Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2

Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật


SV: guyễn Duy Khanh
1
PHẦ MỞ ĐẦU
1. LÝ DO CHỌ ĐỀ TÀI
Màng sinh học ( Bacterial cellulose; Biocellulose; BC) có cấu trúc và đặc
tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với
nhau bằng liên kết β-1,4 glucorit) cellulose vi khuNn khác với cellulose thực
vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như: ligin, hemicellulose,
peptin và sáp nến…do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai,
bề chắc.[17]
Trên thế giới màng Bacterial cellulose đã được ứng dụng rất nhiều trong các
lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình
xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào,dùng làm
chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ
chất trong sinh học, thực phNm hay thay thế thực phNm. Đặc biệt trong lĩnh
vực y học, màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá
trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị các bệnh tim
mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người.[13]
Ở Việt Nam, vic nghiên cu và ng dng màng BC còn  mc  khiêm
tn, các nghiên cu ng dng mi ch dng li bưc u nghiên cu. Các kt
qu ng dng ca màng BC hu như mi ch dng li  iu kin thí nghim.
Trong nhng năm gn ây phòng thí nghim Thc vt - Vi sinh Trưng i
hc Sư phm Hà Ni 2 phân lp tuyn chn ưc chng A. xylinum BHN
2
có
kh năng to màng BC và nhng nghiên cu bưc u cho thy màng BC t
chng A. xylinum BHN
2

có kh năng ng dng cho tr bng cho th là cơ s
 to ra màng tr bng cho ngưi.


Khóa lun tt nghip Chuyên ngành: Vi sinh vt


SV: guyễn Duy Khanh
2
Vi mc ích tìm hiu din tích và th tích liên quan n  thoáng khí trong
quá trình to màng BC trong iu kin nuôi tĩnh chúng tôi chn  tài:
“ ghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi
khun Acetobacter xylinum BH
2
”
2. Mục tiêu và ý nghĩa khoa học của đề tài
- Nghiên cu nh hưng ca t l S/V ti kh năng to màng BC t vi khuNn
A. xylinum BHN
2
phân lp t ngun nguyên liu t phòng thí nghim.
- Kho sát kh năng to màng BC ca vi khuNn A. xylinum BHN
2
.
- B sung thêm các kin thc v vi khuNn A.xylinum nhm ng dng to
màng BC ưc tt nht.
3. ội dung nghiên cứu
- Nghiên cu nh hưng ca t l S/V ti kh năng to màng ca vi khuNn
A. xylinum BHN
2
.

- Nghiên cu nh hưng ca thi gian nuôi cy n t l S/V thích hp nht
n kh năng to màng BC ca chng A. xylinum BHN
2
.
- Nghiên cu nh hưng ca nhit  nuôi cy n t l S/V thích hp nht
n kh năng to màng BC ca chng A. xylinum BHN
2
.
- Nghiên cu mt s tính cht vt lý ca màng BC ưc to ra t chng
A. xylinum BHN
2
t ó nh hưng cho ng dng trong tr bng.





Khóa lun tt nghip Chuyên ngành: Vi sinh vt


SV: guyễn Duy Khanh
3
PHẦ ỘI DUG
CHƯƠG 1. TỔG QUA TÀI LIỆU
1.1. Đại cương về vi khun A. Xylinum và màng BC
1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của A. Xylinum
Theo h thng phân loi ca nhà khoa hc Bergey thì A.xylinum thuc
ging Acetobacter, h Pseudomonadaceae, b Pseudomonadales, lp
Schizommycetes. Vic phân loi vi khuNn này còn nhiu tranh cãi, có mt s
tác gi coi A. xylinum như mt loài ph ca A. Aceti.[21]

A. xylinum có dng hình que, thng hay hơi cong, có th di ng hay
không di ng, không sinh bào t. Chúng là vi khuNn Gram âm, nhưng c
im nhum Gram có th thay i do t bào già i hay do iu kin môi
trưng. Chúng có th ng riêng l hay xp thành chui.

