Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter Xylinum cho màng dày, nghiên cứu ảnh hưởng của etanol, axit axetic, ( NH4)2SO4, pH, ứng dụng làm thạch dừa (Khóa luận tốt nghiệp)

Khoá luận tốt nghiệp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA : SINH HỌC

NGUYEN

THI QUANG

- K29A

“TUYEN CHON CHUNG VI KHUAN ACETOBACTER XYLINUM CHO
MANG DAY, NGHIEN CUU ANH HUONG CUA ETANOL, AXIT AXETIC,
(NH¿);SO¿, pH,ỨNG DỤNG LÀM THẠCH DỪA ”

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành : Vị sinh vật

Người hướng dẫn :

Thạc sĩ: Nguyễn Khắc Thanh

Hà Nội: 2007
Nguyên Thị Quang

1

K29A-Sinh


Khố luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Để có được sự thành cơng của đề tài khố luận, em đã nhận được sự giúp đỡ tâm
huyết và tận tình của các thầy cơ trong bộ mơn Vì Sinh tơ thực vật, đặc biệt là sự

giúp đỡ của thầy Nguyễn Khắc Thanh và cô Đinh thị Kim Nhung cùng các bạn
sinh viên, những ý kiến đóng góp của các bạn trong nhóm vi sinh. Em xin được
bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất về sự giúp đỡ quý báu đó của các

thầy cơ, các bạn trong nhóm vi sinh và người trực tiếp hướng dẫn em là thầy
Nguyễn Khắc Thanh.
Hà Nội, tháng 05 năm 2007

Sinh viên: Nguyễn thị Quang

Nguyên Thị Quang

2

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Khoá luận tốt nghiệp này được hồn thành dưới sự hướng dẫn tận tình của
thạc sĩ Nguyễn Khắc Thanh. Em xin cam đoan rằng:
Đây là kết quả nghiên cứu của riêng em.
Kết quả này không trùng với kết quả của bất kì tác giả nào đã cơng bố

Nếu sai em xin chịu hồn tồn trách nhiệm.
Sinh viên: Nguyễn Thị Quang

Nguyên Thị Quang

3

K29A-Sinh


Khố luận tốt nghiệp

TĨM TẮT CƠNG TRÌNH
Thạch dừa là sản phẩm

được tạo thành trong q trình ni cây vi sinh

Acetobacter xylinum trong mơi trường nước dừa chuyển hố thành
Hemixenluoza, qua chế biến và xử lý cùng với một sỐ nguyên liệu thành thạch

dừa. Đây là món ăn cơ truyền của một số nước Đông Nam Á: Philipin,
Malaixia... Việt Nam cũng là một trong những xử sở của dừa. Bên cạnh các món
ăn được chế biến từ dita như cơm dừa, kẹo dừa, bánh đa...Thì thạch đừa cũng

được khá nhiều người ưa thích. Thạch dừa với thành phân chính là

Hemixenluloza, có tác dụng giúp cho q trình tiêu hố tốt hơn, dưỡng da, chống
lão hố, giảm cholesterol trong máu và phịng ngừa một số bệnh ung thư... Ở
nước ta, việc nghiên cứu ứng dụng vi khuânAcetobacter xylinum và sản xuất
thach diva rat it, xuất hiên một vải cơ sở sản xuất thạch đừa (Thành phố Hồ Chí

Minh) nhưng sản lượng ít trong khi nhu cầu sử dụng thạch dừa ngày càng tăng,

hơn nữa nguồn nguyên liệu lại khá dồi dào. Đứng trước nhu cầu và tiềm năng đó
cũng như việc nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum đến việc ứng dụng tạo

nguôn thức ăn từ nguyên liệu sẵn có là một việc làm có ý nghĩa thực tiễn và lý
luận sâu sắc, vì vậy tơi đã chọn và nghiên cứu đề tài:”Tuyền chon ching vi

khuẩn Acetobacter xylinum cho mang dày, nghiên cứu ảnh hưởng etanol,
axit axefic, (NHa);SO¿, pH, ứng dụng làm thạch dừa”.
Trong đề tài này, từ các nguồn nguyên liệu sẵn có ở trong nước tơi đã
phân lập được 60 mẫu, tuyên chọn được 02 chủng vi khuan Acetobacter xylinum

cho màng dày hơn cả làm đối tượng nghiên cứu tiếp theo. Nghiên cứu khả năng
tạo màng chọn ra hai chủng vi khuân Acetobacter xylinum 1a A; va Ag cho mang
đày nhất.
Nghiên cứu tiếp theo là quan sát hình dạng tế bào trên kính hiên vi quang
học.

Nghiên cứu động thái phát triển của hai chủng trên.
Nghiên cứu ảnh hưởng của etanol, axIt axetic, (NH¿);5O¿x, pH tới quá trình
tạo màng của hai chủng này.
Ứng dụng hai chủng đó vào làm thạch dừa trong phạm vi phịng thí
nghiệm,
Ngun Thị Quang

4

K29A-Sinh

Khoá luận tốt nghiệp

1.1.

