Nghiên cứu vai trò của một số gốc axit amin đối với tính chất của β galactosidase từ bacillus subtilis VTCC DVN 12 01 phân lập ở việt nam bằng kỹ thuật ep RCA và đột biến điểm định hướng tt

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ THẢO

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ
GỐC AXIT AMIN ĐỐI VỚI TÍNH CHẤT CỦA
β-GALACTOSIDASE TỪ Bacillus subtilis VTCC-DVN-12-01
PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT ep-RCA VÀ
ĐỘT BIẾN ĐIỂM ĐỊNH HƯỚNG

Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62 42 01 16

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC


2

Hà Nội - 2017


Công trình được hoàn thành tại:
Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS Quyền Đình Thi
Viện Công nghệ sinh học

Phản biện 1: ............................................................
………………………………………
Phản biện 2: ............................................................

………………………………………
Phản biện 3: ............................................................
………………………………………

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án phiên chính thức
Họp tại: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam
18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Vào hồi ...... giờ ......, ngày ...... tháng ...... năm 201...

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia
- Thư viện Viện Công nghệ sinh học


4
- Webside:


1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
β-Galactosidase (hay còn gọi là lactase), thuộc nhóm các enzyme chuyển hóa
saccharide, cắt các gốc β-D-galactose từ đầu không khử của các β-galactoside
galactoside của các poly- và oligosaccharide hoặc các sản phẩm chuyển hóa bậc
hai. Enzyme này phổ biến trong tự nhiên và được tìm thấy ở vi sinh vật, thực vật,
động vật và người. Trong đó, β-galactosidase được sinh tổng hợp chủ yếu từ vi sinh
vật như nấm men, nấm mốc và vi khuẩn và đây cũng là nguồn enzyme có giá trị
thương mại hơn so với từ thực vật và động vật vì dễ thao tác, tốc độ sinh trưởng
nhanh và năng suất tổng hợp cao.
β-Galactosidase được ứng dụng nhiều trong y dược, môi trường, công nghệ

sinh học và đặc biệt là công nghiệp chế biến sữa. Với 75% dân số trên thế giới
thiếu hụt enzyme lactase để phân giải lactose của sữa, nên đây được xem là một
ứng dụng quan trọng của β-galactosidase trong ngành công nghiệp này. Ngoài ra βgalactosidase còn được bổ sung vào quá trình lên men bơ sữa để tránh sự kết tinh
của lactose ở nhiệt độ thấp và tăng độ ngọt cho sản phẩm. Đặc biệt gần đây,
β-galactosidase đã được khai thác mạnh vào việc sản xuất thực phẩm chức năng là
tổng hợp galacto-oligosaccharide (GOS) nhờ hoạt tính chuyển gốc glycosyl trong
quá trình thủy phân lactose trong sữa để tạo thành các oligosaccharide. GOS được
sử dụng như nguồn thức ăn không tiêu hóa (prebiotic) để kích thích hệ vi khuẩn
hữu ích đã hiện diện trong đường ruột. Để đáp ứng nhu cầu trong ngành công
nghiệp này, β-galactosidase từ rất nhiều nguồn vi sinh vật đã được nghiên cứu khai
thác. Trong số này β-galactosidase từ B. subtilis đang rất được chú ý bởi khả năng
hoạt động tối ưu trong khoảng pH 6-7, bền ở nhiệt độ 30-40°C rất thích hợp cho
ứng dụng thủy phân lactose trong sữa cũng như trong các sản phẩm chế biến khác
từ sữa. Đây cũng là một enzyme có tiềm năng để ứng dụng trong một số lĩnh vực
khác và B. subtilis cũng đã được biết là một chủng an toàn được sử dụng rộng rãi
trong công nghiệp thực phẩm.
Bên cạnh đó, để chủ động hơn trong việc ứng dụng cũng như lĩnh vực ứng
dụng, bên cạnh việc sàng lọc và tuyển chọn vi sinh vật sinh tổng hợp các enzyme
mới có hiệu suất xúc tác cao và tính chất như mong đợi, sự phát triển của công
nghệ DNA cũng cho phép chúng ta có thể chủ động hơn trong việc cải biến
protein/enzyme để nâng cao hiệu suất xúc tác cũng như phát triển các tính chất mới
của enzyme. Phương pháp tạo đột biến ngẫu nhiên trong in vitro hoặc in vivo cùng
với việc lựa chọn di truyền cùng với phương pháp sàng lọc nhanh, là những công
cụ mạnh để phát triển enzyme với những đặc tính mới so với ban đầu.


