Nghiên cứu xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Pasteurella multocida trong bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Hà Giang, Cao Bằng và lựa chọn vắc xin phòng bệnh

i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
---------------------------

PHẠM THỊ PHƯƠNG LAN

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ GÂY BỆNH
CỦA VI KHUẨN Pasteurella multocida TRONG BỆNH TỤ
HUYẾT TRÙNG TRÂU, BÒ TẠI HÀ GIANG, CAO BẰNG
VÀ LỰA CHỌN VẮC XIN PHÒNG BỆNH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y

Thái Nguyên, năm 2017


ii

MỤC LỤC
MỤC LỤC................................................................................................................ii
DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT.................................................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG.......................................................................................vi
DANH MỤC CÁC HÌNH......................................................................................viii
MỞ ĐẦU................................................................................................................... 1
Chương 1................................................................................................................... 4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................................................4
1.1. Vi khuẩn Pasteurella multocida...................................................................................4

1.1.1. Phân loại vi khuẩn................................................................................................4
1.1.3. Đặc tính sinh hóa..................................................................................................7
1.1.4. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn P. multocida...................................................7
1.2. Bệnh tụ huyết trùng do vi khuẩn P. multocida gây ra................................................18
1.2.1. Đặc điểm bệnh tụ huyết trùng trâu, bò...............................................................18
1.2.2. Cơ chế sinh bệnh................................................................................................18
1.2.3. Đặc điểm dịch tễ học..........................................................................................19
1.2.4. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích bệnh tụ huyết trùng trâu, bò.......................23
1.2.5. Chẩn đoán bệnh..................................................................................................25
1.2.6. Phòng và trị bệnh tụ huyết trùng........................................................................32
1.3. Vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng...........................................................................35
1.3.1. Trên thế giới.......................................................................................................35
1.3.2. Ở Việt Nam.........................................................................................................39
1.4. Một số kết luận qua phân tích tổng quan...................................................................41

Chương 2................................................................................................................. 43
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................43
2.1. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu.................................................................................43
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................43
2.1.2. Nguyên vật liệu..................................................................................................43
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu......................................................................45
2.2. Nội dung nghiên cứu.................................................................................................45
2.2.1. Nghiên cứu điều tra về dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang
và Cao bằng..................................................................................................................45
2.2.2. Nghiên cứu phân lập và xác định các đặc tính sinh vật, hóa học, yếu tố độc lực
của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được....................................................46
- Phân lập vi khuẩn P. multocida từ mẫu dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe và mẫu bệnh
phẩm lấy từ trâu, bò chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng..............................................46
2.2.3. Xác định miễn dịch chủ động tự nhiên và đánh giá hiệu lực của vắc xin P52 dạng
keo phèn và nhũ dầu trong phòng bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang,

Cao Bằng..........................................................................................................................46
2.2.3.1. Miễn dịch chủ động tự nhiên ở trâu, bò chưa được tiêm phòng vắc xin trong
vùng dịch tụ huyết trùng địa phương...........................................................................46


iii
2.3. Phương pháp nghiên cứu...........................................................................................47
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trâu, bò....................47
2.3.2. Phương pháp lấy mẫu.........................................................................................50
2.3.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn P. multocida....................................................51
2.3.4. Phương pháp xác định đặc tính sinh vật, hóa học của P. multocida...................52
2.3.5. Phương pháp xác định serotype của vi khuẩn P. multocida phân lập được từ
trâu, bò chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng bằng kỹ thuật PCR...................................52
2.3.6. Phương pháp xác định LD50 của vi khuẩn P. multocida phân lập được từ trâu,
bò chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng tại Hà Giang và Cao Bằng...............................53
2.3.7. Phương pháp xác định độc lực của vi khuẩn P. multocida phân lập được từ trâu,
bò chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng đối với chuột nhắt trắng (Carter et al, 1995)
[77]...............................................................................................................................54
2.3.8. Phương pháp xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng P.
multocida phân lập được (Nguyễn Thanh Hà, 1991) [10]...........................................54
2.3.9. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm vắc xin..........................55
2.3.10. Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của trâu, bò trước
khi tiêm vắc xin và sau khi tiêm vắc xin bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp
IHA (Indirect Haemaglunation Tets)............................................................................55
2.3.11. Phương pháp xác định hiệu lực bảo hộ đối với trâu, bò trước và sau khi tiêm
phòng vắc xin bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng (Bain et al, 1982)
[61]...............................................................................................................................57
2.3.12. Phương pháp đánh giá tỷ lệ bảo hộ trung bình (Lê văn Tạo, Dương thế Long,
1996) [42].....................................................................................................................59
2.3.13. Phương pháp xử lý số liệu................................................................................59

Chương 3................................................................................................................. 60
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.......................................................60
3.1. Nghiên cứu điều tra về dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và
Cao bằng từ năm 2011 - 2015......................................................................................60
3.1.1. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng tại tỉnh Hà Giang và Cao
Bằng..............................................................................................................................60
3.1.2. Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng xét riêng ở từng loài trâu, bò tại 2
tỉnh Hà Giang và Cao Bằng..........................................................................................62
3.1.3. Tỷ lệ trâu, bò mắc tụ huyết trùng và tử vong ở các mùa vụ trong năm tại 2 tỉnh
Hà Giang và Cao Bằng.................................................................................................64
3.1.4. Mức độ dịch và hệ số năm dịch đối với bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh
Hà Giang và Cao Bằng.................................................................................................67
3.1.5. Thời điểm phát dịch, mùa dịch đối với bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà
Giang và Cao Bằng.......................................................................................................68
3.2. Nghiên cứu phân lập và xác định các đặc tính sinh vật, hóa học, yếu tố độc lực
của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được....................................................71
3.2.1. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ dịch ngoáy mũi của trâu, bò khoẻ tại 2 tỉnh
Hà Giang và Cao Bằng.................................................................................................71
3.2.2. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ bệnh phẩm trâu, bò nghi mắc bệnh tụ huyết
trùng tại Hà Giang và Cao Bằng..................................................................................73
3.2.3. Giám định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng vi khuẩn P.
mutocida phân lập được...............................................................................................74


iv
3.2.4. Xác định serotype các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được bằng phản
ứng PCR.......................................................................................................................77
3.2.5. Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được..............79
3.2.6. Xác định LD50 của vi khuẩn P. multocida.........................................................83

3.2.7. Kiểm tra khả năng mẫn cảm của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được
với một số loại kháng sinh và hóa dược.......................................................................86
3.3. Xác định miễn dịch chủ động tự nhiên và đánh giá hiệu lực của vắc xin P52 dạng
keo phèn và nhũ dầu trong phòng bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang,
Cao Bằng..........................................................................................................................88
3.3.1. Miễn dịch chủ động tự nhiên ở trâu, bò chưa được tiêm phòng vắc xin trong
vùng thường xuyên xảy ra dịch tụ huyết trùng địa phương.........................................89
3.3.2. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm vắc xin tụ huyết trùng
chủng P52 bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu gián tiếp.......................................95

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...................................................................................125
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................127


v

DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
AGPT
DNA
BHI
CFU
CSY
CBPT7
cs
DNT
ELISA
FAO
GMT
HE
HS

HGXB5
HSND
HSTD
IHA
LD50
MAT
NCCLS
OMP
PCR
PMPT
P. multocida
REP-PCR
RR
SDS
TEM
TSI
THT

: Agar Gel Precipitin Test (Phản ứng kết tủa trên thạch)
: Deoxyribonucleic acid
: Brain Heart Infusion (Môi trường thạch BHI)
: Colony forming units (Đơn vị khuẩn lạc)
: Casein-sucrose-yeast (Môi trường thạch CSY)
: Chủng P. multocida phân lập tại Cao Bằng
: Cộng sự
: Dermonecrotic toxin (Độc tố gây hoại tử)
: Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Phương pháp ELISA)
: Food and Agriculture Organization (Tổ chức Lương thực và Nông
nghiệp Liên Hiệp Quốc)
: Geometic Mean Titer (Hiệu giá trung bình)

