ứng dụng công nghệ enzyme trong sản xuất bia

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

BÁO CÁO THUYẾT TRÌNH
ĐỀ TÀI

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYME
TRONG SẢN XUẤT BIA

GVHD: Th.S Đỗ Thị Hiền

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2017
Mục Lục


1. Tổng quan

Bia là một loại nước uống chứa cồn được sản xuất bằng quá trình lên
men của đường lơ lửng trong môi trường lỏng và nó không được chưng cất
sau khi lên men. Nói một cách khác, bia là loại n ước gi ải khát có đ ộ c ồn
thấp, bọt mịn xốp và có hương vị đặc trưng của hoa houblon. Đặc bi ệt CO2
hòa tan trong bia có tác dụng giải nhiệt nhanh, hỗ tr ợ cho quá trình tiêu
hóa, ngoài ra trong bia còn chứa một lượng vitamin khá phong phú chủ yếu
là vitamin nhóm B như vitamin B1, B2, PP...). Nhờ những ưu đi ểm này, bia
được sử dụng rộng rãi ở hầu hết các nước trên thế giới với sản lượng ngày
càng tăng. Đối với nước ta bia đã trở thành loại đồ uống quen thu ộc v ới s ản
lượng ngày càng tăng và đã trở ngành công nghiệp mũi nh ọn trong ngành
công nghiệp nước ta.
Quá trình sản xuất bia được gọi là nấu bia. Do các thành ph ần s ử dụng
để sản xuất bia có khác biệt tùy theo từng khu vực, các đặc tr ưng c ủa bia
như hương vị và màu sắc cũng thay đổi rất khác nhau và do đó có khái ni ệm

loại bia hay các sự phân loại khác..
2. Nguyên liệu sản xuất bia
2.1 Nước

Nước tham gia trực tiếp vào quy trình công nghệ ( như gâm đ ại m ạch,
nấu malt, lọc dịch nha, lên men, trong công đoạn hiết rót…), tạo nên s ản
phẩm cuối cùng. Có thể nói nước là nguyên liệu chính để sản xuất bia do
trong bia hàm lượng nước chiếm đến 90÷92% trọng lượng bia. Thành
phần và hàm lượng của chúng ảnh hưởng rất lớn đến quy trình công ngh ệ
và chất lượng bia thành phẩm. Nước công nghệ được sử dụng trong quy
trình nấu malt, nấu gạo, rửa bã, ngâm đại mạch,...
∗ Yêu cầu của nước dùng trong sản xuất bia
- Hàm lượng muối cacbonat không quá 50mg/l.
- Hàm lượng muối Mg không quá 100mg/l.
- Hàm lượng muối Clorua 75÷150 mg/l.
- Hàm lượng muối CaSO4 130÷200mg/l .
- Hàm lượng Fe2+ không quá 0,3mg/l.
Công nghệ Enzyme nhóm 2

2


- Khí NH3 và các muối NO3 - , NO2 - : không có.
- Vi sinh vật không quá 100 tế bào /ml.
- E.coli, coliform: không có.
- Độ cứng: 4÷12 0Đ.
- PH: 6.5÷ 7
2.2 Đại mạch.



Đại mạch.

Hình 2.1: Hình ảnh

hạt đại mạch

Gồm 3 bộ phận chính:
- Vỏ hạt: từ ngoài vào trong được chia làm 3 lớp: vỏ trấu, vỏ lụa
và vỏ alơron. Phần này thường chiếm 8÷15% trọng lượng hạt.
- Phôi: là cơ quan sống hô hấp của hạt. Phôi có từ 37÷50% chất
khô là thành phần nitơ, khoảng 7% chất béo, 5÷6%
saccharose, 7÷7,5% pentozan, 6÷6,5% chất tro và một ít thành
phần khác. Riêng tinh bột hầu như rất ít. Phôi thường chiếm
2,5÷5% trọng lượng hạt .
- Nội nhũ: chiếm 45÷68% trọng lượng hạt, phần này của hạt đại
mạch giữ vai trò quyết định chất lượng của đại mạch trong
sản xuất bia .
Malt: Malt là tên gọi của ngũ cốc nảy mầm (đại mạch, ti ểu
mạch, hạt gạo, thóc gạo, thóc mếm). Tuy nhiên ở Việt Nam
chưa trồng được đại mạch, do đó phải nhập malt từ nước
Công nghệ Enzyme nhóm 2

3


ngoài nên chi phí sản xuất tăng lên. Do vậy giá thành của từng
loại bia tương ứng với hàm lượng malt nguyên chất, từ đó
cũng một phần quyết định xem bia có ngon hay không.

