Nghiên cứu chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang naja atra bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

NGUYỄN NGỌC TUẤN

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KÍT PHÁT HIỆN NHANH
NỌC RẮN HỔ MANG NAJA ATRA BẰNG KỸ THUẬT
SẮC KÝ MIỄN DỊCH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

NĂM 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

NGUYỄN NGỌC TUẤN

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KÍT PHÁT HIỆN NHANH
NỌC RẮN HỔ MANG NAJA ATRA BẰNG KỸ THUẬT
SẮC KÝ MIỄN DỊCH
Chuyên ngành: Dị ứng và Miễn dịch
Mã số: 62.72.01.09

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS. TS. NGUYỄN ĐẶNG DŨNG
TS. TRỊNH THANH HÙNG

NĂM 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận án này là của riêng tôi và có một phần số liệu
trong đề tài (Nghị định thư) có tên: “Hợp tác nghiên cứu chế tạo test chẩn
đoán rắn hổ mang cắn”. Kết quả đề tài này là thành quả nghiên cứu của tập
thể mà tôi là một thành viên chính. Tôi đã được chủ nhiệm đề tài và toàn bộ
các thành viên trong nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng số liệu đề tài
này vào trong luận án để bảo vệ lấy bằng tiến sĩ. Các số liệu, kết quả nêu
trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công
trình nào khác.
Tác giả luận án

Nguyễn Ngọc Tuấn


MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng

Danh mục các biểu đồ
Danh mục các sơ đồ
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 3
1.1. Tai nạn rắn cắn và chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt nam ................................ 3
1.1.1. Tai nạn rắn cắn ở Việt nam .................................................................... 3
1.1.2. Chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt Nam ....................................................... 5
1.2. Rắn hổ mang Naja atra ................................................................................. 6
1.2.1. Đặc điểm sinh học và nọc độc ............................................................... 6
1.2.2. Tai nạn do rắn hổ mang Naja atra cắn ................................................... 9
1.3. Một số kỹ thuật miễn dịch phát hiện nọc rắn và kháng thể kháng
nọc rắn ................................................................................................................. 12
1.3.1. Điện di miễn dịch ................................................................................. 13
1.3.2. Ngưng kết hồng cầu ............................................................................. 13
1.3.3. Ngưng kết miễn dịch ............................................................................ 14
1.3.4. Miễn dịch phóng xạ.............................................................................. 15
1.3.5. Miễn dịch huỳnh quang........................................................................ 16
1.3.6. Miễn dịch quang ................................................................................... 16
1.3.7. Miễn dịch gắn enzym ........................................................................... 17
1.3.8. Kít phát hiện nhanh .............................................................................. 18


1.4. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch .......................................................................... 19
1.4.1. Lịch sử hình thành và phát triển........................................................... 19
1.4.2. Nguyên lý hoạt động ............................................................................ 21
1.4.3. Chế tạo và tối ưu que thử .................................................................... 23
1.5. Kháng thể kháng nọc rắn........................................................................... 26
1.5.1. Công nghệ chế tạo kháng thể IgG kháng nọc rắn ................................ 26
1.5.2. Công nghệ chế tạo kháng thể IgY kháng nọc rắn ................................ 30

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 33
2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ............................................................... 33
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 33
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 34
2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................ 35
2.2.1. Thu thập và kiểm định chất lượng nọc rắn .......................................... 36
2.2.2. Chuẩn bị kháng nguyên và gây miễn dịch ........................................... 37
2.2.3. Phát hiện kháng thể kháng nọc rắn trong huyết thanh ......................... 39
2.2.4. Tách chiết và tinh sạch kháng thể ........................................................ 40
2.2.5. Kiểm tra độ đặc hiệu của các kháng thể với các kháng nguyên
nọc rắn ................................................................................................................. 45
2.2.6. Hấp phụ miễn dịch ............................................................................... 45
2.2.7. Thử nghiệm lựa chọn cặp kháng thể .................................................... 46
2.2.8. Tối ưu hóa phản ứng cộng hợp ............................................................ 49
2.2.9. Tối ưu hóa bộ xét nghiệm nhanh ......................................................... 50
2.2.10. Xác định thông số kỹ thuật của xét nghiệm ....................................... 55
2.2.11. Thử nghiệm bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn trên các mẫu
bệnh phẩm ........................................................................................................... 55
2.3. Xử lý số liệu ............................................................................................... 56
2.4. Đạo đức nghiên cứu ................................................................................... 56


