Nghiên cứu vai trò của một số gốc axit amin đối với tính chất của β galactosidase từ bacillus subtilis VTCC DVN 12 01 phân lập ở việt nam bằng kỹ thuật ep RCA và đột biến điểm định hướng

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ THẢO

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ
GỐC AXIT AMIN ĐỐI VỚI TÍNH CHẤT CỦA
-GALACTOSIDASE TỪ Bacillus subtilis
VTCC-DVN-12-01 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM
BẰNG KỸ THUẬT ep-RCA VÀ
ĐỘT BIẾN ĐIỂM ĐỊNH HƯỚNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2017


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Nguyễn Thị Thảo

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ
GỐC AXIT AMIN ĐỐI VỚI TÍNH CHẤT CỦA
-GALACTOSIDASE TỪ Bacillus subtilis VTCC-DVN12-01 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT
ep-RCA VÀ ĐỘT BIẾN ĐIỂM ĐỊNH HƯỚNG

Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Quyền Đình Thi
Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2017


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới cố PGS. TS Quyền Đình Thi, nguyên
Trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, nguyên Phó Viện trưởng Viện Công
nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng
nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, biên tập bản thảo bài báo và tạo mọi điều kiện hóa
chất, thiết bị cũng như kinh phí để hoàn thành Luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Văn Hạnh, Trưởng phòng Các chất chức
năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học đã sửa các bản thảo bài báo và cho tôi sử
dụng số liệu trong khuôn khổ đề tài “Nâng cao hoạt tính xúc tác của enzyme tái tổ
hợp β-galactosidase bằng kỹ thuật sao chép lỗi DNA vòng và đột biến điểm trực
tiếp” thuộc đề tài Nghiên cứu cơ bản 2011-2012 của Quỹ phát triển Khoa học và
Công nghệ Quốc gia do TS làm chủ nhiệm.
Tôi xin cảm ơn GS. TS Trương Nam Hải, nguyên Trưởng phòng Kỹ thuật di
truyền, nguyên Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ hướng dẫn phân
tích cấu trúc enzyme.
Tôi xin cảm ơn TS. Đỗ Thị Tuyên, phụ trách phòng Công nghệ sinh học Enzyme,
Viện Công nghệ sinh học đã giúp tôi hoàn thành các thủ tục để bảo vệ Luận án ở các
cấp. Tôi cũng xin cảm ơn tập thể Phòng CNSH Enzyme, đã tạo điều kiện về thời gian,
chia sẻ chuyên môn và giúp đỡ tận tình trong suốt quá trình thực hiện Luận án.
Tôi xin cảm ơn Phòng quản lý tổng hợp, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công
nghệ gen, các cán bộ tại cơ sở đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất, máy

móc và giúp đỡ tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ,
tạo điều kiện và động viên tôi trong suốt thời gian học tập.
Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm 2017
Tác giả

Nguyễn Thị Thảo

i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
1. Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác;
2. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn án là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép
của các đồng tác giả;
3. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm 2017
Tác giả

Nguyễn Thị Thảo

ii


CÁC TỪ VIẾT TẮT
bp
BOD

BSA
cfu
COD
CS
DNA
ep-RCA
Gal
Glc
GHF
GOS
IPTG
kb
kDa
M
PCR
oNP
oNPG
pNPG/pNP-gal
pNP-fuc
rpm
SDS-PAGE
SOC
TIM
TLC
TE
TBE
TEMED
v/v
w/v
WT

Base pair (cặp bazơ)
Biochemical oxygen demand (Nhu cầu oxy sinh hóa)
Bovine serum albumin (Albumin huyết thanh bò)
Colony forming unit (Đơn vị xác định số lượng tế bào riêng rẽ
của vi khuẩn hoặc nấm)
Chemical oxygen demand (Nhu cầu oxy hóa học)
Cộng sự
Deoxyribonucleic acid (Axit deoxyribonucleic)
Error prone rolling circle amplification (Sao chép vòng tạo lỗi)
Galactose (đường galactozơ)
Glucose (đường glucozơ)
Glycoside hydrolase family (Họ các enzym thủy phân liên kết
glycozit)
Galactose-oligossacharide
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside
Kilo base (Đơn vị đo kích thước của phân tử ADN)
Kilo Dalton (Đơn vị đo khối lượng của phân tử protein)
Marker (Thang chuẩn)
Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)
Ortho-Nitrophenyl
Ortho-Nitrophenyl--D-galactopyranoside
para-Nitrophenyl--D-galactopyranoside
para-Nitrophenyl--D-fucopyranoside
Round per minute (Vòng/phút)
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
(Điện di gel polyacrylamit có bổ sung sodium dodecyl sulfate)
Super optimal broth (Môi trường giàu dinh dưỡng cho vi khuẩn)
Triose-phosphate isomerase
Thin-layer chromatography (Sắc ký bản mỏng)

Tris EDTA
Tris boric acid EDTA
N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamine
Volume/volume (Thể tích/thể tích)
Weight/volume (Trọng lượng/thể tích)
Wild type (Dạng ban đầu)

iii


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................. ii
CÁC TỪ VIẾT TẮT........................................................................................................ iii
MỤC LỤC ....................................................................................................................... iv
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................ vii
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................................... ix
DANH MỤC PHỤ LỤC .................................................................................................. xi
MỞ ĐẦU.......................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................................................4
1.1

Thông tin chung về -galactosidase ............................................................. 4

1.1.1 Định nghĩa ..................................................................................................... 4
1.1.2 Nguồn gốc và phân loại .................................................................................. 4
1.1.3 Cấu trúc ......................................................................................................... 8
1.1.4 Cơ chế phản ứng .......................................................................................... 15
1.2

Ứng dụng ................................................................................................. 18

1.2.1 Trong công nghiệp chế biến sữa ................................................................... 19
1.2.2 Trong xử lý whey ......................................................................................... 20
1.2.3 Trong y dược................................................................................................ 23
1.2.4 Một số ứng dụng khác .................................................................................. 24
1.3

Tình hình nghiên cứu β-galactosidase trong và ngoài nước ........................ 25

1.3.1 Các hướng nghiên cứu trên thế giới .............................................................. 25
1.3.2 Các nghiên cứu trong nước........................................................................... 31
1.3.3 Hướng nghiên cứu của đề tài ........................................................................ 32
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 35
2.1