Ly do chon dé tai

PHAN 1. DAT VAN DE

Cũng như các linh vực khoa học khác, công nghệ vi sinh mà tiền thân của nó là
cơng nghệ lên men cô đã trải qua những chặng đường phát triển đầy khó khăn,
phức tạp. Đã từ rất lâu con người đã biết ứng dụng quá trình lên men trong sản
xuất vào đời sống như: Làm tương, muối dưa, làm bánh mì, sản xuất bia

rượu...mà chưa hiểu hết bản chất của quá trình lên men. Cho đến gần đây khi
trên thị trường đã xuất hiện một loại thực phẩm mới đó là thạch dừa. Đây là một
loại thực phâm được khá nhiều người ưu thích và bơ dưỡng: Giúp cho q trình
tiêu hố tốt hơn, dưỡng da, giảm cJolesferol trong máu, chống lão hoá, ngăn
ngừa một số bệnh ung thư... Tuy nhiên trong nước mới chỉ một vài cơ sở sản
xuất, trong khi nhu cầu sử dụng thạch dừa ngày càng cao, hơn nữa nguồn nguyên
liệu thô để sản xuất lại khá đồi đào và cũng rất khô để bảo quản nước dừa. Đứng
trước tiềm năng và nhu cầu ấy chúng tôi đã chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài:
"Tuyền chon chủng vỉ khuẩn Acetobacter xylinum cho màng dày, nghiên
cứu ảnh hưởng efanol, axit axefic, (NH¿);SO¿a, pH, ứng dụng làm thạch dừa”
1.2.Mục tiêu của đề tài
Từ các nguồn nguyên liệu: Bia, rượu vang, hoa quả, giấm tiễn hành phân lập
tuyên chọn các chủng cho màng dày, nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tơ
tới q trình lên men.
1.3.Nhiệm vụ

Phân lập tuyên chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng dày, từ
đó chọn ra hai chủng cho màng dày nhất làm đối tượng nghiên cứu.
Tìm hàm lượng của efanol, axit axefic, (NH¿);SO¿, pH thích hợp cho sự phát
triển của hai ching Acetobacter xylinum tuyén chọn được.

1.4 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài

Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu hình thái, đặc tính sinh lý, sinh hoá của các
chung Acetobacter xylinum co kha nang cho mang day
Góp phân tìm hiểu q trình sản xuất thạch dừa và nâng cao hiệu quả sản xuất

Nguyên Thị Quang

5

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Phần 2. Tổng quan tài liệu
2.1. Lược sử nghién ciru va phan loai vi khuan Acetobacter xylinum
(A.xylinum)
2.1.1.Lược sử nghiên cứu vi khuẩn A.xylinum
Người ta thường gọi quá trình chuyển hố rượu thành axit axetic là q trình lên
men axetic, nhưng thực chất đây là một quá trình oxi hố, vi khuẩn gầy ra q

trình này là vi khuẩn axetic thuộc giống Acefobacter. Trước đây con người mới
chỉ ứng dụng quá trình này đề làm giẫm từ rượu vang hỏng một cách thụ động
mà chưa hè biết đến cơ chế và bản chất cuả nó. Tuy vậy tới những năm đầu của

thế kỉ 19 con người đã điều chế được axit axetic đậm đặc, biết giấm là sản phẩm
lên men của nhóm vi sinh vật mà ngày nay chúng ta gọi là Acetobacter hay vi
khuân axetic. Từ đó đến nay đã có rất nhiều khoa học nghiên cứu về loại vi

khuẩn này.

Người đầu tiên nhìn thấy vi sinh vật là Antoni Lơvenhuc (1632-1723) và Person
(1822) là người đầu tiên nghiên cứu về axit axetic từ lớp màng mỏng phát triển
trên giẫm. Ơng đã chứng minh được đó là một loại vi sinh vật có tên là
Mycoderma axetic
Năm 1973 Kittzing nhận xét quá trình lên men giẫm nhất thiết phải có vi sinh
vật, như vậy ơng đã khẳng định rõ vai trò của vi sinh vật trong quá trinh lên men
giảm. Cùng năm đó, Hansen cung tách được hai loại vi khuẩn thn khiết từ
mangf giẫm ơng gọi đó là Ä4ycoderma aceti và Mycoderma pasteurianum.
Năm (1862-1868) L.pasteur là người đầu tiên khám phá ra cơ chế của quá trình
lên men axetic, đó là một q trình oxi hố rượu etylic. Ông đã chứng minh sự
đúng đắn trong nhận xét của Kittzing & Hansen, khăng định bản chất của quá
trình lên men axetic. Với việc sử dụng kính hiến vi bởi Lơvenhuc thì nhận thức
về sự tồn tại của thế g1ới v1 sinh vật mới thực sự bắt đầu, nhờ đó Pasteur đã xem

xét sự xuất hiện màng trên bia và rượu vang một cách kỹ lưỡng. Cuối cùng ông
kết luận màng đó được tạo thành do một loại trực khuẩn (màng là tập hợp những
tế bào trực khuẩn) và ông cũng gọi là Ä4ycoderma aceti
Những nghiên cứu tiếp theo nhằm mục đích cải tiễn q trình lên men axetic.
Trên cơ sở đó đã có rất nhiều quan điểm phân loại khác nhau ra đời.
Nguyên Thị Quang

6

K29A-Sinh

Khoá luận tốt nghiệp

2.1.2.Phân loại vỉ khuẩn Acetobacter
Từ trước tới nay đã có rất nhiều tác giả đề cập đến vẫn đề này trong đó đáng chú
ý nhất là khố phân loại của Beijerinck. Ông phân loại vi khuẩn dựa vào hai dấu
hiệu.