Hình 2.2: Malt và các Enzyme trong nó

∗ Một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng malt khô:
- Tỉ lệ thu hồi malt khô: 100kg đại mạch có w=15% sẽ s ản xu ất
được 75÷78kg malt khô có w=2÷4%
- Kiểm tra cảm quan:
+ Màu: malt vàng có màu vàng rơm, malt đen có màu s ẫm h ơn,
vỏ malt phải óng ánh, kích thước và hình dáng ph ải gi ống nh ư
hạt đại mạch khô.
+ Mùi và vị: phải đặt trưng cho từng loại malt, không có mùi l ạ,
nếu có mùi chua hoặc mốc chứng tỏ malt còn ẩm.
+ Về độ sạch: không lẫn tạp chất, hạt không bị vỡ (lượng hạt vỡ
tối đa là 15%), lượng hạt bệnh tối đa là 1%, lượng hạt không
nảy mầm tối đa là 5%.
- Những thành phần chính của malt khô (% chất khô):
+ Tinh bột: 58%
+ Pentose hòa tan 1%
+ Hexozan và pentozan không tan: 9,0%
Công nghệ Enzyme nhóm 2

4


+ Xenlulose: 6,0% 21
+ Sacarose : 5%
+ Đường khử: 4,0%
+ Protein(n*6,25): 10,0%
+ Protein hòa tan: 3,0%
+ Chất béo: 2,5%
+ Chất tro: 2.5%

2.3 Hoa houblon

Hoa houblon là nguyên liệu cơ bản đứng thứ 2 (sau đại mạch)
của công nghệ sản xuất bia. Hoa houblon làm cho bia có vị đắng
dịu, hương thơm rất đặc trưng làm tăng khả năng tạo và giữ bền
bọt, làm tăng độ bền keo và độ ổn định thành phần sinh học của
sản phẩm. do những đặc tính cực kì đặc biệt như vậy nên hoa
houblon vẫn giữ một vai trò độc tôn và là nguyên liệu không thể
thay thế trong ngành sản xuất bia.

Hình 2.3: Hoa houblon

Hoa houblon có hoa đực và hoa cái riêng biệt cho từng cây, trong
sản xuất bia chỉ sử dụng hoa cái chưa thụ phấn. Hoa đực không
được sử dụng vì nó rất nhỏ, chứa ít lượng phấn hoa (lupulin), chất
đắng cũng rất kém.
2.4 Men bia

Đã từ lâu, trong ngành sản xuất bia, các giống nấm men đựơc chia
thành 2 nhóm:
Công nghệ Enzyme nhóm 2

5


- Nhóm nấm men nổi với các đặc tính :
+ Nhiệt độ lên men: 10÷25
+ Lên men mạnh, quá trình lên men xảy ra trên bề mặt của môi
trường. Khi quá trình lên men kết thúc, các tế bào kết chùm,
chuỗi, tạo thành lớp dày trên bề mặt cùng với bọt bia, bia tự

trong chậm.
+ Khả năng lên men đường tam (rafinase) kém (chỉ đạt 33%).
- Nhóm nấm men chìm với các đặc tính:
+ Nhiệt độ lên men: 0÷10
+ Quá trình xảy ra trong lòng môi trừơng nên khả năng lên men
tốt.
+ Có khả năng lên men hoàn toàn (vì có thể lên men đường
rafinosse hoàn toàn).
+ Khi lên men xong, các tế bào kết thành chùm hoặc chuỗi kết
lắng xuống đáy thùng lên men rất nhanh, nhờ vậy bia chóng tự
trong hơn hên men nổi.
2.5 Phụ gia ủ bia.

-

Nhóm phụ gia trực tiếp: Gồm tất cả những nguyên liệu và
hóa chất có mặt trong thành phần của sản phẩm với sự ki ểm
soát chặt chẽ với hàm lượng cho phép: Các hóa ch ất xử lý đ ộ
cứng (HCl, Al2(SO4)3), caramen, chất điều chỉnh PH (acid

-

lactic, CaCl2),…
Nhóm phụ gia gián tiếp: bột trợ lọc, tác nhân làm lạnh, hóa
chất vệ sinh thiết bị,…

3. Quy trình công nghệ sản xuất bia.

Công nghệ Enzyme nhóm 2

6


4. Enzyme amylase sử dụng trong sản xuất bia:

4.1 Cấu tạo:
Enzyme α-Amylase là proteincó phân tử lượng thấp, thường nằm trong
khoảng 50.000 đến 60.000 Dal. Có một số trường hợp đặc biệt như αAmylase từ loài vi khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến
130.000 Dal. Đến nay người ta đã biết rất rõ các chuỗi acid amin của 18
loại α-Amylase nhưng chỉ có 2 loại α-Amylase là taka-Amylase từ
Apergillus orysee và α-Amylase của tụy lợn được nghiên cứu kỹ về hình
thể không gian cấu trúc bậc 3. Mới đây các nghiên cứu về tính đồng nhất
của chuỗi mạch acid amin và về vùng kị nước cho thấy các chuỗi mạch
acid amin của tất cả các Enzyme α-Amylase đều có cấu trúc bậc 3 tương
tự nhau.
Công nghệ Enzyme nhóm 2