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................ 57
3.1. Kết quả nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra
từ thỏ và gà .......................................................................................................... 57
3.1.1. Kết quả kiểm định chất lượng nọc rắn hổ mang Naja atra .................. 57
3.1.2. Biến động hiệu giá kháng thể trong quá trình gây miễn dịch .............. 58
3.1.3. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể của các huyết thanh kháng
nọc rắn ................................................................................................................. 60
3.1.4. Phản ứng chéo giữa kháng thể kháng nọc rắn với kháng nguyên nọc

rắn của các loài khác ........................................................................................... 61
3.2. Kết quả tách chiết và tinh sạch kháng thể IgG và IgY từ huyết thanh và
trứng gà................................................................................................................ 62
3.2.1. Sắc ký đồ tinh sạch kháng thể .............................................................. 62
3.2.2. Kết quả điện di kháng thể IgG và IgY sau tách chiết và tinh sạch ...... 63
3.2.3. Hoạt tính kháng thể IgG và IgY sau tách chiết và tinh sạch................ 64
3.3. Phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của kháng thể với các kháng
nguyên nọc rắn hổ mang Naja atra, hổ đất và hổ chúa ....................................... 65
3.3.1. Kiểm tra phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của các kháng thể
bằng kỹ thuật Western blot ................................................................................. 65
3.3.2. Hoạt tính và phản ứng đặc hiệu của các kháng thể với kháng nguyên
nọc rắn hổ mang Naja atra sau hấp phụ miễn dịch ............................................. 66
3.4. Kết quả lựa chọn cặp kháng thể ................................................................. 68
3.4.1. Kết quả lựa chọn cặp kháng thể bằng phương pháp ELISA ................ 68
3.4.2. Kết quả lựa chọn cặp kháng thể bằng phương pháp nhúng
trực tiếp................................................................................................................ 69
3.5. Kết quả cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng ......................................... 70
3.5.1. Tối ưu hóa nồng độ kháng thể và pH dung dịch hạt nano vàng .......... 70


3.5.2. Kết quả cộng hợp và hoạt tính của kháng thể sau khi cộng hợp với
hạt nano vàng ...................................................................................................... 71
3.6. Kết quả tối ưu xét nghiệm phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra.... 72
3.6.1. Hệ đệm ................................................................................................. 72
3.6.2. Nồng độ kháng thể ở vạch phát hiện.................................................... 73
3.6.3. Nồng độ kháng thể ở vạch chứng ........................................................ 74
3.6.4. Nồng độ kháng thể cộng hợp ............................................................... 74
3.7. Kết quả xác định các thông số kỹ thuật của xét nghiệm phát hiện
nhanh ................................................................................................................... 75
3.7.1. Giới hạn phát hiện ................................................................................ 75

3.7.2. Phản ứng chéo ...................................................................................... 76
3.7.3. Độ ổn định của bộ kít xét nghiệm phát hiện nhanh ............................. 76
3.7.4. Bộ kít xét nghiệm phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang .......................... 77
3.8. Đánh giá khả năng phát hiện nọc rắn hổ mang của bộ kít trên
lâm sàng............................................................................................................... 77
3.8.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu ........................................................... 77
3.8.2. Kết quả định lượng và phát hiện nọc rắn hổ mang trên lâm sàng ....... 78
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ................................................................................. 85
4.1. Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra từ
thỏ và gà .............................................................................................................. 85
4.1.1. Kiểm định chất lượng nọc rắn hổ mang Naja atra ............................... 85
4.1.2. Lựa chọn loài gây miễn dịch ................................................................ 86
4.1.3. Tạo kháng nguyên và quy trình gây miễn dịch .................................... 87
4.1.4. Phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của kháng thể với các kháng
nguyên nọc rắn .................................................................................................... 88
4.1.5. Tách chiết và tinh sạch kháng thể IgG và IgY từ huyết thanh và
trứng gà................................................................................................................ 89


4.2. Lựa chọn nguồn kháng thể cho tối ưu bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn
hổ mang Naja atra ............................................................................................... 91
4.3. Tối ưu hóa bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra .................. 93
4.3.1. Lựa chọn nguyên liệu cho bộ kít .......................................................... 93
4.3.2. Tối ưu hóa quy trình cộng hợp ............................................................. 94
4.3.3. Tối ưu hóa hệ đệm và các hóa chất xử lý màng................................... 96
4.3.4. Tối ưu hóa nồng độ kháng thể ............................................................. 97
4.4. Thử nghiệm bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra trên
in vitro ................................................................................................................. 99
4.5. Đánh giá khả năng phát hiện nọc rắn hổ mang trên lâm sàng ................. 102
4.5.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu ......................................................... 102

4.5.2. Thử nghiệm khả năng phát hiện nọc rắn hổ mang trên mẫu
lâm sàng............................................................................................................. 103
KẾT LUẬN ...................................................................................................... 109
KIẾN NGHỊ ..................................................................................................... 110
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
CỦA LUẬN ÁN ............................................................................................... 111
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 112
PHỤ LỤC ......................................................................................................... 126


DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Phần viết đầy đủ

TT

Phần viết tắt

1

BSA

Bovine Serum Albumin (Albumine huyết thanh bò)

2

CFA

Completed Freund's Adjuvant (Tá chất Freund hoàn chỉnh)

3

CNBr

Cyanogen Bromide

4

ECVAM

European Centre for the Validation of Alternative Methods

5

EDC

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide

6

ECL

Enhanced chemiluminescence

7

ELISA

Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Thử nghiệm miễn
dịch hấp phụ gắn enzym)

8

HRP

Horseradish Peroxidase

9

HTKNR

Huyết thanh kháng nọc rắn

10

ICA

Immunochromatographic assay (Sắc ký miễn dịch)

11

IFA

Incompleted Freund's Adjuvant (Tá chất Freund không
hoàn chỉnh)

12

IgG

Immunoglobulin G (Kháng thể lớp IgG)

13

IgY

Yolk Immunoglobulin (Kháng thể IgY)

14

KN

Kháng nguyên

15

KT

Kháng thể

16

KTKNR

Kháng thể kháng nọc rắn


17

LD50

Lethal dose, 50% (Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm)

18

LFIA

Lateral flow Immunoassay (Miễn dịch dòng chảy bên)

19

NC

Nitrocellulose (Màng Nitrocellulose)

20

OIA

Optical immunoassay (Miễn dịch quang)

21

OPD

O – phenylene diamine (Cơ chất)

22

PBS

Phosphat Buffer Salin (Dung dịch đệm phosphat)

23

PEG

Polyethylene Glycol

24

PVA

Polyvinyl Alcohol

25

PVDF

Polyvinylidene Fluoride (Màng PVDF)

26

PVP

Polyvinyl Pyrrolidone

27

RIA

Radioimmunoassay (Miễn dịch phóng xạ)

28

TBS

Tris-Buffered Saline

29

TBS-T

Tris-Buffered Saline + Tween 20

30

TMB

3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine

31

SDS-PAGE

Sodium

Dodecyl

Sulfate

Polyacrylamide

Electrophoresis
32

WHO

World health oganization (Tổ chức y tế thế giới)

Gel


DANH MỤC BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

1.1.

Ưu và nhược điểm của các vật liệu sử dụng làm màng cộng hợp

25

2.1.

Liều kháng nguyên sử dụng gây miễn dịch cho thỏ và gà

37

3.1.

LD0 và LD100 của nọc rắn hổ mang Naja atra

57

3.2.

Tỷ lệ tử vong của chuột sau 24 giờ tiêm nọc rắn hổ mang Naja
atra

57

3.3.

Tính kết quả LD50 theo phương pháp Karber-Behrens

57

3.4.

Kết quả thử nghiệm với kháng nguyên nọc rắn hổ mang Naja atra

68

3.5.

Thời gian giải phóng kháng thể cộng hợp

72

3.6.

Kết quả xác định khả năng phát hiện nọc rắn của bộ kít xét nghiệm
ở các nồng độ khác nhau

3.7.

75

Phản ứng chéo của bộ kít xét nghiệm với nọc của một số loài rắn độc
khác

76

3.8.

Kết quả thử nghiệm độ ổn định của bộ kít

76

3.9.

Kết quả phát hiện nọc rắn trong các mẫu bệnh phẩm theo thời gian
nhập viện

3.10.

80

Kết quả xét nghiệm của bộ kít so với xét nghiệm VDK của Đài loan
trên mẫu bệnh phẩm huyết thanh

81


3.11.

Kết quả xét nghiệm của bộ kít so với xét nghiệm VDK của Đài loan
trên mẫu bệnh phẩm dịch vết cắn

3.12.

82

Kết quả xét nghiệm của bộ kít so với xét nghiệm VDK của Đài loan
trên mẫu bệnh phẩm nước tiểu

83

3.13.

Kết quả xét nghiệm của bộ kít và chỉ định sử dụng HTKNR

84

3.14.

Kết quả xét nghiệm của bộ kít so với xét nghiệm ELISA

84


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ

Tên biểu đồ

3.1.

Biến động hiệu giá kháng thể đặc hiệu của các lô thỏ trong quá
trình gây miễn dịch

3.2.

59

Xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu của 3 huyết thanh kháng nọc
rắn

3.4.

58

Biến động hiệu giá kháng thể đặc hiệu của các lô gà trong quá
trình gây miễn dịch

3.3.

Trang

60

Phản ứng chéo giữa huyết thanh kháng nọc rắn với nọc rắn của
các loài khác

61

3.5.

Sắc ký đồ tinh sạch kháng thể IgG và IgY

62

3.6.

Hoạt tính kháng thể sau khi tinh sạch

64

3.7.

