quy trình sản xuất pectinase và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm (nước quả)

S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

MỤC LỤC

1


S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

LỜI MỞ ĐẦU
Từ lâu enzyme đã được con người sử dụng một cách phổ biến. Ngày nay, cùng với sự
phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học , các chế phẩm enzyme được sản xuất ra ngày càng
nhiều và được sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực như: công nghệ thực phẩm, nông nghiệp, chăn
nuôi, y tế,… Vì thế đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, các sản phẩm tạo ra nhiều hơn, chi
phí giá thành giảm, chất lượng sản phẩm tăng, giảm tác động xấu đến môi trường. Cho thấy
enzym ngày càng đóng vai trò quan trọng.
Enzym pectinase là một nhóm enzym được ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp
thực phẩm, đặc biệt có thể kể đến việc sản xuất các loại nước quả như táo, vả, nho, dâu tây, anh
đào, phúc bồn tử... Dạng enzym cố định được sử dụng rất hiệu quả vì có nhiều ưu điểm hơn hẳn
dạng enzym thông thường (enzyme hòa tan).
Để tìm hiểu rõ hơn về ứng dụng trong sản xuất nước quả của enzym pectinase cũng như
bổ sung thêm kiếm thức trong chương trình học bộ môn Ứng dụng CNSH trong CNTP nhóm 10
chúng em đã tiến hành thu thập thông tin tài liệu để hoàn thành bài báo cáo này với đề tài “QUY
TRÌNH SẢN XUẤT PECTINASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
(NƯỚC QUẢ)”. Trong quá trình thực hiện đề tài với hạn chế về mặt thời gian cũng như kiến
thức chuyên môn không tránh khỏi những sai sót, mong cô thông cảm và cho lời khuyên để
nhóm có thể tích lũy thêm kinh nghiệm với những đề tài nghiên cứu sau này. Xin chân thành
cảm ơn cô!

2

S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

1. Tổng quan
2.1.

Định nghĩa enzyme pectinase

Pectin là cơ chất của enzyme pectinase. Pectin là polysaccharide dị thể. Về bản chất hóa
học, pectin là polygalacturonic nó phân hóa rộng rãi trong các mô thực vật, hòa tan trong dịch
thực vật. Có nhiều trong các loại rau quả, củ, đặc biệt là trong cùi trắng của bưởi, cam, chanh.

Cùi trắng bưởi cam chanh có chứa nhiều pectinase
Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng, mạch chính của phân tử do các acid
galacturonic kết hợp với nhau bằng liên kết α-1,4-glucoside tạo nên. Petin khác với các
carbonhydrate thông thường vì thành phần chủ yếu của nó không phải là đường đơn mà là một
acid còn tên gọi là acid galacturonic.
Pectin gồm một mạch chính có thay đổi nhưng tỷ lệ lớn các đơn vị acid D-galacturonic
đã được methyl hóa và được gọi là acid pectic (acid polygalacturonic).

3


S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

Hai phân tử D-galacturonic acid nối với nhau bằng liên kết glucoside
Pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy các polymer pectin.Sản phẩm tạo thành là acid
galacturonic, galactose, arabinose, methanol…Là nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi sau
protease và amylase.
Enzyme pectinase có ở thực vật bậc cao và sản phẩm của VSV.Ở thực vật bậc cao có

nhiều trong lá, khoai tây, chanh, trong các loại quả thường có enzyme pectinesterase. Trong tự
nhiên có nhiều trong nấm mốc, vi khuẩn phân giải pectin.
Sự phân hủy của pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Vì vậy enzyme
pectinase có vai trò rất quan trọng trong quá trình chế biến rau quả và bảo quản trái cây. Việc
kiểm soát enzyme này trong cà chua chuyển gen là một ví dụ điển hình trong ứng dụng RNA
chuyển gen đối mã để thao tác biểu hiện gen.
Enzyme pectinase được ứng dụng nhiều trong chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng
làm trong nước quả.( Việc kiểm soát cũng có thể phụ thuộc vào độ nhớt của sản phẩm).

2.2.

Cấu tạo enzyme pectinase

Pectin là polysaccharide dị thể, chủ yếu là một mạch chính gồm các gốc acid –α–D–1,4
galacturonic, liên kết với nhau bằng liên kết 1,4–O glucozic còn gọi là acid polygalacturonic hay
acid pectic. Pectine hòa tan trong tự nhiên là ester metylic của acid pectic.
4


S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

Trong thực tế không phải tất cả các nhóm –COOH ở C6 của đường galactose cũng bị
metyl hóa (tạo ester metylic), mà đôi khi một số nhóm –COOH bị decacboxyl hóa (khử CO2),
một số nhóm –COOH thay thế -H bằng kim loại, cũng có lúc giữ nguyên dạng –COO. Người ta
cho rằng protopectine là hợp chất giữa pectine và araban, galactose hay tinh bột. Trọng lượng
phân tử từ 20.000 – 200.000 đvC.
2.3.

Trung tâm hoạt động của enzyme pectinase

Chứa vùng có 8-10 vòng xoắn về phía phải đối với hai vòng tạo thành khe liên kết với cơ
chất.
Trung tâm hoạt động của enzyme này chứa các acid amin aspartate và lysine. Có một
Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của enzyme. Nhiệt
độ tối ưu của enzyme pectinase khoảng từ 45-550C.
2.4.

Cơ chế tác động của enzyme pectinase

Trong chế biến nước quả, người ta sử dụng các chế phẩm enzym nhằm hai mục
đích cơ bản.
•

Phá vỡ thành tế bào thức vật nhằm nâng cao hiệu suất thu nước quả.

•

Làm trong và ổn định chất lượng nước.