Một là: Khả năng sử dụng đạm amoni để thực hiện sự sinh trưởng và phát triển
Hai là: Có hay khơng có giai đoạn đi động trong q trình phát triển
Năm 1962 Heneberg đã chia tất cả các vi khuẩn axetic thành 4 nhóm theo nơi
sống đặc trưng của chúng.
Nhóm I: Vi khuẩn khơng phát triển trên bia vì hoa Hublon độc với chúng
Nhóm 2: Vi khn phát triển trên bia
Nhóm 3: Vi khuẩn phát triển trong dung dịch rượu vang
Nhóm 4: Vi khuẩn để sản xuất giẫm theo phương pháp nhanh
Năm 1934, theo nghiên cứu của hội nhà vi khuẩn học Hoa Kỳ, các vi khuân
axetic có khả năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản của cacbon và nitơ
nên đã kết hợp vào họ Wiobacteriaceae. Từ đó vi khuân giâm giữ tên là

Acetobacter. Nim 1848 Vanght cơng bơ kết quả của mình khi ơng quan sát thấy
được sự di động của nhiéu loai Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianum,

Acetobacter oxydans, Acetobacter malanogenum
Vanght đã giải thích răng các lồi trên cùng một loại có đơn mao ở cực và đã xác
nhận vị trí của vi khuẩn axetic trong họ Pseudomonadaceae.
Ngày nay theo khoá phân loại của Bergeys và nhiều tác giả khác đã xếp vi
khuan Acetobacter va Gluconobacter vao ho Acetobacter iaceae.

Năm 1914 Bergeys phân loại các loài trong giống 4cefobacter thành hai loại
- Loại 1: OxI hoá axIt axetic thành CO› và HạO
+ Loại này sử dụng muối amoni làm nguồn nito duy nhất, đại diện là vi khuẩn

Acetobacter aceti
+ Không sử dụng muối amoni lam ngu6n nito duy nhat

Trên bề mặt môi trường dịch thể tạo màng nhây có chứa xenluloza, điển hình là

acetobacter xylinum
Trên bề mặt môi trường dịch thể không tạo màng nhây chứa xenluloza, dàng
dién hinh la Acetobacter rancens, Acetobacter pasteurianum
Nguyên Thi Quang

7

K29A-Sinh


Khố luận tốt nghiệp

_ Loại 2: Vi khn khơng oxi hố axit axetic
+Tạo thành sắc tố trên mơi trường glucoza
Sắc tô nâu tới đen nhạt : Acefobacter malanogenus
Sắc tố hồng: Acetobacter zancens
+ Khơng tạo thành sắc tố.
Nhiệt độ thích hợp nhất 14 30-35°C: Acetobacter suboxydans
Nhiệt độ thích hợp giưa 18-21°C :4cetobacter oxydans
Năm 1960 Shiwel và Car nghiên cứu về đặc trưng ni cấy sinh hố của vi
khuẩn Acetobacter va dua ra két luận khơng thể có sự đồng nhất các vi khuân

Acetobacter. Tư những nghiên cứu về 4cefobacfer người ta đã khơng ngừng phát
huy vai trị của nó trong đời sống con người. Nhu cầu của con người vè sử dụng
Acetobacter ngay cang da dang va ching dugc sử dụng nhiều trong các công
trinh khoa hoc phuc vu nhu cau hàng ngày như: lên men giám, chế biến thức ăn,
sản xuất vitaminC, B¿, B;, B;;, sản xuất tơ nhân tạo ...
2.2. Đặc điểm chung về vi khuẩn 4cefobacfer|2]
Ngày nay người ta đã biết vi khuan Acetobacter là tác nhân chính của quá
trình lên men axetic. Chúng thuộc vào 2 giống vi khuân 4cefobacfer chu mao
hoặc không bà Giwconobacfer đơn mao. Đây là 2 giỗng vi khuẩn axeticquan
trọng nhất trong họ 4cefobaccfer iaceae. Chúng phơ biến trongtự nhiên, có trên
bề mặt lá, hoa quả.. .chúng tạo ra axix axetic tir rugu etylic.

Trong tế bào Giuconobacter khơng có chu trình tricacboxylic hoạt động

nên nó khơng thê oxi hố axetat nhưng có một chu trình khác thay thế( chu trình
glyoxylat)
Khơng oxI hố axit axetic
Khi so sánh vi khuẩn này với những vi khuẩn thuộc giồng pseudomonas
thay có đặc điểm tương tự. Chúng chỉ khác pseudomonas ở chỗ chịu được độ

axit cao hơn, khắ năng chuyển hố pepton yếu ít di động và khơng sinh sắc
tô.Nhiều loại vi khuẩn Acetobacter khi phat triển trên môi trường thiếu thức ăn

hoặc môi trường đã nuôi cây lâu dé làm biến đổi hình thái thành dạng có hình
thái đặc biệt
Vi khuẩn Acefobacfer ở dạng hình que, có thể có tiêm mao, di động,
khơng sinh bào tử,gram âm, hiếu khí bắt buộc.
Nguyên Thị Quang

8

K29A-Sinh


Khố luận tốt nghiệp
Trên cơ sở dựa vảo tính chất đặc trưng cua vi khuẩn Acetobacter ma người

ta xếp chúng vào nhóm độc lập là khả năng oxi hố rượu etylic thành axit axetic,
pH-=4,5. Ngồi ra chúng cịn thực hiện q trình oxI hố khơng hồn tồn các
hợp chất hữu cơ khác

dé tạo thành các hợp chất xeton,

Vi khuẩn Acefobacter chỉ phát triển tốt trong điều kiện hiểu khí, nhiệt độ
thích hợp từ25-30°C, pH thích hợp 5,4-6,8. hố đị đưỡng hữu cơ [10,15].
Đặc điểm phân biệt 4cefobacter và Giuconobacter. So sánh với
Pseudomonas
Dac diém so sanh