Vật liệu và hóa chất .................................................................................. 35

2.1.1 Vật liệu ........................................................................................................ 35
2.1.2 Hóa chất và dung dịch .................................................................................. 36
2.1.3 Thiết bị thí nghiệm ....................................................................................... 38
2.2

Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 38

iv


2.2.1 Tạo đột biến ngẫu nhiên trên gen lacA.......................................................... 38

2.2.2 Xây dựng thư viện các dòng mang gen lacA đột biến ................................... 41
2.2.3 Tạo đột biến điểm và đột biến điểm suy biến ............................................... 42
2.2.4 Xây dựng và phân tích cấu trúc enzyme ....................................................... 43
2.2.5 Sàng lọc hoạt tính -galactosidase từ các dòng mang gen lacA đột biến ....... 43
2.2.6 Tách DNA plasmid ...................................................................................... 44
2.2.7 Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn ............................................................... 45
2.2.8 Điện di agarose ............................................................................................ 45
2.2.9 Xác định trình tự DNA ................................................................................. 45
2.2.10 Biểu hiện và tinh sạch LacA tái tổ hợp ......................................................... 45
2.2.11 Điện di SDS-PAGE ...................................................................................... 46
2.2.12 Xác định hàm lượng protein ......................................................................... 47
2.2.13 Xác định hoạt tính thủy phân của -galactosidase ......................................... 48
2.2.14 Xác định khả năng chuyển hóa glycoside của -galactosidase ...................... 49
2.2.15 Đặc điểm của LacA tự nhiên và đột biến ...................................................... 50
2.2.16 Xử lý số liệu ................................................................................................. 52
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...................................................................................................... 53
3.1

Tạo đột biến ngẫu nhiên............................................................................ 54

3.1.1 Tạo đột biến ngẫu nhiên trên gen lacA.......................................................... 54
3.1.2 Tạo thư viện các dòng mang gen lacA đột biến và sàng lọc hoạt tính ............ 57
3.1.3 Phân tích trình tự các dòng đột biến.............................................................. 59
3.1.4 Xác định điểm đột biến làm thay đổi hoạt tính LacA .................................... 60
3.2

Tạo đột biến điểm suy biến........................................................................ 66

3.2.1 Xác định vùng liên kết cơ chất của LacA ...................................................... 67
3.2.2 Tạo thư viện đột biến điểm suy biến ............................................................. 68

3.2.3 Sàng lọc hoạt tính và chọn dòng ................................................................... 69
3.2.4 Phân tích trình tự các dòng đột biến.............................................................. 69
3.2.5 Tinh sạch và xác định hoạt tính riêng của LacA đột biến điểm suy biến .............. 72
3.3

Đánh giá tính chất lý hóa của các LacA đột biến ........................................ 77

3.3.1 Nhiệt độ hoạt động tối ưu ............................................................................. 78
3.3.2 pH hoạt động tối ưu...................................................................................... 79
3.3.3 Ảnh hưởng của pH đến độ bền LacA tự nhiên và đột biến ............................ 80

v


3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền LacA tự nhiên và đột biến .................... 81
3.3.5 Động học của LacA tự nhiên và đột biến ...................................................... 85
3.3.6 Ảnh hưởng của đột biến đến khả năng tạo oligosaccharide ........................... 86
3.4

Phân tích sự ảnh hưởng của các đột biến đến cấu trúc của LacA ............... 88

3.4.1 Ảnh hưởng của vị trí Ala301 đến cấu trúc của LacA..................................... 88
3.4.2 Ảnh hưởng của vị trí Phe361 đến cấu trúc của LacA .................................... 91
3.4.3 Ảnh hưởng của vị trí Leu373 đến cấu trúc của LacA .................................... 93
CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN ............................................................................................................................. 97
4.1

Tạo đột biến ngẫu nhiên trên gen lacA ...................................................... 97

4.2

Đánh giá ảnh hưởng của các vị trí đột biến tìm được trên LacA................. 98

4.2.1 Ảnh hưởng của axit amin Ala301 ................................................................. 99
4.2.2 Ảnh hưởng của các axit amin dự đoán liên kết với cơ chất ......................... 103
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................................................ 112
CÁC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .......................................................... 113
THESIS ABSTRACT ................................................................................................... 114
TÀI LỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 121
PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 1

vi


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1.

10
Cấu trúc -galactosidase của E. coli thuộc họ GHF-2. ................................................................

Hình 1.2.

10
Cấu trúc của -galactosidase từ K. lactis. ................................................................................................

Hình 1.3.

11
So sánh cấu trúc -galactosidase từ người với một số vi sinh vật khác ................................

Hình 1.4.

12
Cấu trúc của -galactosidase từ B. circulans ATCC 31382. ................................................................

Hình 1.5.

Cấu trúc không gian 3 chiều và vùng trung tâm hoạt động của LacA. ................................
14

Hình 1.6.

16
Động học phản ứng thủy phân lactose của -galactosidase.................................................................

Hình 1.7.

Động học phản ứng thủy phân lactose của -galactosidase với hai axit glutamic
17
trong trung tâm hoạt động. ................................................................................................................................

Hình 1.8.

Sự tổng hợp oligosaccharide.................................................................................................22

Hình 1.9.

Sơ đồ so sánh phương pháp error prone-RCA với các phương pháp đột biến
ngẫu nhiên khác. ................................................................................................................................

33

Hình 2.1.

Cơ chế tạo đột biến ngẫu nhiên bằng sao chép lỗi vòng DNA.................................................................
40

Hình 2.2.

Các bước trong quá trình tạo đột biến định hướng. ................................................................
42

Hình 2.3.

Đường chuẩn hàm lượng albumin huyết thanh bò theo Bradford................................. 48

Hình 2.4.

49
Sự thủy phân của oNPG bởi -galactosidase.................................................................................................

Hình 2.5.

Đồ thị Lineawever-Burk. ................................................................................................................................
51

Hình 3.1.

Điện di đồ sản phẩm plasmid pELacA sau phản ứng ep-RCA. ................................................................
55

Hình 3.2.

Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid pELacA từ các dòng trong thư viện đột biến
ngẫu nhiên bằng BamHI và NotI ................................................................................................
57

Hình 3.3.