: Hemtoxylin Eosin (Phương pháp nhuộm HE)
: Haemorrhagic septicaemia (Nhiễm trùng huyết, xuất huyết)
: Chủng P. multocida phân lập tại Hà Giang
: Hệ số năm dịch
: Hệ số tháng dịch
: Indirect Haemaglunation Tets (Phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp)
: Lethal Dose 50 – Liều gây chết 50%
: Microscopic Agglutination Test (Xét nghiệm huyết thanh học MAT)
: National Committee for Clinical Laboratory Standards (Viện
Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét ngiệm)
: Outer membrane protein (Protenin màng ngoài)
: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng nhân gen)
: Passive Mouse Protection Test (Phương pháp bảo hộ thụ động trên chuột)
: Pasteurella multocida
: Repetitive extragenic palindrome (Nhân các đoạn gen lặp lại bằng
kỹ thuật PCR)
: Relative Risk (nguy cơ tương đối RR)
: Sodium dodicyl sulphate
: Transport enrichment medium (Môi trường vận chuyển)
: Triple Sugar Iron (Môi trường 3 đường)
: Tụ huyết trùng


vi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Sự tương quan giữa các type của Roberts và Carter...........................................
Bảng 1.2. Hệ thống phân loại serotype P. multocida...........................................................
Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi dùng để xác định serotype B của vi khuẩn P. multocida
............................................................................................................................

Bảng 2.2. Thành phần các chất trong phản ứng PCR..........................................................
Bảng 2.3. Đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh
(NCCLS – 2014) [126]......................................................................................
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định hiệu lực bảo hộ của trâu, bò trước khi tiêm
phòng vắc xin.....................................................................................................
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định hiệu lực bảo hộ của trâu, bò sau khi tiêm
phòng vắc xin.....................................................................................................
Bảng 3.1. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng.........................................
Bảng 3.2. Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng xét riêng ở từng loài trâu,
bò........................................................................................................................
Bảng 3.3. Tỷ lệ trâu, bò mắc tụ huyết trùng và tử vong ở các mùa vụ................................
Bảng 3.4. Hệ số năm dịch bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Hà Giang và Cao Bằng
............................................................................................................................
Bảng 3.5. Hệ số tháng dịch bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao
Bằng...................................................................................................................
Bảng 3.6. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe.......................
Bảng 3.7. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ mẫu bệnh phẩm trâu, bò nghi mắc
bệnh tụ huyết trùng............................................................................................
Bảng 3.8. Giám định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng vi khuẩn P.
mutocida phân lập được.....................................................................................
Bảng 3.9. Kết quả thử phản ứng lên men đường của các chủng vi khuẩn...........................
Bảng 3.10. Xác định serotype các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được bằng
phản ứng PCR....................................................................................................
Bảng 3.11. Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được.............
Bảng 3.12. Dung quang khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập
được...................................................................................................................
Bảng 3.13. LD50 của vi khuẩn P. multocida........................................................................
Bảng 3.14. Kiểm tra khả năng mẫn cảm với một số loại kháng sinh của............................

vii
Bảng 3.15. Kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng tụ huyết trùng trong huyết thanh của
trâu, bò chưa được tiêm phòng vắc xin..............................................................
Bảng 3.16. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của trâu, bò chưa tiêm vắc xin phòng bệnh
tụ huyết trùng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng................
Bảng 3.17. Điều tra tình hình tiêm phòng vắc xin tụ huyết trùng trâu, bò tại Hà
Giang và Cao Bằng............................................................................................
Bảng 3.18. Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh trâu, bò tại thời điểm 1
tháng sau tiêm vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng............................................
Bảng 3.19. Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh trâu, bò tại thời điểm 3
tháng sau tiêm vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng..........................................
Bảng 3.20. Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh trâu, bò tại thời điểm 6
tháng sau khi tiêm vắc xin tụ huyết trùng........................................................
Bảng 3.21. Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể đối với từng loại vắc xin
tại các thời điểm 1, 3, và 6 tháng sau tiêm phòng............................................
Bảng 3.22.Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh trâu, bò sau khi tiêm vắc
xin tụ huyết trùng nhũ dầu...............................................................................
Bảng 3.23. Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể đối với vắc xin tụ huyết
trùng nhũ dầu tại thời điểm 9 và 12 tháng sau tiêm phòng..............................
Bảng 3.24. Kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng đối với trâu, bò sau khi tiêm 1
tháng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng............................
Bảng 3.25. Kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng đối với trâu, bò sau khi tiêm 3
tháng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng............................
Bảng 3.26. Kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng đối với trâu, bò sau khi tiêm 6
tháng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng............................
Bảng 3.28. Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng nhũ dầu
chủng P52 đối với trâu, bò sau khi tiêm tại thời điểm 1, 3 và 6 tháng
bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng......................................
Bảng 3.29. Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng nhũ dầu
chủng P52 đối với trâu, bò sau khi tiêm tại thời điểm 9 và 12 tháng bằng

phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng...............................................
Bảng 3.30. Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng keo phèn
chủng P52 đối với trâu, bò sau khi tiêm tại thời điểm.....................................
1, 3 và 6 tháng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng...............................


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn P.multocida (Viện Thú y Quốc gia)
..............................................................................................................................51
Hình 3.1. Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng ở từng loài trâu, bò tại
tỉnh Cao Bằng.......................................................................................................63
..............................................................................................................................63
Hình 3.2. Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng ở từng loài trâu, bò tại
tỉnh Hà Giang.......................................................................................................63
Hình 3.3. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng vụ Đông – Xuân
và Hè – Thu tại tỉnh Hà Giang.............................................................................66
Hình 3.4. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng vụ Đông – Xuân
và Hè – Thu tại tỉnh Cao Bằng.............................................................................66
Hình 3.5. Diễn biến tình hình bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Hà Giang và Cao
Bằng......................................................................................................................70
Hình 3.6. Thử phản ứng lên men đường Hình 3.7. Phản ứng sinh Indol............77
Hình 3.8. Phản ứng PCR xác định serotype của các chủng vi khuẩn P. multocida
phân lập được.......................................................................................................79
Hình 3.9. Thử độc lực trên chuột nhắt trắng dòng Swiss.....................................82
Hình 3.10. Dung quang khuẩn lạc chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được..83
Hình 3.11. Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn P. multocida phân lập
được......................................................................................................................88
Hình 3.12. Chỉ số miễn dịch của trâu, bò được tiêm vắc xin nhũ dầu và vắc xin

keo phèn chủng P52 sau 1, 3, 6 tháng tại tỉnh Cao Bằng...................................103
Hình 3.13. Chỉ số miễn dịch của trâu, bò được tiêm vắc xin nhũ dầu và vắc xin
keo phèn chủng P52 sau 1, 3, 6 tháng tại tỉnh Hà Giang....................................103
Hình 3.14. Tỷ lệ trâu, bò được bảo hộ sau tiêm vắc xin nhũ dầu và vắc xin keo
phèn chủng P52..................................................................................................122


1

MỞ ĐẦU
Ở Việt Nam ngành chăn nuôi trâu, bò luôn giữ vai trò quan trọng trong sản
xuất nông nghiệp. Ngoài cung cấp thịt, sữa là 2 loại sản phẩm có giá trị dinh dưỡng
cao phục vụ cho nhu cầu đời sống của người tiêu dùng, còn cung cấp sức kéo, phân
bón cho trồng trọt. Bên cạnh đó, chăn nuôi trâu, bò cũng là nguồn cung cấp các sản
phẩm phụ như: da, lông, phủ tạng ... cho ngành nông nghiệp chế biến. Theo thông
báo của Cục thống kê (2015) [173] tính tới thời điểm 01/10/2015, đàn trâu cả nước
có 2,5 triệu con, tăng 0,1% so với cùng thời điểm năm trước; đàn bò có 5,4 triệu
con, tăng 2,5%, riêng đàn bò sữa đạt 275,3 nghìn con, tăng 21%. Song song với sự
phát triển của ngành chăn nuôi trâu, bò thì công tác phòng chống dịch bệnh được
đặc biệt coi trọng, trước tiên phải nói đến bệnh tụ huyết trùng. Đây là một trong
những bệnh truyền nhiễm thường được đánh giá là nguy hiểm đối với trâu, bò hiện
nay ở Việt Nam và trên thế giới. Bệnh gây ốm và chết nhiều trâu, bò làm ảnh hưởng
đến sản xuất, gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho người chăn nuôi. Báo cáo tại Hội
nghị phòng chống dịch bệnh gia súc, gia cầm, thủy sản năm 2014 [1] và hội nghị
tổng kết năm 2015 và triển khai nhiệm vụ năm 2016 [2] của Bộ Nông nghiệp và
Phát triển nông thôn cho biết, trong năm 2014 có 26 tỉnh thành có bệnh tụ huyết
trùng với 7.682 trâu, bò mắc bệnh, năm 2015 cũng có 26 tỉnh thành báo cáo có bệnh
với 7.278 trâu, bò mắc. Chính vì vậy bệnh này luôn được xác định là đối tượng
nghiên cứu của ngành Thú y trong những năm qua và những năm tiếp theo.
Một số tỉnh miền núi phía Bắc, trong đó có Hà Giang, Cao Bằng, có diện tích

