Quy trình sản xuất amylase và ứng dụng trong sản xuất mật tinh bột

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Báo cáo
Đề tài: quy trình sản xuất amylase và
ứng dụng trong sx mật tinh bột
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang
SVTH: Nguyễn Văn Chí 3005110037
Hồ Văn Chương 3005110029
Phạm Đình Chương 3005110030
Nguyễn Minh Nhân 3005110205
Trần Thị Trang 3005110354

TP. HCM 06/2014
NIÊN KHÓA: 2011-2014NIÊN KHÓA: 2011-2014NIÊN KHÓA: 2011-2014NIÊN KHÓA: 2011-2014
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang
MỤC LỤC
: TỔNG QUAN VỀ ENZYME
AMYLASE
1.1. Lịch sử nghiên cứu, định
nghĩa
Vào đầu thế kỷ XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được các chất gây ra
quá
trình lên men. Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg đã phát hiện
nước
chiết của mầm đại mạch có khả năng chuyển hoá tinh bột thành đường ở
nhiệt
độ thường. Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Persor
đã
chứng minh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường có thể tách
được

ở dạng bột. Thí nghiệm này được tiến hành bằng cách cho etanol vào dịch
chiết
của lúa đại mạch nảy mầm thì thấy xuất hiện kết tủa. Kết tủa được hình
thành
này có khả năng chuyển hoá tinh bột và nếu đun kết tủa này sẽ mất tác
dụng
chuyển hoá. Danh từ diastase là do Payen và Persor dung để gọi enzyme
lúc
bấy
giờ.
Các enzyme amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân
giải
liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của
nước:
R.R` + H-OH → RH +
R`OH
1.2. Phân loại, đặc tính, cơ chế tác
dụng
1.2.1. Phân
loại
Có 6 loại enzyme được xếp vào hai nhóm lớn: Endoamylase
và
Exoamylase.
Nhóm 6 Trang 2
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang
Enzyme amylase được phân loại theo sơ đồ
sau
Nhóm 6 Trang 3
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang
Amylase

Endo amylase
Exo amylase
Enzyme khử nhánh
Khử gián tiếp
Khử trực tiếp
γ-
amylase
β- amylase (α- 1,4
–
glucanmaltohydrolase
α-amylase
Maylo-1,6- glucosidase
Transglucosylase (oligo-1,6 glucosidase
Pullulanase
(α-dextrin 6
– glucosidase
Nhóm 6 Trang 4
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang

Endoamylase:
-
α– amylase
α– amylase
có khả
năng
phân cắt các liên kết
1,4-
glucoside của cơ chất một
cách
ngẫu nhiên, là enzyme

nội
bào. α-amylase không chỉ có
khả
năng phân hủy hồ
tinh bột
mà
còn có khả năng phân hủy
các
hạt tinh bột nguyên
vẹn.
 Enzyme khử
nhánh:
- Khử trực tiếp
(Pullulanase)
Pullulanase là một trong
các
enzyme quan trọng nhất trong
chế
biến tinh bột.
Enzyme này được
sử
dụng trên một quy mô lớn
trong
glucose và các ngành công
nghiệp
sirô maltose. Pullulanase là một
loại
enzyme rất mạnh cho sự thoái
hóa
tinh bột

thành glucose hoặc
maltose.
Pullulanase thủy phân α-1,liên kết
6-
glycosidic của chuỗi
phân
nhánh và α-1,
4-glycosidic.
Nhóm 6 Trang 5
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang
- Khử gián
tiếp
Transglucosylase
(oligo-1,6-
glucosidase) và
Maylo-1,6-glucosidase:
Enzyme này thủy phân
liên kết
β-1,6-
glucoside trong isomaltose, panose
và
các dextrin tới hạn có thể chuyển hóa đường có
thể lên men
được.

Exoamylase
-
β–amylase
(β-1,4-glucan-maltohydrolase)
β–amylase

xúc tác từ sự thủy phân các
liên
kết 1,4-glucan
trong tinh bột, glucogen
và
polysaccharide,
phân cắt từng
nhóm
maltose từ đầu
không khử của
mạch.
Maltose được hình
thành do sự xúc tác
của
β-amylase có cấu hình
β.
γ–amylase (glucose amylase) Glucose amylase
có khả
năng
thủy phân liên kết -1,4 lẫn
-1,6-
glucoside, ngoài ra còn có khả
năng
thủy phân
liên kết -1,2 và
-1,3- glucoside.
Glucose amylase
có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột,
glucogen,
amylopectin, dextrin… thành