2
Từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu vai trò
của một số gốc axit amin đối với tính chất của β-galactosidase từ Bacillus subtilis VTCCDVN-12-01 phân lập ở Việt Nam bằng kỹ thuật ep-RCA và đột biến điểm định hướng”.
2. Mục đích nghiên cứu

- Xác định vai trò của một số axit amin quan trọng của β-galactosidase (LacA)
từ B. subtilis VTCC-DVN-12-01.
- Tìm được LacA đột biến có tính chất mới so với enzyme ban đầu.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tạo đột biến ngẫu nhiên gen (lacA) mã hóa β-galactosidase từ
B. subtilis VTCC-DVN-12-01 bằng phương pháp sao chép lỗi DNA vòng (error
prone rolling circle amplification, ep-RCA) và sàng lọc các dòng mang gen lacA
đột biến có hoạt tính tăng hoặc có các tính chất mới như nhiệt độ hoạt động, độ bền
nhiệt độ so với LacA ban đầu.
- Sử dụng chương trình dự đoán cấu trúc protein/enzyme, kết hợp với so sánh
trình tự axit amin với các β-galactosidase trong cùng họ đã được xác định cấu trúc
để dự đoán một số axit amin quan trọng tham gia trực tiếp trong quá trình thủy
phân cơ chất của LacA để từ đó tạo đột biến điểm định hướng nhằm tạo ra các
LacA có các tính chất mới so với enzyme ban đầu.
4. Những đóng góp mới của luận án
(i) Xây dựng được thư viện đột biến ngẫu nhiên gen lacA mã hóa
β-galactosidase của B. subtilis VTCC-DVN-12-01 bằng phương pháp ep-RCA với
tần suất đột biến đạt 2,7 đột biến/kb.
(ii) Xác định được sáu vị trí axit amin quyết định đến hoạt tính của LacA gồm
Arg120, Asn158, Trp331, Glu371, Lys372 và His374.
(iii) Xác định được một số thay đổi axit amin ở vị trí Ala301, Phe361 làm tăng độ
bền LacA và một số thay đổi tại vị trí Leu373 làm tăng nhiệt độ hoạt động của LacA.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Về khoa học: Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về
phương pháp tạo đột biến ngẫu nhiên trên gen bằng phương pháp lỗi DNA vòng,
đột biến điểm suy biến. Kết quả cũng cung cấp thông tin về vai trò quan trọng của
một số axit amin của β-galactosidase từ B. subtilis VTCC DVN-12-01 ảnh hưởng
đến hoạt tính và tính chất của enzyme.
Về ý nghĩa thực tiễn: Những kết quả thu được có thể áp dụng để cải biến các
β-galactosidase khác trong cùng họ enzyme thủy phân liên kết glycoside GHF-42

(Glycoside Hydrolase Family 42) nhằm thay đổi hoạt tính cũng như phát triển các


3
tính chất mới của enzyme.
*

Cấu trúc luận án:

Luận án gồm 130 trang (cả tài liệu tham khảo), 21 bảng và 28 hình được chia
thành các chương, phần: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu 31 trang;
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (18 trang); Chương 3: Kết quả
nghiên cứu (44 trang); Chương 4: Bàn luận (15 trang); Kết luận và đề nghị (1
trang); Tóm tắt tiếng Anh (7 trang); Các công trình công bố liên quan đến luận án
(1 trang); Tài liệu tham khảo (10 trang, gồm 5 tài liệu tiếng Việt và 119 tài liệu
tiếng Anh); Phụ lục (23 trang).
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận án đã tham khảo 5 tài liệu tiếng Việt và 119 tài liệu tiếng Anh để tổng kết
các nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Thông tin chung về β-galactosidase;
(Nguồn gốc và phân loại, Cấu trúc, Cơ chế phản ứng); (2) Ứng dụng; (3) Tình hình
nghiên cứu trong, ngoài nước và hướng nghiên cứu của đề tài.
β-Galactosidase (β-D-galactohydrolase, E.C.3.2.1.23), thuộc nhóm các
enzyme chuyển hóa saccharide trong họ các enzyme thủy phân, cắt các gốc β-Dgalactose từ đầu không khử của các β-galactoside (CAZy, />Ngoài ra, β-galactosidase còn được gọi là enzyme tiêu hóa lactose hay lactase có
mặt trong ruột non ở hầu hết động vật có vú giúp thủy phân lactose. Enzyme này
được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: công nghiệp chế biến sữa, xử lý
whey (một chất thải trong công nghiệp sản xuất bơ với thành phần chính là lactose)
để sản xuất ethanol, tổng hợp oligo-saccharide (GOS), trong công nghệ sinh học và
trong y dược.
Trong những năm gần đây, β-galactosidase được nghiên cứu tập trung vào ba
hướng chính là tìm kiếm các β-galactosidase có đặc tính mới, tạo enzyme tái tổ