Hình 1: Kt qu nhum Gram ca A. xylinum BHN
2

KhuNn lc ca A.xylinum có kích thưc ln (ưng kính khuNn lc t
2-5mm), tròn, b mt nhy và trơn bóng, phn gia khuNn lc li lên, dày hơn
và sm màu hơn các phn xung quanh, rìa mép khuNn lc nhn.[18]

Khóa lun tt nghip Chuyên ngành: Vi sinh vt


SV: guyễn Duy Khanh
4
1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của A. Xylinum
Vi khuNn A. xylinum phát trin  nhit  25-35
0
C, pH = 4-6. Nhit 
và pH ti ưu tùy thuc vào ging.  37
0
C, t bào s suy thoái hoàn toàn ngay
c trong môi trưng ti ưu.
A. xylinum có kh năng chu ưc pH thp, vì th thưng b sung thêm
acid acetic vào môi trưng nuôi cy  hn ch s nhim khuNn l.[12]
Các c im sinh hoá dùng nh danh ca A. xylinum bao gm: Oxy
hoá ethanol thành acid acetic, CO
2

, H
2
O; Phn ng catalase dương tính;
Không tăng trưng trên môi trưng Hoyer; Chuyn hoá glucose thành acid;
Chuyn hoá glycerol thành dihydroxyaceton; Không sinh sc t nâu; Tng
hp cellulose.[12]
1.1.3. Màng BC của vi khun A. xylinum
Trên môi trưng dch th, trong iu kin nuôi cy tĩnh, vi khuNn A. xylinum
hình thành nên mt lp màng có bn cht là cellulose, ưc tp hp bi nhng
bó si cellulose liên kt vi nhau ưc gi là màng Bacterial cellulose hay
màng BC.
* Cu trúc ca màng Bacterial cellulose:
Cellulose ưc cu to bi chui polyme β -1,4 glucopynanose mch
thng. Có thành phn hoá hc ng nht vi cellulose thc vt, nhưng cu
trúc và c tính li khác xa nhau.
Chui polyme β -1,4 glucopynanose mi hình thành liên kt vi nhau to
thành si nh (subfibril) có kích thưc 1,5nm. Nhng si nh kt tinh to si
ln hơn- si vĩ mô ( microfibril) ( Tonas and Farah, 1998), nhng si này kt
Khóa lun tt nghip Chuyên ngành: Vi sinh vt


SV: guyễn Duy Khanh
5
hp vi nhau to thành bó và cui cùng to di ribbon (Yamanaka et.al
2000). Di ribbon có chiu dài trong khong t 1-9nm. Nhng di ribbon
ưc kéo ra t t bào này s liên kt vi nhng di ribbon ca t bào khác
bng liên kt hiro hoc lc vandesvan to thành cu trúc mng lưi hay mt
lp màng mng trên b mt môi trưng nuôi cy.[15]
Do di ribbon ca màng BC có ưng kính nh hơn ca PC, ch s kt
tinh cao (khong 60%),  polyme hoá ln nên màng BC có  bn cơ hc

cao, kh năng hp th nưc ln.
Bacterial cellulose sn xut bi vi khuNn A. xylinum ưc nghiên cu u
tiên bi Brown năm 1886. Nó ã thu hút s chú ý t na sau ca th k XX,
nhng nghiên cu tp trung sâu vào cơ ch tng hp, cũng như cu trúc và
c tính ca cellulose.[22]
1.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC
từ vi khun A.xylinum
1.2.1.Ảnh hưởng hàm lượng glucose
Ngun cacbon có nh hưng mnh m ti sinh trưng cũng như tng
hp cellulose ca Acetobacter xylinum. Theo kt qu nghiên cu ca Thc s
Nguyn Th Nguyt trên chng Acetobacter xylinum HN5 thì ngun cacbon
có nh hưng ln nht n s hình thành màng ca Acetobacter xylinum là
glucose.  to màng phc v mc ích nghiên cu, Thc s Trn Như
Quỳnh ã quyt nh s dng hàm lưng glucose 20 g/l cho các nghiên cu
trên chng A. xylinum BHN
2
.[14]
1.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (H
4
)
2
SO
4