7


Hình 4.1: cấu trúc không gian của phân tử α- amylaza
1

Cơ chế tác dụng:
-

α-Amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau.
αAmylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm
ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một
cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-Amylase không

chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên

-

nhưng với tốc độ rất chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-Amylase là quá trình đa giai
đoạn:
+ Giai đoạn đầu (dextrin hóa): Một số phân tử cơ chất bị thủy
phân tạo thành lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ
nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin bị
dịch hóa nhanh).
+ Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): Các dextrin phân tử thấp
tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không
cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi αAmylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác
dụng

của

α-Amylase,

amylose

bị

phân

giải

thành

oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose.
+ Giai đoạn 3: các poliglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên
các mạch polyglucosecolagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm
Công nghệ Enzyme nhóm 2

8


đến maltotetrose, maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác
dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và
87% maltose. Tác dụng của α-Amylase lên amylopectin cũng
xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6
glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù
có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường
nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử
thấp và isomaltose 8%.
Tóm lại, dưới tác dụng của α-Amylase, tinh bột chuyển thành
maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy
nhiên, thường α-Amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành
dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít
maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-Amylase là tính chất
đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại Amylase này
là Amylase dextrin hóa hay Amylase dịch hóa.
2

Ứng dụng trong sản xuất bia.
Trong công nghệ sản xuất bia truyền thống các nước phương Tây chủ
yếu sử dụng enzim α–amylase của malt để thủy phân tinh bột trong malt ,
sau đó đến giai đoạn rượu hóa bởi nấm men Saccharomyces . Cơ sở khoa
học của việc sử dụng malt là khi đại mạch chuyển từ trạng thái hạt sang

trạng thái nảy mầm, enzyme α–amylase sẽ được tổng hợp và enzyme này sẽ
thủy phân tinh bột có trong hạt tạo ra năng lượng và vật chất cho sự nảy
mầm. Enzyme α –amylase tác động vào giai đoạn đường hóa biến đổi tinh
bột thành các dextrin và maltose . Qúa trình này xảy ra trong giai đoạn nấu
bia. Trong quá trình này malt sau khi được nghiền sẽ hòa tan chung với
nước theo một tỷ lệ thích hợp dưới tác dụng của các enzyme ở nhiệt độ nhất
định sẽ được đường hóa trong nồi nấu malt.
Trong giai đoạn lên men tiếp theo, các chất đường , dextrin có phân tử
thấp sẽ được chuyển hóa thành rượu etylic, C02 và một số sản phẩm phụ
khác tạo thành bia theo yêu cầu kỹ thuật và chất lượng sản phẩm.

Công nghệ Enzyme nhóm 2

9


5. Bài báo khoa học: Đồng hóa lượng dextrin và đồng hóa asomaltose men bia đ ể
sản xuất bia có nồng độ carbohydrate thấp:
5.1 Tóm tắt:

Hầu hết Saccharomyces spp. không thể phân giải dextrin sau khi
lên men, đây là lượng Carbohydrate phổ biến thứ hai trong wort
để sản xuất bia thương mại. Dextrin-degrading của nhà sản xuất
bia và nấm men thể hiện gen glucoamylase (GAM1) từ
debaryomyces occidentalis được phát triển để sản xuất các loại
bia carbohydrate thấp (calorie). GAM1 thể hiện trong men bia của
nhà sản xuất bằng cách sử dụng một hệ thống tích hợp rDNA nấm
men chứa Gen CUP1 mã hóa kháng đồng như một chất đánh dấu
chọn lọc. Các DNA tái tổ hợp tiết glucoamylase hoạt động, hiển thị
cả α-1,4- và α-1,6-debranching hoạt tính, dextrin và isomaltose bị

phân huỷ, do đó đã sử dụng chúng như nguồn carbon duy nhất.
Một trong những dòng tái tổ hợp thể hiện GAM1: thủy phân
96% dextrin và 98% isomaltose trong vòng 5 ngày sau khi tăng
trưởng. Tăng trưởng, hấp thu chất nền, và hoạt động enzyme của
các chủng này là đặc trưng chính.
5.2 Giới thiệu