tự nhiên rộng chủ yếu là rừng núi, đây là điều kiện thuận lợi để phát triển chăn nuôi
gia súc, đặc biệt là chăn nuôi trâu, bò. Hiện nay, tổng đàn trâu, bò tỉnh Hà Giang
trên 265.000 con và tỉnh Cao Bằng trên 228.000 con. Trâu, bò là nguồn sức kéo
quan trọng và nguồn thu nhập đáng kể cho người chăn nuôi. Nhưng do có những
đặc thù riêng về địa lý, kinh tế xã hội và tập quán chăn nuôi, việc áp dụng kỹ thuật
và phòng chống dịch bệnh trong chăn nuôi còn hạn chế, đây chính là những nhân tố
tạo nên sự tồn tại và phát sinh nhiều ổ dịch tụ huyết trùng, gây thiệt hại trong chăn
nuôi. Theo các báo cáo tổng kết công tác thú y hàng năm của các địa phương và kết
quả nghiên cứu của Đặng Xuân Bình và cs (2010) [3]; năm 2008 tỉnh Hà Giang có
276 trâu, 157 bò chết vì bệnh tụ huyết trùng, tỉnh Cao Bằng năm 2008 có 455 trâu,
bò chết và năm 2009 có gần 400 trâu bò chết do bệnh tụ huyết trùng.
Để khống chế bệnh, cho đến nay đã có một số loại vắc xin tụ huyết trùng
trâu, bò được các cơ quan nghiên cứu, sản xuất, sử dụng để tiêm phòng cho đàn


2

gia súc, nhưng bệnh vẫn liên tục xảy ra ở nhiều địa phương, do đó mục tiêu
khống chế, thanh toán bệnh tụ huyết trùng ở từng tỉnh và trong cả nước vẫn còn
gặp nhiều khó khăn. Ở tỉnh Hà Giang và Cao Bằng hàng năm công tác tiêm phòng
được triển khai 2 lần/năm, nhưng do một số địa phương chưa quan tâm nhiều đến
công tác tiêm phòng, tuyên truyền vận động chưa tốt, một số người dân chưa thực
sự hưởng ứng việc tiêm phòng, số trâu, bò tiêm đủ 2 mũi không đạt nên tỷ lệ tiêm
phòng thấp, vì vậy dịch bệnh tụ huyết trùng vẫn thường xuyên xảy ra. Việc phân
lập xác định vi khuẩn Pasteurella để làm rõ đặc điểm dịch tễ của bệnh, tìm ra
quy luật lưu hành, tính gây bệnh của vi khuẩn để sản xuất và ứng dụng vắc xin
phù hợp trong từng vùng, hạn chế tiến tới thanh toán bệnh là cần thiết. Vì vậy
việc lựa chọn vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng trâu, bò phù hợp cho địa
phương có ý nghĩa quyết định đến hiệu quả công tác kiểm soát, khống chế bệnh.
Xuất phát từ yêu cầu của thực tiễn sản xuất, chúng tôi đã tiến hành đề tài

“Nghiên cứu xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Pasteurella
multocida trong bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Hà Giang, Cao Bằng và lựa
chọn vắc xin phòng bệnh”.
* Mục tiêu của đề tài
- Nghiên cứu dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng và tình trạng mang trùng đối
với vi khuẩn Pasteurella multocida ở trâu, bò tại hai tỉnh Hà Giang và Cao
Bằng.
- Giám định đặc tính sinh vật, hoá học và yếu tố độc lực của vi khuẩn Pasteurella
multocida gây bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò trên thực địa.
- Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch, hiệu lực của vắc xin tụ huyết trùng
đang sử dụng cho trâu, bò tại Hà Giang, Cao Bằng và đề xuất giải pháp, lựa chọn
vắc xin phòng bệnh hiệu quả.
* Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Bổ sung tư liệu khoa học về đặc điểm dịch tễ, serotype kháng nguyên, yếu tố
độc lực, và sự lưu hành của vi khuẩn P. multocida gây bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò
tại hai tỉnh Hà Giang, Cao Bằng.
- Bổ sung tư liệu khoa học về hiệu lực bảo hộ của vắc xin khi thử thách với
chủng vi khuẩn P. multocida cường độc phân lập được; làm tiền đề cho việc lựa chọn
vắc xin thương mại phù hợp, cũng như tuyển chọn chủng vi khuẩn P. multocida thích
hợp, ổn định kháng nguyên cho việc phát triển vắc xin nội địa để phòng bệnh tụ huyết
trùng tại các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam.


3

* Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Việc đánh giá tình trạng mang khuẩn P. multocida ở trâu, bò khỏe là cơ sở
cho việc điều chỉnh chiến lược phòng bệnh tụ huyết trùng tại hai tỉnh Hà Giang,
Cao Bằng.
- Kết quả nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm vắc xin tụ

huyết trùng tại thực địa là cơ sở thực tiễn để các nhà khoa học tiếp tục nghiên
cứu thay đổi công nghệ chế tạo vắc xin theo hướng tăng cường sự an toàn, đồng
thời kéo dài thời gian bảo hộ, hạn chế tỷ lệ mắc bệnh, góp phần nâng cao hơn
nữa hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi trâu, bò.
- Kết quả đề xuất lựa chọn vắc xin phòng bệnh thích hợp tại địa phương giúp
cho cơ quan thú y và người chăn nuôi tại Hà Giang, Cao Bằng nói riêng và các tỉnh
miền núi phía Bắc nói chung rà soát, điều chỉnh kế hoạch sử dụng vắc xin thích
hợp, đạt tỷ lệ miễn dịch bảo hộ cao ở trâu, bò sau khi tiêm phòng.
* Những đóng góp mới của đề tài
- Việc sử dụng chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được từ trâu bò
mắc bệnh để xác định độ dài đáp ứng miễn dịch và hiệu lực của vắc xin phòng bệnh
đã cho thấy sự tương đồng giữa chủng vi khuẩn sản xuất vắc xin thương mại với
chủng vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng tại thực địa. Đây là đóng góp mới có ý
nghĩa khoa học và thực tiễn trong việc lựa chọn vắc xin đồng bộ về tính kháng
nguyên với chủng vi khuẩn lưu hành tại địa phương để tiêm phòng cho trâu, bò.
- Sử dụng chủng vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng
trâu bò phân lập được để đánh giá hiệu lực của vắc xin phòng bệnh tụ huyết
trùng sản xuất trong nước là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc chọn
giống chuẩn đáp ứng yêu cầu sản xuất vắc xin phòng bệnh phù hợp ở các tỉnh
miền núi phía Bắc Việt Nam.