5


S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

Enzym pectinase làm trong nước quả
Phá vỡ thành tế bào. Tế bào thực vật được cấu tạo bằng vỏ tế bào (thành tế
bào). Vỏ tế bào như một lớp thành bảo vệ rất hữu hiệu và tạo hình cho tế bào. Ở vỏ tế
bào thực vật có nhiều chất pectin, các chất pectin được xem như chất ciment gắn các tế
bào với nhau. Phá vỡ sự gắn kết này sẽ tạo điều kiện cho các vật chất trong tế bào
thoát ra khỏi tế bào. Các chế phẩm enzym có chứa không chỉ pectinase mà còn chứa

các enzym trong nhóm cellulase. Các loại enzym này sẽ làm phá vỡ thành tế bào và
giúp quá trình thu nhận dịch tế bào tốt hơn.
Làm trong nước quả. Nước quả sau khi được tách khỏi tế bào thường chứa
nhiều chất khác nhau. Trong đó chất pectin chiếm lượng đáng kể và pectin thường gây
hiện tượng độ nhớt cao và gây đục nước quả. Hàm lượng pectin ở một số loại quả được

6


S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

trình bày ở bảng sau
Bảng 6:Hàm lượng pectin của một số loại quả và dịch quả

Các chất protein có trong bào tương, màng tế bào và gian bào. Pectin chứa
polygalacturonic acid, araban và galactan. Trong đó lượng polygalacturonic acid
chiếm tới 40-60%. Khi bị thủy phân, pectin tách thành hai phần:
•

Phần trung tính – phức chất galactanoraban

•

Phần acid – acid pectic
Trong bào tương, pectin nằm ở dạng hòa tan. Trong màng tế bào và gian bào,

chúng nằm ở dạng không hòa tan gọi là protopectin. Protopectin ở màng gian bào có
chứa lượng kim loại k

há lớn và một lượng nhóm metocyl đủ để làm protopectin bền

vững. Còn protopectin ở màng tế bào chứa một lượng kim loại không nhiều, có độ
metocyl hóa cao. Vì thế, tế bào thực vật có khả năng trương nở tốt.
Nếu enzym tham gia phân giải pectin ở gian bào sẽ làm các tế bào khó liên kết
với nhau và thịt quả dễ dàng bị mềm ra. Pectin thường có mối liên kết hydro và liên

7


S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

kết nguyên tử yếu hơn so với cellulose. Tham gia phân hủy pectin gồm nhiều loại
enzym.
Bảng 7: Các loại enzym pectinase

2.5.

Lợi ích của việc sử dụng enzyme pectinase

 Hạn chế trong sử dụng enzyme pectinase

Nước quả được sử dụng enzym có nhiều ưu điểm, tuy nhiên việc sử dụng enzyme cũng
có những nhược điểm như xảy ra những biến đổi bất lợi về VSV.
Nếu xử lý trong thời gian ngắn, quá trình oxy hóa và sự nhiễm VSV không thành vấn đề
lớn. Nhưng nếu xử enzym trong thời gian dài sẽ xảy ra quá trình oxy hoá và sự nhiễm VSV.
Người ta ngăn ngừa quá trình oxy hoá trong nước quả bằng một trong ba cách sau:
• Cho ascorbic acid
• Cho anhydric sulfur
• Cho enzym glucose oxidase.

8


S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

Trước khi dùng những chất chống oxy hóa trên, người ta phải đun nóng dịch quả.
Khi đun nóng dịch quả, các enzym có trong nước quả sẽ bị ức chế. Theo đó, nước quả
được ly tâm để làm sạch cơ học, sau đó nước quả được đun nóng tới 80OC và sau đó hạ nhiệt
đến nhiệt độ tối ưu của họat động enzym. Người ta thường cho lượng ascorbic acid tới
5mg/100g nước quả để hạn chế quá trình oxy hoá.
Để hạn chế sự phát triển của VSV trong tường hợp sử dụng enzym để xử lý nước quả,
người ta thường áp dụng những biện pháp sau.
Sử dụng sorbic acid, ascorbic acid, benzoate natri. Sorbic acid thường được sử dụng
trong nước quả với liều lượng là 0,03%. Acid này hoạt động ở pH rất rộng (pH 3,9-9,2). Sorbic
acid ức chế sự phát triển của nấm men và nấm sợi, không làm thay đổi vị và mùi của sản phẩm.
Benzoate natri thường được sử dụng trong nước quả với liều lượng là 0,15%.
Sử dụng anhydric sulfur. Người ta thường sử dụng anhydric sunfurơ để bảo quản nước
quả bán thành phẩm. Chất này vừa có khả năng tiêu diệt VSV, vừa có khả năng chống oxy hoá.
Khi cho chất anhydric sunfurơ vào dịch quả, chúng dễ dàng bị oxy hóa.
Khi đó lượng oxy có trong dịch quả ít dần và đến mức triệt tiêu, gây ra trạng thái thế hiệu
oxy hóa-khử trong dịch quả thay đổi và VSV sẽ bị ức chế hoặc tiêu diệt. Tuy nhiên cần phải lưu
ý rằng, nếu lượng anhydric sunfurơ quá nhiều sẽ dẫn đến ức chế các hoạt động của enzym. Các
thí nghiệm cho thấy, nếu hàm lượng anhydric sulfur 0,1% làm giảm hoạt tính của chế phẩm
enzym, nếu 0,5% thì enzym hoàn toàn bị ức chế.
Xử lý nhiệt. Người ta có thể đun nóng dịch quả để bảo quản nước quả. Tuy nhiên, việc
đun nóng dịch quả không thể quá cao vì chính nhiệt độ sẽ làm thay đổi tính chất cảm quan,
thành phần hóa học và hoạt tính enzym.
Đa số enzym phân giải pectin bị mất hoạt tính ở 70 0C và chúng hoạt động mạnh ở 45500C. Tuy nhiên, ở nước quả lên men, người ta sử dụng enzym để xử lý nước quả ngay ở nhiệt
độ thường (trùng với nhiệt độ lên men).