Dextrin là đường không lên men chính trong quá trình lên men
bia, chiếm 20-25% tổng lượng carbohydrate trong wort. Giảm
dextrin trong wort là điều kiện tiên quyết để sản xuất các loại bia
carbohydrate thấp. Số lượng lớn các enzyme ngoại sinh thủy phân
dextrin được thêm vào trước khi lên men để giải phóng đường lên
men từ dextrin trơ trong suốt quá trình ủ bia thông thường. Kỹ
thuật thay thế để sản xuất bia với dextrin giảm có thể được thiết
lập bằng cách cung cấp cho các nhà máy bia các dòng men biến đổi
gen biểu hiện các enzyme amylolytic. Giống α-amylase (ALP1) từ
Saccharomycopsis Fibuligera, gen dextranase (LSD1) từ Lipomyces
Công nghệ Enzyme nhóm 2

10


starkeyi và các gen glucoamylase (STA, SGA1,và GLA) từ
Saccharomyces diastaticus, S. cerevisiae, và S. fibuligera đã được s ử
dụng để phát triển men bia để giảm hàm lượng calo của bia. Tuy
nhiên, những nấm men tái tổ hợp này không thể phân hủy hoàn
toàn dextrin thành các loại đường có thể lên men (Hansen và c ộng
sự 1990, Liu và cộng sự, 2004, 2008, Wang và cộng sự 2010).
Các glucoamylase từ Debaryomyces occidentalis
(Schwanniomyces occidentalis) và Aspergillus awamori có các hoạt

động của cả α-1,4 và hydrolases α-1,6-debranching. Đặc biệt,
D.Occidentalis là men duy nhất có nguồn gốc ascosporogenic có
hoạt động của enzyme debranching đáng kể (dohmen et al. 1990;
Naim et al. 1991; Lin và cộng sự 1998). Trong nghiên cứu này,
chúng tôi xây dựng gấp đôi ribosome18S, các vectơ kết hợp rDNA
có chứa cả gen CUP1 đưa ra có sức chống chịu cao với đồng và D.
occidentalis chứa gen glucoamylase (GAM1) hoặc gen
glucoamylase A. awamori (GA1) để phát triển các chủng nấm men
công nghiệp của nhà sản xuất để có thể phân giải hoàn toàn lượng
dextrin trong quá trình lên men để sản xuất bia carbohydrate
thấp. Chúng tôi so sánh sự khác nhau về các dòng men của nhà s ản
xuất bia biểu hiện GAM1 hoặc GA1 sử dụng các vector tích hợp
trong nghiên cứu này về các hoạt động enzyme và đồng hóa các
dextrin và Isomaltose.

5.3 Vật liệu và phương pháp

5.3.1 Các chủng và plasmid
Công nghệ Enzyme nhóm 2

11


Escherichia coli DH5a được sử dụng để xây dựng và chuy ển
plasmid. Các chủng nấm men được sử dụng như là vật chủ cho thí
nghiệm biến đổi nấm men WLP 810, một nấm men lên men chìm
S. cerevisiae ATCC 18824, một nấm men lên men nổi S. cerevisiae
ATCC 26108 là nguồn gốc của gen CUP1. Plasmid YIpdAURSAdd
(Kang và cộng sự, 2003) đã được sử dụng để nhân bản gen CUP1.
YIpSG2rD và YIpAG2rD là trụ cột của hệ thống 2rDNA-integrative.

5.3.2 Điều kiện môi trường và nuôi cấy
Môi trường YPD [1% (w / v) chiết xuất nấm men, 2% (w / v)
Bacto-peptone và 2% (w / v) glucose] được sử dụng để nhân gi ống
S. cerevisiae. Nấm men được nuôi cấy trên các đĩa YNBD [0.67%
YNB, 2% (w / v) glucose và 2% (w / v) Bacto-agar] chứa 0.35 mM
CuSO4 và sau đó chuyển sang đĩa YPDS3 [YPD chứa 2% (w / v) tinh
bột hòa tan] và ủ trong 4 ngày ở 24 0C, sau đó chúng đã được ủ
trong 2 ngày ở 400C. Các tế bào nấm men được nuôi cấy trong môi
trường YPDex hoặc YPI [môi trường YP chứa 2% (w / v) dextrin
hoặc 2% (v / v) isomaltose] ở 24 0C trong 5 ngày để khảo sát các
hoạt động glucoamylase hiện diện trong nuôi cấy bề mặt. Dextrin
dư

và

isomaltose

được

khảo

sát

bằng

phương

pháp

phenol/sulfuric acid và dinitrosalicylic acid. Tất cả các thí nghi ệm

được tiến hành từ ba đến năm lần một cách độc l ập. Các k ết qu ả
được chỉ ra là trung bình ± SD của kết quả trung bình c ủa ba thí
nghiệm khác nhau. Các kết quả lập lại thu được, và các số li ệu
được thể hiện trong các bảng số liệu.