hợp, cố định enzyme để nâng cao độ bền và hướng quan tâm nhất là cải biến
enzyme để tạo tính mới. Feng và CS (2005) đã cải biến β-glycosidase từ Thermus
thermophilus bằng đột biến ngẫu nhiên (error prone PCR) kết hợp với đột biến
điểm định hướng suy biến (site-saturation mutagenesis) làm tăng hiệu suất tổng
hợp trisaccharide lên 50 và 74%, trong khi enzyme ban đầu chỉ tổng hợp không
quá 8%. Placier và CS (2009) đã tạo đột biến gen mã hóa β-galactosidase (BgaB)
từ Geobacillus stearothermophilus KVE39 cũng làm tăng hiệu suất tổng hợp
trisaccharide 5-11 lần so với ban đầu. Dong và CS (2011) gây đột biến BgaB từ
G. stearothermophilus tại một số axit amin tham gia liên kết trực tiếp với cơ chất
và tìm thấy đột biến thay thế Glu thành Tyr tại vị trí 351 của BgaB đã làm tăng


4
hoạt tính thủy phân lên 3,5 lần với cơ chất oNPG.
Cho đến nay, ở Việt Nam cũng đã có một số công trình nghiên cứu về
β-galactosidase ở vi vinh vật và tập trung chủ yếu theo hướng thu nhận enzyme tự
nhiên và tái tổ hợp. Năm 2007, Đặng Thị Thu và CS đã tuyển chọn được ba chủng
Asperillus oryzae sinh tổng hợp β-galactosidase nội bào năng suất tổng hợp cao
nhất đạt 1325,6 mU/g tế bào sau khi tối ưu. Nguyễn Thị Vân Linh và CS (2012) đã
nghiên cứu thu nhận và tinh sạch β-galactosidase từ Lactobacillus acidophilus có
khối lượng phân tử 40 kDa với hiệu suất thu hồi đạt 89,9%. Năm 2003, Trương
Nam Hải và CS đã lần đầu tiên nghiên cứu tạo chủng giống bằng kỹ thuật di truyền
để sinh tổng hiểu hiện β-galactosidase tái tổ hợp trong Escherichia coli ATTC 1105
có hiệu suất cao để ứng dụng trong thực phẩm. Nguyễn Quỳnh Uyên và CS (2012)
cũng đã nghiên cứu biểu hiện thành công β-galactosidase tái tổ hợp trong
B. subtilis PY79 dưới sự điều khiển của promoter PrrnO-RBS. Gen mã hóa
β-galactosidase được cài vào genome của B. subtilis bằng cách thay thế gen mã hóa
amylase của vật chủ.
Để phát triển một hướng nghiên cứu mới với β-galactosidase ở Việt Nam,
trong đề tài này chúng tôi ứng dụng kỹ thuật sao chép lỗi vòng DNA và đột biến

điểm định hướng tại một số vị trí axit amin được dự đoán liên kết với cơ chất nhằm
tạo ra tính chất của LacA từ B. subtilis VTCC-DVN-12-01 phân lập ở Việt Nam.
Trong một nghiên cứu trước đây về LacA tái tổ hợp trong E. coli BL21, Quyền
Đình Thi và CS (2011) cho thấy LacA tuy có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 50°C
nhưng vẫn hoạt động tốt ở nhiệt độ thấp, hoạt tính vẫn đạt được 60% so với nhiệt
độ tối ưu ở 20-25°C. Bên cạnh đó LacA còn hoạt động tối ưu trong khoảng pH
trung tính 6-7,0 và bền ở nhiệt độ 30-40°C. Đây là một enzyme tiềm năng cho ứng
dụng thủy phân lactose trong sữa và các sản phẩm chế biến khác từ sữa.

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1.1Vật liệu và hóa chất nghiên cứu
Gen lacA (2061 bp, mã số EU585783) mã hóa cho β-galactosidase (LacA) từ
B. subtilis VTCC-DVN-12-01 (B. subtilis G1) đã được đưa vào pET22b(+) bằng
BamHI và NotI tạo thành plasmid tái tổ hợp pElacA đã được tạo ra theo nghiên cứu
trước đây. Plasmid pElacA được sử dụng để tạo các thể đột biến LacA bằng sao
chép lỗi DNA vòng.
Chủng Escherichia coli JM109(DE3) [endA1, recA1, gyrA96, thi, hsdR17 (rk-,
mk ), relA1, supE44, λ-, ∆(lac-proAB), [F’, traD36, proAB, lacIqZ∆M15], IDE3]
(Promega Corp, Madison, WI) dùng để biểu hiện LacA ban đầu và các LacA đột biến.
+