9


S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10
 Hiệu qủa trong sử dụng enzyme pectinase

Đã có nhiều nghiên cứu và kết quả áp dụng trong sản xuất nước quả và rượu vang cho
thấy khi sử dụng enzym pectinase cho hiệu suất nước quả và chất lượng rượu vang rất cao.
Khi tiến hành ứng dụng enzym trong sản xuất nước quả và rượu vang, người ta đặc biệt
quan tâm đến hai yếu tố có tính chất quyết định đến hiệu quả enzym.
•
•

Nguyên liệu
Khả năng xay, nghiền và làm nhỏ nguyên liệu
Nguyên liệu. Không phải tất cả các loại quả đều cho hiệu suất cao khi xử lý enzym. Khi

sử dụng enzym trong chế biến nước quả và rượu vang người ta phải đưa ra độ chín kỹ thuật cho
phù hợp. Khái niệm này hoàn toàn khác với khái niệm độ chín kỹ thuật khi trong công nghệ
người ta không sử dụng enzym. Độ chín kỹ thuật để sản xuất nước quả là giai đoạn chín của
quả, đảm bảo tách dịch quả được tốt với sự tích tụ tối đa các chất có giá trị dinh dưỡng cao và
hương vị thích hợp.
Tuy nhiên cũng cần biết rằng, phần lớn nguyên liệu, hiệu suất dịch quả cao không trùng
hợp với sự tích tụ các chất có giá trị dinh dưỡng. Ở nhiếu loại quả, khả năng thoát dịch quả
không trùng với mức độ chín. Nhiều khi quả thật chín, khả năng tích tụ chất dinh dưỡng cao
nhưng lại không thuận lợi cho việc tách nước quả. Chính vì thế, từng loại quả, người ta phải tiến
hành phân loại và xác định độ chín kỹ thuât riêng, sao cho phù hợp với việc sử dụng enzym và
thu hồi dịch quả.
Công việc thứ hai sau khi phân loại quả, việc nhất thiết phải làm trước khi sử dụng
enzym là quả phải được làm sạch bằng cách rửa nhiều lần để loại bỏ những tạp chất, VSV. Sau

đó là các quá trình kỹ thuật như xé nhỏ, nghiền, … để tăng khả năng tác động của enzym và
tăng hiệu suất thu dịch quả.
Khả năng làm nhỏ nguyên liệu. Làm nhỏ nguyên liệu là khâu kỹ thuật rất quan trọng, nó
quyết định đến hiệu quả tác động của enzym và hiệu suất thu nhận dịch quả cũng như chất lượng
dịch quả.
10


S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

Tùy theo tính chất cơ lý và đặc điểm cấu tạo của từng loại quả người ta chọn những
phương pháp xử lý quả thích hợp như nghiền cắt, chà hay xé nhỏ.
Khi thực hiện một trong những phương pháp cơ học trên, một số tế bào bị phá hủy, mất
tính chất bán thấm, do đó việc chọn phương pháp cơ học làm nhỏ quả phù hợp với từng loại quả
rất có ý nghĩa công nghệ.
2. Công nghệ sản xuất
2.1.
•

Nguồn gốc thu nhận

Từ vi sinh vật : Nếu ở thực vật người ta chỉ thấy có một loại enzyme thì ở vi sinh

vật là một loại enzyme rất phong phú.Vi sinh vật phân giải pectine hầu như có mặt ở các
đại diện nấm mốc, nấm men, vi khuẩn như:
 Nấm mốc: Asp. niger, Asp. oryase, Asp. terreus, Asp. saito, Asp. japonicus…
 Nấm men: Sac. ellipsoideus, Sac. fragilis, Sac. ludwigii …
 Vi khuẩn: Bac. polymixa, Bac. felseneus, Clostridium roseum…
1.1.1. Từ môi trường nuôi cấy bề mặt
Để chiết rút enzyme từ môi trường rắn người ta dùng nước, các dung dịch muối trung

tính, các dung môi hữu cơ (cồn, axeton). Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy dùng nước trong
mục đích này có kết quả tốt và dể được dùng rộng rãi trong sản xuất.Theo phương pháp khuếch
tán bằng nước có thể chiết được lượng enzyme trên 90 – 95% và trong nước chiết không chứa
các tạp chất không tan. Nước thường dung khuếch tán ở nhiệt độ 25 – 28 0C. Để tránh tạp nhiễm
nên thêm vào nước một ít focmalin hoăc chất sát trùng khác. Dịch chiết thu được có màu nâu
sẫm, khá trong, chứa 10 – 15% chất khô hòa tan và được làm lạnh kịp thời xuống 10 – 12 0C.

11


S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

Phương pháp tách chiết và làm sạch enzyme được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là phương
pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (etanol, izopropanol và axeton).