5.3.3 Thao tác ADN và biến nạp nấm men
Tất cả các thao tác DNA và biến nạp E. coli được ti ến hành
theo các phương pháp tiêu chuẩn. Sự biến nạp phức hợp men
Công nghệ Enzyme nhóm 2

12


được tiến hành thông qua phương pháp lithium acetate như Gietz
và cộng sự đã mô tả.
5.3.4 Xây dựng hệ thống tích hợp 2rDNA
Gen CUP1 được khuyếch đại bằng PCR sử dụng các
oligonucleotides5’-ACTGTCGACGGATCCCATT ACCGACATTTG-3’ và
5’ -TGAGTCGACGGTACC ATGAATAGCTTTTTT-3’. Những mồi được
thiết kế sử dụng các trình tự nucleotide đã được công bố của gen
CUP1 ATCC 26108 S. cerevisiae (mã số GenBank E00298). Phản
ứng PCR đã tạo ra các mảnh DNA khuếch đại 0,9 kb ch ứa toàn b ộ
khung đọc mở từ DNA di truyền của S. cerevisiae ATCC 26108, đã
trải qua quá trình giải mã với SalI và được đưa vào cùng m ột v ị trí
của YIp δAURSAδ với gen AMY đã loại bỏ để tạo ra YIp δAURCUδ.
Để xây dựng hệ thống 18S rDNA kép có chứa gen CUP1, m ột gen
CUP1 0,9 kb được tách khỏi YIpδAURCUδ đã được chèn vào vị trí
SalI trong YIpSG2rD và YIpAG2rD thiếu gen đề kháng G418, do đó
tạo ra YIpSGCU2rD và YIpAGCU2rD (Hình 1).
5.3.5 Phân tích enzyme

Hoạt tính của glucoamylase được định lượng ở pH 5,5 và 40 0C
sử dụng phương pháp PGO / ODAD (Sigma). Một đơn vị hoạt động
glucoamylase được xác định như là lượng enzyme gi ải phóng 1
µmol glucose ml-1 min-1 sử dụng 0,5% tinh bột hòa tan, dextrin,
hoặc isomaltose như chất nền enzyme. Tất cả các thí nghiệm
được lặp lại ba lần và đã được tính toán thực tiễn qua các công
thức.

Công nghệ Enzyme nhóm 2

13


Hình 1: Bản đồ Plasmid của YIpSGCU2rD và YIpAGCU2rD cho th ấy
kích thước tương đối, các vị trí gi ới hạn, và vị trí c ủa ADN chèn vào. M ỗi
vector hợp thành rDNA được tuyến tính hóa bởi sự dung n ạp SacII. Các
chuỗi vector DNA vi khuẩn chứa gen marker chống lại ampicillin, ngu ồn gốc
ColE1 (pUC) và gen URA3 (5,1 kb) đã được cắt bỏ.

5.3.6 Phân tích các sản phẩm phản ứng enzym bằng ph ương pháp
HPLC
Sự nuôi cấy bề mặt (50 µl) được ủ với 0,5% isomaltose trong
dung dịch natri phosphat 0,1 M (pH 5.5, 950 µl). Sau khi b ắt đ ầu ủ,
100 µl đã được lấy ra vào các thời đi ểm đã được chỉ định và các
sản phẩm được phân tích bằng phương pháp HPLC sử dụng một
cột Rezex RSO-oligosaccharide (200 x 10 mm, Phenomenex,
Torrance, CA, USA). Các điều kiện hoạt động là 750C với nước như
pha động ở 0,3 ml min-1. Hàm lượng đường được theo dõi bằng
máy dò RI.