Hoạt tính của các kháng thể với nọc rắn hổ mang Naja atra sau
khi hấp phụ miễn dịch

66

3.8.

Phổ hấp phụ của phức hợp kháng thể - hạt nano vàng

71

3.9.

Thời gian nhập viện của nhóm BN nghiên cứu sau khi bị rắn cắn

80

3.10.

Phân bố bệnh nhân được lựa chọn lấy mẫu theo chẩn đoán

78

3.11.

Nồng độ nọc rắn trong huyết thanh của bệnh nhân lúc nhập viện

79


DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ

Tên Sơ đồ

Trang

2.1.

Thiết kế nghiên cứu

35

2.2.

Quy trình chế tạo bộ xét nghiệm nhanh

51


DANH MỤC HÌNH

Hình

Tên hình

Trang

1.1.

Số ca nhiễm độc nọc rắn mỗi năm theo khu vực

4

1.2.

Rắn hổ mang Naja atra

7

1.3.

Phân bố của rắn hổ mang Naja atra

8

1.4.

Biến chứng hoại tử tổ chức do rắn hổ mang Naja atra cắn và
hình ảnh mẫu vật do bệnh nhân đem đến

10

1.5.

Hệ thống sản xuất que thử điển hình

20

1.6.

Cấu tạo bộ kít phát hiện nhanh

21

1.7.

Nguyên lý hoạt động theo cơ chế sandwich

22

1.8.

Nguyên lý hoạt động theo cơ chế cạnh tranh

23

1.9.

Sự khác nhau về màu sắc giữa các kích thước của hạt nano vàng

24

1.10.

Mối liên quan giữa đặc tính màng mao dẫn và hiệu suất của que
thử

25

2.1.

Chế tạo kháng nguyên và gây miễn dịch trên thỏ và gà

38

2.2.

Các bước thẩm tích loại muối

41

2.3.

Thử nghiệm lựa chọn cặp kháng thể bằng kỹ thuật ELISA

46

2.4.

Thử nghiệm lựa chọn cặp kháng thể trực tiếp trên que thử

48

2.5.

Thiết kế xét nghiệm nhanh theo nguyên lý sắc ký miễn dịch

50

2.6.

Hệ thống in và trải kháng thể

53

3.1.

Kết quả điện di nọc rắn hổ mang Naja atra

58

3.2.

Các kháng thể sau quá trình tách chiết và tinh sạch

63


3.3.

Kiểm tra phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của các kháng thể
bằng kỹ thuật Western blot

3.4.

Kiểm tra phản ứng đặc hiệu của các kháng thể bằng kỹ thuật
Western blot sau hấp phụ miễn dịch

3.5.

65

67

Kết quả lựa chọn cặp kháng thể bằng phương pháp nhúng trực
tiếp

69

3.6.

Kết quả tối ưu nồng độ kháng thể

70

3.7.

Kết quả tối ưu pH dung dịch hạt nano vàng

70

3.8.

Hoạt tính kháng thể sau khi cộng hợp hạt nano vàng bằng kỹ
thuật dot-blot

71

3.9.

Khả năng thấm màng cộng hợp trước và sau khi xử lý

72

3.10.

Kết quả thử nghiệm lựa chọn hệ đệm

73

3.11.

Lựa chọn nồng độ kháng thể ở vạch phát hiện

73

3.12.

Lựa chọn nồng độ kháng thể ở vạch chứng

74

3.13.

Lựa chọn nồng độ kháng thể cộng hợp vàng tối ưu

74

3.14.

Thử nghiệm khả năng phát hiện nọc rắn ở các nồng độ khác nhau

3.15.

của bộ kít xét nghiệm

75

Bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang

77


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Rắn độc cắn là một cấp cứu ngộ độc thường gặp. Theo các chuyên gia
ước tính, ở nước ta hàng năm có khoảng 30000 trường hợp bị rắn cắn [71].
Thủ phạm gây ra các vết cắn có độc chủ yếu thuộc hai họ rắn hổ và rắn lục
[12], [13]. Theo số liệu thống kê của Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch
mai năm 2015, số bệnh nhân nhập viện do bị rắn hổ cắn chiếm 7,12% tổng số
trường hợp ngộ độc nói chung, trong đó có 29% được chẩn đoán xác định do
rắn hổ mang cắn [3].
Một trong những loài rắn hổ mang thường gặp và hay gây ra tai nạn rắn
cắn ở Miền bắc là rắn hổ mang Naja atra, hay còn được gọi là rắn hổ mang
bành. Tai nạn do rắn hổ mang Naja atra cắn có thể dẫn tới nhiễm độc nọc rắn,
nếu không được điều trị kịp thời có thể dẫn đến tử vong hoặc để lại di chứng
nặng nề, ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống của nạn nhân sau khi sống
sót [4]. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, thuốc điều trị hiệu quả nhất cho bệnh
nhân bị nhiễm độc nọc rắn là Huyết thanh kháng nọc rắn, chế tạo từ huyết
thanh động vật được gây miễn dịch [124]. Thế nhưng, điều kiện tiên quyết
cho sử dụng Huyết thanh kháng nọc rắn là phải xác định loài rắn độc đã gây
ra tai nạn rắn cắn. Tuy nhiên cho đến nay, ở nước ta việc chẩn đoán loài rắn