5
Hóa chất trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết được mua từ các hãng hóa
chất có uy tín như Sigma, Invitrogen, Thermo (Mỹ), Qiagen, Bio basic (Canada),
Merck (Đức). Các dung dịch và đệm dùng cho thí nghiệm được pha theo hướng
dẫn của các bài thí nghiệm chuẩn.
Các thiết bị được sử dụng làm thí nghiệm đều có độ chính xác cao thuộc
Phòng Công nghệ sinh học Enzyme và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ
Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

1.2Phương pháp nghiên cứu
1.2.1 Phương pháp vi sinh vật
Thư viện các dòng E. coli mang gen lacA đột biến được tạo dòng trên môi
trường LB có bổ sung 50 µg/ml ampicillin; Dòng E. coli tái tổ hợp mang gen lacA
và các lacA đột biến được nuôi cấy biểu hiện trong LB có bổ sung 50 µg/ml
ampicillin và cảm ứng bằng 1 mM IPTG.
1.2.2 Phương pháp hóa sinh
Tinh sạch LacA-WT và các LacA đột biến bằng sắc ký ái lực qua cột ProBond
resin (Invitrogen); Chạy điện di gel polyacrylamide (SDS-PAGE) theo phương
pháp của Lemmli (1970); Điện di agarose; Xác định hàm lượng protein theo
phương pháp Bradford (1975); Xác định hoạt tính β-galactosidase theo phương
pháp của Miller (1959); Nghiên cứu đặc điểm của LacA-WT và các LacA đột biến
(Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính của enzyme; Ảnh hưởng của nhiệt độ
và pH đến độ bền của enzyme; Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến độ bền
enzyme; Động học phản ứng của enzyme); Đánh giá khả năng chuyển hóa
glycoside của LacA bằng sắc ký lớp mỏng TLC.
1.2.3 Phương pháp sinh học phân tử
Phương pháp sao chép lỗi vòng DNA ep-RCA được sử dụng để tạo đột biến
ngẫu nhiên trên gen lacA bằng phản ứng RCA có bổ sung Mn2+ để làm giảm tính
đặc hiệu của DNA polymerase. Phản ứng RCA được thực hiện bằng kit
amplification TempliPhi 100 (Healthecare).
Đột biến điểm định hướng sử dụng cặp mồi có bộ ba suy biến 3 nucleotide
‘NNK’ tại vị trí cần gây đột biến trong phản ứng PCR.
Các phương pháp sinh học phân tử khác như tách chiết, tinh sạch plasmid; Biến nạp
plasmid hóa học, biến nạp xung điện; Các kỹ thuật cắt, nối DNA;... được tham khảo theo
Sambrook và Ruessell (2001). Giải trình tự và phân tích gen theo Sanger (1975).
1.2.4 Phương pháp phân tích số liệu
Phần mềm Microsoft Excel được xử dụng để xử lý số liệu thu được trong quá

6
trình thực nghiệm, tính giá trị tham số thống kê. Phần mềm Dolphin 1D được dùng
để phân tích và đánh giá mức độ biểu hiện và tinh sạch. Chương trình DNA star
được dùng để phân tích và so sánh trình tự nucleotide của các chủng βgalactosidase tự nhiên và đột biến. Chương trình Phyre2 (Kelley et al., 2015) dùng
để phân tích cấu trúc và 3DligandSite (Wass et al., 2010) phân tích mối tương tác
trong vùng xúc tác của LacA và các LacA đột biến.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ
1.3Tạo đột biến ngẫu nhiên
1.3.1 Tạo đột biến ngẫu nhiên trên gen lacA
Gen lacA mã hóa β-galactosidase (LacA) từ B. subtilis VTCC-DVN-12-01 đã
được đưa vào plasmid pET22b(+) tạo thành plasmid tái tổ hợp pELacA và biểu
hiện ở dạng thể tan trong E. coli BL21 trong một nghiên cứu trước đây (Quyen et
al., 2011). Trong nghiên cứu này, plasmid pELacA được dùng làm khuôn để tạo đột
biến ngẫu nhiên trên gen lacA trong phản ứng ep-RCA có sự tham gia của Φ29
polymerase và ion Mn2+ (yếu tố tạo đột biến). Mn2+ được bổ sung vào phản ứng với
các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5 và 2 mM. Sản phẩm ep-RCA chỉ được tạo ra ở phản ứng
có bổ sung MnCl2 ở nồng độ từ 0,5-1,5 mM. Sản phẩm khuếch đại nằm trong vùng
có kích thước từ 1000 đến trên 10.000 bp, trong đó chủ yếu tập chung thành băng
có kích thước lớn hơn 10.000 bp (Hình 3.1, làn 1-3). Những đoạn DNA này có thể
có hai hoặc nhiều hơn các trình tự pELacA được lặp lại (multimer). Nồng độ Mn 2+
càng tăng thì sản phẩm ep-RCA càng giảm và ở nồng độ 2 mM, Φ29 polymerase bị
ức chế hoàn toàn nên sản phẩm ep-RCA không được tạo ra (Hình 3.1, làn 4). Sau
24 giờ ủ ở 30°C, 25 pg khuôn pELacA ban đầu đã được khuếch đại và có hàm
lượng từ 52,3-25,5 ng/µl tương ứng với nồng độ 0,5-1,5 mM MnCl 2 bổ sung trong
phản ứng.
bp