4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩn Pasteurella multocida
1.1.1. Phân loại vi khuẩn
Theo phân loại của Bergey ’s (1994) [63], vi khuẩn P. multocida thuộc bộ
(order) Eubacteriales, họ (family) Parvobacteriaceae, tộc (tribe) Pasteurelliae,

giống (genus) Pasteurella, loài (Species) Pasteurella multocida.
1.1.2. Hình thái, kích thước và đặc tính nuôi cấy
Vi khuẩn Pasteurella multocida (P. multocida) là vi khuẩn có dạng cầu trực
khuẩn nhỏ, gram âm, kích thước khoảng 0,25 - 0,4 × 0,4 - 1,5 µm, vi khuẩn có thể
đứng riêng lẻ, thành đôi hoặc thành chuỗi, có giáp mô, không sinh nha bào, không
có lông, không di động, bắt màu lưỡng cực. Khi nuôi cấy nhiều lần trong phòng thí
nghiệm hoặc trên các môi trường nuôi cấy lâu ngày, với các điều kiện không thuận
lợi vi khuẩn có khuynh hướng biến dạng, thay đổi hình thái từ trực khuẩn dài hơn
cho tới dạng sợi mảnh De Alwis (1999) [86].
P. multocida dễ dàng bắt màu với thuốc nhuộm fucxin hoặc xanh methylen.
Tính chất bắt màu lưỡng cực của vi khuẩn P. multocida có thể thấy khi nhuộm bằng
xanh methylen và chỉ thấy ở những tiêu bản làm từ máu động vật hay vi khuẩn phân
lập từ con vật mới chết. Vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường nhân tạo ít thấy tính
chất này (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001) [45]. Theo OIE (2012) [129] sử dụng kỹ
thuật nhuộm Leishman, nhuộm xanh metylen, hoặc kỹ thuật nhuộm Giemsa cho
thấy vi khuẩn được nhuộm bắt màu lưỡng cực.
Vi khuẩn P. multocida có thể nuôi cấy ở nhiều loại môi trường, môi trường
nuôi cấy lỏng, đặc hoặc bán cố thể. Tùy vào mục đích nghiên cứu, người ta cho
thêm vào môi trường các loại đường, axit amin và hóa chất khác nhau. Peter và cs
(1996) [133] sử dụng môi trường dinh dưỡng tối thiểu để nuôi cấy chủng sinh độc
tố và không sinh độc tố của P. multocida. Môi trường này gồm có 17 thành phần,
trong đó có cystein, glutamic axit, leucine, methionine, muối vô cơ, nicotinamide,
pantothenate, thiamine. Kết quả 40/46 chủng đem thử (87%) mọc tốt trên môi
trường này, sau 10 lần cấy chuyển vẫn giữ nguyên khả năng sinh độc tố hoặc không


5

sinh độc tố như lúc đầu. Warner S. (1996) [165] đã chế tạo ra môi trường TEM
(Transport enrichment medium), môi trường vận chuyển giàu dinh dưỡng. Môi

trường có bổ sung thêm một số kháng sinh nhằm ngăn chặn sự tạp nhiễm của các
loại vi khuẩn như: Escherichia coli, Pseudomonas, Proteus và các vi khuẩn gram âm
khác, cũng như các loại nấm. Đây là điều kiện nâng cao khả năng phân lập được P.
multocida từ gia súc mắc bệnh. Theo De Alwis (1999) [86], môi trường thích hợp nhất
cho sự sinh trưởng của P. multocida là môi trường dextrose-starch agar và caseinsucrose-yeast (CSY). Trong các phòng thí nghiệm trên thế giới hiện nay thường sử
dụng môi trường thạch máu (Blood agar) và CSY agar bổ sung 5% máu (bò, cừu) đã
loại bỏ sợi huyết để nuôi cấy và phân lập P. multocida. Vi khuẩn P. multocida phát triển
mạnh trong điều kiện nhiệt độ 37 °C trong môi trường bổ sung 5% máu cừu, môi
trường dextrose - starch, casein-sucrose-yeast (CSY), choco- late, Mueller-Hinton,
hoặc môi trường nuôi cấy có dung dịch não tim (BHI) (OIE, 2012) [129]
Vi khuẩn P. multocida phát triển trong môi trường thông thường có thêm tụy
đệm, CaCl2 và MgCl2 cũng giống như phát triển trên môi trường BHI. Trong môi
trường nước thịt Hotinger hoặc Martin sau khi nuôi cấy 24h, P. multocida mọc tốt,
làm đục môi trường tạo mùi tanh của nước dãi khô. Mùi tanh đặc trưng rõ nhất ở
pha phát triển, để lâu mùi tanh giảm dần (Michael et al, 2002) [112]. Theo Seleim
(2005) [150], để vi khuẩn P. multocida phát triển tốt trên môi trường nhân tạo cần
thêm một số chất như: cystein, glutamic axit, leucine, methionine, muối vô cơ,
nicotinamide, pantothenate, thiamine và đường. Trong đó leucin tác dụng kích thích
tăng trưởng. Trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, các gen liên quan tới quá trình
trao đổi chất của vi khuẩn hoạt động mạnh (Shivachandra, 2006) [155]. Hussain và
cs (2012) [97] nghiên cứu sự phát triển của vi khuẩn P. multocida trên các nguồn
cacbon khác nhau, sử dụng đường glucose, maltose, galactose, sucrose như nguồn
carbon để tăng sinh khối tế bào vi khuẩn P. multocida tăng hiệu quả sản xuất vắc xin.
Môi trường BHI và môi trường Hottinger cải tiến là những môi trường thích
hợp để sản xuất kháng nguyên tụ huyết trùng theo phương pháp lên men (Đào Trọng
Đạt, 1994) [8]. Môi trường này được bổ sung thêm 0,8% sucrose và 2% tụy đệm đã
làm tăng hiệu suất phát triển của vi khuẩn trong quá trình lên men (Phạm Quang
Thái, 2004) [43]. Nguyễn Mạnh Thắng và cs (2008) [49] cũng kết luận rằng, môi
trường Hottinger thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn P. multocida trong hệ thống lên
men kín từng mẻ vắc xin.

6

P. multocida có nhiều loại hình dạng khuẩn lạc. Theo Namioka và Murata (1961)
[121], trên môi trường thạch huyết thanh P. multocida có thể tạo thành 3 dạng khuẩn lạc:
+ Khuẩn lạc dạng S (Smooth): có rìa gọn, bóng láng, có dung quang mạnh và
vi khuẩn có độc lực mạnh.
+ Khuẩn lạc dạng M (Mucoid): nhày, ướt, có kích thước lớn nhất, bề mặt
khuẩn lạc ẩm ướt, có dung quang yếu, vi khuẩn có độc lực trung bình.
+ Khuẩn lạc R (Rough): có rìa xù xì, thường không có dung quang, vi khuẩn có
độc lực yếu.
Trên môi trường thạch thường: vi khuẩn hình thành khuẩn lạc dạng S, nhỏ
long lanh như giọt sương, mặt khuẩn lạc vồng. Nuôi cấy lâu, khuẩn lạc có màu
trắng ngà dính vào môi trường.
Trên môi trường thạch máu hay BHI có bổ sung máu: vi khuẩn phát triển
mạnh, không gây dung huyết, kích thước khuẩn lạc lớn hơn trên môi trường thạch
thường, có màu tro xám, hình giọt sương và có mùi tanh nước dãi khô rất đặc trưng.
Đặc điểm này rất dễ nhận ra và được nhiều tác giả công nhận như một đặc điểm để
chẩn đoán.
Trên môi trường thạch có huyết thanh và huyết cầu tố: khuẩn lạc nhỏ, rìa gọn,
có hiện tượng phát huỳnh quang khi xem khuẩn lạc bằng kính hiển vi có hai thị kính
với độ phóng đại thấp và góc phản quang của ánh sáng đèn điện là 45 o, thấy xung
quanh mép khuẩn lạc có hiện tượng phát sắc cầu vồng. Khuẩn lạc dạng S có dung
quang màu xanh lơ, khuẩn lạc dang R có dung quang vàng, khuẩn lạc dạng M
không có đặc điểm nói trên. Hiện tượng phát quang của khuẩn lạc P. multocida có
liên quan đến tính chất của một số hợp chất có khả năng hấp thụ những tia sáng nhất
định có trong vi khuẩn (Heddleston, 1966) [94].
Theo De Alwis (1999) [86], tuỳ theo độc lực của vi khuẩn mà màu sắc huỳnh
quang của khuẩn lạc khác nhau:

+ Nếu vi khuẩn có độc lực cao: khuẩn lạc có màu xanh lơ, xanh lá mạ chiếm
2/3 diện tích khuẩn lạc về phía đèn, còn 1/3 diện tích khuẩn lạc là màu vàng kim
loại, khuẩn lạc này gọi là Fg (Greenish Fluorescent).
+ Nếu vi khuẩn có độc lực vừa: khuẩn lạc màu xanh lơ ít hơn diện tích màu
vàng da cam, khuẩn lạc loại này là Fo (Orange Fluorescent).