độc đã gây ra tai nạn rắn cắn để lựa chọn Huyết thanh kháng nọc rắn chủ yếu
dựa vào kinh nghiệm lâm sàng, do đó thường bị hạn chế và chỉ được thực
hiện ở các bệnh viện tuyến cuối nơi có các chuyên gia nhiều kinh nghiệm.
Hơn thế nữa, ngay cả tại các bệnh viện tuyến cuối, việc xác định loài rắn và
lựa chọn Huyết thanh kháng nọc rắn thường cũng chỉ thực hiện được khi các
biểu hiện lâm sàng đã rõ, điều này dẫn đến sử dụng Huyết thanh kháng nọc
rắn muộn, chủ yếu để cứu tính mạng nạn nhân chứ chưa hạn chế được những
di chứng tổn thương do nọc độc gây ra. Chính vì vậy, việc xác định chính xác
nọc độc của của loài rắn gây tai nạn trong cơ thể nạn nhân rắn cắn có ý nghĩa
thực tiễn rất quan trọng, vừa giúp sơ cấp cứu đúng cách vừa định hướng lựa


2
chọn đúng loại Huyết thanh kháng nọc rắn để sử dụng, đem lại hiệu quả điều
trị cao và an toàn hơn cho nạn nhân.
Do thành phần chính của nọc rắn độc đa phần là các độc tố có bản chất
là protein [1], [2], [14], [16]. Trong đó đa số đều có tính kháng nguyên cao
[42], [49]. Nên các xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc thường dùng là xét
nghiệm miễn dịch dựa vào tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên nọc rắn với
các kháng thể đặc hiệu có trong thành phần của bộ xét nghiệm. Ở Việt nam,
Hà Thị Hải và cộng sự đã nghiên cứu thành công bộ xét nghiệm ELISA định
lượng nọc rắn hổ mang Naja atra [7]. Tuy nhiên, ở khía cạnh giúp phát hiện
nhanh nọc rắn bộ xét nghiệm khó có thể được coi như một xét nghiệm cấp
cứu do có thời gian tiến hành tương đối dài. Bên cạnh kỹ thuật ELISA đã
được nhiều tác giả trong nước và trên thế giới lựa chọn để phát triển các xét
nghiệm phát hiện nọc rắn [5], [29], [107]. Xét nghiệm dựa trên nguyên lý sắc
ký miễn dịch là kỹ thuật có nhiều ưu điểm như có độ nhạy cao trong khi thời
gian tiến hành nhanh, kỹ thuật này cũng dễ triển khai và có thể sử dụng trên
thực địa [123]. Ở Đài loan, Hung D.Z và cộng sự cũng đã áp dụng nguyên lý
này để phát triển bộ xét nghiệm nhanh phát hiện nọc rắn hổ mang và đã có

những thành công nhất định [59]. Qua đó có thể thấy việc nghiên cứu chế tạo
bộ kít chẩn đoán nhanh rắn hổ mang Naja atra cắn với nguyên lý sắc ký miễn
dịch là thích hợp với điều kiện thực tế ở Việt nam, nơi mà tai nạn rắn độc cắn
thường xuyên xảy ra ở các khu vực nông thôn và miền núi, những nơi xa các
trung tâm y tế.
Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài
“Nghiên cứu chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra
bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch” nhằm hai mục tiêu:
1. Chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra theo
nguyên lý sắc ký miễn dịch.
2. Đánh giá khả năng phát hiện nọc rắn Naja atra của bộ xét nghiệm
trên thực nghiệm và lâm sàng.