10.000 →

M

1

2

3

4

Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm plasmid
pELacA sau phản ứng ep-RCA.
Phản ứng ep-RCA được bổ sung 0,5
mM Mn2+ (làn 1); 1 mM (làn 2) và 1,5
mM (làn 3); thang DNA chuẩn (M)

1000 →

Tần suất xuất hiện đột biến trên gen lacA cao nhất ở nồng độ 1,5 mM MnCl 2,
đạt 2,7 ± 2,1 đột biến/kb. Trong đó có hai dạng đột biến là đột biến thay thế các


7
nucleotide (chiếm 94,7%) và đột biến chèn thêm nucleotide (chiếm 5,3%). Như
vậy, nồng độ 1,5 mM MnCl2 là thích hợp nhất để bổ sung vào phản ứng ep-RCA
để tạo đột biến ngẫu nhiên trên gen lacA.
1.3.2 Tạo thư viện các dòng mang gen lacA đột biến và sàng lọc hoạt tính
Sản phẩm ep-RCA được cắt với MluI (enzyme giới hạn có điểm cắt duy nhất
trong vector pET22b+) và đóng vòng bằng T 4 ligase để tạo thành các đơn vị
plasmid đơn lẻ hoàn chỉnh, sau đó biến nạp vào JM109(DE3) để tạo thư viện các
dòng mang gen lacA đột biến.

Các dòng trong thư viện đột biến được nhặt nuôi, biểu hiện trong môi trường LB
trên các đĩa nuôi cấy 96 giếng để sàng lọc hoạt tính. Dịch nuôi cấy (gồm cả tế bào)
được sử dụng như nguồn enzyme để xác định hoạt tính thủy phân với cơ chất oNPG.
Thống kê kết quả sàng lọc hoạt tính từ 10.000 dòng trong thư viện đột biến ngẫu
nhiên cho thấy 7563 các dòng có hoạt tính không thay đổi (chiếm 75,63%), 1950
dòng mất hoạt tính (chiếm 19,5%) và 487 dòng giảm mạnh hoạt tính (chiếm 4,87%).
Bên cạnh hướng sàng lọc hoạt tính để tìm dòng đột biến có hoạt tính LacA
tăng so với ban đầu, các dòng trong thư viện cũng được kiểm tra độ bền nhiệt của
enzyme nhằm tìm kiếm các LacA đột biến bền nhiệt hơn so với LacA ban đầu
(LacA-WT). Theo nghiên cứu của Quyen và CS (2011), LacA hoạt động tối ưu ở
55°C và không bền ở nhiệt độ trên 40°C, do đó dịch enzyme của các dòng trên được
ủ ở 50°C trong 1 giờ sau đó xác định hoạt tính còn lại. Kết quả sàng lọc cho thấy
mặc dù hoạt tính dòng 3.259 giảm còn 51,9% so với dòng tự nhiên nhưng vẫn giữ
được 92,5% hoạt tính sau 1 giờ ủ ở 50°C. Dòng 2.461 hoạt tính cũng chỉ bằng
36,2% so với dòng tự nhiên nhưng cũng giữ được 40,4% hoạt tính so với trước khi
ủ. Kết quả này cho thấy LacA của hai dòng 2.461 và 3.259 có thể có các đột biến
làm tăng độ bền enzyme.
1.3.3 Phân tích trình tự các dòng đột biến
Kết quả phân tích trình tự gen lacA ở dòng 2.461 giảm hoạt tính còn 36,2% và
dòng 3.259 giảm còn 51,9% so với WT đều có các đột biến làm thay đổi một số
axit amin trên LacA. Dòng 2.461 có các đột biến Glu62Val, Arg77Trp,
Ala191Val và Ala301Val. Dòng 3.259 có các đột biến Phe361Tyr,
Ala429Val và Ala524Thr.
1.3.4 Xác định điểm đột biến làm thay đổi hoạt tính LacA
3.1.4.1 Tạo dòng mang gen lacA có các điểm đột biến
Từ các điểm đột biến thu được sau khi phân tích trình tự ở dòng 2.461 và 3.259,
chúng tôi đã thiết kế các cặp mồi tại từng vị trí đột biến để tạo đột biến điểm nhằm tìm


