CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC CHẾ PHẨM SINH HỌC BẰNG VSV TÁI TỔ HỢP BẰNG VSV TÁI TỔ HỢP ((recombinant microorganisms

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC CHẾ PHẨM SINH HỌC
BẰNG VSV TÁI TỔ HỢP

(recombinant

microorganisms


Production by recombinant microorganisms

 Sản phẩm
•
•
•

•
•
•

Vaccin tái tổ hợp (recombinant vaccines)
Tạo chế phẩm dùng trong test chẩn đoán bệnh
(components of diagnostic test)
Tạo những dược liệu từ VSV tái tổ hợp (insulin, interferon,
protein làm tan huyết khối , hormones tăng trưỏng , antigen
tumors- kháng nguyên từ tế bào ung thư, kháng thể đơn
dòng )
Tạo gen kháng sâu hại cho cây trồng – tạo thuốc trừ sâu
sinh học ( Bioinsecticide) .
Tạo dòng VSV phân giải chất dầu để chống ô nhiễm môi
trường
Tạo loại protein dùng trong nghiên cứu chức năng và cấu

Công nghệ sản xuất các chế phẩm sinh học dùng nông nghiệp, xử lý ô
nhiễm môi trường, dùng điều trị bệnh


 Products

from animal cell culture

with permission of Prof. Enfors, KTH, Sto


Tính chất quan trọng : protein tái tổ hợp là sản phẩm sơ cấp
của tế bào được tạo ra trong giai đọan tăng trưởng của tế bào.
Phase tăng trưởng và phase tạo sản phẩm của tế bào có thể
được phân biệt bằng cách sử dựng các inducable promoters

with permission of Prof. Enfors, KTH, Stockholm


 Những ưu điểm của proteins tái tổ hợp

1. Giá

rẻ (virus, bacteria, yeast dễ nuôi cấy )
2. Ít tốn công sức (ChỈ cần một phần tử của virus
3. Năng suất sản xuất cao ( Nuôi ở qui mô lớn với
năng suất cao
4. Không cần phải thử nghiệm trên cơ thể người hay

động vật .
5. Sản xuất được các Protein dùng trong nghiên cưu
cấu trúc và chức năng tế bào


Những kiểu nuội cấy
* Nuôi cấy từng mẻ (batch culture): dùng
trong trường hợp sản phẩm được thu hoạch
trước khi phase cân bằng xảy ra
*Nuôi cấy mẻ có bổ sung dưỡng chất
(Fed batch): Nuôi cấy có bổ sung dưỡng chất
trong phase tăng trưởng cấp số
* Nuôi cấy liên tục (Continuous): Kiểu này
ít được sử dụng vì tính chất sinh lý của tế
bào trong phase cực đại


Nuôi cấy từng mẻ (batch culture)


Nuôi cấy mẻ có bổ sung dưỡng chất (Fed batch)


Các kiểu reactor
•

Kiểu khuấy đảo (Stirred tank reactor):

Pha trộn và thông khí tốt nhưng thường làm tế bào bị
phá vở ( tế bào bị ly giải, giãm khả năng sinh tổng hợp,

làm gia tăng nhiều polisaccarid là tăng độ nhớt của môi
trường gây khó khăn trong việc vận hành qui trình lên
men
•

Kiểu cột có thổi bọt khí (Air lift & bubble columns):

Tuy ít làm tế bào bị tổn thương nhưng lại tạo nhiều
bọt dễ gây nhiễm và khó làm các thành phần dinh dưỡng
được hoà trộn đều


Kiểu khuấy đảo (Stirred tank reactor)

(From: )


Kiểu cột có thổi bọt khí (Air lift & bubble columns)


Kiểu khuấy đảo

Kiểu thổi bọt khí


Những sinh vật được tái tổ hợp gen
■

Mould: Aspergillus niger, extracellular product.
Yeast: S. cerevisie, Pichia pastoris.

■

Bacteria:

■

E.coli, dễ nuôi cấy nhưng thường tạo nội độc tố lipopolisaacarid, có enzime
protease hoạt lực cao
B. subtilis, tạo những sản phẩm ngoại bào –là vi khuẩn chiụ nhiệt
(Thermotolerant bacterie), proteins bền nhiệt , Tốc độ tăng trưởng cao , nguy cơ
tạp nhiễm thấp .
Pseudomonas, toxic substrate -nguy cơ tạp nhiễm thấp .
.

■
■

Mammalian cells:.
Insect cells: Spodoptera frugiperda (Sf) with baculovirus Autographa californica, higher
eucaryotic, easier to culture then mammalian

■

Transgenic animals or plants


Tính không ổn định của plasmid :
■

■
■

Cấu trúc plasmid dễ bị hư hỏng –(structural plasmid destruction,
multimerisation)
KHi phân chia tế bào con có thể mất plasmid.
Tế bào mẹ không có plasmid nhưng có thể tế bào con lại là tế bào mang
plasmid
So sánh giữa tế bào mang plasmid và tế bào không có plasmid thì
tế bào có plasmid có sự gia tăng hoạt động biến dưỡng hơn tế bào
không có plasmid




The type of animal cells

organism (e.g. epithelia, connective tissues, muscle,
nerve cells, lung, liver, kidney)

primer cell culture
cell line

cell strain
(specific stable properties like
marker chromosome,
marker enzyme, resistance)

permanent cell line

 The nature of animal cells
Tế bào tự do dạng huyền phù suspension(anchorage
independent )
Tế bào bị kết với chât mang Microcarriers(anchorage dependent - contact
inhibition, monolayer)
Những vi chất mang dùng cho cố định tế bào (Microcarriers for anchorage dependent cells)
 small spherical particles 100-200 mm diameter, 1.04 g/ml
 electrostatic or van der Waals forces with cell membrane

Dextran coated with DEAE (diethylaminoethyl) - positively charged

2-3 g/lit. carrier concentration => 2-3 x 10 6 cell/ml

The macroporous structure of Cytopore 1 is clearly seen on an
"empty" microcarrier.

Cytopore 1 filled with CHO cells.
(From: )


• agitation

• aeration
blended air and CO2,
bubbling can damage
(silicon tubing, surface aeration)

• pH control
bicarbonate buffer - (bicarbonate: pH increase, CO2 : pH drops)

HEPES buffer

• cell maintenance
controlled gradual decrease in temperature, down to -190 oC
warming up as quickly as possible to 37 oC at right pH!
major problem: infection by virus, bacteria, fungi, mycoplasma


 Những

vật

sự khác nhau giữa tế bào động vật và tê bào vi sinh


 Cell culture on laboratory scale

(Roux- bootles)
with permission of Prof. Enfors, KTH, Stockholm

(From: )




Nuôi cấy tế bào trong các reactor
A. Batch
• titre:

2-3 x 106 cell/ml ~ 0.6 g dry weight/lit.

• limiting factors: lack of nutrients, depletion/inactivation of growth
factors, surface on carrier, toxic metabolites (ammonia, lactate)

B. Fed-batch
• slightly

higher cell concentration
• more nutrients, but no removal of toxic metabolites

C. Contunuous



Production Figures from 7.5L CelliGen Plus Bioreactor

Run
No. 1

Duration Volume
(Days) Produced
42
270 L

MAb Yield
Recovered
0.93 g/day

Purified Mab
39.3 g

No. 2

33

250 L

1.02 g/day

33.8 g

No. 3

32

250 L

0.95 g/day

30.3 g


Hind III
5’

AGCTCA

AGCTTACTG

TCGAGTTCGA

ATGAC

5’


5
AGCTTACTG
’ AGCTCA
TCGAGTTCG
ATGAC
A

5’