Điện di đồ sản phẩm PCR khuôn pELacA với các cặp mồi đột biến. ................................
60

Hình 3.4A.

Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Glu62 trên LacA ................................
61

Hình 3.4B.

Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Arg77 trên LacA................................
61

Hình 3.4C.

Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Ala191 trên LacA ................................
62

Hình 3.4D.

62

Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin A301 trên LacA ................................

Hình 3.4E.

Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Phe361 trên LacA................................
62

Hình 3.4F.

Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Ala429 trên LacA ................................
63

Hình 3.4G.

Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Ala524 trên LacA ................................
63

Hình 3.5.

SDS-PAGE protein tổng số của các dòng đột biến điểm biểu hiện LacA. ................................
64

Hình 3.6.

SDS-PAGE LacA tinh sạch từ các dòng đột biến điểm.................................................................
64

Hình 3.7.

Kết quả dự đoán các vị trí axit amin tương tác với cơ chất theo chương trình

67
SWISS-MODEL.................................................................................................................................

Hình 3.8.

Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại khuôn pElacA với các cặp mồi đột biến.................................
68

vii


Hình 3.9.

Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Ala301 trên LacA-WT
và các LacA đột biến.................................................................................................................................
70

Hình 3.10.

Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Leu373 trên LacA-WT
72
và các LacA đột biến.................................................................................................................................

Hình 3.11.

SDS-PAGE protein tổng số của một số dòng đột biến điểm biểu hiện LacA. ................................
73

Hình 3.12.

SDS-PAGE LacA tinh sạch từ một số dòng đột biến điểm.................................................................
74

Hình 3.13.

Nhiệt độ hoạt động tối ưu của LacA-WT và các LacA đột biến. ................................................................
78

Hình 3.14.

pH hoạt động tối ưu của LacA-WT và các LacA đột biến. ................................................................
79

Hình 3.15.

Ảnh hưởng pH đến độ bền LacA-WT và các LacA đột biến ở pH 4. ................................
81

Hình 3.16.

82
Độ bền của LacA-WT và các LacA đột biến ở 45 và 50C. ................................................................

Hình 3.17.

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính LacA và các đột biến. ................................
85

Hình 3.18A.

Sắc ký bản mỏng sản phẩm chuyển hóa của LacA-WT và các LacA đột biến tại
vị trí 301. ................................................................................................................................................................
87

Hình 3.18B.

Sắc ký bản mỏng sản phẩm chuyển hóa của LacA-WT và các LacA đột biến tại 88
vị trí Phe361 và Leu373. ................................................................................................................................

Hình 3.19.

Một phần cấu trúc bậc hai của LacA-WT và LacA đột biến ở vị trí Ala301.................................
89

Hình 3.20.

Mối tương tác với cơ chất trong vùng xúc tác của LacA-WT và các đột biến tại
90
Ala301.................................................................................................................................................................

Hình 3.21.

Một phần cấu trúc bậc hai của LacA-WT và LacA đột biến Phe361Tyr.................................
91

Hình 3.22.

Kết quả phân tích cấu trúc 3D của LacA-WT và LacA-361Tyr. ................................................................
92

Hình 3.23.

Kết quả phân tích mối tương tác với cơ chất trong vùng trung tâm LacA-WT và
LacA-361Tyr. ................................................................................................................................
92

Hình 3.24.

Một phần cấu trúc bậc hai của LacA-WT và LacA đột biến tại Leu373.................................
94

Hình 3.25.

Kết quả phân tích mối tương tác với cơ chất trong vùng trung tâm LacA-WT và
LacA đột biến tại Leu373.................................................................................................................................
95

Hình 4.1.

Sự phân bố của các đột biến nucleotide trên gen lacA.................................................................
97

Hình 4.2.

100
Trình tự một phần của -galactosidase thuộc họ 42 từ các loài khác nhau. ................................

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1.

6
Nguồn -galactosidase từ vi sinh vật................................................................................................

Bảng 1.2.

15
Độ tương đồng về trình tự axit amin của LacA với một số -galactosidase khác................................

Bảng 1.3.

15
Các vị trí axit amin của LacA được dự đoán liên kết với cơ chất ................................................................

Bảng 1.4.

Tính chất của một số -galactosidase từ vi sinh vật ................................................................19

Bảng 1.5.

β-Galactosidase hoạt động ở nhiệt độ thấp và độ bền nhiệt................................................................
25

Bảng 2.1.

Các cặp mồi tạo đột biến điểm ............................................................................................................................
35

Bảng 2.2.

Các cặp mồi đột biến điểm suy biến................................................................................................
36

Bảng 2.3.

Các hóa chất thí nghiệm chính ............................................................................................................................
36

Bảng 2.4.

Thành phần các loại đệm và dung dịch................................................................................................
37

Bảng 2.5.

Các thiết bị thí nghiệm................................................................................................................................
38

Bảng 2.6.

Thành phần gel cô và gel tách .............................................................................................................................
47

Bảng 2.7.

Quan hệ giữ 1/V và 1/[S] ................................................................................................
51

Bảng 3.1.

55
Ảnh hưởng của nồng độ MnCl2 đến khả năng khuếch đại DNA trong phản ứng RCA .............................

Bảng 3.2.

Tần suất đột biến nucleotide trên gen lacA ở các nồng độ MnCl2 khác nhau ................................
56

Bảng 3.3.

Các dạng đột biến nucleotide trong phản ứng RCA ở nồng độ 1,5 mM MnCl2................................
56

Bảng 3.4.

Sàng lọc hoạt tính LacA của các dòng có khả năng mang gen lacA đột biến................................
58

Bảng 3.5.

59
Hoạt tính LacA còn lại của một số dòng LacA đột biến sau khi ủ ở 50C ................................

Bảng 3.6.

Các axit amin đột biến của LacA từ một số dòng có hoạt tính thay đổi so với dòng
ban đầu ................................................................................................................................................................

59

Bảng 3.7

Các bước tinh sạch LacA-WT và các LacA đột biến ngẫu nhiên từ E. coli
JM109(DE3) ................................................................................................................................ 65

Bảng 3.8.

Hoạt tính của LacA ban đầu và LacA đột biến................................................................................................
66

Bảng 3.9.

Sàng lọc hoạt tính các dòng đột biến ................................................................................................
69

Bảng 3.10.