7

+ Nếu vi khuẩn có độc lực yếu: khuẩn lạc của chúng không có hiện tượng phát
quang, khuẩn lạc loại này là Nt (Not Fluorescent). Khuẩn lạc nhỏ tròn trong.
Theo đặc tính dung quang này còn có quan hệ chặt chẽ với sự tạo giáp mô của
vi khuẩn P. mutocida. Dựa vào tính chất này, có thể chọn những chủng P. multocida có
tính kháng nguyên và miễn dịch cao (Smith, 1990) [156]. Rimler (1992) [141] cho
rằng, khuẩn lạc của vi khuẩn P. multocida tập trung ở hai dạng chính. Khuẩn lạc
dung quang sắc cầu vồng và khuẩn lạc dung quang màu xanh. Dung quang của
khuẩn lạc liên quan đến vỏ nhày của vi khuẩn. Vi khuẩn có dung quang sắc cầu
vồng đứng riêng hoặc từng đôi, có vỏ nhày và rất độc, thường gây bệnh thể cấp
tính. Vi khuẩn, có dạng khuẩn lạc dung quang màu xanh kém độc hơn, thường
gặp ở những đàn gia súc bị dịch địa phương.
1.1.3. Đặc tính sinh hóa
P. multocida lên men các đường glucose, mannitol, saccarose, fructose,
galactose, không lên men các loại đường lactose, mantose, arabinose. Dương tính
với phản ứng sinh Indol, oxidase, catalase. Phản ứng urease âm tính, không mọc
trên môi trường MacConkey (Đặng Xuân Bình, 2010 [3]; Lê Văn Dương, 2012 [6]).
Mitra và cs (2013) [113] cho biết, vi khuẩn P. multocida dương tính với phản
ứng Indole, khử nitrat, phản ứng gelatin hóa, lên men đường glucose, sucrose,
galactose, fructose và mannitol.
Azmat và cs (2013) [59] nghiên cứu về đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn P.
multocida phân lập tại Pakistan cho thấy, vi khuẩn dương tính với oxydase, catalase,

sinh Indol. Phản ứng với TSI cũng dương tính, lên men đường xylose, không lên
men đường mantose, phản ứng nitrate dương tính, âm tính với phản ứng urease và
citrate, vi khuẩn không di động.
1.1.4. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn P. multocida
1.1.4.1. Yếu tố độc lực
* Kháng nguyên
Kháng nguyên P. multocida rất phức tạp và cấu trúc từng loại kháng nguyên
cũng luôn thay đổi. Những nghiên cứu về cấu trúc, số lượng và sự phân bố kháng
nguyên P. multocida rất quan trọng trong việc chế tạo vắc xin. Cho đến nay,


8

người ta đã xác định được kháng nguyên của P. multocida có 3 loại là: Kháng
nguyên vỏ K, kháng nguyên thân O, kháng nguyên màng ngoài OMP (outer
membrane protein).
- Kháng nguyên vỏ (K): chỉ có ở P. multocida tạo khuẩn lạc dạng S, không gặp
ở vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng M và R. Kháng nguyên K bao bọc xung quanh thân
vi khuẩn, giúp cho vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào và ngăn cản sự tiếp xúc
giữa kháng nguyên O và kháng thể O. Thành phần và cấu trúc kháng nguyên K khá
phức tạp, theo Price và Smith (1966) [134] chúng gồm có 3 loại là α, β, γ. Kháng
nguyên có cấu tạo dạng phức giữa protein và polysaccharide. Kháng nguyên protein
của vỏ (giáp mô) có khả năng gây miễn dịch mạnh. Kháng nguyên protein đã được
nhiều tác giả nghiên cứu và cho rằng nó rất thông dụng, được coi là yếu tố miễn
dịch quan trọng.
Vai trò của polysaccharit trong quá trình hình thành miễn dịch bảo hộ kém.
Theo Bain và cs (1982) [61], những polysaccharide tinh khiết không tạo được sự bảo
hộ đối với chuột, thỏ và bò khi thử thách cường độc. Thành phần polysaccharide chính
trong kháng nguyên serotype A là axit hyaluronic (Rosner et al, 1992) [143]. Ngược
lại với kháng nguyên serotype A, kháng nguyên polysaccharide serotype B bao gồm

arabinose, mannose, đường galactose với những mối liên kết chưa rõ ràng (Boyce và
cs, 2000) [67].
- Kháng nguyên thân (O): vi khuẩn P. multocida có kháng nguyên thân là phức
hợp protein - lipid - polysaccharide chiết xuất được nhờ acid trichoaxetic, dung dịch
phenol và siêu âm. Phát hiện được bằng phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch.
Namioka và Murata (1964) [122] là những người đầu tiên phát triển kỹ thuật
định type kháng nguyên thân. Sau khi bộc lộ kháng nguyên thân bằng xử lý tế bào
vi khuẩn với acide HCl và cho ngưng kết với kháng huyết thanh thỏ. Sử dụng kỹ
thuật này các tác giả đã xác định được 11 kháng nguyên thân. Price và Smith (1966)
[134] dùng phương pháp điện di miễn dịch trên máy lắc Mikle đã tách được 16
kháng nguyên O và kí hiệu từ 1 - 16. Sau khi nhuộm đỏ thiazine, xử lý nhiệt và
enzyme, tác giả xác định được 6 trong 16 kháng nguyên O là protein. Tiếp đến
Heddleston và cs (1972) [95], đã sử dụng phản ứng kết tủa trên thạch để định loại
kháng nguyên thân. Để thực hiện phản ứng này, tác giả đem tế bào vi khuẩn xử lý ở
nhiệt độ 100 °C/1 giờ, sau đó thu lấy huyễn dịch, kháng huyết thanh được chuẩn bị
qua gà, bằng phương pháp này đã phát hiện có 16 kháng nguyên thân.


9

Johnson và cs (1989) [102], phát hiện được một kháng nguyên O là protein
với hơn 40 chuỗi polypeptit trong một chủng P. multocida gây bệnh. Khi mở rộng
nghiên cứu 14 chủng gây bệnh trên các loài vật từ những vùng khác nhau, cũng cho
kết quả tương tự. Tuy nhiên qua phân tích, tác giả cho rằng không có một protein
nào đặc trưng cho những chủng P. multocida phân lập từ bệnh tụ huyết trùng, mà chỉ
có một chuỗi polypeptit chính (27kDa) được coi là chung cho những chủng phân lập.
Các chủng vi khuẩn tụ huyết trùng có serotype khác nhau theo kháng nguyên
O, chỉ có serotype B hầu như chỉ thuộc một nhóm kháng nguyên O. Những chủng
vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng S chuyển sang dạng R vẫn giữ được kháng nguyên O.
Hiện nay, nhiều thực nghiệm xác nhận rằng, kháng nguyên O đóng vai trò quan trọng

trong quá trình hình thành miễn dịch bảo hộ gia súc chống bệnh (Phan Thanh Phượng,
1994) [39].
- Protein màng ngoài (Outer membrane proteins – OPM): kháng nguyên
màng ngoài gồm 3 protein chính là 27kDa, 34kDa và 36kDa được tìm thấy ở hầu
hết các chủng (không phụ thuộc vào type của chủng đó). Một trong những
protein độc tính quan trọng của protein màng ngoài này là protein gắn huyết cầu
tố (hemoglobin-binding protein), protein này có một receptor đặc hiệu trên màng
hemoglobin. Đoạn gen mã hóa hemoglobin binding protein (hgbA) đã được giải
trình tự (Seleim, 2005) [150].
Ba loại protein màng ngoài đã được phát hiện ở các chủng gây viêm teo mũi
được đặt tên là là OMP type I, OMP type II, và OMP type III. Sự khác biệt này
được phân loại dựa trên cấu trúc chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (W) của kháng
nguyên này, khối lượng phân tử dao động trong khoảng giữa 28 kDa và 40kDa.
Protein H của P. multocida có các đặc điểm tương tự protein xuyên màng của vi
khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, giống các peptidoglycane, kháng trypsine,
kháng dung dịch SDS (sodium dodicyl sulphate). Hơn nữa protein H phức hợp với
lipopolysaccharide khi gây đáp ứng miễn dịch. Mặc dầu không thể phát hiện ra mối
quan hệ giữa độc tính của các chủng với protein màng ngoài, song OMP type I có
độc tính cao với lợn và gây ra viêm teo mũi truyền nhiễm. ngược lại OMP type II và
III ít độc tính hơn. Protein OmpA và OmpH cho thấy sự không đồng nhất đáng kể,
ít nhất là giữa các chủng P. multocida ở gia cầm, một số các biến thể khác nhau có
liên quan tới các loại kháng nguyên cụ thể B, D, F (Davies et al, 2003) [81]. Một
kháng nguyên bề mặt khác đã được xác định là một protein kết hợp 39-kDa (Cp39)