glucose mà không cần có sự tham gia của
các
loại enzyme amylase
khác.
1.2.2. Đặc
tính
Nhóm 6 Trang 6
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang
Khả năng dextrin hóa: Thủy phân tinh bột > dextrin + một ít
maltoza.
Dextrin có khả năng họat hóa cao, đặc trưng cho tính chất của enzyme
này.
Tính bền nhiệt: Phân tử có 1-6 nguyên tử C, tham gia vào sự hình
thành
ổn định
cấu trúc bậc 3 của
enzyme.
Tính tan: Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và
rượu
loãng
Các amylase bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu
2+,
Ag
+
,
Hg
2+.
Cơ chất tác dụng: của enzyme amylase là tinh bột và
glycogen.
• Đặc

tính



riêng

α – amylase có những đặc tính rất đặc trưng về cơ chế tác động,
chuyển
hóa tinh
bột, khả năng chịu
nhiệt:
Thể hiện họat tính trong vùng axit yếu: với nấm mốc có pH từ 4.5 –
4.9,
nấm sợi
có pH từ 4.0 – 4.8 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4. 5 – 5.8),
vi
khuẩn có pH từ
5.9 – 6. 1 (pH<3 thì enzyme α – amylase bị vô hoạt trừ
enzyme
của Asp.Niger có pH 2.5
–
2.8).
α - amylase của nấm mốc có khả năng dextrin hóa cao tạo ra một lượng
lớn
glucose và maltose.
Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác nhau. α-amylase của
Asp.oryzae
bền

vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn
Bac.subtilis.
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α - amylase từ các nguồn
khác
nhau
cũng không đồng nhất. α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với
tác
động nhiệt.
Nhiệt độ tối thích của nó là 50°C và bị vô hoạt ở 70°C
(Kozmina,1991).
α-amylase là
một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa
1-30
nguyên tử gam Ca/mol,
nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca
tham
gia vào sự hình thành, ổn định cấu
trúc bậc 3 của enzyme và duy trì hoạt
động
của enzyme. Do đó, Ca còn có vai trò duy
Nhóm 6 Trang 7
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang
trì sự tồn tại của enzyme khi bị
tác
động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của
các enzyme phân
giải
protein. Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn
toàn bị mất
hết

khả năng thủy phân cơ chất. α-amylase bền với nhiệt độ hơn các
enzyme
khác.
Một số kim loại như: Li
+
, Na
+
, Cr
3+
, Mn
2+
, Zn
2+
, CO
2+
, Sn
2+
, Cr
3+
thì
không
có
ảnh hưởng mấy đến
α-amylase.
Nhóm 6 Trang 8
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang
PHẦN 2: NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE
2.1. Thu nhận enzyme từ nguồn thực vật
Người ta đã biết cách chiết xuất enzyme amylase từ hạt nảy mầm để sử dụng

trong ngành công nghiệp chế biên thực phẩm vd như kẹo mạch nha, bia khi đó, hạt
ngũ cốc được cho nảy màm, tách bỏ phần rễ và thân mầm, sấy khô ở nhiệt độ thấp
và khi đó ta thu được malt.
2.1.1. Malt đại mạch
Các enzyme thủy phân tinh bột trong đại mạch chủ yếu là amylase mà chủ yếu là α-
amylase và
β-amylase, quá trình nảy màm của đại mạch là giai đoạn chuyển hóa
enzyme từ trạng thái khong hoạt đông sang trạng thái hoạt động, đồng thời tổng hợp
them hang loạt các enzyme mới, giai đoạn này cần chú ý không làm giảm nhiều
chất khô của hạt, tạo độ thông thoáng bằng cách đảo trộn. hạt đại mạch trước khi
ngâm không có hoạt lực của enzyme
α-amylase, khi hạ trải qua 3-4 ngày trong giai
đoạn nảy màm thì hoạt lực đạt tới mức cực đại vào ngày t7. Sau đosex giảm xuống
2.1.2. Lúa
Hệ enzyme trong lúa cũng tương tự như trong hạt đại mạch, trong quá trình
nảy mầm,hoạt động các enzyme tăng cao thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp các loại
enzyme và quá trình sinh hóa gần giống đại mạch, chỉ khác về mức độ tạo thành
enzyme và tốc độ phản ứng.
Khi hạt chưa nảy mầm, các enzyme tồn tại ở dạng liên kết. khi hạt nảy mầm,
chúng lại chuyển sang hoạt động.
2.1.3. Vi sinh vật
Trong ba nguồn thực vật, đông vật, vi sinh vật thì vi sinh vật được sử dụng
nhiều nhất để thu nhận enzyme. Cơ bản là do các lí do sau:
- Có thể điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn
Nhóm 6 Trang 9
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang
khác.
- Hệ enzyme từ vsv vô cùg phong phú.
- Giá thành môi trường nuôi cấy đơn giản và rẻ tiền.