71
Đột biến thay thế axit amin khác nhau tại một số vị trí trên LacA.................................................................

Bảng 3.11.

Tinh sạch LacA-WT và các LacA đột biến điểm suy biến từ E. coli JM109(DE3)................................
75

Bảng 3.12.

Hoạt tính đặc hiệu của LacA ban đầu và LacA đột biến với cơ chất oNPG................................

77

Bảng 3.13.

Độ bền pH của LacA-WT và các LacA đột biến.............................................................................................
80

Bảng 3.14.

Thời gian bán hủy của LacA-WT và các LacA đột biến ................................................................
84

Bảng 3.15.

Các thông số động học của LacA-WT và đột biến với cơ chất oNPG................................86

Bảng 3.16.

Sự thay đổi số lượng liên kết với cơ chất và ion kim loại của các axit amin trong
vùng trung tâm xúc tác của LacA đột biến tại vị trí Ala301 ................................................................
89

Bảng 3.17.

So sánh sự tương tác của các axit amin được dự đoán liên kết với cơ chất ở LacA 90

ix


đột biến tại Ala301 ................................................................................................................................

Bảng 3.18.

So sánh sự tương tác của các axit amin được dự đoán liên kết với cơ chất khi Tyr
thay thế cho Phe ở vị trí 361 ................................................................................................................................
93

Bảng 3.19.

Sự thay đổi số lượng liên kết với cơ chất và ion kim loại của các axit amin trong 93
vùng trung tâm xúc tác của LacA đột biến tại vị trí Phe361................................................................

Bảng 3.20.

Sự thay đổi số lượng liên kết với cơ chất và ion kim loại của các axit amin trong
vùng trung tâm xúc tác của LacA đột biến tại vị trí 373................................................................
94

Bảng 3.21.

So sánh sự tương tác của các axit amin được dự đoán liên kết với cơ chất khi Tyr
95
thay thế cho Phe ở vị trí 373 ................................................................................................................................

x


DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1.

Trình tự nucleotide thay đổi tại vị trí 120 trên gen lacA của một số dòng đột biến ................................
1

Phụ lục 2.

Trình tự nucleotide thay đổi tại vị trí W331 trên gen lacA của một số dòng đột biến ................................
1

Phụ lục 3.

Trình tự nucleotide thay đổi tại vị trí 361 trên gen lacA ................................................................
2

Phụ lục 4.

Trình tự nucleotide thay đổi tại vị trí 371, 373 và 374 của một số dòng đột biến................................
2

Phụ lục 5.

3
Hoạt tính đặc hiệu của LacA ban đầu và LacA đột biến với cơ chất oNPG................................

Phụ lục 6.

3
Nhiệt độ hoạt động tối ưu của LacA-WT và các LacA đột biến ................................................................

Phụ lục 7.

pH hoạt động tối ưu của LacA-WT và các LacA đột biến ................................................................
4

Phụ lục 8.

Độ bền pH của LacA-WT ................................................................................................................................
5

Phụ lục 9.

Độ bền pH của LacA đột biến A301E................................................................................................
6

Phụ lục 10.

Độ bền pH của LacA đột biến A301Y ................................................................................................
7

Phụ lục 11.

Độ bền pH của LacA đột biến A301V ................................................................................................
8

Phụ lục 12.

Độ bền pH của LacA đột biến F361Y................................................................................................
9

Phụ lục 13.

Độ bền pH của LacA đột biến L373C ................................................................................................
10

Phụ lục 14.

Độ bền pH của LacA đột biến L373M................................................................................................
11

Phụ lục 15.

12
Độ bền nhiệt của LacA-WT và các LacA đột biến ở 30 và 40C ................................................................

Phụ lục 16.

Độ bền nhiệt của LacA-WT ở các nồng độ cơ chất khác nhau ................................................................
14

Phụ lục 17.

15
Độ bền nhiệt của LacA-301E ở các nồng độ cơ chất khác nhau ................................................................

Phụ lục 18.

Độ bền nhiệt của LacA-301V ở các nồng độ cơ chất khác nhau................................................................
16

Phụ lục 19.

Độ bền nhiệt của LacA-301Y ở các nồng độ cơ chất khác nhau................................................................
17

Phụ lục 20.

Độ bền nhiệt của LacA đột biến Y361F ở các nồng độ cơ chất khác nhau ................................
18

Phụ lục 21.

Độ bền nhiệt của LacA đột biến L373C ở các nồng độ cơ chất khác nhau ................................
20

Phụ lục 22.

Độ bền nhiệt của LacA đột biến L373M ở các nồng độ cơ chất khác nhau ................................
21

Phụ lục 23.

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính của LacA-WT và biến thể ................................
22

xi


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề

-Galactosidase (hay còn gọi là lactase), thuộc nhóm các enzyme chuyển hóa
saccharide, cắt các gốc -D-galactose từ đầu không khử của các -galactoside
galactoside của các poly- và oligosaccharide hoặc các sản phẩm chuyển hóa bậc hai.
Enzyme này phổ biến trong tự nhiên và được tìm thấy ở vi sinh vật, thực vật, động
vật và người. Trong đó, -galactosidase được sinh tổng hợp chủ yếu từ vi sinh vật
như nấm men, nấm mốc và vi khuẩn và đây cũng là nguồn enzyme có giá trị thương
mại hơn so với từ thực vật và động vật vì dễ thao tác, tốc độ sinh trưởng nhanh và
năng suất tổng hợp cao.
-Galactosidase được ứng dụng nhiều trong y dược, môi trường, công nghệ sinh
học và đặc biệt là công nghiệp chế biến sữa. Với 75% dân số trên thế giới thiếu hụt
enzyme lactase để phân giải lactose của sữa, nên đây được xem là một ứng dụng
quan trọng của -galactosidase trong ngành công nghiệp này. Ngoài ra galactosidase còn được bổ sung vào quá trình lên men bơ sữa để tránh sự kết tinh
của lactose ở nhiệt độ thấp và tăng độ ngọt cho sản phẩm. Đặc biệt gần đây, galactosidase đã được khai thác mạnh vào việc sản xuất thực phẩm chức năng là
tổng hợp galacto-oligosaccharide (GOS) nhờ hoạt tính chuyển gốc glycosyl trong
quá trình thủy phân lactose trong sữa để tạo thành các oligosaccharide. GOS được
sử dụng như nguồn thức ăn không tiêu hóa (prebiotic) để kích thích hệ vi khuẩn hữu
ích đã hiện diện trong đường ruột. Để đáp ứng nhu cầu trong ngành công nghiệp
này, -galactosidase từ rất nhiều nguồn vi sinh vật đã được nghiên cứu khai thác.
Trong số này -galactosidase từ B. subtilis cũng rất được chú ý bởi khả năng hoạt
động tối ưu trong khoảng pH 6-7, bền ở nhiệt độ 30-40C rất thích hợp cho ứng
dụng thủy phân lactose trong sữa cũng như trong các sản phẩm chế biến khác từ sữa.
Đây cũng là một enzyme có tiềm năng để ứng dụng trong một số lĩnh vực khác và
B. subtilis cũng đã được biết là một chủng an toàn được sử dụng rộng rãi trong công
nghiệp thực phẩm.