10

xuất hiện trong các chủng P. multocida ở gia cầm, chủng P-1059 (serotype A: 3) và
X-73 (serotype

A: 1) (Sthitmatee et al, 2008) [157]. OmpH và Pasteurella

lipoprotein E (PlpE) là các kháng nguyên trên bề mặt có sức đề kháng cao có liên
quan đến P. multocida serotype A: 1, A: 3, và A: 4 thu thập từ những cá thể bò bị
xuất huyết nặng (Wu et al, 2007 [171]; Okay et al, 2012 [130]).
Kháng nguyên của P. multocida rất phức tạp, xét về quan hệ hoá học, các
kháng nguyên protein và lipopolysaccharid của P. multocida có vai trò chính trong
quá trình hình thành miễn dịch bảo hộ gia súc chống bệnh và kháng nguyên là
polysaccharid đóng vai trò hỗ trợ.
* Giáp mô của vi khuẩn P. multocida
Giáp mô là lớp vỏ nhày bao bọc ngoài tế bào, được sinh ra ở điều kiện nhất
định trong quá trình sinh trưởng. Giáp mô có tác dụng bảo vệ vi khuẩn chống lại sự
thực bào và các tác động có hại của môi trường. Giáp mô cũng là nơi dự trữ chất
dinh dưỡng cho vi khuẩn, đồng thời là yếu tố độc lực của vi khuẩn, vi khuẩn có giáp
mô thường có độc lực cao. Carter (1955) [70] cho biết, khi nuôi cấy vi khuẩn ở 37 oC
trong môi trường nhân tạo qua một đêm thấy vi khuẩn phát triển giáp mô đầy đủ,
sau đó mất dần đi. Điều này chứng tỏ giáp mô chỉ tồn tại ở những vi khuẩn mới
phân lập từ gia súc mắc bệnh hoặc nuôi cấy trong thời gian ngắn. Vi khuẩn phân
lập được từ động vật mắc bệnh cấp tính đa số đều thấy có giáp mô và có độc lực,
khi nuôi cấy những vi khuẩn này lâu trong môi trường nhân tạo, giáp mô của vi
khuẩn sẽ mất và vi khuẩn không còn độc lực (Carter, 1967) [72]. Nhưng nếu cấy
những vi khuẩn đã mất giáp mô trên môi trường có thêm máu hoặc tiêm truyền qua
động vật thì vi khuẩn có thể tái tạo lại giáp mô và thể hiện độc lực.
Đặc tính kháng nguyên giáp mô của P. multocida xác định theo type huyết thanh A,
B, D, E và F (Wilson et al, 1992) [168]. Giáp mô của chủng type A được cấu tạo bởi axit
hyaluronic và polysaccharide. Axit hyaluronic không bị thực bào phát hiện do nó không có
tính miễn dịch, nhưng khi tinh chế kháng nguyên K của P. multocida serotype A có một
protein (300kDa) có thể ức chế đại thực bào của bò (Seleim, 1993) [149].
Theo Seleim (2005) [150], khi tiến hành loại bỏ axit hyaluronic của giáp mô
thì không những vi khuẩn giảm khả năng bám dính với tế bào vật chủ mà còn dễ

dàng bị thực bào phát hiện. Tác giả cho rằng, giáp mô là thành phần rất quan trọng
trong việc xác định nhóm huyết thanh (serotype) của P. multocida.


11

* Độc lực của vi khuẩn
Độc lực của P. multocida được biết từ thời Pasteur, đầu thế kỷ 20, Baldrey đã
nhắc đến ảnh hưởng của chất lọc canh trùng già trên thỏ và cho rằng vi khuẩn có
độc tính của lipopolysaccharide. Các nghiên cứu về độc lực của vi khuẩn P.
multocida trên thế giới cho thấy độc lực của vi khuẩn này không ổn định, nó thay
đổi tùy thuộc vào chủng vi khuẩn, loài vật mà nó ký sinh, cấy chuyển nhiều lần
trong môi trường nhân tạo độc lực của nó cũng yếu đi.
Nghiên cứu của Ramdani và cs (1990) [137] cho thấy, một trong những chủng
P. multocida phổ biến gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò là chủng M1404 thuộc
serotype B rất độc với chuột bạch, chỉ cần tiêm 20 vi khuẩn/chuột sau 18 giờ chuột
đã có triệu chứng nhiễm trùng huyết.
Diallo và cs (1995) [87] nghiên cứu độc lực của 9 chủng P.multocida phân lập
được thuộc serotype A tại Australia, trong 9 chủng này có 3 chủng không chứa plasmid
nhưng rất độc với chuột, tiêm liều 100 CFU/con vào xoang bụng thì chuột chết trong
vòng từ 10-24 giờ, trong khi đó có 3 chủng phân lập có chứa 1 plasmid và 3 chủng
có chứa 2 plasmid lại không có khả năng giết chết chuột dù tiêm liều cao hơn.
Chung và cs (2001) [79] cũng tiến hành đánh giá độc lực của vi khuẩn P. multocida
chủng X-73, PBA 930 và PBA 954 thuộc serotype A trên chuột và gà. Độc lực của
chủng X-73 đối với gà cao hơn hẳn hai chủng kia, đối với chuột thì độc lực của chủng
PBA 930 là thấp nhất.
Borrathybay và cs (2003) [66] đã nghiên cứu sự liên quan giữa vỏ và độc lực của
vi khuẩn P. multocida type A dưới kính hiển vi điện tử bằng kỹ thuật đánh dấu thấy: vi
khuẩn P. multocida chủng PM-18 và X-73, độ dày trung bình của vỏ lần lượt là 91,4 và
50,4nm, hai chủng này có độc lực cao. Hai chủng PM-1 và PM-3, độ dày trung bình

của vỏ chỉ là 21,0 và 29,8 nm nên có độc lực thấp hơn. Tuy nhiên cũng có ngoại lệ như
chủng P-1059, độ dày trung bình của vỏ lên tới 101,2 nm nhưng chỉ có độc lực trung
bình. Độ dày trung bình của vỏ vi khuẩn tùy thuộc vào số lượng protein kháng nguyên
39kDa, số lượng protein này càng nhiều thì vỏ vi khuẩn càng dày.
Khả năng xâm nhập và nhân lên trong cơ thể vật chủ được tăng cường bởi sự
hiện diện của kháng nguyên và polysaccharide đó là một trong những yếu tố độc lực
quan trọng nhất đối với loài này (Wilkie et al, 2012) [169].