Công nghệ Enzyme nhóm 2

14


5.4 Kết quả và thảo luận

5.4.1 Giới thiệu gen GAM1 hoặc GA1 vào nấm men của quá trình s ản
xuất bia.
Để tích hợp được nhiều bản sao của gen GAM1 hoặc GA1 vào
nhiễm sắc thể của nấm men công nghiệp, YIpSGCU2rD và YIpAG
CU2rD được tuyến tính hóa bằng cách phân cắt chuỗi 18S rDNA
bằng SacII (Hình 1), sau đó các chuỗi DNA nhỏ (7.4 hoặc 6.6 kb )
chứa các nhóm gen GAM1 và CUP1 hoặc các gen GA1 và CUP1 bên
cạnh các trình tự rDNA 18S đã được tích hợp vào chuỗi 18S rDNA
phân tán trong toàn bộ bộ gen S. cerevisiae (Lin và c ộng s ự, 1998;
Nieto và cộng sự, 1999). Hệ thống 18S rDNA kép tạo ra m ột đo ạn
nhỏ không cần thiết (nhỏ hơn 5,1 kb) chứa các chuỗi prokaryotic
và một marker đánh giá kháng ampicillin, đã được loại bỏ trước
khi chuyển đổi..
Theo Wang và các cộng sự (2010a, b), gen ILV2 mã hóa synthase
của α-acetolactate, chất tiền chất của diacetyl, đã được sử dụng
như một điểm tái kết hợp để đưa gen men amylolytic ngoại sinh
vào men bia và giảm hàm lượng diacetyl trong bia. Tuy nhiên, các
phương pháp tích hợp nhiều bản sao như tích hợp rDNA hoặc tích
hợp là những phương pháp thích hợp nhất để biểu hiện quá m ức
các gen glucoamylase ngoại bào trong men bia (Kim và cộng s ự
2010). Một số nhà nghiên cứu đã sử dụng các marker lựa chọn ch ủ
đạo như gen kháng G418 để chọn các con số tích phân s ố cao
(Wang và cộng sự, 1996). Tuy nhiên, các gen kháng kháng sinh như

gen kháng G418 không có trong các băng tích hợp của các ch ủng
nấm men hữu ích thương mại (Nieto và cộng sự, 1999). Men
metallothionein được mã hoá bởi gen CUP1 và đóng một vai trò
bảo vệ các tế bào nấm chống lại các chất oxy hóa, tương quan v ới
sự ổn định hương vị bia (Jamieson 1998, Wang và cộng sự, 2010a,
b). Vì gen CUP1 có nguồn gốc từ men là marker lựa chọn ưu tiên đã
Công nghệ Enzyme nhóm 2

15


được đưa vào nấm men của ngành công nghiệp, việc sử dụng nó
trong sản xuất nước giải khát thương mại là an toàn nên thích h ợp
cho các ứng dụng công nghiệp (Wang và cộng sự, 2010a, b).
5.4.2 Sự đồng hoá của dextrin và isomaltose bởi men bia s ản xu ất t ừ
các gen GAM1 hoặc GA1
Các men biến đổi trong bia thể hiện gen GAM1 hoặc GA1 được
nuôi cấy trong môi trường có chứa dextrin làm nguồn carbon đ ể
nghiên cứu khả năng thủy phân và hấp thu dextrin. Các dòng
hoang dã (S. cerevisiae ATCC 18824 và WLP 810) cho thấy mức
sinh trưởng thấp, không thủy phân dextrin. Các men chuy ển của
men bia biểu hiện GAM1 hoặc GA1 tăng đáng kể trong môi trường
chứa dextrin. Hơn nữa, sự phát triển của các men chuy ển th ể bi ểu
hiện GAM1 xảy ra ở các mức độ tương đối cao hơn so với các bi ến
thể biểu hiện gen GA1 (dữ liệu không được hiển thị).
Kết quả này cho thấy tốc độ tăng trưởng được cải thiện trong
các men biến thể trước đây có thể tương quan với hoạt động
glucoamylase cao ở nhiệt độ nuôi cấy thấp phù hợp với men bia.
Glucoamylase mã hoá GAM1 giữ lại đến 75% hoạt động tối đa ở 20
và 25 0C, và hơn 50% ở 150C (Sills và cộng sự.1984). Các hoạt động

của glucoamylase đã được kiểm tra trong các dịch nổi nuôi cấy từ
các biến thể được nuôi cấy trong môi trường YPDex. Các dòng vô
tính có mức hoạt động cao nhất đã được chọn từ các ch ất bi ến đ ổi
và được sử dụng cho các phân tích tiếp theo.
Kết quả (Bảng 1) cho thấy biến thể men đáy WLP 810 /
YIpSGCU2rD (tiết glucoamylase mã hoá GAM1) có hoạt tính
glucoamylase cao nhất ở 0,5 U ml-1. Hoạt tính glucoamylase bi ểu
hiện bởi WLP 810 / YIpSGCU2rD gấp 2,5 lần so v ới WLP 810 /
YIpagCU2rD tiết glucoamylase mã hoá GA1 (0,2 U ml-1, Kim và
cộng sự 2010). Ngược lại, các biến thể men đáy cho th ấy các ho ạt
động glucoamylase khoảng hai lần so với các bi ến th ể men trên.
Công nghệ Enzyme nhóm 2