Khóa lun tt nghip Chuyên ngành: Vi sinh vt


SV: guyễn Duy Khanh
6
Vi sinh vt và tt c các cơ th sng khác u cn nitơ trong quá trình sng 

xây dng t bào. Nhân t (NH
4
)
2
SO
4
là mt trong nhng nhân t có nh
hưng ln n s phát trin ca Acetobacter xylinum, là nhân t quan trng
cung cp ngun nitơ cho t bào phát trin. Vì vy, nu ngun nitơ trong môi
trưng quá ít s nh hưng n hot ng sng ca t bào, t ó nh hưng
n quá trình to màng BC.  nng  2,0 g/l môi trưng cho hiu sut màng
BC cao nht.[14]
1.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO
4
.7H
2
O
MgSO
4
 nng  2 g/l cho sn lưng BC cao nht, theo PGS-TS inh Th
Kim Nhung, magie là nhân t tham gia vào vic to thành các enzim, nhng
enzim này xúc tác cho các phn ng chuyn hóa các cht trong quá trình hình
thành màng BC.[14]
1.2.4. Ảnh hưởng của hàm lượng KH
2
PO
4
Phospho ngoài vai trò tham gia cu trúc các thành phn ca t bào, nó còn có
vai trò ht sc quan trng trong tng hp cellulose  vi khuNn Acetobacter
xylinum ( Ross et.al, 1991). S dng nng  2g/l KH

2
PO
4
s cho sn lưng
BC cao nht.[14]
1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ vi
khun A.xylinum
1.3.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men và hàm lượng giống.
Lưng ging và thi gian nuôi cy là 2 yu t quan trng nh hưng
trong quá trình lên men cellulose vi khuNn.
Khóa lun tt nghip Chuyên ngành: Vi sinh vt


SV: guyễn Duy Khanh
7
 dai ca màng ph thuc rt nhiu vào s kt tinh ca màng BC, 
kt tinh ca màng li chu nh hưng ln v thi gian lên men thu nhn màng.
Vì nu thu sm  polymer hoá và kt tinh chưa cao s nh hưng n tính
cht cơ hc ca màng BC. Ngưc li nu  lâu trong môi trưng nghèo dinh
dưng màng chìm xung, vi khuNn s tin hành phân hu thu năng lưng
cung cp cho hot ng sng ca t bào.
i vi loài Actobacte xylinum, trong quá trình lên men, phn lơn các
t bào liên kt vi phân t glucose  hình thành lp màng BC trên b mt
nuôi cy. Lp màng này ngăn cn s tip xúc ca oxy vi môi trưng dich
th. Vì vy vic nghiên cu xác nh ưc lưng ging b sung ban u cho
phù hp có ý nghĩa quan trng  thu ưc màng BC vi năng sut cao nht.
Sn lưng cellulose thu ưc trong quá trình lên men u tăng theo t l
ging và thi gian lên men.[14]
1.3.2. Độ thông khí
Vi khuNn A. xylinum là vi khuNn hiu khí bt buc. iu kin tiên

quyt khi lên men to sinh khi là iu kin thông khí. Trong cơ ch ca quá
trình lên men, lưng oxy cn cung cp là tương i ln. Trong thc t 
thông khí quyt nh năng sut BC. Vì vy hình thc sc khí cung cp oxy và
s dng cánh khuy trong lên men ng là phù hp cho sn lưng BC cao
trong lên men chìm. Lên men tĩnh cn s dng dng c có b mt rng,
thoáng và lp môi trưng mng.[19]
Wanatabe và Yamanaka (1995) phát hin ra áp sut oxy cũng nh
hưng n kh năng hình thành cellulose vi khuNn. Cellulose hình thành dưi
áp sut oxy thp có s phân nhánh nhiu hơn so vi trong iu kin áp sut
Khóa lun tt nghip Chuyên ngành: Vi sinh vt


SV: guyễn Duy Khanh
8
oxy cao. Do ó nh hưng trc tip n hình dng và  chu lc ca lp
màng BC.[20]
1.3.3. hiệt độ
Nhit  thích hp vi vi khuNn A. xylinum t 25-30
0
C.  nhit  thp
quá trình lên men xy ra chm.  nhit  cao s c ch hot ng và n
mc nào ó s ình ch s sinh sn ca t bào và hiu sut lên men s
gim.[21]
1.3.4. Độ PH
Vi khuNn A. xylinum phát trin thun li trên môi trưng có pH thp.
Do ó trong môi trưng nuôi cy cn b sung thêm acid acetic nhm acid hoá
môi trưng. ng thi acid acetic còn có tác dng sát khuNn, giúp ngăn chn
s phát trin ca vi sinh vt có hi.[21]
1.4. Ứng dụng của màng BC
1.4.1. Ứng dụng của BC trong một số lĩnh vực