Sơ đồ tinh sạch Enzyme từ canh trường nấm mốc.
Các dung môi hữu cơ này làm giảm hằng có điện môi của môi trường. Như ta đã biết,
lực hút tĩnh điện tỉ lệ nghịch với hằng số điện môi. Vì vậy các enzyme, các chất protein cũng
như các chất có phân tử thấp trong hệ dung dịch nước – dung môi hữu cơ sẽ tủa và lắng xuống.
Độ hòa tan của enzyme vào dung dịch cồn – nước phụ thuộc vào nồng độ cồn, nhiệt độ,
lực hút ion của dung dịch và tính chất protein của enzyme. Để tránh mất họat tính của enzyme
tất cả phải được làm lạnh xuống 3 – 50C. Khi trộn phải khuấy mạnh, khi các enzyme kết tủa và
lắng xuống dưới cần tách ly ngay.
1.1.2. Từ môi trường nuôi cấy bề sâu
•

Phương pháp hiếu khí

12

S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

Sự tích tụ enzyme trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của vi sinh vật gần đạt
đến pha ổn định, khi môi trường bị acid hoá mạnh và khi lượng phospho vô cơ được sử dụng
hoàn toàn, pH của môi trường nuôi cấy thường đạt từ 6-7.2 là thích hợp. Đối với nấm mốc, pH
kìm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự tích luỹ enzyme pectinase.Khi pH dịch về phía acid, ngay
cả khi pH nằm trong khoảng 4.5-5.0, tuy sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự
tạo thành enzyme pectinase bị kìm hãm.
Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng. Cô đặc chân không
canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị sấy phun. Điều
kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-180 độ C và đi ra đạt 60-70 độ C.
Thời gian lưu của chế phẩm enzyme trong thiết bị sấy phun phải không quá 7 giây và nhiệt độ
chế phẩm sau khi sấy phải không quá 40 độ C. Chế phẩm thu được cần phải đóng gói kín để
tránh hút ẩm.
•

Phương pháp yếm khí
Môi trường: bã củ cải 2%; (NH 4)2SO4 0.75%; KH2PO4 0.1%; CaCO3 0.3%; nước chiết

ngô 0.5%. Clostridium pectinofermentants 15 có khả năng tổng hợp pectinase một cách mạnh
mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tích luỹ sinh khối. Sự
tích luỹ enzyme sẽ tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 55-60h, pH ban đầu
của môi trường dinh dưỡng là 6.5-7.0. Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở trạng thái canh
trường chứa bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích. Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở
nhiệt độ 350C.
Cl. felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinase. Thành phần môi
trường gồm có: lactose 2%; pectin củ cải 1%; (NH 4)2SO4 0.4%; K2HPO4 0.7%; KH2PO4 0.3%;
NaCl 0.1%; MgSO4 0.025%; FeSO4 dạng vết; CaCO3 0.5%; dịch nấm men tự phân 0.05%;
ascorbic acid 0.5%.

Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzyme với
dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium sulfat. Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, pH của

13


S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

dung dịch đã xử lý là 6.5-6.8. Nếu kết tủa bằng 2-2.5 thể tích aceton thì hoạt độ enzyme trong
kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu.
Khi kết tủa ammonium sulfat có độ bão hoà bằng 0.2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa
pectinesterase và pectintranseliminase, khi độ bão hoà là 0.9-1.0 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ
chứa pectintrenseliminase và exopolygalacturonase.
2.2.

Tách và làm sạch

Có 2 loại enzyme: nội bào và ngoại bào, mỗi enzyme đòi hỏi phải có phương pháp tách
và thu nhận riêng:
•

Enzyme ngoại bào: (gồm pectinase) do vi sinh vật tiết ra trong môi trường nuôi cấy ngoài

tế bào, thường hoà tan trong nước do đó dễ trích ly và tinh sạch.
• Enzyme nội bào: là enzyme được sản xuất ra bên trong tế bào vi sinh vật và không được tiết
ra môi trường bên ngoài. Những tế bào vi sinh vật sau khi được nuôi cấy sẽ được tách ra và
phá vỡ tế bào. Mục đích của việc này là giải phóng toàn bộ các chất có trong tế bào gồm cả
enzyme nội bào. Hỗn hợp thu được sẽ đem ly tâm tách tạp chất và những chất có phân tử
lượng lớn; còn enzyme sẽ được kết tủa bằng cồn hay muối. Enzyme sau đó sẽ tinh sạch được
tinhh sạch.

Enzyme nội bào

Enzyme ngoại bào

Khó tách
Phải phá vỡ thành tế bào
Thường lẫn chung với các chất khác của tế
bào sau khi bị phá vỡ (acid nucleic, chất
nguyên sinh, lipid…)
Chỉ bền vững trong môi trường nội bào
Phương pháp tinh sạch khó thực hiện, quy
trình công nghệ phức tạp, giá thành đắt

Dễ tách
Không cần phá vỡ thành tế bào
Không lẫn chung với các thành phần nội bào,
nếu có chỉ là một vài enzyme ngoại bào khác.
Bền vững hơn
Phương pháp tinh sạch dễ và rẻ hơn

14


S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

2.3.

Phương pháp tinh sạch
1.1.3. Phương pháp kết tủa

1.1.4. Kỹ thuật siêu lọc


Nguyên tắc:

Kỹ thuật siêu lọc (Ultrafiltration) là quá trình phân riêng chọn lọc các hợp chất bằng
màng lọc có kích thước siêu nhỏ với áp suất làm việc vào khoảng 0,5 – 5bar. Đường kính mao
quản trung bình từ 2 đến 50 nm.