- Tốc độ sinh sản rất nhanh.
- Dễ kiểm soát quá trình sx và mở rộng ở quy mô công nghiệp.
PHẦN 3: TỔNG QUAN VỀ NGUỒN GIỐNG VI SINH
VẬT
3.1. Vai trò của giống vi sinh vật trong công nghệ
enzyme
Trong công nghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết
định:
o Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà
máy.
o Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học (hay
là
hoạt tính
enzyme).
o Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản
xuất.
o Giống VSV còn quyết định đến giá thành sản
phẩm.
3.2. Vi sinh vật dùng để sản xuất enzyme
Amylase
3.2.1. Các giống vi sinh vật sản xuất enzyme
Amylase
Những chủng vi sinh vật tạo nhiều amylase
thường
được phân lập từ các
nguồn tự nhiên. Vi sinh vật tạo amylase được dùng
nhiều
hơn cả là nấm sợi, giả
nấm men và vi khuẩn,còn xạ khuẩn thì ít
hơn.

Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus,
rhizopus.
Nấm
men và giả nấm men thuộc các giống Candida,
Saccharomyces,
Endomycopsy,
Endomyces cũng tạo
amylase.
Nhóm 6 Trang 10
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang
Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn amylase như:
Bac.polymyxa,
Phytomonas destructans, Cassavanum… các vi khuẩn ưa nhiệt có khả
năng
sinh
trưởng nhanh và phát triển tốt ở nhiệt độ cao nên khi nuôi chúng ít
bị
nhiễm vi sinh
vật
khác.
Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo amylase mạnh mẽ, tuy
nhiên
cũng có một số ít như xạ khuẩn ưa nhiệt. Micromonospora vugaris 42 có
khả
năng
tạo một lượng nhỏ a-amylase hoạt động ở 65°C cùng với protease và
các
enzyme
khác.

3.2.2. Giới thiệu Chủng nấm mốc Aspergillus
Oryzae
Đặc

điểm

cấu

trúc

hình thái của

Chủng

nấm

mốc

Aspergillus
Oryzae
-
Ưu điểm:
+ Không
sinh tổng
hợp độc tố
+ Sinh tổng hợp hợp hợp chất chính cao
+ Thích nghi nhanh , sinh tổng hợp mạnh
+ Điều kiện nuôi cấy đơn giản rẻ tiền
+ Dễ dàng tách khỏi môi trường nuôi cấy lỏng để thu enzyme ngoaị bào
Aspergillus Oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales,

lớp
Ascomyctes (năng khuẩn). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao
gồm
những
sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7µm, phân nhánh rất nhiều và có vách
ngăn,
chia sợi
thành nhiều bao tế bào (nấm đa bào). Từ những sợi nằm ngang
này
hình thành
những sợi đứng thẳng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ
quan
sinh sản vô tính.
Nhóm 6 Trang 11
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang
Cuống đính bào tử của Aspergillus Oryzae thường dài
1-2mm
nên có thể nhìn thấy
bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng
lên
gọi là bọng. Từ bọng này
phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi
là
những tế bào hình chai. Đầu các
tế bào hình chai phân chia thành những bào
tử
đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử.
Đính bào tử của Aspergillus Oryzae
có

màu vàng lục hay màu vàng hoa cau…. Bào
tử cùng thành phần môi
trường
được sấy khô ở nhiệt độ < 50
o
C cho đến khi độ ẩm
<8
o
C, đưa vào bao, hàn
kín
và bảo quản ở nhiệt độ
thường.
Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu cả enzyme thủy phân nội bào
và
ngoại
bào (amylase, protease, pectinasae,….), ta rất hay gặp chúng ở các
kho
nguyên liệu,
trong các thùng chứa đựng bột, gạo….đã hết nhưng không
được
rửa sạch, ở cặn bã
bia, bã rượu, ở lõi ngô, bã sắn….chúng mọc và phát triển
có
khi thành lớp mốc, có
màu đen, vàng… màu do các bào tử già có màu sắc.
các
bào tử này, dễ bị gió cuốn
bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi
sẽ
mọc thành

mới.
3.2.3. Các phương pháp phân lập và bảo
quản
3.2.3.1. Các phương pháp phân
lập
Vi sinh vật phân bố rất rộng trong tự nhiên từ nơi có địa hình
bình
thường
đên nơi có địa thế phức tạp, đâu đâu cũng có mặt vsv. ở những nơi
giàu
chất hữu cơ,
hay nghèo chất hữu cơ, trong không khí, trên bề mặt các vật,
trong
cơ thể người,
động vật, nơi có nhệt độ rất thấp và hiện diện cả ở nơi có nhệt
độ
cao. VSV có khả
năng thích nghi trong trong mọi hoàn cảnh môi trường.
Chính
nhờ khả năng tuyệt
vời này mà VSV có khả năng tồn tại ngay cả trong
hoàn
cảnh khắc nghiệt
nhất.
Thông thường để phâp lập một giống chủng vsv để thu nhận enzyme
thì
có 3
cách phân
lập:
- Phân lập giống trong điều kiện tự