Màng BC có nhiu li im vưt tri như:  tinh sch,  kt tinh, 
bn sc căng,  àn hi,  co giãn, kh năng gi hình dng ban u, kh
năng gi nưc và hút nưc cao, b mt tip xúc ln hơn bt g thưng, b
dày ca vi si dưi 100nm, b phân hu sinh hc, có tính tương thích sinh
hc, tính trơ chuyn hoá, không c và không gây d ng. Màng BC có các
ng dng a dng trong nhiu lãnh vc như y hc, thc phNm, m phNm, bo
v môi trưng, công nghip.[22]
1.4.2. Ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng
Bng là mt tai nn thưng gp trong lao ng và sinh hot hng ngày.
Khóa lun tt nghip Chuyên ngành: Vi sinh vt


SV: guyễn Duy Khanh
9
Ngoài tn thương da, trưng hp bng nng còn gây ri lon ni tng,  li
di chng nng n kh năng vn ng, thNm m và sc khe ca ngưi bnh.
 Vit Nam, ch riêng Vin Bng Quc gia (Hà Ni) mi năm tip nhn
khong hơn 400 ca bng. Các tác nhân gây bng ch yu là bng nưc sôi.
Ngoài ra các tác nhân khác là xăng, du, nưc canh nóng, acid, vôi tôi
nóng.[6]
Vic iu tr ti ch vt thương bng là mt công tác có ý nghĩa c
bit quan
trng. i vi vt bng nông iu tr ti ch vt bng có tác dng
làm gim au
ngăn chn các bin chng nhim khuNn, to iu kin tt cho
quá trình tái to
phc hi. i vi nhng trưng hp bng sâu, iu tr ti
ch có tác dng ln
trong vic iu tr d phòng các bin chng ca nhim
khuNn ti ch, không  nhim khuNn toàn thân, ngăn nga s mt nưc và

dch trong cơ th (là nguy cơ
dn n t vong cao), loi b nhanh các t chc
hoi t, to iu kin tt cho quá trình hình thành mô ht và biu mô hóa hình
thành so, chuNn b tt nn ghép da trong phu thut.[6]
1.5. Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt am và trên thế giới
1.5.1. Trên thế giới
Nghiên cu v màng BC t vi khuNn A.xylinum và nhng ng dng ca
nó ã ưc tin hành  nhiu nưc trên th gii. Tác gi Brown, 1989, dùng
màng BC làm môi trưng phân tách cho quá trình x lý nưc, dùng làm cht
mang c bit cho các pin và năng lưng cho t bào. Brown (1989), Jonas và
Farad, 1998, dùng màng như là mt cht  bin i  nht,  làm ra các
si truyn quang, làm môi trưng cơ cht trong sinh hc, thc phNm hoc
thay th thc phNm. c bit Brown (1989) ã dùng BC làm vi c bit,
Nogiet và cs (2005), Jonas và Farad, 1998, Soloknicki và cng s (2006)
Khóa lun tt nghip Chuyên ngành: Vi sinh vt


SV: guyễn Duy Khanh
10
dùng màng BC  sn xut giy cht lưng cao, làm cơ cht  c nh
protêin hay cho sc kí.[5]
Tuy nhiên, nhng ng dng thưng thy trên th gii ca màng BC là
dùng trong ngành dưc phNm và m phNm. Các tác gi: Hamlyn và cs (1997),
Cienchanska (2004), Legeza và cs (2004) Wan và Millon (2005), Czaja và cs,
(2006) s dng màng BC p lên các vt thương h, vt bng ã thu ưc kt
qu tt. c bit tác gi Wan (Canada) ã ưng ăng kí bn quyn v làm
màng BC t A.xylinum dùng tr bng. Các tác gi Jonas và Farad (1998),
Czaja và cs (2006) ã dùng màng BC làm da nhân to, làm mt n dưng da
cho ph n.[5]
1.5.2. Ở Việt am