8

chính xác điểm đột biến ảnh hưởng đến hoạt tính cũng như độ bền nhiệt của LacA.
Khuôn plasmid pELacA được dung làm khuôn để khuếch đại toàn bộ khuôn
pELacA với từng cặp mồi đột biến đã thiết kế với bộ ba nucleotide thay đổi mã hóa
cho các axit amin cần thay thế tại các vị trí Glu62Val, Arg77Trp, Ala191Val,
Aal301Val, Tyr361Val, Ala429Val và Ala524Thr. Sản phẩm khuếch đại plasmid
pELacA có một băng kích thước khoảng 7500 bp, đúng với kích thước tính toán
(gồm pET22b+ có kích thước 5493 bp và gen lacA có kích thước 2061 bp) và
ngang với băng DNA của khuôn pELacA được cắt mở vòng với MluI (Hình 3.3).
bp

M

1

2

3

4

5

6

7

10.000 →
6000 →

8

M

bp
← 10.000
← 6000

Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm PCR khuôn pELacA với các cặp mồi đột biến.
Glu62Val (1), Arg77Trp (2), Ala191Val (3), Ala301Val (4), Phe361Tyr (5), Ala429Val (6) và
Ala524Thr (7), đối chứng khuôn pELacA cắt mở vòng với MluI (8), thang DNA chuẩn 1kb (M)

Sản phẩm pELacA sau khi khuếch đại với mỗi cặp mồi đột biến được đóng vòng
trở lại bằng T4 ligase và biến nạp vào JM109(DE3). Các khuẩn lạc thu được từ mỗi vị
trí gây đột biến được nhặt nuôi, tách plasmid để kiểm tra lại trình tự gen lacA. Kết quả
đọc trình tự gen lacA từ các dòng đột biến cho thấy các bộ ba nucleotide mã hóa cho
các axit amin ở các vị trí Glu62, Arg77, Ala191, Ala301, Phe361, Ala429 và Ala524 đã
được thay thế thành các bộ ba mã hóa cho các axit amin mong muốn (Hình 3.4).
↑
Glu62

Wild-type

↑

Glu62Val

Hình 3.4A. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Glu62 trên LacA


9

↑
Arg77

↑

Wild-type

Arg77Trp

Hình 3.4B. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Arg77 trên LacA

↑
Ala191

↑

Wild-type

Ala191Val

Hình 3.4C. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Ala191 trên LacA

↑
Ala301

Wild-type

↑

Ala301Val

Hình 3.4D. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Ala301 trên LacA

↑
Phe361

Wild-type

↑

Phe361Tyr

Hình 3.4E. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Phe361 trên LacA


10
↑
Ala429

↑

Wild-type

Ala429Val

Hình 3.4F. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Ala429 trên LacA
↑
Ala524

↑

Wild-type

Ala524Thr

Hình 3.4G. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Ala524 trên LacA

3.1.4.2 Biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính riêng của LacA đột biến
Trong cùng điều kiện nuôi biểu hiện, các đột biến Glu62Val, Arg77Trp,
Ala191Val, Aal301Val, Tyr361Val, Ala429Val và Ala524Thr không làm ảnh hưởng
đến mức độ biểu hiện của LacA. Mức độ biểu hiện đạt 18,86% - 19,27% protein
tổng số của tế bào khi phân tích bằng phần mềm Dolphin 1D. LacA-WT cũng như
các LacA đột biến từ các dòng được tinh sạch 4,08 đến 4,98 lần qua cột sắc ký ái lực
Ni2+ và hiệu suất thu hồi đạt từ 71 đến 84,1%. LacA-WT và các LacA đều cho một
băng duy nhất có kích thước khoảng 70 kDa trên điện di đồ, đúng với kích
thước theo tính toán của LacA (Hình 3.6) và có độ sạch trên 98% (theo phân tích
của phần mềm Dolphin 1D).
kDa

1

2

3

4

M 5

6

7

8

116 →
66 →
45 →
35 →
25 →
18 →

←

Hình 3.6. SDS-PAGE LacA tinh
sạch từ các dòng đột biến điểm.
WT (1), Glu62Val (2),
Arg77Trp (3), Ala191Val (4),
Ala301Val (5), Phe361Tyr (6),
Ala429Val (7) và Ala524Thr
(8), thang protein chuẩn (M)