2
Bên cạnh đó, để chủ động hơn trong việc ứng dụng cũng như lĩnh vực ứng dụng,
ngoài việc sàng lọc và tuyển chọn vi sinh vật sinh tổng hợp các enzyme mới có hiệu
suất xúc tác cao và tính chất như mong đợi, sự phát triển của công nghệ DNA cũng

cho phép chúng ta có thể chủ động hơn trong việc cải biến protein/enzyme để nâng
cao hiệu suất xúc tác cũng như phát triển các tính chất mới của enzyme. Phương
pháp tạo đột biến ngẫu nhiên trong in vitro hoặc in vivo cùng với việc lựa chọn di
truyền và phương pháp sàng lọc nhanh, là những công cụ mạnh để phát triển
enzyme với những đặc tính mới so với ban đầu.
Từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu vai trò
của một số gốc axit amin đối với tính chất của β-galactosidase từ Bacillus subtilis
VTCC-DVN-12-01 phân lập ở Việt Nam bằng kỹ thuật ep-RCA và đột biến điểm
định hướng”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Xác định vai trò của một số axit amin quan trọng của -galactosidase (LacA)
từ B. subtilis VTCC-DVN-12-01.
- Tìm được LacA đột biến có tính chất mới so với enzyme ban đầu.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tạo đột biến ngẫu nhiên gen (lacA) mã hóa -galactosidase từ
B. subtilis VTCC DVN-12-01 bằng phương pháp ep-RCA (error prone rolling circle
amplification, sao chép lỗi DNA vòng) và sàng lọc các dòng mang gen lacA đột
biến có hoạt tính tăng hoặc có các tính chất mới như nhiệt độ hoạt động, độ bền
nhiệt độ so với LacA ban đầu.
- Sử dụng chương trình dự đoán cấu trúc protein/enzyme, kết hợp với so sánh
trình tự axit amin với các -galactosidase trong cùng họ đã được xác định cấu trúc
để dự đoán một số axit amin quan trọng tham gia trực tiếp trong quá trình thủy phân
cơ chất của LacA để từ đó tạo đột biến điểm định hướng nhằm tạo ra các LacA có
các tính chất mới so với enzyme ban đầu.


3
4. Những đóng góp mới của luận án
(i) Xây dựng được thư viện đột biến ngẫu nhiên gen lacA mã hóa betagalactosidase của B. subtilis VTCC-DVN-12-01 bằng phương pháp ep-RCA với tần
suất đột biến đạt 2,7 đột biến/kb.

(ii) Xác định được 6 vị trí axit amin quyết định đến hoạt tính của LacA gồm
Arg120, Asn158, Trp331, Glu371, Lys372 và His374.
(iii) Xác định được một số thay đổi axit amin ở vị trí Ala301, Phe361 làm tăng độ
bền LacA và một số thay đổi tại vị trí Leu373 làm tăng nhiệt độ hoạt động của LacA.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Về khoa học: Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về
phương pháp tạo đột biến ngẫu nhiên trên gen bằng phương pháp lỗi DNA vòng,
đột biến điểm suy biến. Kết quả cũng cung cấp thông tin về vai trò quan trọng của
một số axit amin của -galactosidase từ B. subtilis VTCC DVN-12-01 ảnh hưởng
đến hoạt tính và tính chất của enzyme.
Về ý nghĩa thực tiễn: Những kết quả thu được có thể áp dụng để cải biến các
β-galactosidase khác trong cùng họ enzyme thủy phân liên kết glycoside GHF-42
(Glycoside Hydrolase Family 42) nhằm thay đổi hoạt tính cũng như phát triển các
tính chất mới của enzyme.


4

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Thông tin chung về -galactosidase

1.1.1 Định nghĩa
-Galactosidase (-D-galactohydrolase, E.C.3.2.1.23), thuộc nhóm các enzyme
chuyển hóa saccharide trong họ các enzyme thủy phân, cắt các gốc -D-galactose từ
đầu không khử của các -galactoside (CAZy, />Ngoài ra, β-galactosidase còn được gọi là enzyme tiêu hóa lactose hay
lactase có mặt trong ruột non ở hầu hết động vật có vú giúp thủy phân lactose
(Järvelä et al., 2009).

1.1.2 Nguồn gốc và phân loại
1.1.2.1 Nguồn gốc
-Galactosidase phân bố rộng rãi ở vi sinh vật, thực vật, động vật và người. Ở
thực vật enzyme này có thể ở dạng hòa tan hoặc bám vào thành tế bào ở một số mô,
chúng phân giải các cơ chất như glycoprotein, glycolipid, flavonoid và alkaloid.
-Galactosidase đầu tiên ở thực vật được tìm thấy là ở những cây họ hoa hồng như
mơ, đào, táo (Wallenfels and Malhotra, 1961). Gần đây, người ta cũng tìm thấy
enzyme này ở một số hệ thực vật khác và các gen mã hóa tương tự nhau hoặc có độ
tương đồng cao. Một số nghiên cứu về các quá trình sinh học đã cho thấy βgalactosidase tham gia vào sự sinh trưởng của tế bào (Dopico et al., 1990; Gomez et
al., 1995), quá trình chín của quả (Ali et al., 1995; Carey et al., 1995) và huy động
khả năng dự trữ, nảy mầm của hạt (Buckeridge and Reid, 1994; Alcântara et al.,
1999; Kim et al., 2003). Chúng cũng liên quan đến việc giải phóng năng lượng dự
trữ trong quá trình sinh trưởng nhanh, giải phóng galactose tự do trong chu trình
chuyển hóa bình thường của galactolipid, glycoprotein và trong việc tạo thành của
tế bào (Smith and Gross, 2000).