nhiên
- Phân
lập giống trong điều kiện sản
xuất
Nhóm 6 Trang 12
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang
- Phân lập giống trong mẫu giống đã hư
hỏng
Tùy thuộc vào khả năng và những điều kiện thực tế mà ta chọn
cách
phân lập
cho phù hợp. mỗi cách phân lập trên đều cho thấy những ưu
điểm
riêng biệt. Sau
đây là một số ưu
điểm
Phân lập

giống

trong

điều

kiện

tự

nhiên

Trong điều kiện tự nhiên, VSV để có thể tồn tại và thích nghi
nhanh
được
thì cần phải có khả năng sinh tổng hợp thật nhiều loại enzyme để
chuyển
hóa
nhanh cơ chất có trong môi trường thành vật chất cung cấp cho tế
bào(thích ứng
mạnh mẽ .
Điều này thì không thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme (ở quy mô
sản
xuất công nghiệp) với một loại enzyme thật sự
mạnh.
Các loài VSV có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme nào
đó
thường
tập trung ở vùng môi trường chứa nhiều cơ chất tương ứng. Dựa
vào
đặc điểm này
chúng ta có thể dễ dàng xác định vị trí cần phân lập loại
VSV
sinh tổng hợp enzyme
mà ta
cần
Ví dụ: nếu ta muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp
protease
cao, ta phải
tìm nơi có chứa nhiều protein trong tự nhiên, còn nếu muốn
phân
lập vsv có khả

năng sinh tổng hợp amylase ta cần phải tìm nơi có chứa
nhiều
tinh bột trong tự
nhiên.
Phân lập

giống

trong

điều

kiện

sản

xuất
Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích
nghi
với
điều kiện sản xuất. Nhờ đó, sau khi phân lập, các giống này không cần
qua
giai
đoạn sản xuất thử, thí
nghiệm.
Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường là
những
giống
đã được chọn lọc hoặc đã qua
dại.

Nhóm 6 Trang 13
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang
Mật độ tế bào vi sinh quá trình biến đổi gen và có những
đặc
điểm sinh hóa
hơn các giống vi sinh vật trong điều kiện sản xuất (trong dịch lên
men,
dịch nước
thải, chất thải của quá trình lên men) thường rất cao. Do đó,
khả
năng thu nhận của
những chủng có khả năng sinh tổng hợp cao thường rất
cao
.
Phân lập

giống

trong

môi

trường

giống

đã hư

hỏng

Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản. Do bị nhiễm,
có
thể rất
nhiều tế bào vi sinh vật giống bị thoái hóa, nhưng cũng còn nhiều tế
bào
không bị
thoái hóa. Việc phân lập lại từ nguồn gốc này nhiều khi lại đạt
được
những kết quả
tốt.
Phương

pháp

phân

lập

nấm

mốc

Aspergillus

oryzae
Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp
enzyme
amylase. Ở
nấm mốc nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng
hợp

enzyme amylase này
là tinh bột. Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn
hay
có thể mua trực tiếp từ
cung cấp nấm mốc giống. Ưu điểm của việc này
là
giống mua thì thời gian bảo
quản và hiệu suất chất lượng giống được bảo
đảm
chắc chắn. Tuy nhiên, quá trình
phân lập giống này có thể cho những kết
quả
đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc bổ
sung một chủng giống mới tại phòng
thí nghiệm.
Quá trình lấy mẫu : có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai
tây
cắt lát
đem chôn xuống đất. Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng
khoai
tây ra, rửa
sạch cát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây. Sau đó cho vào
bao
nylon và mang
về phòng thí
nghiệm.
Tiền hành thí nghiệm phân
lập:
• Nghiền mẫu đối với mẫu khoai
tây

• Lấy 10g mẫu đất hay mẫu khoai tây (đã làm nhuyễn) cho vào 90ml
nước
cất vô trùng sau đó đảo
mẫu.
• Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyền sang 1
ống
Nhóm 6 Trang 14
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang
nghiệm khác có chứa 90ml nước cất vô
trùng.
• Tiếp tục pha loãng ở nồng độ 10-3, 10-4 ở những ống nghiệm tiếp
theo.
• Hút 0.1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn
lọc
cho nấm mốc phát triển, môi trường PDA (Potato Dextro Agar
)
• Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường đem
ủ
ở
nhiệt độ phòng trong vòng 3
ngày.
• Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chỗ này
sẽ
xuất hiện những quầng sánh xung quanh khuẩn
lạc.
• Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường nước khi
cấy.
Có tác dụng là chất chỉ thị cho tinh
bột.

• Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trong ống
thạch
nghiêng
với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong 72 giờ sau đó có thể
dự
trữ trong
máy làm
đông.
Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (quy mô nhỏ
).

 Đổ 10ml H
2
O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử
nấm.
 Lắc đều cho bào tử hòa trộn vào môi trường đến khi tạo dung
dịch
huyền
phù.
 Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác
có
chứa môi
trường sinh trưởng của
nấm.
KH
2
PO
4
1,4 mg
NH

4
NO
3
10 mg
KCl 0,5 mg
MnSO
4
.7H
2
O 0,1 mg
Nhóm 6 Trang 15
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang
FeSO
4
.7H
2
O 0,01 mg
Hồ tinh bột 20 g
pH =6,5
Phân phối khoảng 30 – 40 ml môi trường vào erlen 50ml
đem
khử trùng bởi
Autoclave ở 73 - 121
0
C trong 15 phút sau đó để nguội đến
nhiệt
độ phòng. Sau đó
đem ủ ở 25 – 30
0

C trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng
/
phút. Sau khi nhân
giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi
bảo
quản và dự trữ. Để có hiệu
quả cao cho nấm mốc giống ta cần có
những
phương pháp bảo quản thích
hợp.
3.2.3.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh
vật
Mục đích của bảo quản giống vi sinh vật dùng trong sản xuất enzyme
là
đảm
bảo tính ổn định trong quá trình tổng hợp enzyme và tính ổn định của
hoạt
tính
enzyme. Có các phương pháp để thực hiện quá trình này như
sau:

Cấy

truyền

và bảo

quản

lạnh

Phương pháp dựa trên nguyên tắc là vi sinh vật sẽ hạn chế quá trình
trao
đổi
chất trong điều kiện lạnh ở một khoảng thời gian nhất định. Trong thời
gian
này vi
sinh vật có khả năng bảo tồn được khả năng sinh tổng hợp
enzyme.
Cách thực hiện : Ống giống vi sinh vật được cấy truyền vào 3-5
ống
nghiệm
có môi trường tối thiểu. Trong đó một ống dùng để kiểm tra, một
ống
dùng cho sản
xuất hoặc nghiên cứu và một ống dùng để bảo quản. Có thể
làm
thêm hai ống để
tránh sai sót do thao tác đối với những người mới bắt đầu
làm
công tác bảo quản
giống.
Sau khi cấy truyền, ống giống cần được bảo quản ở điểu kiện nhiệt
độ
lạnh
từ 4-7
0
C. Sau thời gian định kỳ, sẽ phải cấy truyền trở lại, thao tác
này
được thực
hiện liên

tục.
Nhóm 6 Trang 16
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang

Bảo

quản

giống

trong

đất

hoặc

trong

cát
Phương pháp dựa trên nguyên tắc : Trong môi trường tối thiểu có độ
ẩm
thấp, vi
sinh vật có bào tử có thể bảo tồn khả năng sinh tổng hợp enzyme
trong
thời gian
dài. Phương pháp này rất phù hợp và có hiệu quả đối với nấm
mốc Asp.oryzae.
Trước khi sử dụng, đất, cát phải được làm sạch và sấy đến độ ẩm <
5%.

Asp.oryzae được nuôi cho đến khi tạo bào tử. Người ta trộn bào tử với đất
hoặc
cát
đã được làm sạch và sấy khô. Sau đó hỗn hợp này cho vào bao hàn kín
và
bảo quản
ở nhiệt độ
thường.

Bảo

quản

giống

trong

hạt

ngũ

cốc
Phương pháp dựa trên nguyên tắc bào tử nấm được giữ trong hạt
ngũ
cốc đã
xử lý nhiệt có độ ẩm < 8% và giữ được khả năng sinh tổng hợp
enzyme
trong
thời gian
dài.

Người ta thực hiện bảo quản giống trong hạt ngũ cốc như sau:
Giống
ống nấm
mốc được nuôi trong môi trường hạt ngũ cốc cho đến khi tạo
nhiều.
3.3. Yêu cầu đối với giống vi sinh
vật
Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại
và
được sản
xuất theo quy mô công nghiệp. Do đó, giống VSV ứng dụng
trong
công nghệ
enzyme cần phải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất
định.
Đó
là:
o Giống VSV phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm này
phải
có số
lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì trong quá
trình
trao đổi
chất, để chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp
hàng
nghìn lần cơ
thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể
VSV
cần tổng hợp
nhiều chất. Do đó, sản phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại khác.