12

Hoàng Đăng Huyến (2004) [23] nghiên cứu độc lực của vi khuẩn bằng
phương pháp kiểm tra dung quang của khuẩn lạc và thử độc lực trên chuột, thấy
100% số chủng thử nghiệm đều giết chết chuột trong vòng 5-10 giờ, kiểm tra dung
quang khuẩn lạc thấy có ánh xanh lơ, điều đó khẳng định độc lực của các chủng vi
khuẩn phân lập được là rất cao. Đặng Xuân Bình và cs (2010) [3] khi thử độc lực
của các chủng P. multocida phân lập được từ trâu, bò và lợn ở 2 tỉnh Hà Giang, Cao
Bằng thấy các chủng đều có độc lực cao gây chết chuột từ 80 – 100% trong vòng 48
giờ sau khi công cường độc. Cù Hữu Phú và cs (2014) [36] kiểm tra độc lực của 10
chủng P. multocida, thấy cả 10 chủng đều có độc lực mạnh, có khả năng gây chết
chuột trong vòng 16 – 32 giờ sau tiêm. Hoàng Văn Khoản và cs (2015) [24] kiểm
tra dung quang khuẩn lạc của giống vi khuẩn P. multocida sản xuất vắc xin chủng
N41, thấy khuẩn lạc có dung quang đặc trưng, màu xanh lơ, xanh lá mạ chiếm phần
lớn diện tích bề mặt khuẩn lạc, phần diện tích khuẩn lạc còn lại có màu vàng da cam
chứng tỏ vi khuẩn có độc lực cao.
Độc lực của P. multocida rất phức tạp và không ổn định, tuỳ thuộc vào chủng
vi khuẩn và loài vật kí sinh. Nghiên cứu về độc lực của vi khuẩn P. multocida các
tác giả cho thấy ở những gia súc, gia cầm chết do P. multocida gây ra người ta tìm
thấy dấu hiệu tác động của độc tố.
* Độc tố của vi khuẩn P. multocida

Độc tố của P. multocida là chất phân bào mạnh, có khả năng hoạt hóa men
phospholipase C beta. Độc tố này cũng thúc đẩy hoạt động của RhoA và tác động tới
các protein nhóm G như: G alpha (q), G alpha (12/13) (Orth et al, 2005) [131].
Theo Blocker và cs (2006) [64], độc tố P. multocida còn có khả năng tái tạo
polymeractin, làm thay đổi hình thái tế bào dendrite (Dendritic cells), làm cản trở sự
xâm nhập của tế bào này vào các hạch lympho trong quá trình đáp ứng miễn dịch đối
với bệnh tụ huyết trùng. Tuy nhiên độc tố của P. multocida không ảnh hưởng tới sự ẩm
bào của các đại thực bào (macropinocylosis).
Những độc tố có bản chất từ protein không chịu nhiệt đã được tìm thấy ở một
số chủng P. multocida thuộc type huyết thanh A và D, đặc tính kháng nguyên của
những độc tố này tương đối giống nhau. Các vi khuẩn thuộc serotype B hiếm khi có


13

độc tố bản chất là protein, chưa có thí nghiệm nào chứng minh độc tố có bản chất
protein của serotype E.
- Nội độc tố (Lipopolysaccharide): Lipopolysaccharide là yếu tố độc lực chính
và nó còn đóng một vai trò chủ yếu trong việc gây bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò.
Nội độc tố được sinh ra bởi các chủng P. multocida, kể cả chủng có độc lực và
không có độc lực, Heddleston và cs (1972) [95] đã chứng minh nội độc tố được gắn
kết lỏng lẻo và có thể rửa trôi khỏi tế bào vi khuẩn P. multocida bằng dung dịch
nước muối có formalin và khi được làm lạnh. Nội độc tố của P. multocida có thể
chiết xuất được bằng acid trichloroacetic theo qui trình của Boivin. Khi tiến hành
nghiên cứu lipopolysaccharide của các chủng có nguồn gốc từ các ký chủ khác nhau
cho

thấy

chúng

khá

giống

với

nội

độc

tố

của

Enterobacteriacae.

Lipopolysaccharide là thành phần quan trọng giúp xác định kháng nguyên thân, khi
tiến hành điện di cho thấy lipopolysaccharide có khối lượng phân tử rất thấp. Bằng
phương pháp này cũng cho thấy lipopolysaccharide của P. multocida ngắn hơn của
các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae và S. typhimurium (Horadagoda et al,
2001) [96]. Lipopolysaccharide được xác định có khả năng kích thích giải phóng
TNF-a từ đại thực bào phế nang phổi bò và nhiều yếu tố gây hoại tử khác,
interleukine đã được giải phóng và cắt ngang bởi chất gây gián phân hoạt hóa của
nội độc tố, dẫn đến rối loạn hoạt động của tế bào (Lax and Thomas, 2002) [109]. Các
chủng P. multocida thuộc type D gây viêm teo mũi sau khi tiến hành điện di phát hiện
thấy có ít nhất 6 loại lipopolysaccharide đồng nhất với protein màng ngoài.
Vi khuẩn P. multocida được nuôi cấy trên môi trường thạch tới 72 giờ sẽ sinh
nhiều độc tố hơn. Nội độc tố của vi khuẩn P. multocida chỉ xuất hiện trong huyết thanh
của những con vật bị bệnh nặng từ 3 - 5 giờ trước khi chết với những triệu chứng như

giảm nhiệt độ, run rẩy… (Horadagoda et al, 2001) [96].
- Ngoại độc tố (Exotoxin): Ngoại độc tố là sản phẩm của giáp mô P.
multocida, đặc biệt là của các chủng thuộc type D. Yếu tố này là nhân tố gây hoại tử
niêm mạc (dermonecrotic toxin - DNT). Gen toxA qui định tổng hợp dermonecrotic
toxin có chiều dài 4,381 bp, nếu nuôi cấy vi khuẩn ở 30 °C thì hoạt tính của gene toxA


14

này bị giảm nhiều và lượng độc tố DNT sinh ra cũng ít đi (Hunt et al, 2000) [98]. Khi
tiến hành tinh chế độc tố hoại tử niêm mạc cho thấy nó là một protein khoảng
112kDa - 160 kDa và có thể phát hiện được thông qua phá vỡ tế bào bằng siêu âm
và tách ra từ dịch nuôi cấy (Seleim, 2005) [150].
Viêm teo mũi truyền nhiễm ở lợn chủ yếu do tác động của DNT trên tế bào
xương mũi, gây viêm teo mũi ở lợn (Lax and Grigoriadis, 2001 [ 108], Rubies et
al, 2002 [144]).
* Serotype của vi khuẩn P. multocida
Năm 1943 Little và Lyon [110] đã tìm cách phân loại serotype vi khuẩn P.
multocida nhưng không thành công. Roberts (1947) [142] đã dựa trên phản ứng
chéo bảo hộ trên chuột để phân loại. Tác giả dùng kháng huyết thanh chuẩn bị trên
thỏ để bảo vệ chuột khi công cường độc bằng các chủng P. multocida khác nhau,
trên cơ sở chuột được bảo hộ, chia vi khuẩn này thành 4 type là I, II, III và IV, đây
là hệ thống phân loại đầu tiên được công nhận. Kể từ đó tất cả các chủng gây bại
huyết, xuất huyết độc lực cao được xếp vào Roberts type I, các chủng phân lập được từ
trâu, bò thuộc type I. Điều này giúp ích khá nhiều cho việc phát hiện các chủng độc
lực cao.
Tiếp đó, Carter sử dụng phản ứng kết tủa (Carter, 1952) [68] và phản ứng
ngưng kết hồng cầu gián tiếp (Carter, 1955) [70], xác định được 4 serotype (được
ký hiệu là A, B, C, D). Phản ứng ngưng kết hồng cầu này được thực hiện trên tế bào
hồng cầu người nhóm O, thành phần tách từ màng tế bào này được chuẩn bị bằng

cách đun tế bào sống P. multocida ở 56 °C/30 phút, loại bỏ tế bào bằng ly tâm sau
đó thu lấy dịch nổi phía trên. Dựa trên phản ứng này, tác giả đã phân loại P.
multocida thành 4 loại kháng nguyên vỏ là A, B, C và D. Các chủng gây bại huyết,
xuất huyết theo cách phân loại của Carter chủ yếu thuộc type B.
Bảng 1.1. Sự tương quan giữa các type của Roberts và Carter
Type theo Carter
Type theo Roberts