Vật liệu lọc

Trong phương pháp này, vật ngăn để phân riêng các cấu tử là membrane. Áp lực là động
lực duy nhất của quá trình. Membrane có thể được sản xuất từ nhiều loại vật liệu khác nhau như:
cellulose acetate, polyamide, polysulfone hay ceramic.
Ứng dụng trong nghiên cứu tinh sạch pectinase
Trong lĩnh vực tinh sạch enzyme nói chung, đặc biệt là pectinase, quá trình siêu lọc


thường được áp dụng trong giai đoạn đầu của quy trình tinh sạch. Mục đích của quá trình là tách
nước và các tạp chất có phân tử lượng nhỏ trong canh trường lỏng như các ion kim loại, đường
sót, acid amin, peptide… (dòng permeate). Trong hầu hết các trường hợp, enzyme tinh sạch phải
được giữ lại trên bề mặt vật liệu lọc (dòng retentate). Vì thế, vật liệu lọc cần phải có kích thước
mao quản nhỏ hơn kích thước enzyme. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, việc áp dụng kỹ
thuật siêu lọc không đạt hiệu quả cao do lựa chọn kích thước lỗ màng không thích hợp.
1.1.5. Phương pháp sắc ký
Thuật ngữ sắc ký dùng để chỉ các kỹ thuật phân tích và điều chế cho phép tách biệt các
hợp chất khác nhau của một hỗn hợp. Phép phân tích sắc ký này dựa vào sự di chuyển khác nhau
15

S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

trong một pha động của các chất hoà tan đã được gắn trên một pha tĩnh ở trạng thái rắn. Người
ta thường chọn các chất có khả năng kết gắn được với các chất định phân tách làm pha tĩnh.
Tương tác giữa chất hoà tan và pha tĩnh có thể là tương tác hấp phụ, tương tác trao đổi ion,
tương tác kị nước, tương tác kiểu rây phân tử hoặc tương tác đặc hiệu sinh học.
• Sắc ký lọc gel: (sắc ký loại trừ phân tử) phân đoạn protein theo khối lượng riêng.
Sắc ký lọc (sắc ký loại trừ không gian, loại trừ khuếch tán hay phương pháp loại trừ phân
tử) cho phép phân đoạn một số hỗn hợp protein theo khối lượng phân tử của chúng. Thực tế
ngoài kích thước ra, hình dạng của phân tử cũng có ảnh hưởng.Tuy nhiên thông số này có thể bỏ
qua nếu protein trong hỗn hợp là hình cầu. Theo phương pháp này, các loại gel được nạp vào
trong cột dùng để tách enzyme, các phân tử được tách ra dựa theo kích thước và hình dạng của
chúng. Pha tĩnh: các hạt gel xốp chứa đầy trong cột.
Khi cho dung dịch các protein chảy qua cột thì các phân tử lớn nhất của hỗn hợp có đường kính
lớn hơn lỗ của pha tĩnh, không thể khuếch tán vào bên trong hạt nên bị loại trừ và chúng sẽ đi ra
khỏi cột cùng với thể tích dịch rửa bằng thể tích giữa các hạt gel (Vo).
Các phân tử bé, ngược lại, sẽ khuếch tán tối đa vào torng hạt gel và thể tích dịch rửa của
chúng sẽ bằng tổng thể tích pha lỏng của cột (V1). Còn các phân tử có kích thước trung gian sẽ
khuếch tán hạn chế vào hạt, thể tích dịch rửa của chúng càng lớn khi quãng đường đi (của
chúng) vào bên trong hạt càng dài thì kích thước của chúng càng nhỏ.
Phương pháp lọc gel thường được ứng dụng để tách các phân tử nhỏ như muối vô cơ và
các phân tử nước thông qua cấu trúc mạng lưới của sephadex. Thường phương pháp này chỉ làm
tăng độ cô đặc nhưng giảm hiệu suất thu hồi sản phẩm do các phân tử protein bị kẹt lại giữa các
hạt gel.
Sắc ký trao đổi ion: liên kết ion.
 Nguyên tắc:
Dựa trên sự tích điện của các phân tử protein. Phương pháp trao đổi ion được sử dụng
•

rộng rãi trong sản xuất ezyme trong quy mô công nghiệp. Tính chất tích điện của phân tử protein
chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi giá trị pH, từ đó người ta chọn chất trao đổi là anion hay cation.
Trong sắc ký trao đổi ion, việc gắn một protein enzyme vào nhựa trao đổi ion sẽ phụ thuộc vào
16


S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

trạng thái ion hoá của potein, cũng như trạng thái ion hoá của nhựa trao đổi, pH, lực ion và nhiệt
độ.
•
•

Sắc ký ái lực: liên kết kỵ nước.
Sắc ký hấp phụ: liên kết yếu như liên kết kỵ nước, liên kết Vander Waals.
1.1.6. Phương pháp thẩm tích

Trong quá trình tinh sạch các enzyme, để loại bỏ các phân tử hoà tan nhỏ không mong
muốn khỏi dịch trích ly enzyme như là amoni sulfat sau kết tủa, dùng một muối để khử hấp thụ
enzyme trong sắc ký trao đổi ion, hoặc một phối tử cạnh tranh trong sắc ký ái lực,... người ta
thường dùng phương pháp thẩm tích.
Túi thẩm tích được cấu tạo bằng một màng bán thấm (thường bằng solephan). Túi thẩm
tích có chứa dịch chiết enzyme, được đặt vào trong một dung dịch đệm không được chứa chất
hoà tan cần loại bỏ. Chất hoà tan khuếch tán ra khỏi màng theo chiều Gradient nồng độ, ở trạng
thái cân bằng thì nồng độ chất hoà tan bên trong túi và bên ngoài dịch đệm sẽ cân bằng nhau do
đó phải dùng một thể tích lớn dung dịch đệm và thỉnh thoảng phải thay dung dịch mới.
(NH4)2SO4 được cho vào túi thẩm tích, rồi đặt túi đó vào dung dịch có chứa polymer cacboxyl
methyl cellulose, polyetylenglycol (PEG) là những polymer có tính háo nước.
1.1.7. Kết tủa ái lực
Kết tủa ái lực là phương pháp phân tách dựa trên sự tạo phức giữa một phối từ ái lực với

protein cần tách nằm trong dịch enzyme thô, sau đó phức này sẽ được kết tủa bằng cách thêm
vào một tác nhân hợp lý.
Alginate là copolymer của acid guluronic và acid mannuronic, tạo kết tủa với ion Ca 2+ ,
được dùng để liên kết với pectinase trong quá trình tinh sạch (đi từ Asp.niger). Nếu xử lý
alginate bằng vi sóng ở nhiệt độ 750C sẽ làm tăng khả năng chọn lọc, chế phẩm enzyme thu
được có tỷ lệ tinh sạch 20 lần và giữ được 83% hoạt tính.
2.4.