Chính
vì thế, giống
VSV dùng trong sản xuất một sản phẩm nào đó, thì sản phẩm
này
phải trội hơn các
sản phẩm khác cả về số lượng và chất
lượng.
o Giống phải cho năng suất sinh học
cao.
o Giống VSV phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh
trong
điều kiện
Nhóm 6 Trang 17
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang
sản xuất công
nghiệp.
o Giống VSV phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và
dễ
kiếm tại địa phương nơi nhà máy đang hoạt
động.
o Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những
VSV
thuần khiết, có tốc độ sinh sản
nhanh.
o Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh sản phẩm mong muốn, dễ
dàng
tách
sản phẩm ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối VSV
giống.

Giống phải ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo
quản.
Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống VSV cung cấp cho quá trình
lên
men công
nghiệp, ta cần tiến hành phân lập giống VSV thuần
khiết.
Muốn thu nhận các Enzyme Amylase với hiệu suất cao cần phải
tiến
hành phân
lập, và chọn giống VSV để tuyển lấy những chủng hoạt động
mạnh,
đồng thời phải
tiến hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi
trường
tối thích cũng như
tiêu chuẩn hoá các điều kiện nuôi. Như vậy sự tổng
hợp
Enzyme Amylase không
những phụ thuộc vào tính chất di truyền của VSV
mà
còn phụ thuộc vào việc tuyển
chọn các điều kiện nuôi đặc hiệu. Ngoài các
yếu
tố hoá học (thành phần môi
trường) ra, thì các điều kiện lý hoá của quá
trình
nuôi cấy cũng có một ý nghĩa
rất lớn đối với sinh tổng hợp
Enzyme

Amylase.Trong các yếu tố ảnh hưởng đến
sinh tổng hợp các Enzyme
Amylase
trong quá trình nuôi VSV, thì thành phần môi
trường, tính chất cơ lý của
môi
trường, độ tiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độ thoáng khí,
nhiệt độ nuôi và pH
môi
trường… Là những yếu tố cơ bản quan trọng
nhất.
PHẦN 4: QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME Α-
AMYLASE TỪ ASPERGYLLUS ORYZAE
Nhóm 6 Trang 18
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang
4.1. Bảo

quản

giống

Aspergyllus
oryzae:
- Cho cát vào ống nghiệm, tiệt trùng trong autoclave 130
o
C trong
30
phút.
- Trộn bào tử vào

cát.
- Sấy chân không < 40
o
C (độ ẩm
5%).
- Dùng parafin rắn đun chảy và đổ lên nút
bông.
-
Thời gian bảo quản: 1 năm hoặc
hơn.
4.2. Nguyên
liệu:
- Nguồn tinh bột: cám gạo: chứa khoảng 20% tinh bột, 10–15% chất
béo,
10-14% protein, 8-16% cellulose, các chất hoà tan không chứa nitơ
37-59%.
- Cám không được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20-30%, không có
vị
chua hay
đắng, không hôi mùi mốc, độ ẩm của cám không quá 15%, tạp
chất
độc không quá
0,05%.
- Các phụ phẩm thêm vào để tăng độ thoáng khí cho môi trường
nuôi
cấy: trấu, mạt
cưa….
4.3. Sơ

đồ

công

nghệ: sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt
Nuôi cấy bề mặt:
Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng
phát triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ
bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng môi
trường đã được tiệt trùng, làm ẩm. Đối với một số mục đích đặc biệt, người ta nuôi
vi sinh vật trực tiếp trên bề mặt hạt gạo (sản xuất tương), hạt đậu tương (đậu tương
lên men- misô) đã được nấu chín trộn hạt cốc còn sống (làm men thuốc bắc, men
dân tộc, làm tương).
Nhóm 6 Trang 19
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang
Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia là
trấu. Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, mông, tạo được độ xốp nhiều, không có
những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỉ lệ các chất phụ
gia phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được
thấp hơn 20%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH4)2SO4, (NH4)2CO),
photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô,
nước lọc bã rượu.
NGUYÊN LIỆU
XỬ LÝ
THANH TRÙNG
LÀM NGUỘI
PHÓI TRỘN
NUÔI CẤY
THU ENZYME THÔ
SẤY