16


Các phân tích về thời gian của các hoạt động glucoamylase, tăng
trưởng tế bào và thủy phân dextrin đối với các biến đổi men đáy ở
dưới (WLP 810 / YIpSGCU2rD và WLP 810 / YIpagCU2rD) trong 5
ngày được trình bày trong hình. 2. Tăng trưởng tế bào đã được tích
cực ảnh hưởng bởi các hoạt động enzyme, đạt được giá trị gần
như tối đa sau 3 ngày nuôi cấy. WLP 810 / YIpSGCU2rD s ử d ụng
96% dextrin trong môi trường nuôi cấy có chứa 2% (w / v) dextrin
trong suốt 5 ngày tăng trưởng, trong khi WLP 810 / YIpagCU2rD
sử dụng 75% dextrin trong môi trường nuôi cấy tương ứng. Với a là
một tế bào nấm men được nuôi cấy trong môi trường có chứa
dextrin (YPDex) ở 24 C trong 4 ngày.

Công nghệ Enzyme nhóm 2

17


có

Bảng 1 Các hoạt động của glucoamylase trong môi tr ường không

tế
bào
tự

nhiên của men bia và các chất biến đổi của chúng

Hình. 2 Thời gian tăng trưởng, suy thoái dextrin, và hoạt động

glucoamylase ngoại bào được sản xuất bởi WLP 810 / YIpSGCU2rD (a)
và WLP 810 / YIpagCU2rD (b) tại 24 C trong môi trường YPDex.

Tăng trưởng được đo bằng những ngày khác nhau dựa trên
trọng lượng khô của tế bào, và các hoạt động glucoamylase được
đo trong môi trường nuôi cấy trên bề mặt. Các giá trị dextrin còn
lại được trình bày dưới dạng tỷ lệ phần trăm xem dextrin trong
môi trường chưa được cấy như 100%; Mg ml-1 khối lượng tế bào
(vòng tròn); U ml-1 glucoamylase hoạt động (hình vuông); %
Dextrin dư (tam giác). Dữ liệu (trung bình ± SD) được l ấy từ ba thí
nghiệm độc lập được thực hiện trong ba lần
Những phát hiện này chỉ ra rằng bước hạn chế tốc độ tăng
trưởng từ dextrin là sự suy giảm hiệu quả của dextrin đến glucose
bằng glucoamylase (Hansen và cộng sự, 1990). Để làm sáng tỏ kh ả
năng glucoamylaza glucose của WLP 810 / YIpSGCU2rD và WLP

Công nghệ Enzyme nhóm 2

18


810 / YIpAGCU2rD để phân giải một liên kết a-1,6-glycosidic và a1,4 trong dextrin, các men chuyển dưới đáy được nuôi cấy trong
môi trường chứa isomaltose (disaccharide bao gồm glucose các
đơn vị liên kết bởi một liên kết a-1,6-glycosidic) như nguồn
carbon duy nhất. Tỷ lệ tăng trưởng, hoạt động glucoamylase và
hydrolysis isomaltose cho WLP 810 / YIpSGCU2rD trong 5 ngày

được so sánh với sự phát triển của WLP 810 / YIpagCU2rD. Nh ư
thể hiện trong hình. 3, WLP 810 / YIpSGCU2rD thủy phân 98%
isomaltose trong môi trường nuôi cấy có chứa 2% (w / v)
isomaltose trong 5 ngày tăng trưởng, trong khi WLP 810 /
YIpagCU2rD có tốc độ tăng trưởng tương đối thấp và không có s ự
giảm isomaltose riêng biệt.
Hình 3 Các đường cong tăng trưởng, thời gian của quá trình th ủy
phân isomaltose và hoạt tính glucoamylase ngoại bào được sản xu ất b ởi
WLP 810 / YIpSGCU2rD (a) và WLP 810 / YIpagCU2rD (b) t ại 24 0C
trong môi trường chứa isomaltose (YPI).

Tăng trưởng được đo bằng những ngày khác nhau dựa trên

trọng lượng khô của tế bào, và các hoạt động glucoamylase được
đo trong môi trường nuôi cấy trên bề mặt. Các giá trị isomaltose
Công nghệ Enzyme nhóm 2