3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Tai nạn rắn cắn và chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt nam
1.1.1. Tai nạn rắn cắn ở Việt nam
Nước ta nằm trong vùng nhiệt đới với địa hình và khí hậu khác nhau
giữa các miền Bắc, Trung, Nam. Từ đặc điểm tự nhiên đó đã tạo nên sự đa
dạng sinh học ở nước ta, trong đó có rắn độc. Theo các tác giả Trần Kiên và
Nguyễn Quốc Thắng, Việt Nam có hơn một trăm loài rắn, trong đó có hàng
chục loài rắn độc phân bố cả trên cạn và dưới nước [11].
Theo cách phân loại của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) [124] và dựa
trên các nghiên cứu đáng tin cậy trong nước có thể phân loại rắn độc ở nước
ta thành 2 nhóm [6], [10], [12], [13], [17]:
- Nhóm 1: bao gồm các loài rắn có độc tính cao, thường gặp hoặc phân
bố rộng rãi và gây nên tỷ lệ bị nhiễm độc, tử vong và tàn phế cao. Thuộc
nhóm này có rắn hổ mang ở miền Bắc (Naja atra) và miền Nam (Naja

kaouthia), rắn cạp nia ở miền Bắc (Bungarus multicinctus) và miền Nam
(Bungarus candidus), rắn chàm quạp (Calloselasma rhodostoma, ở miền
Nam), rắn lục tre (Cryptelytrops alborabris) trên cả nước và rắn lục mũi hếch
(Deinagkistrodon acutus).
- Nhóm 2: bao gồm các loài rắn có độc tính cao và có thể gây tỷ lệ ngộ
độc, tử vong và tàn phế nhưng:
▪ Thiếu các số liệu lâm sàng hoặc dịch tễ và/hoặc
▪ Ít cắn người hơn (do chu kỳ hoạt động, hành vi, nơi cư trú mà rắn ưa
thích hoặc chỉ ở các vùng ít dân cư. Thuộc nhóm này có rắn cạp nia đầu
đỏ (ở Đồng Nai, Bungarus flaviceps), Cryptelytrops macrops, rắn hổ
mèo (Naja siamensis, miền Nam), rắn khô mộc (Protobothrops
mucrosquamatus, miền Bắc), rắn hổ chúa (Ophiophagus hanah, cả


4
nước), rắn lục xanh (Viridovipera stejnegeri, miền Bắc và Trung) và
rắn cạp nong (Bungarus fasciatus).
Cho đến nay, chưa có số liệu nào thống kê chính xác nào về số ca
nhiễm độc và tử vong do rắn cắn. Mặc dù vây, bằng nhiều cách tiếp cận khác
nhau, các chuyên gia ước tính mỗi năm nước ta có đến 30.000 trường hợp bị
rắn cắn, thủ phạm chủ yếu do hai họ rắn hổ (Elapidae) và họ rắn lục
(Viperidae) gây ra [12], [13], [17], [71].

Hình 1.1. Số ca nhiễm độc nọc rắn mỗi năm theo khu vực
*Nguồn: theo Kasturiratne A. và cộng sự (2008) [71]

Tại Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch mai, năm 2015, chỉ tính số
trường hợp bị rắn hổ cắn đã là 216 trường hợp (chiếm 7,12% so với tổng số
bệnh nhân ngộ độc nói chung) [3]. Số liệu trên đây chỉ là “phần nổi của tảng
băng” vì rất nhiều trường hợp tử vong không được thống kê. Một nguyên

nhân quan trọng là phần lớn người bị rắn cắn thường lựa chọn điều trị theo


5
phương pháp cổ truyền, nên có thể tử vong tại nhà mà không đưa đến bệnh
viện.
1.1.2. Chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt Nam
Cho đến nay, ở nước ta việc chẩn đoán loài rắn độc đã gây ra tai nạn
rắn cắn để lựa chọn Huyết thanh kháng nọc rắn (HTKNR) chủ yếu dựa vào
kinh nghiệm lâm sàng và nhận biết loài rắn [4], [13]. Chẩn đoán lâm sàng
thường dựa vào:
• Mô tả của bệnh nhân hoặc người đi cùng về tình huống bị cắn và đặc
điểm con rắn gây tai nạn do họ nhìn thấy hoặc bắt được mang theo đến
bệnh viện;
• Dấu vết móc độc để lại tại vết thương rắn cắn;
• Biểu hiện nhiễm độc tại chỗ quanh vết cắn như chảy máu, đau buốt,
phù nề, hoại tử;
• Biểu hiện nhiễm độc toàn thân như nhiễm độc thần kinh hay rối loạn
đông cầm máu.
Tuy nhiên, chẩn đoán dựa vào lâm sàng có một số hạn chế do rắn cắn là
một tai nạn thường gây hoảng loạn cho bệnh nhân dẫn đến những mô tả sai
lệch về con rắn gây tai nạn. Rất ít trường hợp bệnh nhân có thể mang theo con
rắn gây tai nạn do không phải lúc nào cũng bắt được rắn. Việc mang con rắn
độc đã cắn bệnh nhân tới bệnh viện thường không được khuyến khích vì có
thể gây nguy hiểm thêm cho người tiếp xúc với rắn, một số trường hợp các
nhân viên y tế được nhìn tận mắt con rắn cũng chưa thể đưa ra chẩn đoán một
cách chính xác do kiến thức về phân loại rắn còn hạn chế. Hơn nữa, những
nghiên cứu về đặc điểm nhiễm độc của các loài rắn độc gây tai nạn cho đến
nay chưa có nhiều, mới chỉ có một số nghiên cứu mô tả đặc điểm chung của
nhiễm độc do rắn hổ mang cắn nói chung ở tại Trung tâm Chống độc Bệnh