A

B

C

D

I, II, III

I

IV

-


15

Khi nghiên cứu vi khuẩn phân lập từ vụ dịch bại huyết, xuất huyết trâu, bò trong
các ổ dịch ở châu Phi, Carter (1961) [71] thấy rằng, chúng không thuộc bất kỳ một
type nào đã phân loại, mặc dù chúng có nhiều mối tương quan với type B. Tác giả đã

đề xuất thành lập một nhóm mới đặt tên là type E. Sau này, đến năm 1963 Carter thấy
rằng type C không đủ các điều kiện cho hình thành một nhóm, vì vậy type C đã bị
loại bỏ. Rimier và Rhoades (1987) [140] sử dụng phương pháp ngưng kết hồng cầu
gián tiếp của Carter và phát hiện một type mới được phân lập từ gà tây đặt tên là type
F. Cho đến nay phương pháp này được sử dụng phổ biến để xác định kháng nguyên
vỏ của P. multocida.
Hiện nay hệ thống phân loại được chấp nhận rộng rãi nhất là sự kết hợp hệ
thống phân loại kháng nguyên vỏ của Carter và kháng nguyên thân của Heddleston.
Theo hệ thống phân loại này các chủng gây bại huyết, xuất huyết cho trâu, bò ở
Châu Á và Châu Phi lần lượt là serotypes B:2 và E:2. Có 2 chủng thuộc type B
không gây bại huyết, xuất huyết là các chủng B:3,4 có nguồn gốc từ Australia (các
chủng này được phân lập từ vết thương của bò), nhưng sau đó thấy rằng các chủng này
có liên quan tới dịch tụ huyết trùng bò ở Bắc Mỹ và hươu, nai ở Anh.
Hệ thống phân loại kết hợp của Namioka - Carter cũng được sử dụng. Theo cách
phân loại này chỉ có hai type (6 và 11) thuộc những chủng kháng nguyên vỏ type B và
type E, chỉ có một type duy nhất là type kháng nguyên thân 6 thường gây bệnh 6:B ở
châu Á và 6:E ở châu Phi. Cũng theo hệ thống phân loại này thì ở Australian chỉ có
chủng 11:B.
Cả hai hệ thống phân loại của Carter - Heddleston và Namioka - Carter đều
được sử dụng trong các nghiên cứu. Song để tránh nhầm lẫn thì theo hệ thống phân
loại Carter - Heddleston kháng nguyên vỏ (A, B, D, E, F) sẽ viết trước kháng
nguyên thân (1 - 16) còn theo hệ thống phân loại Namioka - Carter thì kháng
nguyên thân (1 - 11) sẽ viết trước kháng nguyên vỏ (A, B, D, E, F). De Alwis
(1999) [86], để thuận tiện thì các nhà nghiên cứu thường dùng hệ thống phân loại
của Carter - Heddleston.


16

Bảng 1.2. Hệ thống phân loại serotype P. multocida

Tác giả
* Phân loại theo giáp mô:

Phản ứng dùng

Phân loại

Carter (1955)

Ngưng kết gián tiếp hồng cầu (IHA)

Type A, B, C, D

Carter (1961)

IHA

Type E

Carter (1963)

IHA và PMPT

Bỏ type C

Namioka và Murata (1961)

Ngưng kết trên phiến kính

Type A, B, C, D

Rimler và Rhoades (1987) IHA
* Phân loại theo kháng
nguyên thân:

Type F

Namioka và Murata (1961)

Ngưng kết tế bào đã xử lý HCl

Type 1 - 11

Namioka và Bruner (1963)

AGPT

Type 1 - 16

Namioka và Murata (1964)

AGPT

Type 1 - 16

Heddleston và cs (1972)

AGPT

Type 1 - 16

Nguồn: De Alwis (1999) [86]

1.1.4.2. Yếu tố không phải độc tố
* Sức đề kháng của vi khuẩn P. multocida
Theo Nguyễn Bá Hiên và cs (2009) [19], vi khuẩn tụ huyết trùng dễ bị tiêu
diệt bởi nhiệt độ, ánh sáng mặt trời và các chất sát trùng thông thường. Vi khuẩn bị
diệt khi đun ở 58 oC trong 20 phút, 80 oC trong 10 phút, 100 oC chết ngay. Ánh nắng
mặt trời chiếu trực tiếp, diệt vi khuẩn trong canh trùng sau 1 ngày. Trong tổ chức của
động vật bệnh bị thối nát, vi khuẩn sống được 1 – 3 tháng.
Trong máu, mô bào, nước tiểu của súc vật chết, vi khuẩn giữ được độc lực
trong vòng 5 – 9 ngày. Trong tuỷ xương vi khuẩn giữ được độc lực ít nhất 8 ngày
sau khi con vật chết. Vì vậy, bệnh phẩm được gửi đi chẩn đoán tốt nhất là tuỷ xương.
Các chất sát trùng thông thường diệt vi khuẩn nhanh chóng như axit phenic
5% trong 1 phút, creolin 3%, crezyl 3%, nước vôi 1% trong 3-5 phút. Vi khuẩn
sống khá lâu và sinh sản trong đất ẩm, thiếu ánh sáng có nhiều muối nitrat và
chất hữu cơ. Trong chuồng, trên đồng cỏ, trong đất, vi khuẩn có thể sống hàng
tháng có khi hàng năm.


17

* Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn P. multocida
Các nghiên cứu về khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn P. multocida đã
được một số tác giả công bố. Jeffrey và cs (1994) [100] đã nghiên cứu tình trạng gia
tăng kháng kháng sinh tại các nước châu Âu (1988 - 1992) cho thấy, tổng số 880 chủng
vi khuẩn P. multocida hầu như đều kháng với ampicilin, tetracyline, erythromycin, và
sulfamethazine. Wassenaar và Silley (2008) [166] cho biết, vi khuẩn P. multocida
kháng lại các loại thuốc streptomycin, tetracycline, oxacillin và trimethoprim.
Azmat và cs (2013) [59] kiểm tra sự nhạy cảm kháng sinh của Pasteurella
multocida bằng phương pháp đĩa khuếch tán thấy vi khuẩn này kháng lại các kháng

sinh augmentin, amoxicillin và aztreonam. Rabia Durrani và cs (2013) [136], kiểm
tra khả năng kháng thuốc của vi khuẩn P. multocida thu thập từ các thành phố khác
nhau ở Pakistan thấy vi khuẩn kháng lại ciprofloxacin, neomycin, ofloxacin và
norfloxacin.
Ở Việt Nam, nghiên cứu của Trương Văn Dung và cs (2000) [ 5] cho biết,
hiện tượng kháng thuốc (kháng kháng sinh) của vi khuẩn P. multocida là không
giống nhau ở một vài địa phương phía Bắc. Cần phải có kế hoạch nghiên cứu vấn
đề này để xây dựng phác đồ điều trị thích hợp cho từng địa phương. Nguyễn
Đình Trọng (2002) [52] kiểm tra tính mẫn cảm kháng sinh của 31 chủng P.
multocida phân lập tại Bắc Kạn, có 83,87% các chủng vi khuẩn kháng lại với
penicilline, streptomycine 32,26%, ampicilline 19,35%, chlortetracycline 12,9%
và 9,67% với furazolidone. Kết quả nghiên cứu của Đặng Xuân Bình và cs
(2010) [3] cho biết, vi khuẩn đã kháng lại colistin (25%), neomycine (21,4%),s
pectinomycine và trimethoprim (17,8%), ampicilline (14,2%), gentamycine
(7,1%). Trương Quang Hải và cs (2012) [11] xác định khả năng mẫn cảm với
kháng sinh của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được ở lợn mắc bệnh
viêm phổi cho biết, vi khuẩn kháng lại với một số loại kháng sinh như neomycin
(70,0%), penicillin G (65,0%) và tetracyclin (60,0%).
Mặc dù kháng kháng sinh không được coi là một yếu tố độc lực, song khả
năng kháng kháng sinh của P. multocida là một nguyên nhân làm tăng quá trình gây
bệnh. Khi chưa tìm ra phương pháp hiệu quả chống khả năng kháng thuốc, ta cần
phải tăng nồng độ thuốc hoặc phối hợp nhiều thuốc mới có khả năng làm giảm tỷ lệ
kháng thuốc của vi khuẩn P. multocida.