11
Kết quả xác định hoạt tính riêng với cơ chất oNPG ở 50°C trong đệm 0,1 M Naphosphate pH 7,0 của LacA-WT và các LacA đột biến điểm sau khi tinh sạch đã xác
định được đột biến Ala301Val ở dòng 2.461 làm giảm hoạt tính còn 23,69% và
Phe361Tyr ở dòng 3.259 làm giảm hoạt tính còn 44,42% so với ban đầu. Hai vị trí
này cũng đồng thời làm tăng độ bền nhiệt của LacA khi Ala301Val vẫn giữ 25,57%
và Phe361Tyr vẫn giữ 90,02% hoạt tính so với trước khi ủ ở 50°C trong 1 giờ. Như
vậy, hai vị trí axit amin Ala301 và Phe361 có vai trò quan trọng với LacA.

1.4Tạo đột biến điểm suy biến
Để đánh giá mức độ ảnh hưởng của các axit amin ở vị trí Ala301, Phe361 đến
hoạt tính thủy phân của LacA, hai vị trí này lần lượt được tạo đột biến thay thế
bằng các axit amin khác nhau bằng cặp mồi suy biến có bộ ba nucleotide “NNK”
tại vị trí cần tạo đột biến. Bên cạnh đó, các axit amin tham gia liên kết trực tiếp
với cơ chất trong quá trình thủy phân của LacA cũng được xác định để tạo đột
biến suy biến nhằm tìm kiếm những đột biến làm tăng hoạt tính hoặc làm thay
đổi tính chất của LacA.
1.4.1 Xác định vùng liên kết cơ chất của LacA
Dựa vào chương trình Phyre2, cấu trúc LacA đã được xác định xác định
(Kelley et al., 2015). Trong vùng xúc tác, các axit amin Arg120, Asn158, Glu159,
Trp331, Phe361 và Glu371 được dự đoán liên kết với cơ chất bằng chương trình
3DLigandSite (Wass et al., 2010). Các axit amin này tạo hai liên kết với galactose,
11 liên kết với phân tử glucose và hai liên kết với ion canxi. Trong đó vị trí
Arg120, Glu159 và Phe361 được dự đoán liên kết trực tiếp với cơ chất. Các vị trí
còn lại có thể tương tác với cơ chất qua các liên kết khác như ion, Val-der-Waal.
Kết quả dự đoán này cũng cho thấy vị trí Phe361 đã xác định ảnh hưởng đến hoạt
tính và độ bền nhiệt của LacA cũng là một vị trí được dự đoán có liên kết với cơ chất.
Mặt khác, khi sử dụng công cụ dự đoán cấu trúc SWISS-MODEL
( kết hợp với ClustalX (version 1.81;
Thompson et al., 2008) so sánh nhiều trình tự protein của β-galactosidase thuộc họ
GHF-42 cũng như so sánh với β-galactosidase đã biết cấu trúc tinh thể của
Thermus thermophilus A4 (Hidaka et al., 2002) để định hướng đã xác định được
các axit amin Glu159 và Glu323 là trung tâm hoạt động, các axit amin Arg120,
Asn158, Glu159, Trp331, Glu323 và một vùng gồm bốn axit amin là Glu371,
Lys372, Leu373, His374 tham gia liên kết với cơ chất. Kết quả dự đoán này có bốn
vị trí Arg120, Asn158, Trp331 và Glu323 trùng với kết quả dự đoán bằng chương
trình 3DLigandSite.

12
Như vậy, tám axit amin được xác định liên kết với cơ chất là Arg120, Asn158,
Trp331, Phe361, Glu371, Lys372, Leu373, His374 cùng với axit amin Ala301 đã
xác định ảnh hưởng đến hoạt tính thủy phân cũng như độ bền nhiệt của LacA thu
được khi tạo đột biến ngẫu nhiên sẽ được sử dụng để tạo đột biến điểm suy biến
cho từng vị trí nhằm đánh giá sâu hơn vai trò của chúng trong quá trình thủy phân
cơ chất cũng như ảnh hưởng đến tính chất của enzyme.
1.4.2 Tạo thư viện đột biến điểm suy biến
Từ 9 vị trí axit amin được xác định có vai trò quan trọng với LacA là Ala301,
Arg120, Asn158, Trp331, Phe 361, Glu371, Lys372, Leu373 và His374, chín thư
viện đột biến điểm suy biến được tạo ra. Khuôn plasmid pELacA được dùng làm
khuôn để khuếch đại toàn bộ khuôn pELacA với từng cặp mồi được thiết kế với bộ
ba nucleotide “NNK” ở vị trí cần gây đột biến.
bp
p
10000→
6000→