viện Bạch Mai và Bệnh viện Chợ rẫy [13], [89]. Việc chẩn đoán mới chỉ dừng


6
lại ở định hướng chẩn đoán họ rắn cắn (ví dụ “rắn lục cắn”, “rắn hổ cắn”),
hoặc tiến bộ thêm một bước nữa là chẩn đoán giống rắn độc cắn (ví dụ “rắn
hổ mang cắn”, “rắn cạp nong, cạp nia cắn”) [3], [13]. Việc chẩn đoán vẫn
chưa thể tiến tới mức độ xác định cụ thể loài rắn độc cắn (ví dụ “rắn hổ mang
Naja atra cắn”, “rắn cạp nia Candidus multicinstus cắn”...), ngoại trừ những
trường hợp bắt được rắn gây tai nạn mang đến. Một trong những nhược điểm
khác nữa là phải dựa trên các biểu hiện và mức độ nhiễm độc của bệnh nhân,
những biểu hiện này chỉ có khi nọc rắn đã gây hại cho cơ thể bệnh nhân một
cách rõ ràng, tức là ở giai đoạn muộn của bệnh. Trong nhiều trường hợp, các
bác sỹ phải mất cả quá trình theo dõi diễn biến các biểu hiện nhiễm độc để
đưa ra kết luận cuối cùng về loài rắn độc cắn. Khi đã hội đủ các triệu chứng
lâm sàng, xét nghiệm cần thiết thì đồng nghĩa với việc nọc rắn đã gây tổn
thương tối đa cho cơ thể. Song song với quá trình theo dõi đó, các bác sỹ còn
phải áp dụng tất cả các biện pháp có thể (thậm chí điều trị thử bằng HTKNR
đặc hiệu). Ngoài ra, việc chẩn đoán loài rắn độc gây tai nạn cũng có thể dựa
vào phân bố địa lý của các loài rắn (ví dụ chủng rắn hổ mang Naja atra
thường gặp và gây nhiễm độc nhiều nhất ở miền Bắc, chủng Naja kaouthia
thường gặp ở miền Nam) [4], [13]. Nhưng do sự phát triển của các hoạt động
mua bán rắn giữa các vùng miền dẫn tới thay đổi về phân bố rắn độc và các
bệnh nhân bị rắn cắn. Thay đổi này là một khó khăn với việc chẩn đoán loài
rắn cắn dựa trên các biểu hiện nhiễm độc.
1.2. Rắn hổ mang Naja atra
1.2.1. Đặc điểm sinh học và nọc độc
Rắn hổ mang Naja atra hay còn gọi là Taiwan cobra, Chinese cobra, là
loài thuộc họ Elapidae [4], [13], [65], [116].

7

Hình 1.2. Rắn hổ mang Naja atra
*Nguồn: theo Breuer H. và cộng sự (2009) [28].

Rắn hổ mang N.atra được mô tả lần đầu tiên bởi một bác sỹ, nhà động
vật học người Đan mạch là Theodore Edward Cantor vào năm 1842 [105].
Rắn hổ mang N.atra trưởng thành có kích thước hơn 1m. Lưng rắn thường
màu đen hoặc xám, vẩy ở lưng mịn và bóng. Rắn có thân hình hơi dẹt, đuôi
ngắn. Đầu hình tam giác, không có vảy má và có khả năng bạnh cổ khi bị kích
thích. Khi bạnh cổ sẽ xuất hiện một vòng cung gọi là mắt kính và vệt giống
gọng kính ở hai bên màu vàng hoặc trắng (hình 1.2). Giống các loài rắn hổ
khác, răng nanh của rắn là vĩnh viễn và có tuyến nọc ở bên trong, vị trí của
răng nanh ở phía trước hàm trên. Rắn có khả năng phun nọc độc, đây là một
trong những đặc điểm độc đáo của loài rắn hổ [11], [69].
Môi trường sống của rắn hổ mang N.atra thường là rừng, cánh đồng,
thậm chí cả khu vực đông dân cư. Rắn thường ẩn dưới lá cây, gậy, đá... Rắn
hoạt động săn mồi cả ngày và đêm, đặc biệt vào thời điểm từ tháng 3 đến
tháng 10 [11], [13].
Nọc của rắn có độc tính cao, thành phần chính là các neurotoxin gây
độc thần kinh, cardiotoxin, haematoxin và Phospholipase A2… [1], [2], [16],
[117]. Cardiotoxin (I, II, III và IV) chiếm đến 54% trọng lượng khô của nọc
(Wang JD, 1981) [117]. Giá trị LD50 trên chuột 0,62 mg/kg khi tiêm dưới da
[78].