19

còn lại được trình bày dưới dạng tỷ lệ phần trăm isomaltose trong
môi trường không nhiễm như 100%; Mg ml -1 khối lượng tế bào
(vòng tròn); U ml-1 glucoamylase hoạt động (hình vuông); % Dư
lượng isomaltose (tam giác). Dữ liệu (trung bình ± SD) được l ấy từ
ba thí nghiệm độc lập được thực hiện trong ba lần
Do đó glucoamylase mã hóa GAM1 của WLP 810 / YIpSGCU2rD
có hoạt tính a-1,6-debranching đáng kể và isomaltose bị thủy phân
thành glucose, trong khi glucoamylase mã hóa GA1 của WLP 810 /
YIpagCU2rD cho thấy hoạt tính rất thấp đối với a-1, 6, có th ể d ẫn
đến thủy phân chưa hoàn chỉnh của isomaltose trong nuôi cấy (Lin
et al., 1998). Theo các phân tích sản phẩm ph ản ứng enzyme b ằng
phương pháp HPLC (Hình 4), isomaltose là chất nền cho
glucoamylase mã hóa GAM1, do đó làm tăng sự giải phóng glucose
tự do với sự giảm isomaltose khi thời gian phản ứng đã qua, trong
khi glucoamylase mã hóa GA1 cho mức glucose th ấp và không có
thủy phân đáng kể isomaltose.

Hình. 4 Phân tích HPLC về các sản phẩm enzyme t ừ isomaltose b ằng

glucoamylase từ WLP 810 / YIpSGCU2rD (a) và WLP 810 / YIpagCU2rD
(b). Thời gian (h) trong ngoặc đơn cho thấy thời gian phản ứng enzym. I
isomaltose, G glucose

Công nghệ Enzyme nhóm 2

20


5.5 Kết luận

Cho đến nay, đã có nhiều nỗ lực để th ể hiện gen a-amylase và
glucoamylase trong men bia để làm suy giảm dextrin đối với các lo ại bia
carbohydrate thấp. Tuy nhiên, do khả năng thấp hoặc không có kh ả năng
thủy phân liên kết α-1,6, các dextrin không bị phân hủy hoàn toàn với
đường lên men (Liu và cộng sự, 2004, 2008, Wang và cộng sự 2010a, b).
Hansen và cộng sự (1990) đã báo cáo rằng nấm men của nhà s ản xu ất có
thể làm giảm chất dextrin hoàn toàn và đạt được mức đ ộ suy gi ảm rõ ràng
100% khi một enzyme như glucoamylase mã hóa GAM1 từ D. occidentalis,
thủy phân liên kết α-1,6 và α- 1,4 , đã được thêm vào.
Men nấm men mới tạo glucoamylase mã hóa GAM1 (WLP 810 /
YIpSGCU2rD) có thể được sử dụng để lên men men dưới đáy kéo dài b ởi vì
glucoamylase giữ được đến 30% hoạt tính tối đa của nó ở nhiệt độ th ấp
hơn nhiều hơn 10. Hơn nữa enzym này giữ lại đến 90% hoạt độ tối đa ở pH
4.0, đó là độ pH trung bình trong quá trình lên men bia (Sills et al 1984). Do
đó, nồng độ men bia của nấm men tiết ra glucoseaza D. occidentalis có th ể
hữu ích trong việc giảm dextrin ở nhiệt độ thấp và nhiệt độ trong suốt quá
trình sản xuất bia và thích hợp để sản xuất các lo ại bia carbohydrate th ấp.
Các nghiên cứu đang được tiến hành để giới thi ệu gen a-amylase c ủa D.
occidentalis (Kim và cộng sự 2011) vào các nấm men của Brewer đ ể cải
thiện tốc độ và hiệu quả thủy phân dextrin burger, phù hợp cho việc s ản
xuất bia ít Cacbonhydrat.

Công nghệ Enzyme nhóm 2

21


TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Công nghệ enzyme, Nguyễn Đức Lượng, NXB Đại Học Quốc Gia, 2004.

2. Công nghệ enzyme, Đặng Thị Thu, NXB Khoa học Kĩ thuật, 2012.
3. Công nghệ sản xuất Malt và bia, Hoàng Đình Hòa, NXB Khoa học Kĩ
thuật, 1998.
4. Khoa học – Công nghệ malt và bia, Nguyễn Thị Hiền, NXB Khoa học Kĩ
thuật, 2008.
5. Applycation of enzyme in brewing industry and it’s prospect, Wang Jianguo, China Brewing, 2004.
6. Construction of dextrin and isomaltose-assimilating brewer’s yeasts
for production of low-carbohydrate beer Jin Yeong Park,Ja-YeonLee,Seung-Hyun Choi,2014.
7. Enzyme in brewing, Hans Sejr Olsen, Biokemisk Forening, 2008.
8. Innovations in the brewing industry: light beer, Carlors A. Blanco, Isabel
Caballero, Rosa Barrios, and Antonio Rojas, Food sciences and nutrition,
2014.
9. Unmalted triticale cultivars as brewing adjuncts: efects of enzyme
activities and composition on beer wort quality, Jens Glatthar, Dr Jurgen J
Hrinisch, Dr Thomas Senn, Science of food and agriculture, 2004.
10. />11. />
Công nghệ Enzyme nhóm 2

22