Gluconobacter

Acetobacter

Pseudomonas

oe
VỊ trí tiêm mao

Don mao ở cực hoặc

`

Chu mao hoặc
ˆ

Chu mao ở

+

+

+

+

Phát triển ở
pH=4.5

Oxy hố etanol
pH=4.5

khơng

Oxy hoa axit

không

Cực

—

—

+

+

_

+

+

+

+

+

lactose

—

7

Su dung Gelatin

_

_

+

—

—

+

axetic

7

Oxy hoa lactat
Glucoza ->
Gluconate

Sử dung tinh bột

Sac tơ huỳnh
quang

+

Về hình dạng tế bào, vi khn Acefobacter là những trực khuẩn hình que,

kích thước trung bình từ 0,6-0,8uim. Các tế bào đứng tách riêng hoặc xếp thành

chuỗi, loại đặc biệt có tế bào hình câu tuỳ thuộc vào điều kiện pH môi trường

„nhiệt độ nuôi cây. [2].Vi khuan Acetobacter khơng có khả năng sinh bào tử, tạo

Ngun Thị Quang

9

K29A-Sinh


Khố luận tốt nghiệp

màng nhây, một số có khả năng di động nhờ tiêm mao,một số khơng có khả năng
này
Khi nghiên cứu về khuẩn lạc và màng vi khuẩn 4cefobacfer trên môi
trường cây cho thấy vi khuẩn 4cefobacfer phát triển tốt trên mơi trường nước
bia, các mơi trường có chứa cao nẫm men:glucoza, rượu etylic, hoặc manitol.
Trên môi trường đặc chúng phát triển những khuẩn lạc tròn đều đặn đường kính

trung bình là 3mm, bề mặt trơn bóng, phần giữa khguân lạc nỗi lên day va sam
hơn các phân xung quanh. Một số loại có khuân lạc lớn(đ=4-5mm) bề mặt trơn
bóng khơng có màu, mỏng như hạt sương nhỏ đễ đàng dùng que cấy gạt ra khỏi
môi truường .
Trên môi trường lỏng vi khuẩn axetic phát triển tạo thành lớp màng. Dung

dich duéi màng bao giờ cũng trong suốt. Khi nghiên cứu lớp màng này người ta
thấy có sợi xenluloza giỗng như ở trong sọi bông.
Nhu câu đinh dưỡng của vi khuẩn axetic đôi với nguồn cacbon, nitơ và các
chat sinh trưởng rất đa dạng. Chúng sử đụng đường, rượu efylic, axit hữu cơ làm
nguôn cacbon, muỗi amoni làm nguồn nitơ. Trong q trình phát triển chúng

có

nhu cầu đối với một số axit amin, chất kích thích sinh trưởng...
Một số lồi vi khuẩn có khả năng tổng hợp các chất cao phân tử:xenluloza,
tinh bột ...Con người đã ứng dụng điều này trong sản xuất cơng nghiệp
Vi khuẩn axetic có khả năng oxi hố gluxit theo mây hướng sau:
-Hướng 1: Khơng có sự photphoril hố cơ chất với sự tham gia của enzym
đặc hiệu
-Hướng 2: Oxxi hoá các cơ chất đã được photphoril hoá trong con đường
pentozo photphat.
-Hướng 3: Theo sơ đồ của Entenr-Doudoroff
-Hướng 4: Theo chu trình Krebs hoặc Glyoxylat

2.3.Một số loại vi khuẩn Acetobacter[10,15]
2.3.1.Acetobacter xylinum
Là những trực khuân hình que (2um), đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi,
không di động các tế bào được bao bọc bởi chất dây, tạo váng nhanh khá dày, bắt
màu xanh với thuốc nhuộm lốt và H;SO¿

2.3.2. Acetobacter aceti
Nguyên Thi Quang

10

K29A-Sinh


Khố luận tốt nghiệp

Trực khuẩn hình que khơng di động, bắt màu gram âm màu vàng với

thuốc nhuộm lốt. Chúng tạo khuẩn lạc sám trên gelatin với dịch lên men chứa
10% đương xacaroza thường phát triển trên bia
2.3.3.Acetobacter Pasteurianum
Bắt màu xanh với thuốc nhuộm lốt, tạo thành váng khô và nhăn nheo. Tế
bào xếp rời nhau thành chuỗi, nhiệt độ thích hợp là 30°C

2.3.4.Acetobacter kiitzingianum
Là vi khn có màng nhâày, nhắn ở mép và được nâng lên theo thành bình.
Trực khuẩn ngắn, to, thô, không di động, tạo thành màng xếp nếp trên các môi

trường lỏng
2.3.5.Acetobacter acetosum

Các tế bào xếp riêng rẽ thành từng chuỗi, không di động, nhiệt độ thích

hợp 30-> 36°C
2.3.6.Acetobacter scutzenbacri
Có dạng hình que, thường đứng riêng rễ hoặc xếp thành đơi, có thể tạo

thành những dạng tế bào đặc biệt. Trong mơi trường có thể tích luỹ tới 11,5%
axit axetic
2.3.7.Acetobacter lindsni
Trực khuẩn xếp riêng rẽ tạo thành chuỗi, đơi khi bắt gặp các tế bào phình
to như hình cầu. Trên các mơi trường lỏng, váng vi khuẩn có màu vàng nâu,
nhớt.
2.3.8.Acetobacter subxydans
Dạng hình que, đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi ngắn, khơng có khš
năng di động, tạo thành những màng mỏng đễ tan vỡ.
2.3.9.Acetobacter hoshiakii
trực khuẩn, thường xếp riêng rẽ, không di động. Khuẩn lạc trên thạch với

chất chiết rút đậu nành nhỏ, tròn, ở dạng hạt sáng, sau đó chuyển màu nâu.
Khuẩn lạc trên thạch với dịch lên mem tròn, màu trắng sữa, về sau ở giữa hố
nâu, phần ngồi màu vàng nhạt.
2.3.10.Acetobacter ascendens
Trực khuẩn không di động, các khuân lạc trên Glucoza, gelatin khơ, trang,
với vùng sáng chói trên các mơi trường lỏng tạo màng dày, chắc.
Nguyên Thị Quang