5
Ở động vật, người ta tìm thấy β-galactosidase ở ruột cá rô phi (Taniguchi and
Takano, 2004), ở động vật có vú như dê (Gaur et al., 2000) và người. Chúng có
nhiều ở thành ruột non của hầu hết động vật có vú và người, đặc biệt là ở trẻ em
hàm lượng enzyme cao hơn vì chức năng chính là phân giải lactose.
Ở vi sinh vật, β-galactosidase được tìm thấy ở nấm men, nấm mốc và vi khuẩn.
Nguồn enzyme từ vi khuẩn có giá trị thương mại hơn so với từ thực vật và động vật
vì dễ thao tác, tốc độ sinh trưởng nhanh và năng suất tổng hợp cao. Một lượng lớn
các loài vi sinh vật đã được biết đến như một nguồn cung cấp β-galactosidase
thương mại tiềm năng (Bảng 1.1) (Panesar et al., 2010).
β-Galactosidase có thể được tổng hợp ở nhiều loại vi khuẩn khác nhau, nhưng
trong đó Streptococcus thermophilus và Bacillus stearothermophilus được coi như

nguồn enzyme tiềm năng. Ở nấm mốc β-galactosidase thường hoạt động tối ưu
trong khoảng pH từ 2,5 đến 5,4. Do đó, chúng rất thích hợp cho công nghệ sản xuất
các sản phẩm sữa lên men. Nhiệt độ tối ưu cho các enzyme này rất cao và có thể
được ứng dụng trong điều kiện sản xuất ở nhiệt độ lên tới 50C. Một số nguồn
enzyme từ nấm mốc như Asperilus niger và Asperilus oryae đã được sử dụng trong
công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa. Đặc biệt enzyme từ Crytococcuss
laurentii và Sterigmatomyces elviae có hoạt tính chuyển gốc galactosyl cao do vậy
được ứng dụng để sản xuất galacto-oligosaccaride từ lactose (Panesar et al., 2010).
Nấm men được coi là một trong những nguồn tổng hơp -galactosidase quan
trọng trong ngành công nghiệp. Với pH tối ưu trung tính, đây là điều kiện rất thích
hợp cho quá trình thủy phân lactose trong sữa và được chấp nhận rộng rãi vì tính an
toàn khi sử dụng trong công nghiệp thực phẩm. Nhiều công trình nghiên cứu sản
xuất -galactosidase từ các chủng nấm men khác nhau được thực hiện vì tiềm năng
ứng dụng cao của nó. Các sản phẩm thương mại -galactosidase từ nguồn nấm men
như Maxilact (Hà Lan), Lactase (Ý) được tách chiết từ Kluyveromyces lactis và
Lactozym (Đan Mạch) từ Kluyveromyces fragilis (Roy and Gupta, 2003).


6

Bảng 1.1. Nguồn -galactosidase từ vi sinh vật
Nguồn: (Panesar et al., 2010)
Nguồn

Vi sinh vật
Alicyclobacillus acidocaldarius, Arthrobacter sp.
Bacillus acidocaldarius, B. circulans, B. coagulans, B. subtilis,
B. megaterum, B. stearothermophilus
Bacteriodes polypragmatus
Bifidobacterium bifidum, B. infantis

Clostridium acetobutylicum, C. thermosulfurogens
Corynebacterium murisepticum
Enterobacter agglomerans, E. cloaceae, Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae

Vi khuẩn

Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. delbrueckii, L. helviticus,
L. kefiranofaciens, L. lactis, L. sporogenes, L. themophilus,
Leuconostoc citrovorum
Pediococcus acidilacti, P. pento
Propioionibacterium shermanii
Pseudomonas fluorescens, Pseudoalteromonas haloplanktis
Streptococcus cremoris, S. lactis, S. thermophius
Sulfolobus solfatarius
Thermoanaerobacter sp.
Thermus rubus, T. aquaticus
Trichoderma reesei, Vibrio cholera, Xanthomonas campestris
Alternaria alternate, A. palmi
Aspergillus foelidis, A. fonsecaeus, A. fonsecaeus, A. carbonarius, A. oryzae
Auerobasidium pullulans, Curvularia inaequalis
Fusarium monilliforme, F. oxysporum

Nấm mốc

Mucor meihei, M. pusillus
Neurospora crassa
Penicillum canescens, P. chrysogenum, P. expansum
Saccharopolyspora rectivergula, Scopulariapsis sp.
Streptomyces violaceus

Bullera singularis

Nấm men

Candida pseudotropicalis
Saccharomyces anamensis, S. lactis, S. fragilis
Kluyveromyces bulgaricus, K. fragilis, K. lactis, K. marxianus


7
1.1.2.2 Phân loại
Theo Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử Quốc tế
(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and
Molecular Biology - NC-IUBMB), enzyme được phân lớp (EC – Enzyme
Classification) dựa vào phản ứng hóa học và đặc hiệu cơ chất của enzyme. Theo
tiêu chí này, β-galactosidase thuộc phân lớp EC 3.2.1.23:
-

Lớp: enzyme thủy phân (3),

-

Phân lớp: glycosylase (2),

-

Dưới phân lớp: glycosidase - hydrolysing O-glycosyl (1),

-

Enzyme: -glycoside (23).