Thu chế phẩm từ Asp.Niger 72-32

Thành phần với môi trường thích hợp để chủng Asp.Niger cho pectinase cao.
17


S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

1.1.8. Ảnh hưởng của thời gian nuôi
Để nghiên cứu ảnh hưởng này Asp.niger được nuôi cấy trên môi trường có độ ẩm 50% và
nuôi ở nhiệt độ 300C trong khỏang từ 30-40 giờ. Sau 2 giờ xác định họat độ pectinase của canh
trường. Qua đó ta thấy sự sinh tổng hợp pectinase của chủng nấm mốc này xảy ra mạnh mẽ từ
giờ thứ 32 trở đi và đạt cực đại vào giờ thứ 36. Sau đó giảm dần.
Thời gian nuôi

Hoạt động pectinase
(dvhd/1g canh trường)

30

361

32

740

34

1150

36

1300

38

887

40

288

1.1.9. Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi
Asp.niger 72-32 được nuôi cấy trên môi trường cơ bản có độ ẩm 50% ở nhiệt độ khác
nhau. Sau 2 giờ xác định họat độ pectinase của canh trường.
Nhiệt độ nuôi
( 0C)
28

Hoạt động pectinase
(dvhd/1g canh trường)
803

30

1134

32

1351

34

1688

36

764

18


S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

48

520

Bảng: Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi đến sinh tổng hợp pectinase Asp.niger 72-73
Ta thấy nhiệt độ từ 30-340C là thích hợp nhất cho sinh tổng hợp pectinase của Asp.niger
72-32.
1.1.10.Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường nuôi cấy

Asp.niger 72-32 được nuôi cấy trên môi trường có độ ẩm ban đầu thay đổi từ 40-65% và
nuôi ở 320C. Sau 36 giờ xác định họat độ pectinase của canh trường.
Độ ẩm ban
đầu

Hoạt động pectinase
(dvhd/1g canh trường)

40

481

45

731

50

957

55

1355

60

897

65

638

Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu đến nuôi đến sinh tổng hợp pectinase Asp.niger 72 -73
Qua đó ta thấy độ ẩm ban đầu của môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến sự hình thành
pectinase của Asp.niger 72-32. Họat độ pectinase mạnh nhất khi môi trường nuôi cấy có độ ẩm
ban đầu là 55%. Khi độ ẩm hơi tăng họat độ pectinase giảm đi 1 cách nhanh chóng, chỉ còn xấp
xỉ 2/3 họăc 1/2 khi độ ẩm ban đầu 60-65%.
2.5.

Xác định hoạt tính enzyme

Xác định hoạt tính pectinase có thể tiến hành bởi một trong những phương pháp sau đây:

19


S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

1.1.11.Phương pháp nhớt kế
Độ nhớt của dung dịch chứa pectine sẽ thay đổi sau một thời gian bị pectinase tác dụng.
Độ nhớt được đo bằng nhớt kế, thông qua thời gian dịch chuyển một thể tích nhất định dung
dịch chứa pectinase. Sử dụng 9 bình tam giác, mỗi bình cho vào 50ml dung dịch pectin 0.6%
vào tủ ấm 50 độ C, thời gian 15 phút, sau đó cho enzyme vào với lượng từ 0.1-0.9 ml và bổ sung
nước cất cho đủ 1ml. Duy trì 9 mẫu này ở nhiệt độ 50 độ C, thời gian 1h, sau đó làm lạnh xuống
2-3 độ C, lọc qua vải 2 lần.
Lấy 5ml dung dịch thì nghiệm này cho qua nhớt kế để đo độ nhớt thông qua thời gian
chảy của 9 mẫu dung dịch chứa pectine đem thí nghiệm nói trên.
1.1.12.Phương pháp đông chung (CU-pectat)
•

Nguyên tắc:

Thủy phân pectin dưới tác dụng pectinase.Sau đó dùng CuSO 4 5% để kết tủa axit pectin
dưới dạng đồng pectat(Cu-pectat).Hòa tan kết tủa bằng NH 4OH 25%. Xác địng lượng đồng nhờ
iốt. Một đơn vị họat động pectinase theo phương pháp này là một lượng emzyme có khả năng
xúc thủy phân hết 1 mg pectin trong thời gian 1 giờ ở điều kiện tiêu chuẩn.
1.1.13.Phương pháp so màu
Theo phương pháp này: Một đơn vị họat động pectinase là một lượng emzyme có khả
năng xúc tác thủy phân hết 1 g pectine trong thời gian 1giờ thành acid galacturonic ở điều kiện
tiêu chuẩn.
3. Ứng dụng chế phẩm pectinase trong sản xuất nước quả
Từ các loại quả khác nhau, người ta thường chế biến thành các dạng nước quả trong,
nước quả đục và phẩm, trước tiên phải chiết rút được dịch quả từ mô cơ bản, mô bì đôi khi mô
cơ học nữa. Do đó, hiệu suất chiết rút dịch quả sẽ phụ thuộc vào khả năng thấm của tế bào, cấu
tạo giải phẩu và tính chất cơ lý của nguyên liệu, độ nhớt của chính dịch quả, độ chắc của thịt