11

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

2.3.11.Acetobacter oxydans
Trực khuẩn, các tế bào rời nhau, có khả năng di động, khuẩn lạc trên
gelatin trịn, sau đó thành những dạng khơng phân nhánh đặc trưng
2.3.12. Acetobacter plicatum
Trên vải môi trường chúng được nhộm màu như nhau. Ở 28->30°C tạo
thành những khuẩn lạc phông to kéo đài, khuẩn lạc trên gelatin rượu vang trịn,

hơi nhơ lên, ẩm ướt

2.3.13.Acetobacter orleanense
Trực khuẩn dài trung bình, gặp nhiệt độ cao có thể sinh ra đị hình kéo dài,

hoặc phình to ra, váng vi khuẩn tạo ra rất dày ở trên mơi trường lỏng. Tích luỹ
được 4,5% axIt axetic, thường dùng để sản xuất rượu vang

Tóm lại

Cac loai Acetobacter thudng phat trién tốt ở nhiệt độ 25-> 30°C. Một số
loại có khả năng tổng hợp vitamin B¡, B;, một số loại có khả năng chuyển

hố

rượu socbit thành đường socboza. Chúng được sử dụng trong công nghiệp dược
phẩm sản xuất vitamin C, có khả năng oxi hố rượu thành axit axetic
Dựa vào đặc điểm trên người ta ứng dụng sản xuất đối với từng chủng
nhưng trong sản xuất để quá trình lên men đạt hiệu quả cao không dùng hỗn hợp
nhiều loại vì trong hỗn hợp có thể gặp loại oxi hố axit axetic trong khi mơi

trường vẫn cịn rượu etylic
2.4.Cơ sở khoa học của sự lên men axefic

Người ta gọi q trình chun hố rượu thành axit axetic là q trình lên
men axetic hay lên men giẫm [5.6]. Nhưng thực ra đây là q trình oxi hố khử
nhờ một nhóm vi khuẩn thuộc chỉ 4cefobacfer chúng thuộc hai giỗng
Acetobacter chu mao hoac khéng va gluconobacter don mao
Bản chất sinh học của q trình chun hố rượu etylic thành axit axetic
được Kittzing nêu lên đầu tiên vào năm 1838, đến năm 1868 Pasteur đã xác

nhận sự đúng đắn của nó. Ơng cho rằng sự oxy hố rượu etylic thành axit axetic
có liên quan mật thiết đến việc hấp thụ một lượng lớn oxy. Liebig (1851), người
đầu tiên xác định sự có mặt của axêtaldehit như một sản phẩm trung g1an của q

trình oxy hố rượu thành axit axetic. Henegerg (1898) xác định phản ứng xảy ra
theo hai giai đoạn:
Nguyên Thị Quang

12

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp
Gai đoạn 1: Rượu etanol được chuyên thành axetaldehit
G1a1 đoạn 2: Axetaldehit được hydrat hoá thành axit axetic

Tiếp theo đó có nhiều tác giả nghiên cứu về cơ chế q trình này
Trên cơ sở đó các tác giả đã xây dựng được một sơ đồ chung cho q trình
oxy hố này.
Rượu etylic dưới tác đụng của enzym oxi hoá khử bị oxi hoá đến
axetaldehit, axetaldehit tiếp tục bị các alhidrogenaza oxi hố đến axit axetic.
Trong q trình này các điện tử được giải phóng đều được chuyển đến các
coenzym của các enzym này như: NADP-> NADPH; Phương trình tổng quát của
quá trình lên men như sau.
CH;CH;OH + O; -> CH;COOH + H;O + 494.4 (K]) hoặc 117 Kcal
Acetobacter là vi khn hiễu khí có khả năng oxy hố các cơ chất trong
điều kiện hiểu khí nhưng lại tạo ra các sản phẩm chưa được oxy hố hồn toàn
như axit axetic, giống như sản phẩm lên men kị khí nên người ta gọi là q trình
oxy hố khơng hồn tồn [1Š]
2.5.Các điều kiện ảnh hưởng đến q trình lên men axetic
2.5.1.Nhiệt độ
Vi khuẩn axetic thuộc nhóm ưu âm nhiệt độ thích hợp là 25 -> 30°C. Nếu

nhiệt độ quá thấp sẽ làm quá trình lên men diễn ra chậm, cong khi nhiệt độ cao
sẽ ức chế hoạt động của vi khuan va đến một mức nảo đó thì quá trình sinh sản

của vi khuẩn sẽ bi đình chỉ làm giảm hiệu suất của quá trình lên men [10,15]
2.5.2. Ảnh hưởng của các hợp chất vô cơ và hữu cơ
2.5.2.1. Sự axit hố dịch lên men

Trong q trình sản xuất giẫm người ta thường đưa vào cơ chất ban đầu

một lượng giẫm nhất định để axit hố mơi trường nhằm mục đích: Ngăn cản sự
phát triển của vi sinh vật có hại và đưa vào địch lên men một lượng vi khuẩn

nhất định.