Tuy nhiên, hệ thống EC không sử dụng cấu trúc hoặc thông tin tiến hóa và ít sử
dụng cho phân loại enzyme khi cơ chất phù hợp chưa biết. Do đó Henrissat đã đưa ra
một hệ thống phân loại dựa vào trình tự axit amin, tính kỵ nước và cơ chế phản ứng
(Henrissat, 1991). Theo tiêu chí này, β-galactosidase hiện nay được chia thành 4 họ
thủy phân glycoside (GHF, Glycoside Hydrolase Family) là 1, 2, 35 và 42 dựa vào
sự tương đồng về chức năng. Tuy nhiên, hiện nay trên hệ thống CAZy
(Carbohydrate-active Enzymes), ngoài 4 họ trên, β-galactosidase còn có thêm nhóm
mới trong họ GHF-59 là β-galactosidase từ Clostridium cellulolyticum. Mặc dù vậy,
sự phân nhóm này cũng chưa rõ ràng vì enzyme này có thể thủy phân nhiều cơ chất
khác

nhau

như

cellobiose,

cellotriose,

cellotetraose,

p-nitrophenyl-beta-

glucopyranoside, lactose và o-nitrophenyl-beta-galactopyranoside, trong đó hiệu suất
xúc tác Kcat/Km với cơ chất cellodextrin cao hơn 2-4 lần so với lactose và Kcat/Km
với cellodextrin và cũng cao hơn cellobiose, cellotriose, cellotetraose nên được đề
nghị cellodextrin glucohydrolase (EC 3.2.1.74), họ GHF-1 (Liu et al., 2010).
GHF-42 đã được công nhận là một nhóm khác biệt vào 1993. Dựa vào trình tự,

các enzyme GHF-42 có một cấu trúc trung tâm Triose phosphate isomerase (TIM)
(α/β)8 và axit amino đóng vai trò chất cho proton và ái nhân nằm trên các chuỗi β số
4 và 7 của trung tâm TIM nên những enzyme này thuộc dưới họ 4/7 (Jenkins et al.,


8
1995). Theo nhìn nhận ban đầu, cấu trúc của β-galactosidase nhóm GHF-42 có
domain trung tâm (α/β)8 giống với các enzyme của nhóm GHF-2, nhưng toàn bộ
cấu trúc bậc 4 lại không giống nhau (Hidaka et al., 2002).
β-Galactosidase từ eukaryote được phân vào nhóm GHF-35, ngoại trừ
β-galactosidase từ K. lactis và K. marxianus. Hai enzyme này được xếp vào họ
GHF-2 cùng với β-galactosidase từ Arthrobacter sp. và E. coli. Trong khi họ
GHF-42 chỉ gồm β-galactosidase từ các sinh vật đơn bào (chủ yếu là vi khuẩn), một
số từ vi khuẩn cổ và nấm. Các β-galactosidase thuộc họ GHF-42 có hoạt tính thủy
phân lactose (Kang et al., 2005b, a; Yuan et al., 2008) và chuyển gốc galactosyl để
tổng hợp galacto-oligosaccharide (GOS).

1.1.3 Cấu trúc
1.1.3.1 Cấu trúc chung của -galactosidase
-Galactosidase có khối lượng phân tử rất khác nhau và cấu trúc đa dạng ở các
loài. -Galactosidase tách chiết từ quả kiwi gồm ba tiểu phần khoảng 59 kDa (Ross
et al., 1993). Ở lúa mạch -galactosidase gồm hai tiểu phần là 45 kDa và 33 kDa, ở
củ cải gồm hai tiểu phần 46 kDa và 33 kDa và ở hạt Vông nem (Erythrina indica)
cũng có hai tiểu phần 74 kDa và 78 kDa (Kotake et al., 2005; Rakesh and Shobhana,
2007). Ở người, -galactosidase ở người có 1927 axit amin gồm bốn tiểu phần và ở
thỏ có 1926 axit amin (Mantei et al., 1988).
Riêng ở vi sinh vật -galactosidase cũng rất đa dạng về cấu trúc bậc một, cấu
trúc bậc bốn và khối lượng phân tử. Từ các protein đơn phân có khối lượng
75 kDa như ở B. subtilis đến các -galactosidase gồm nhiều dưới đơn vị có khối
lượng lớn (hơn 700 kDa) như T. aquaticus YT-1 (Berger et al., 1997).

-Galactosidase từ nấm men cũng có những khác biệt về mặt cấu trúc cũng như về
khối lượng phân tử như -galactosidase của S. lactis chỉ có một tiểu đơn vị với khối
lượng 124 kDa, trong khi ở S. fragilis enzyme này lại có hai tiểu đơn vị với khối
lượng phân tử là 90 kDa và 120 kDa.
Với các cấu trúc đại diện từ tất cả 4 họ GHF-1, GHF-2, GHF-35 và GHF-42 của


9

các -galactosidase đã được xác định như S. pyogenes (Stepper et al., 2013) thuộc
họ GHF-1; E. coli (Juers et al., 2001; Matthews, 2005), Arthrobacter sp. (Skalova
et al., 2005) thuộc họ GHF-2; T. reesei (Hypocrea jecorina) (Maksimainen et al.,
2011) và Penicillium sp. (Rojas et al., 2004) thuộc nhóm GHF-35; Thermus sp.
(Hidaka et al., 2002), B. circulans sp. alkalophilus (Maksimainen et al., 2012),
B. circulans ATCC 31382 (Ishikawa et al., 2015) thuộc họ GHF-42 cho thấy chúng
đều có một đặc điểm chung trong cấu trúc của nhóm enzyme này là được phân chia
thành các domain khác nhau bao quanh một domain trung tâm có cấu trúc xoắn
(/)8, hay còn gọi là đơn vị TIM (gồm 8 chuỗi xoắn  và 8 chuỗi xoắn gấp nếp ).
Đây cũng là cấu trúc đặc trưng của họ enzyme thủy phân liên kết glycoside. Cấu
trúc của các domain còn lại đều ở dạng chuỗi gấp nếp . Cũng như những enzyme
đã biết khác có chứa đơn vị TIM, vị trí hoạt động của -galactosidase nằm phần
cuối đầu C của domain trung tâm. Đối với -galactosidase có cấu trúc gồm nhiều
tiểu phần, mỗi tiểu phần cũng đều có dạng cấu trúc như trên và trung tâm hoạt động
có thể nằm trên hai hay nhiều tiểu phần.
Cấu trúc không gian ba chiều của -galactosidase được nghiên cứu đầy đủ nhất là
từ E. coli. Trình tự của -galactosidase ở E. coli đã được xác định đầu tiên vào năm
1970 với 1023 axit amin và tới năm 1994, cấu trúc của enzyme này được xác định
với kích thước 464 kDa (Jacobson et al., 1994). -Galactosidase có 4 tiểu đơn vị với
điểm đối xứng ở vị trí 222, mỗi tiểu đơn vị được tạo thành từ một chuỗi polypeptide
khối lượng 116 kDa với 1023 axit amin (Hình 1.1A) (Juers et al., 2001).