20


S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

quả, cũng như thành phần định tính và định lượng của pectin chứa trong dịch bào và trong thành
tế bào của mô quả.
Để sử dụng vào việc chế biến nước quả trong thì chế phẩm pectinase phải có enzym endo
và exo-polygalacturonse, enzym pectinesterase và proteinaza. Trong chế phẩm loại này thì
những enzym vừa kể trên là những enzym quyết định hiệu quả tác dụng của chế phẩm. Vì endo
và exo-PG sẽ làm giảm độ nhớt của dịch quả; còn enzym PE cũng góp phần vào tác dụng của
enzym này.
Enzym proteinase của chế phẩm sẽ thủy phân vỏ protein của vỏ nguyên sinh tế bào, kết
quả là làm cho sự thoát của dịch quả dễ dàng. Sự có mặt của xenluase và hemixenlulase ở trong

chế phẩm cũng tốt nhưng không bắt buộc. Khi sử dụng cho các loại quả như táo, lê thì trong chế
phẩm không được phép có enzym pectinaseliminase, và enzym này sẽ phân hủy protopectin vốn
gắn các tế bào riêng biệt của mô quả lại với nhau, do đó gây mủn hoá mô quả, làm tăng độ nhớt
của dịch quả và kết quả là làm giảm hiệu suất dịch quả. Ngược lại, khi sử dụng cho các loại quả
mọng như dâu tây thì sự có mặt trong chế phẩm enzym PTE lại cần thiết vì enzym này sẽ làm
mủn hoá tế bào làm cho tính chất thoát nước của tế bào tăng lên còn độ nhớt của dịch quả lại
giảm xuống.
Ngoài ra, đối với các chế phẩm pectinase dùng trong sản xuất nước quả trong cũng không
được phép có các enzym oxydase (ascohatoxydase, poliphenoloxydase).
Trong chế biến nước quả có thịt thì các enzym PTE, hemixenlulase và xenlulase lại là
những enzym quyết định hiệu quả tác dụng của chế phẩm. Trong đó vai trò dẫn động là enzym
PTE có tác dụng phân hủy protopectin của mô quả. Hemixenlulase và xenlulase sẽ cùng với
PTE làm cho độ đồng thể của nước quả có thịt tốt hơn. Trong trường hợp này sự có mặt trong
chế phẩm enzym PG đặc biệt là endo-PG là không cho phép vì lẽ độ đồng thể của nước quả sẽ
phụ thuộc vào độ nghiền mịn của mô quả và độ nhớt của dịch quả. Trong chế phẩm loại này có
mặt proteinase cũng tốt nhưng không bắt buộc. Ngoài ra khi dùng các nguyên liệu có màu sáng
thì trong chế phẩm không được chứa enzym oxi hoá, còn cho các nguyên liệu có carotenoid và
antoxian thì không được chứa enzym phá hủy các chất này.
21


S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

Để thu được nước quả, trong trường hợp có sử dụng enzym pectinase, người ta cũng phải
nghiền nhỏ nguyên liệu quả. Bã nghiền nhận được đem xử lý bằng enzym, sau đó mới đem ép
hoặc ly tâm. Trong trường hợp có sử dụng enzym, người ta có thể nghiền nhỏ tới mức tối đa, cốt
sao thuận lợi cho tác dụng của enzym mà khôpng sợ bị tắc nghẽn kênh dẫn dịch quả trong quá
trình ép sau này. Vì lẽ sau khi đã kinh qua tác dụng của enzym, dịch quả dễ dàng thoát ra khỏi
bã nghiền, nên khi ép hoặc ly tâm, chỉ làm công việc tách dịch khỏi các tiểu phần của mô quả
mà thôi.

Thực tế sản xuất đã chứng tỏ khi xử lý bã táo nghiền bằng 0,03% chế phẩm pectinase
hiệu suất của dịch quả được nâng lên từ 20-25%. Hoặc khi thu nước nho mà không sử dụng chế
phẩm pectinase thì hiệu suất dịch chỉ đạt được tối đa là 65% so với khối lượng nguyên liệu. Nếu
sử dụng pectinase thì tăng hiệu suất dịch quả từ 65% lên 77,3% (nho trắng) và từ 66% lên 82,2%
(nho đỏ).
Dùng pectinase không chỉ làm tăng hiệu suất dịch quả mà còn để làm trong dịch quả.
Phương pháp sử dụng enzym có hiệu quả hơn cả. Bởi lẽ nhờ tác dụng của các enzym mà các hệ
keo của nước quả sẽ bị phá huỷ hoàn toàn.
Nếu như khi làm trong bằng các phương pháp khác pectin bị kết tủa một phần thì khi xử
lý bằng pectinase, pectin bị phân giải hoàn toàn thành các chất hoà tan.
Với phương pháp enzym, khi mang một lượng thừa chế phẩm sẽ loại trừ được trường hợp
làm trong không hoàn toàn.
Dịch nước quả được xử lý bằng chế phẩm pectinase thường có vị hoàn toàn hơn và ít có
khuynh hướng bị đục hơn.
Quá trình làm trong dịch quả dưới tác dụng của pectinase có thể chia làm ba giai đoạn:
•

Giai đoạn “bất ổn định hoá” được tiêu biểu bằng sự giảm độ nhớt một cách sâu sắc và

thường được gọi là trạng thái “phá vỡ”.
• Giai đoạn kết lắng bắt đầu từ trạng thái “phá vỡ” và kết thúc khi kết tủa hoàn toàn.

22


S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10
•

Giai đoạn cuối cùng thường được xác định bằng sự vắng mặt các pectin kết tủa bởi ion
canxi.

2.1.