Độ axit ban đầu có thê dao động từ 2->6% Theo nghiên cứu của Eapen và

Rao 1979 thì hiệu xuất cao nhất đạt được ở độ axit ban đầu của cơ chất là 2%.
Nhưng nếu lượng axit cao hơn sẽ hạn chế sự sinh trưởng của vi khuẩn, làm giảm

khả năng lên men. Nodes cho rằng lượng axit axetic cần hoạt hóa là 2->2.5%[10]

Nguyên Thị Quang

13

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

2.5.2.2. Hàm lượng etylic trong dung địch lên men

Rượu etylic được sử dụng như một cơ chất, hàm lượng có thê thay đối từ 2

-> 10 %, nếu hàm lượng cao hơn sẽ làm giảm năng suất lên men
Đề tránh hiện tượng oxy hoá tiếp tục axit axetic thành CO; và HO cần

một lượng rượu sót trong sản phẩm từ 0.2-> 0.5%. Lượng rượu này có tác duụng
ức chế tổng hợp enzym oxi hoá axit axetic và muỗi axetat [10]
2.5.2.3. Ảnh hưởng của các hợp chất chứa CN, P

Để quá trình lên men xảy ra nhanh trong dung dịch lên men, ngoài
ølucoza, rượu etylic, dung dịch lên men cần được bô sung một số mudi khoảng

như: (NH¿);SO¿, (NH);HPO¿, KH;PO¿, MgSO„¿7H;O, CaHPO¿... tuy theo nhu
cầu cụ thể của từng loại. Ngoài ra cần bồ sung thêm vitamin và chất kích thích
sinh trưởng như pepton, cao nắm mem, cao thịt [7, 8, 9, 10]
2.5.2.4. Ảnh hưởng của oxy
Theo cơ chế của q trình lên men để oxy hố một mol rượu cần một mol
Oz.Trong thực tế nhiều tác giả cho thấy lượng oxy cần thiết phải lớn hơn gấp đơi
lượng oxy lý thuyết. Thựec tế cho thấy, càng thống khí, năng suất càng cao. Vì
vậy q trình lên men kéo đài 3 ->5 tuần, nồng độ giẫm thu được 3 -> 7 % axit
axetic. Trong khi đó phương pháp tuần hoàn nhờ tạo bề mặt tiếp xúc lớn hơn lên
q trình rút xng 5 ->7h. Ở phương pháp chìm thời gian chỉ còn 3->4 ngày

[10]

2.6.Các tiêu chuan ph4n loai Acetobacter
2.6.1. Dia diém noi phan lap

2.6.2. Đặc điểm hình thái

Quan sát hình dạng và cách sắp xếp tế bào, sự hình thành vỏ nhây, tiêm

mao, khả năng di động, màu sắc tế bào khi nhuộm gram, kha nang sinh bao tw.

2.6.3. Đặc điểm nuôi cây

Vi khuẩn Acefobacfer ở trên các mơi trường khác nhau thì phát triển khác
nhau. Trên mơi trường đặc cần lưu ý quan sát trạng thái vết mọc, đặc điểm vết

mọc, màu sắc. Trên môi trường thạch đĩa cần lưu ý hình dạng kích thước khuẩn
lạc [3,14]

Ngun Thị Quang

14

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

2.6.4. Đặc điểm sinh lý
Bao gồm quan hệ của vi khuân với nhiệt độ, pH của môi trường, khả năng

hình thành sắc tố, kị khí hay hiếu khí, khả năng lên men. Cần đi sâu nghiên cứu
một số đặc điểm sinh hoá, phương pháp hiện nay đang được là tính và so sánh tỷ

lệ

A+T

hoặc

G+x*X

G+xX

Nguyên Thị Quang

A+T

trong tế bào hoặc nhân [3]

15

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

PHAN 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Đó là các chủng vi khuẩn øcefobacfer xylinum thuần khiết được phaâ lập từ
màng giấm, nước dừa và dịch hoa quả.
3.2.Hố chất và mơi trường
e

Hoa chat

Các loại đường; Glucoza, Xacaroza, Fructoza

Một số chất vô cơ như: KạẴHPO¿, KH;POx, MgSOx7H;O, (NH¿);SO¿,

(NH¿);HPO¿, CaCO;, NaOH...
Một số chất hữu cơ như: Rượu etylic, axit axetic, pepton, agar...

Dụng cụ và thiết bị: Hộp lồng, ống nghiệm, pIpec, bàn trang thuỷ tính, que
cay, đèn cơn, các loại bình cầu, bình tam giác, nồi hấp,

tủ say, buồng vơ

trùng, cân phân tích, kính hiển vi.

e

Môi trường

MTI dùng cho phân lập
Nước máy

MT2: Tuyển chọn

1000ml

Nước máy

1000ml

CạH¡;O¿

20g

CH:COOH

2ml

Agar

20g

C5H120¢

20g

CaCO;

8g

Agar

20g

(NH,4)2SO,

Sg

Pepton

5g

K;HPO,

5g

K,HPO,

538

(NH¿);HPO¿

2g

(NH¿);HPO¿

2g

2g

Mgs0,7H,0

2g

20

CaCO;