Các axit amin trong chuỗi gấp nếp thành năm domain liên tiếp xếp xung quanh
domain thứ ba có cấu trúc dạng kết hợp giữa xoắn  và gấp nếp  (/) ở trung tâm.
Các domain còn lại đều cuộn xoắn kiểu gấp nếp beta, nhưng có cấu trúc khác nhau.
Domain 1 cuộn xoắn theo kiểu vòng tròn linh động, domain 2 và 4 lại ở dạng kết hợp
globulin và domain 5 cuộn theo kiểu -sandwich (Hình 1.1B) (Matthews, 2005). Phần
trung tâm hoạt động gồm bốn domain khác nhau nằm trên hai tiểu đơn vị liền kề, tạo
thành hình một túi nhỏ có kích thước vừa khít với kích thước phân tử lactose. Trung
tâm này nằm ở ngay đầu của domain 3, kết hợp với các gốc của domain 1 và domain 5


10
trên cùng một tiểu đơn vị và của domain 2 trên tiểu đơn vị khác (Juers et al., 2001).
Hoạt động bề mặt

Vị trí hoạt
động

Vị trí hoạt
động

B

A

Hình 1.1. Cấu trúc -galactosidase của E. coli thuộc họ GHF-2.
Nguồn: A (Juers et al., 2001); B (Matthews, 2005)

Vùng
xúc tác

Vùng nối

Vùng nối

A

B

Hình 1.2. Cấu trúc của -galactosidase từ K. lactis.
Cấu trúc bậc 3 (A) và cấu trúc monomer (B) của -galactosidase từ K. lactis
Nguồn: (Pereira-Rodríguez et al., 2012)


11

-Galactosidase từ K. lactis (thuộc GHF-2) cũng có cấu trúc gồm nhiều tiểu
phần đã được xác định. Cấu trúc này gồm 4 tiểu phần (Hình 1.2A) và mỗi tiểu phần
được cuộn xoắn thành 5 domain khác nhau (Hình 1.2B). Domain 1 (từ axit amin 32
đến 204) cuộn xoắn kiểu vòng tròn linh động. Domain 2 (205-332) và 4 (643-720)
hình thành cấu trúc dạng liên kết globulin, giống các domain -sandwich. Domain 3
(333-642) cuộn xoắn thành một đơn vị TIM quanh trung tâm xúc tác. Domain 5 (7411025) được xem như một chuỗi nhỏ của β-galactosidase. Có hai vùng không cuộn
xoắn mà ở dạng chuỗi dài là vùng đầu N (từ axit amin 2 đến 31) và một chuỗi nhỏ (từ
axit amin 721-740) nối giữa domain 4 và 5. Trung tâm hoạt động gồm hai axit amin
Glu482 và Glu551 (Pereira-Rodríguez et al., 2012).
-Galactosidase ở người hay còn gọi là lactase-phlorizin hydrolase (LPH), thuộc
GHF-35, cũng được nghiên cứu kỹ về cấu trúc và chức năng. LPH là một enzyme
đặc biệt của đường ruột gồm 1927 axit amin. Sản phẩm chuyển hóa đầu tiên của
LPH là ở dạng pre-pro-LPH dài 1927 axit amin và phần tín hiệu gồm 23 axit amin.

Hình 1.3. So sánh cấu trúc -galactosidase từ người với một số vi sinh vật khác.

Nguồn: (Ohto et al., 2012)

Cấu trúc monomer của LPH được cuộn xoắn thành 3 domain là domain trung tâm
TIM hay chuỗi cuộn xoắn (α/β)8 từ 1-359, domain β-1 từ 397-514 và domain
β-2 từ 545-647 (Hình 1.3). Domain trung tâm TIM cũng được hình thành bởi cấu trúc
gấp nếp gồm 8 chuỗi xoắn α và 8 chuỗi xoắn gấp nếp β. Domain 1 được tạo thành từ


12
4 chuỗi β, còn domain 2 được tạo thành từ 6 chuỗi β. Domain trung tâm TIM và
domain β-1 được nối với một vòng lặp khoảng 50 Å (từ axit amin 360-396, sau này
được coi là vòng TIM- β1). Vòng này vắt ngang qua domain 2 và phần axit amin
372-384 của vòng được thêm vào cấu trúc chuỗi β của domain 2 (Ohto et al., 2012).
Cấu trúc monomer của LPH cũng tương đồng với các -galactosidase khác
thuộc họ GH35 là Penicillium sp. (Psp β-Gal) và T. reesei (Tri β-Gal) với domain
trung tâm TIM có cấu trúc cuộn xoắn (α/β)8 (Hình 1.3). Psp β-Gal (1011 axit amin,
monomer) tương đồng 23% và Tri β-Gal (1023 axit amin, monomer) tương
đồng 16% so với LPH.
Gần đây, Ishikawa và CS (2015) đã xác định cấu trúc tinh thể của
-galactosidase (BgaD) từ B. circulans ATCC 31382 thuộc họ GHF-42. BgaD cấu
tạo chỉ có một tiểu phần và được chia thành năm domain khác nhau, trong đó
domain 1 và 2 là domain Glyco_hydro_2_N (liên kết với đường), một domain xúc
tác chứa đơn vị TIM với phần dưới cùng tạo thành một túi nhỏ được cho là phù hợp
với các phân tử disaccharide và vị trí của túi này không bị ảnh hưởng bởi cấu trúc
của các domain khác (Hình 1.4). Trung tâm xúc tác của BgaD gồm ba axit amin là
Glu447, Tyr511 và Glu532, trong đó hai axit Glu447 và Glu532 đóng vai trò
axit/base (cho và nhận proton trong quá trình xúc tác) (Ishikawa et al., 2015).
Đầu C

Domain BID_1

(733-847)

Domain Glyco_hydro_2
(38-202)

Đầu N

Domain chưa xác định
(638-732)

Domain Glyco_hydro_2
(203-320)

Domain xúc tác
(321-637)

Trung tâm
hoạt động

Hình 1.4. Cấu trúc của -galactosidase từ B. circulans ATCC 31382.
Nguồn: (Ishikawa et al., 2015)