Sử dụng enzyme để sản xuất nước quả thanh trùng uống trực tiếp từ quả
táo và quả vả

Ngày nay, nước quả trong hoặc nước quả đục được sản xuất ở nhiều nước trên thế giới.
Tùy theo hàm lượng đường và axit có trong quả, người ta chế biến nước quả có cho thêm đường
hoặc acid hay không. Đối với nước quả có hàm lượng đường và acid thấp, người ta thường bổ
sung đường và acid để điều chỉnh chất lượng cuối cùng của sản phẩm.Hàm lượng pectin cao
trong sản phẩm thường không có lợi vì khi đó độ nhớt của sản phẩm rất cao. Việc thủy phân
pectin có trong dịch quả còn làm cho các sản phẩm dịch quả không bị đục. Tuy nhiên, việc xử lý
pectin bằng pectinase không nên tiến hành phân giải pectin đến cùng mà cần phải giữ một lượng
nhất định trong sản phẩm nước quả. Chính lượng pectin này sẽ giúp cho chất lượng nước quả tốt
hơn.
Khi xử lý nước quả ở 50OC trong 2 giờ, hiệu suất tách nước quả tăng được 20%, ở 3740OC sau 2-4 giờ thì tăng được 20-25%. Các nghiên cứu và thực tế sản xuất cho thấy hiệu quả
xử lý nước táo rất cao. Chính vì thế, việc ứng dụng enzym pectinase được áp dụng ở tất cả các
nhà máy sản xuất nước táo trên thế giới. Trong khi xử lý nước quả bằng enzym pectinase, người
ta thường cho thêm ascorbic acid vào để chống quá trình oxy hoá của nước táo.

Trong sản xuất nước quả táo và nước quả vả, người ta sử dụng chế phẩm pectinase cho
hiệu quả rất cao
23


S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

Bảng 1: Hiệu quả xử lý nước táo và nước quả vả bằng chế phẩm pectinase
Stt

Loại nước quả

1

Nước quả táo
a- Không cho chế phẩm 71,2
enzym
78,8
b- Có cho chế phẩm
enzyme

2

Hiệu
suất
(%)

Nước quả vả
a- Không cho chế phẩm 49,2
enzym
72,4
b- Có chế phẩm
enzyme

2.2.

Chất
khô
(%)

Độ

acid
(%)

Đường
(%)

Pectin
(%)

Chất
chát
(%)

Điểm cảm
quan

10,2
11,5

0,53
0,62

6,7
8,0

0,33
0,15

0,04
0,02

4,5
4,8

8,5
10,2

0,91
1,16

5,62
7,4

0,26
0,12

0,09
0,16

3,8
4,3

Sản xuất nước quả từ dâu tây, anh đào và phúc bồn tử

Người ta thường sản xuất cả dạng nước quả trong và nước quả đục từ các loại trái cây
trên. Trong quá trình sản xuất, người ta cho thêm đường và điều chỉnh lại lượng acid cho phù
hợp.
Các loại nước quả này thường chứa nhiều pectin. Do đó việc sử dụng các chế phẩm
enzym pectinase để loại bỏ khả năng gây dục cho nước quả cũng như ổn định và nâng cao chất
lượng dịch quả là điều cần thiết.

Người ta rửa sạch các loại quả trên bằng nước của vòi hoa sen. Sau đó, các loại quả trên
được đem chà thành dạng purê. Quả nghiền được đun nóng ở nhiệt độ 40-50 OC được cho vào
máy trộn. Tại đây nước quả được phối trộn với tỷ lệ 1 phần nước quả và 10 phần nước enzym có
lượng enzym 0,03%. Riêng đối với nước dâu tây, người ta cho thêm vào 0,03% ascorbic acid để
làm chất chống oxy hóa. Hỗn hợp này được giữ ở 40 OC. Thời gian lưu ở nhiệt độ 40OC là 4-8
giờ. Nước quả sau đó được cho qua máy ép và được đun nóng đến 45 OC. Tiếp đó, người ta đem
nước quả ly tâm và cuối cùng là lọc qua máy ép lọc khung bản.

24


S Ả N X U Ấ T P E C T I N A S E V À Ứ N G D Ụ N G T R O N G C N T P | Nhóm 10

Sử dụng enzym pectinase để loại bỏ khả năng gây dục cho nước quả anh đào
Bảng 2: Kết quả việc xử lý nước quả dâu tây, anh đào bằng enzyme
Stt Loại nước quả

1
2

Hiệu Chất
suất khô
(%) (%)

Nước quả dâu tây
a- Không cho chế phẩm enzym 71,2
b- Có cho chế phẩm enzyme
78,8
Nước quả mâm sôi
a- Không cho chế phẩm enzym 49,2

b- Có cho chế phẩm enzyme
72,4

2.3.

Độ
acid
(%)

Đườn
g (%)

Pectin
(%)

Chất
chát
(%)

Điểm
cảm
quan

10,2
11,5

0,53
0,62

6,7

8,0

0,33
0,15

0,04
0,02

4,5
4,8

8,5

0,91

5,62

0,26

0,09

3,8

10,2

1,16

7,4

0,12

0,16

4,3

Sản xuất nước quả từ nho

Nước uống từ trái nho là loại nước uống trong chứ không thuộc loại nước uống đục. Loại
nước uống từ nho dạng trong thường được sản xuất nhiều ở hầu hết các nước châu Âu và châu
Mỹ. Tuy nhiên hiện nay, người ta cũng sản xuất nước uống từ nho dạng đục (chủ yếu là nho có
màu đỏ). Trong đó, Ý là nước sản xuất nước uống dạng đục nhiều nhất, sau đó là Pháp, Rumani.
Nho là loại quả cho nhiều dịch và chứa nhiều đường. Tuy nhiên, nước nho thường chứa nhiều
25