8g

KH;PO¿
MgSOx7H;O

Nguyên Thi Quang

16

K29A-Sinh


Khố luận tốt nghiệp

MT3: Mơi
Ộ
`
trường nghiên
,
cứu

¬
ke
MT4: Thur kha nang tao
`
mảng

Nước máy

1000ml

Nước dừa

1000ml

CạH;¡;O,;

20g

SA(amonisunfat)

0,8%

pepton

38

DAP(amoniphotphodipazic)

0,2%

(NH¿);SO¿

8g

Sacaroza

2%

K,HPO,

Sg

(NH,)2HPO,

2 8

3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phan lap các chúng vi khuan Acetobacter theo phương pháp của

Vinogradski
Đề có các chủng vi khuẩn 4cefobacfer chúng tôi tiến hành phân lập chúng từ
các dịch lên men như: giẫm, nước hoa quả, bia, nước đừa. Nguồn nguyên liệu
này được pha loãng trên môi trường 3. Xác định hàm lượng đường, rượu
etylic, axit axetic trên cơ sở đó chn bị mơi trường có thành phân thích hợp,
có đủ dinh dưỡng, nguồn cacbon, nito, rượu etylic tao diéu kién cho chung

phát triển tốt. Môi trường lên men được pha chế, phân vào các bình tam giác
hoặc bình cầu, khử trùng trong nỗi hấp ở 0,5 at, để nguội, bô sung rượu etylic

đưa vào tủ âm có nhiệt độ 28-30”C trong 7-15 ngày. Vi khuẩn axetic là loại

hiếu khí vì vậy trên mơi trường lỏng bao giờ cũng tạo thành màng, màng đó

chính là tập hợp tế bào vi khn axetic. Tiếp đó chúng tơi thu nhậnvi khuẩn
axetic. Sau khi đã có địch lên men, để có được các chủng vì khuẩn thuần

khiết, đầu tiên sử dụng phương pháp pha loãng pasteur, Việc pha loãng được
thực hiện với dung dịch NaCL 0,5% vô trùng hoặc nước cất, pipet vô trùng,

ống nghiệm vô trùng(10 ống). Cho vào mỗi ống nghiệm 9ml nước cất, dùng
pipet hút 1ml dịch len men cho vào ông nghiệm đã chứa sẵn 9ml nước cất
trên, lắc đều ta được dung địch pha loãng 10”. Từ ống nghiệm này lại hút Iml
địch cho vào ơng nghiệm có sẵn 9ml nước cất thứ 2, khuây đều được dung
Nguyên Thị Quang

17

K29A-Sinh


Khố luận tốt nghiệp

địch pha lỗng có nồng độ 10”. Cứ tiếp tục như vậy hết 10 ống nghiệm ta
được các dung dịch pha loãng từ 10'` đến 10”. Các mức pha loãng này quyết
định số lượng vi sinh vật dự kiến ban đầu có trong mẫu.
Sau khi có dung dịch pha lỗng tiễn hành phân lập trên mơi trường thạch
đĩa(môi trường l1). Ta dùng pIpet hút 1 lượng nhỏ dung dịch pha loãng ở mức
độ nhất định( thường 107- 10”), mở nắp đĩa không quá to, nhỏ 1 giọt dung
dịch pha lỗng vào. Dùng bàn trang vơ trùng, trang một lượt đều khắp mặt
thạch, thực hiện trong tu cây vơ trùng. Tuy nhiên mơi trường thạchđĩa trước
đó phải được khử trùng bằng nồi hấp ở 0,5 at trong thời gian 3 ngày liên tiếp,

sau đó đồ ra hộp lồng để đông lại mới tiến hành phân lập. Các dụng cụ khác
cũng phải được khử trùng bằng nôi hấp sau đó sẵy khơ.
Sau khi phân lập được 4-7 ngày thì trên môi trường xuất hiện những khuẩn
lạc mọc riêng rẽ. Chọn những khuẩn lạc có vịng phân giải lớn đường kính từ
0,8mm trở lên [2,6,I1,12,13]
3.3.2.Tuyền chọn các chúng vỉ khuan Acetobacter thuan khiết
Dùng que cây( đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn côn) gợt lẫy từng khuẩn
lạc riêng rẽ và cây vào các ông thạch nghiêng( môi trường 2). Môi trường này
cũng phải được khử trùng bằng nôi hấp ở 0,5 at thời gian 30 phút trong 3
ngày, sau đó đặ vào các ống nghiệm đặt nghiêng đề nguội, môi trường đông
lại là được. Mỗi ống là một mẫu, mẫu ni được mã hố đưới 1 kí tự riêng đề
vào tủ ấm. Sau 5-6 ngày các chủng vi khuẩn này sẽ phát triển theo đường cấy.
Tiếp theo làm mẫu tiêu bản nhuộm gram và quan sát hình dạng tế bào dưới
kính hiển vi, cách làm như sau:

Bước 1: Rửa sạch lam kính bằng NaOH sau đó rửa lại bằng HCL hoặc
H;ạSO¿. Cuối cùng rửa lại bằng cồn, nước cất và lau khô.