NGHIỀN MỊN
TRÍCH LY
LỌC
KẾT TỦA ENZYME
ENZYME THÔ
GIỐNG VSV
SẮC KÝ
BAO GÓI
SẤY
THÀNH PHẨM
Nhóm 6 Trang 20
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang
4.4. Thuyết

minh

quy

trình:
- Nguồn tinh bột: cám gạo: chứa khoảng 20% tinh bột, 10–15% chất
béo,
10-14%
protein, 8-16% cellulose, các chất hoà tan không chứa nitơ
37-59%.
- Cám không được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20-30%, không có
vị
chua hay
đắng, không hôi mùi mốc, độ ẩm của cám không quá 15%, tạp
chất

độc không quá
0,05%.
- Các phụ phẩm thêm vào để tăng độ thoáng khí cho môi trường
nuôi
cấy: trấu, mạt
cưa…
- Xử lý nguyên liệu: cám gạo, trấu và mạt cưa được xử lý để loại bỏ
các
tạp chất. Trấu
cho vào với tỉ lệ 20-25% so với khối lượng cám
gạo.
- Thanh trùng: Nhiệt độ thanh trùng là 95
o
C trong 60 phút. Đồng
thời
phải thanh
trùng khay lên
men.
- Rải nguyên liệu lên khay có kích thước 2x3 m, độ dày 2-3 cm,
dùng
3kg môi
trường/khay.
- Sau khi làm nguội, tiến hành cấy mốc giống với nồng độ 5-10% so
với
khối lượng
của môi trường ở mỗi
khay.
- Đưa khay lên các giá
đỡ
- Nhiệt độ phòng nuôi cấy được giữ ở 25-30

o
C, độ ẩm 60-65%, đồng
thời
phải thoáng
khí.
- Đến khoảng 30-32 giờ sau khi cấy giống, ta thu nhận enzyme thô.
Cần
thu nhận
enzyme thô vào thời điểm trước khi nấm sinh bào tử vì khi nấm
sinh
bào tử là lúc
quá trình tổng hợp enzyme đa yếu đi. Do đó cần một bước
nuôi
cấy thử nghiệm để
xác định thời điểm thu nhận enzyme thô. Chế phẩm
enzyme
thô thu được chứa tế
bào nấm, cơ chất, nước và
enzyme
- Để giữ hoạt tính của enzyme, sấy chế phẩm thô này ở nhiệt độ
30-40
o
C,
độ ẩm sau
sấy là
10%.
- Nghiền mịn: chế phẩm enzyme thô được nghiền với cát và bột
thạch
anh. Cát và bột
thạch anh được rửa sạch, sấy khô

trước.
- Trích ly: sau khi nghiền, dùng nước để trích ly. Cứ 1lít enzym thô,
cho
4-5lít nước,
Nhóm 6 Trang 21
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang
khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy
dịch.
- Lọc: dịch sau trích ly lọc bằng lọc tiếp
tuyến.
- Kết tủa enzyme: kết tủa được thực hiện bằng ethanol phải làm lạnh
cả
dung dịch
enzym thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt
tính
enzym.Khi đổ
chất làm kết tủa enzym vào dung dịch enzym thô phải hết sức
từ
từ để tránh hiện
tượng biến tính. Nhiệt độ từ 3-10
o
C và dùng 2lít ethanol
cho
1lít
enzyme.
- Enzyme thu được là 1 hỗn hợp nhiều enzyme khác nhau như:
amylase,
proteinase,
cellulase… Do đó, phải tiến hành sắc ký lọc gel để thu

được
enzyme
amylase. Gel sử dụng là Sephadex
G200.
- Sấy: sản phẩm sau sắc ký được sấy ở nhiệt độ 30-40
o
C để bảo đảm
hoạt
tính cho
enzyme, độ ẩm sản phẩm là
5%.
4.5. Ưu

và

nhược

điểm

của

phương

pháp

này:
a. Ưu
điểm
Quy trình công nghệ thường không phức tạp. Lượng enzyme được
tạo

thành từ nuôi
cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy
chìm.
- Chế phẩm enzyme thô ( bao gồm thành phần môi trường sinh
khối
VSV,
enzyme và nước ). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo
quản.
- Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó
việc
vận
hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn
kém.
- Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, rất dễ xử lý. Môi trường đặc
là
môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ
cần
loại
bỏ
khu
vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi
cấy.
b. Nhược
điểm:
Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy. Trong
phương
pháp này
VSV phát triển trên bề mặt môi trường nên cần nhiều diện
tích
4.6. Các ảnh

hưởng

đến

chất

lượng

enzyme:
a. Ảnh hưởng các nguồn Nitơ dinh
dưỡng:
Nhóm 6 Trang 22
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu
Sang
Nguồn dinh dưỡng Nito hết sức quan trọng. Khi chuẩn bị môi
trường
dinh
dưỡng để nuôi nấm mốc Asp.oryzae để tạo enzym α-amylase, người
ta
dùng muối
vô cơ Natri Nitrat là nguồn Nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại
nấm
sợi tạo α-
amylase. Hàm lượng thường dùng là 0.91% Natri Nitrat và
Amoni
Nitrat có hiệu
quả hơn so với các muối khác( Kali Nitrat, Magie Nitrat,
Amoni Sunfat…)
Cho nguồn Nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng

hợp
amylase
này và ức chế tổng hợp amylase
khác
Bảng ảnh hưởng của nguồn Nito tới sinh tổng hợp các
enzyme
amylase
Nguồn
Nito
Liều
lượng
muối, % theo
N
Hoạt động enzyme sau 6
ngày
nuôi đối với
100ml
α-amylase Glucomyla se
NaNO
3
0.3 145 8000
NaNO
3
0.15 26 3300
(NH
4
)
2
SO
2

0.15 - -
NH
4
NO
3
0.15 98 4100
Nhóm 6 Trang 23
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang
NH
4
NO
3
0.3 45 4900
NH
4
H
2
PO
4
0.3 5.5 8000
b. Ảnh hưởng của amino
acid:
- Amino acid có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon, nguồn nito vừa
là
nguồn năng
lượng.
- Một số amino acid riêng rẻ (glutamic acid, aspatic acid ) đóng vai
trò
vô cùng quan
trọng trong trao đổi amino acid, cụ thể là sinh tổng hợp

nhiều
amino acid khác trong
quá trình chuyển amine
hóa.
- Nhiều amino acid tham gia vào thành phần của các vitamin tan
trong
nước như:
pantotenic acid, biotin, folic acid,…các vitamin này có ý nghĩa
sinh
học rất lớn. Ngoài
ra sự tổng hợp ARN trong tế bào một số vi sinh vật
phụ
thuộc vào sự có mặt của amino
acid trong môi trường
nuôi.
- Amino acid có tính đặc hiệu của sự cảm ứng và kiềm chế sinh
tổng
hợp enzyme. Một số
amino acid kích thích và làm tăng cường sinh tổng
hợp
các enzyme amylase, một số lại
có tác dụng ức chế ngược và một số khác
thì
không có ảnh hưởng gì
cả.
c. Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh
dưỡng:
- Mg
2+
có ảnh hưởng tới độ bền nhiệt của enzyme. Thiếu MgSO

4
sẽ
có
ảnh hưởng xấu
đến sự tổng hợp mọi amylase bởi nấm sợi. khi đó sự tổng
hợp
α-amylase bị ức chế
hoàn toàn. Nồng độ tối ưu của muối này cho tổng hợp
α-
amylase là
0.05%.
- Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh
chất
(nucleic
phospholipide acid) và nhiều coenzyme, đồng thời đề phosphoryl
hóa
glucide trong quá
trình oxy hóa sinh học. phospho ảnh hưởng trực tiếp tới
sinh
sản của nấm sợi, do vậy
mà tăng cường tổng hợp enzyme. Các muối
phospho
thường được dùng với nồng độ
Nhóm 6 Trang 24
Trường ĐHCNTP TPHCM GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang
cao tới 0.15M. Hoạt độ của α-amylase tăng
cao
khi có 0.1%
KH
2

PO
4
.
- Canxi cần cho tổng hợp và ổn định α-amylase hoạt độ vì nó là cấu tử
không
thể thiếu
của enzyme này. Canxi còn có tác dụng bảo vệ amylase khỏi tác
dụng
của protease.
Muốn tích lũy nhiều α-amylase cần có lượng Ca trong môi
trường
là
0.01-0.05%.
- Lưu huỳnh kích thích sự tạo amylase. Lưu huỳnh với hàm lượng
0.04g/ml
môi trường
là sự thích hợp
nhất.
Ngoài các yếu tố đa lượng cần chú ý tới các yếu tố vi lượng. Chẳng hạn:
coban,
kẽm…
và các yếu tố gây ức chế sự tổng hợp enzyme amylase như: đồng,
thủ

y ngân,…
4.7. Các yếu

tối

ảnh

hưởng

đến

quá

trình lên
men:
a. Độ ẩm môi
trường:
Tốt nhất cho sự hình thành enzyme của nấm mốc Asp.oryzae là 55-60%. Độ
ẩm
môi
trường thích hợp cho sự hình thành bào tử là khoảng 45% nên cần giữ
cho
độ ẩm môi
trường không bị giảm trong quá trình phát triển. Ảnh hưởng
của
việc giữ ẩm trong quá
trình sinh trưởng tới sự tạo α-amylase của
Asp.oryzae
nuôi bằng phương pháp bề
mặt:
Bảng: ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo
α-
amylase
của Asp.oryzae nuôi bằng phương pháp bề
mặt
Nhóm 6 Trang 25