Ti Vit Nam tình hình iu tr bng trong nưc ngày càng ưc ci tin.
Công tác iu tr bng bao gm vic cy ghép, phu thut, to ra mt s màng
tr
bng như màng i, trung bì da ln, da ch, màng chitosan, s dng các
cht có
ngun gc t t nhiên có tác dng iu tr bng …
T năm 2000
nhóm nghiên cu ca tác gi Nguyn Văn Thanh và cng s ã có mt s
công trình nghiên cu v màng BC t A. xylinum và bưc u nghiên cu v
các c tính màng BC thu ưc là cơ s  ch to màng sinh hc dùng trong
tr bng  Vit Nam.[9]
iu tr bng bng các thuc có ngun gc t t nhiên ã ưc áp dng
t rt
lâu và ph bin  tt c các nưc. Các thuc này có sn trong thiên
nhiên và có
nhiu c tính tt cho iu tr bng cũng như cha các vt
thương, vt loét…
Màng BC có nhiu ưu im  tr thành cht mang các hp cht có
ngun gc t thiên nhiên s dng trong iu tr bng.[14]
Khóa lun tt nghip Chuyên ngành: Vi sinh vt


SV: guyễn Duy Khanh
11
1.6. Một số công trình nghiên cứu có liên quan đến đề tài
Lun văn thc sĩ vi sinh hc 2009
:
“ghiên cứu một số đặc tính vật lý của
màng BC từ Acetobacter xylinum, ứng dụng trong trị bỏng” ca Trn như
Quỳnh- HSP Hà Ni ã làm ưc mt s vn  sau:

- Nghiên cu mt s c tính sinh lý, sinh hóa ca chng vi khuNn A.xylinum
BHN
2
.
- Nghiên cu nh hưng ca mt s yu t n quá trình lên men to màng
BC ca chng A.xylinum BHN
2
, qua ó la chn ưc môi trưng thích hp
cho chng A.xylinum BHN
2
lên men tĩnh.
+ iu kin nuôi cy: hàm lưng ging b sung ban u cho lên men to
màng là 10% th tích lên men, vi PH ban u ca môi trưng lên men t 4,5-
5,5.
+ Môi trưng dinh dưng: hàm lưng ưng glucose 20g/l; (NH
4
)
2
SO
4
: 2
g/l; KH
2
PO
4
: 2 g/l; MgSO
4
.7H
2
O: 2 g/l.

- Nghiên cu ưc t l din tích b mt và th tích lên men cho chng
A.xylinum BHN
2
to màng tt nht.
- X lý màng BC ng dng trong iu tr bng và kho sát các c tính ca
màng: kh năng kháng khuNn cao,  bn cơ hc 3,62 kN/m,  thu khí
120ml/phút, kh năng hút nưc 6,82g/100cm
2
/24 gi; màng không có triu
chng kích ng.
- Màng BC tNm du mù u và kem ngh làm lành vt thương sau 19 ngày iu
tr.

Khóa lun tt nghip Chuyên ngành: Vi sinh vt


SV: guyễn Duy Khanh
12
CHƯƠG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠG PHÁP GHIÊ CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Vật liệu chính
i tưng nghiên cu là các chng A. xylinum BHN
2
ưc phòng thí
nghim Thc vt - Vi Sinh Khoa sinh - KTNN Trưng i hc Sư pham Hà
Ni 2 cung cp.
2.1.2. Hoá chất và thiết bị
2.1.2.1. Hoá chất
- Ngun Cacbon: Rưu etylic, Glucose, Sacrose, Manitol, Lactose, Fructose,
Dihyroxyaceton, Axit acetic.

- Ngun Nitơ: Cao nm men, Pepton, (NH
4
)
2
SO
4

- Các mui khoáng: KH
4
PO
4
, CaCO
3
, MgSO
4
.7H
2
O, NaOH, CuSO
4
.
- Các cht kích thích sinh trưng: Cao nm men, cao ngô.
- Thuc th: Dung dch Fehling, dung dch Blue Bromophenol.
- Thuc nhum: Tím gentian, Fucshin, Lugol.
- Ngoài ra còn s dng : Các loi bia, nưc da, các loi nưc chit qu.
2.1.2.2. Thiết bị
T m, t sy Binder (c).
Ni hp Tommy (Nht).
Máy so màu UV – vis ( Nht).
Máy o pH (MP 200R - Thy S).
Máy lc Orbital Shakergallenkump (Anh).

Máy li tâm Sorvall (M).
Micropipet Jinson (Pháp), các loi t 20µl – 10ml.