khuẩn Gram (-), thường sống ở
đường ruột và gây ra một số bệnh ở người như ỉa chảy, viêm ruột thừa,…
+ Pseudomonas aeruginosa (Pa) là trực trùng mủ xanh, thường gây mủ,
nhiễm trùng, có thể gây sốt, viêm mủ thận, ỉa chảy khó điều trị…
- Vi khuẩn Gram (+): Lactobacillus fermentum (Lf), Bacillus subtilis (Bs),
Staphylococcus aureus (Sa).
+ Lactobacillus fermentum (Lf) tăng cường hệ miễn dịch, tốt cho đường
ruột.
16