Bước 2: Nhỏ 1 giọt nước vô trùng lên lam kính, dùng que cấy đã khử trùng
lấy 1 ít vi khuẩn trong ơng nghiệm hồ vào giọt nước vơ trùng trên lam kính.
Ho qua trên ngọn lửa đèn cồn đề cô định vết bôi

Đặt lên vết bôi miếng giấy lọc, nhỏ dung dịch tim gentian giữ trong 1-2 phút.
Lẫy miếng giấy lọc ra, nghiêng cho thuốc nhuộm chảy xuống chậu hứng, nhỏ
dung dịch lugon lên vết bôi giữ trong 5 phút. Rửa tiêu bản bằng nước,

Nguyên Thị Quang

18

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

cồn(20s) rửa lại bằng nước. Nhỏ dung địch Fuchsin lên giữ trong 1-2 phút,
rửa nước, hong khô tự nhiên.
Mục đích của phương pháp này là để phân loại vi khuẩn: phân loại vi khuẩn
gram 4m (Gr )và

vi khuẩn gram dương(Gr
`). Nếu sau khi nhuộm kép mà tế

bào bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gr, nếu bắt màu tím là vi khuẩn Gr’. Vi
khuẩn Gr' là do chất nguyên sinh của tế bào được cấu tạo từ 1 loại protein

đặc biệt có chứa muối nucleatmagie.

Muối này có khả năng tạo với tím

gentian và lugon thành một phức chất bền khó bị rửa trơi bởi cồn nên khi
quan sát tế bào vi khuẩn Gr` bắt màu tím( màu của gentian). Trong khi đó

những vi khnGr” khơng có khả năng tạo phức chất bên với thuốc nhuộm
gentian và lugon nên để bị rửa trơi bởi cồn. Do đó khi nhỏ fuchsin lên tế bào

vi khuân Gr sẽ bắt màu hồng( màu của fuchsin)

Có thể sơ tuyến các chủng vi khuân 4cefobacfer bằng cách thử khả năng oxi
hoá etanol trên 2 môi trường A và B

Môi trường A: Dịch chiết nằm men 3%, CaCO; 2%, agar 2%, rượu etylic
15%- 2ml. Khi nhân giống vi khuân axetic nếu là Giwconobacfer sẽ tạo một

vòng sáng xung quanh khuẩn lạc, nếu là 4cefobacfer vịng sáng rõ hơn nhiều
và có một lớp cặn đục ở viền khn lạc hướng về phía vịng sảng

Mơi trường B: Dịch chiết nắm men 3%, agar 2%, xanh lục Bromclesol Iml
của dung dịch 2,2%, rượu etylic 15%- Iml.

Khi cấy giống vi khuẩn axetic nếu là Giuconobacter nó sẽ làm cho môi

trường biến thành màu vàng. Nếu là 4cefobacter cũng làm biến đổi mơi
trường thành màu vàng nhưng có một váng màu xanh lơ do quả trình ox1 hố
các axIt[ 12]
Để giữ giống cần tiến hành cây chuyền 2 tháng 1 lần từ ống thạch nghiêng

này sang ông thạch nghiêng khác [11, 12, 13]
3.3.3. Phương pháp tuyển

chọn các chúng vỉ khuẩn A. xylinum cho mang

day
Sau khi đã tuyên chọn được các chủng 4cefobacter thuần khiết, chúng tôi tiễn
hanh tuyén chon cac ching A. xylinum cho màng dày đề nghiên cứu tiếp,
phuong phap tuyén chon nhu sau:

Nguyên Thi Quang

19

K29A-Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Cay các chung vi khuẩn Acetobacter thuan khiét dugc lua chon bang 2
phương pháp trên ở các ống thạch nghiêng sang môi trường nước dừa( môi
trương 4), sau đó:
-

Quan sat qua trình hình thành màng và đo độ dày màng khi màng đạt độ

dày nhất định .
-

-

Quan sat đặc điểm màng tạo thành trên môi trường lỏng, dày hay mỏng,
nhăn hay trơn, dễ vỡ hay đai, có ăn thành bình hay khơng.

Quan sat hinh dang tế bào trên kính hiển vi

- _ Xác định hàm lượng axit axetic tạo thành của mỗi mẫu vi khuẩn A.

xylinum
-

Quan sat méi trudng nudi cay duc hay trong.

- - Nghiên cứu đặc tính sinh lí của các chủng đã chọn được.

3.3.4. Phương pháp xác định số lượng tế bào của các chủng vi khuẩn
Acetobacter
Để xác định số lượng tế bào vi khuẩn trên môi trường cây nhanh, đơn giản,
chúnh xắct dùng phương pháp đếm số lượng tế bào trên buồng dém hong cầu.

Dụng cụ dùng để đếm là buồng đếm Goriaep. Đó là một phiến kính dày có các
đường kẻ ở giữa đề chia thành 400 hình vngcó điện tích tổng cộng là 1400m”
Cách tiến hành: Lắc đều canh trường, dùng pipet chia độ pha loãng canh trường
ở các mức độ 10”- 10” tuỳ theo giai đoạn phát triển của vi khn trong mơi
trường mà pha lỗng ở độ pha lỗng khác nhau. Dùng pIpet vô trùng nhỏ l giọt

vào khe hở giữa 2 lưới đếm và lamen

-Cách đếm: Đếm trong 5 ơ lớn chéo nhau hình dẫu (x). Đếm 4 ô ở 4 góc và 1 ô ở

giữa. Để đảm bảo độ chính xác đếm lặp lại 3-4 lần
Cách tính số lượng tế bào : X=a.50xf
X: Số lượng tế bào trong 1ml canh trường

A: Số tế bào trung bình có trong 1 6
F: Hệ số pha lỗng
Sau đó xử lí số liệu bằng thống kê tốn học

3.3.5.Xứ lí số liệu bằng thống kê tốn học
3.3.5.1: Tính giá trị trung bình cộng các chỉ số

Nguyên Thị Quang

20

K29A-Sinh