8
Rắn hổ mang N.atra được tìm thấy ở miền đông nam Trung Quốc (bao
gồm các tỉnh Tứ Xuyên, Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng Tây, Quý Châu, Hồ

Nam, Hồ Bắc, Chiết Giang và đảo Hải Nam), Hồng Kông, Bắc Lào, Bắc Việt
Nam và Đài Loan (hình 1.4) [65], [116].

Hình 1.3. Phân bố của rắn hổ mang Naja atra
*Nguồn: theo Ji X. và cộng sự (2014) [65].

Hoàng Ngọc Anh và cộng sự (2006), nghiên cứu tách các độc tố thần
kinh từ nọc rắn hổ mang N.atra (trại rắn Vĩnh Sơn, Vĩnh Tường) thấy trọng
lượng phân tử của các độc tố này không giống với các độc tố của nọc rắn hổ
mang Đài Loan. Khi khảo sát các chất có hoạt tính sinh học có trong nọc rắn
hổ mang, tác giả đưa ra một số kết luận: hàm lượng các neurotoxin có trong
nọc phụ thuộc vào thời gian hoạt động sinh lý của rắn, cao nhất trong thời
gian rắn ngủ đông. Kết quả điện di những phân đoạn có hoạt tính độc cho
thấy các protein và enzym có trong thành phần nọc rắn hổ mang N.atra có
trọng lượng phân tử lần lượt là 6, 25, 35, 45, 66 và lớn hơn 116 kDa [2].
Nọc độc của rắn hổ mang có chứa nhiều các peptid chịu nhiệt tốt. Mặc
dù độc tính bị mất đi ở nhiệt độ 60°C trong 100 phút nhưng hoạt tính sinh học
của một số hoạt chất vẫn còn ngay cả khi được làm nóng trong thời gian 300
phút. Ngoài ra, trong thử nghiệm formalin ở chuột, nọc độc sau khi được làm
nóng ở 60°C trong 300 phút cho hiệu quả giảm đau tốt hơn so với lidocain
[27].


9

1.2.2. Tai nạn do rắn hổ mang Naja atra cắn
1.2.2.1. Dịch tễ
Tai nạn do rắn hổ mang N.atra cắn thường gặp ở các khu vực nông
nghiệp ở các nước Châu Á, các tai nạn thường xảy ra vào mùa hè hoặc đầu
thu. Tại Đài loan, rắn hổ mang N.atra là một trong 6 loài có ý nghĩa dịch tễ

quan trọng [69]. Trong nghiên cứu của Wang JD và cộng sự (2009), trong
thời gian từ năm 1994 đến năm 2007, có đến 38% số trẻ em bị rắn độc cắn
được xác định là do rắn hổ mang N.atra [117]. Ở Việt nam, trong nghiên cứu
của Nguyễn Kim Sơn (2008), có đến 163/384 bệnh nhân bị rắn hổ mang cắn
nhập viện được xác định là do rắn hổ mang N.atra (chiếm 42%) [13]. Tai nạn
do rắn hổ mang N.atra cắn theo các tác giả thường xảy ra vào mùa hè cho đến
mùa thu [60], [122].
1.2.2.2. Biểu hiện lâm sàng
Khi bị rắn hổ mang cắn ngoài dấu vết của răng độc, đau đớn thường
xảy ra trong vòng 10 phút tại vị trí vết cắn. Các triệu chứng đau, đỏ da, sưng
nề, chảy máu thậm chí có bọng nước dần nặng lên. Các vết thương tổ chức tại
chỗ tương đối rõ ràng, nguyên nhân chính là do tác dụng của cardiotoxin và
phospholipase A2. Hình ảnh mô bệnh học nghiên cứu trên vết cắn của N.atra
trên cơ thể người cho thấy trung tâm hoại tử của lớp biểu bì với cục máu đông
với lắng đọng fibrin ở lớp bề mặt và mạch máu lớp sâu ở trung bì. Sự phá hủy
tổ chức lan rộng của nọc rắn hổ mang được cho là kết quả của tác động gây
độc tế bào với thiếu máu thứ phát của các mạch máu trung bì và hậu quả của
nhiễm khuẩn [97], [122]. Theo Nguyễn Kim Sơn, dấu hiệu phù nề + hoại tử
sớm gặp ở 100% trường hợp [13]. Do vị trí cắn thường là các chi, hoại tử lan
rộng dẫn đến làm tăng gánh nặng cho những bệnh nhân còn sống sót (hình
1.4).