M

1

2

3

bp

4

M

5

6

7

8

9

10000→
6000→

Hình 3.8. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại khuôn pElacA với các cặp mồi đột biến.
Ala301X (1), Phe361X (2), His374X (3), Arg120X (4), Asn158X (5), Trp331X (6), Glu371X
(7), Lys372X (8), Leu373X (9); thang DNA chuẩn (M)

Sản phẩm PCR với các cặp mồi đột biến tại các vị trí được khuếch đại đặc
hiệu với một băng duy nhất có kích thước khoảng 7500 bp, tương ứng kích thước
của plasmid tái tổ hợp pELacA (Hình 3.9). Sản phẩm PCR sau đó được đóng vòng
trở lại với T4 ligase và biến nạp vào E. coli JM109(DE3), chọn lọc trên môi trường
LB có bổ sung 100 µg/ml ampicillin tạo thành thư viện đột biến điểm suy biến.
1.4.3 Sàng lọc hoạt tính, chọn dòng và phân tích trình tự
lacA đột biến điểm suy biến
Khoảng 1000-1200 dòng mang gen lacA đột biến từ các thư viện đột biến
được chọn ngẫu nhiên để sàng lọc hoạt tính thủy phân với cơ chất oNPG trên đĩa
96 giếng. Kết quả sàng lọc hoạt tính các dòng từ thư viện đột biến của Phe361 cho
thấy 98,04% các dòng mất hoạt tính, 0,3% các dòng giảm hoạt tính và 1,66% các

dòng có hoạt tính ngang với ban đầu. Một điều rất đáng chú ý ở vị trí Phe361 là khi
phân tích trình tự gen lacA của cả 3 dòng đột biến có hoạt tính giảm còn 40-55%
so với chủng ban đầu đều cho thấy Phe được thay thế bằng Tyr. Như vậy, tại vị trí
này khi Phe được thay thế bằng bất kỳ axit amin nào (ngoại trừ Tyr) đều làm mất


13
hoạt tính của LacA.
Với thư viện đột biến tại Ala301, tỉ lệ các dòng mất hoạt tính chỉ chiếm 15,4
còn phần lớn là các dòng chỉ bị giảm hoạt tính so với ban đầu (chiếm 83,2%). Kết
quả này chứng tỏ việc thay thế các Ala ở vị trí 301 ảnh hưởng làm giảm hoạt tính
mà không làm mất hoàn toàn hoạt tính thủy phân của LacA. Phân tích trình tự ngẫu
nhiên hai dòng giảm hoạt tính 36-45% so với chủng ban đầu, chúng tôi tìm thấy
thêm sự thay thế Ala thành Glu và Tyr (Hình 3.9).
↑
Ala524

Wild-type

↑

Ala301Tyr

↑

Hình 3.9. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị
trí mã hóa cho axit amin Ala301 trên
LacA-WT và các LacA đột biến.

Ala301Glu

Hình 3.10. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị
trí mã hóa cho axit amin Leu373 trên
LacA-WT và các LacA đột biến.


14
Tại các vị trí Arg120, Asn158, Trp331, Glu371, Lys372, Leu373, His374 cũng
chothấy việc tạo đột biến thay thế axit amin ở các vị trí này đều ảnh hưởng mạnh
đến hoạt tính thủy phân của LacA. Các đột biến thay thế axit amin tại các vị trí
Arg120, Asn158, Trp331, Glu371, Lys372, His374 đều làm mất hoàn toàn hoạt
tính. Phân tích ngẫu nhiên một số dòng mất hoạt tính ở các vị trí trên cho thấy có
các đột biến thay thế Arg120Phe, Arg120Thr, Arg120Val, Trp331Val, Glu371Trp,
His374Pro. Riêng ở vị trí Leu373, chúng tôi tìm thấy hai sự thay đổi axit amin Leu
thành Cys và Met chỉ làm giảm hoạt tính thủy phân lần lượt xuống còn 75 và 38% so
với LacA-WT (Hình 3.10).
1.4.4 Tinh sạch và xác định hoạt tính riêng của LacA đột biến điểm suy biến
Để đánh giá chính xác các đột biến Ala301Glu, Ala301Tyr, Arg120Phe,
Arg120Thr, Arg120Val, Trp331Val, Glu371Trp, Leu373Cys, Leu373Met và
His374Pro ảnh hưởng đến hoạt tính LacA, các LacA đột biến trên được tinh sạch
để xác định hoạt tính riêng.
Kết quả kiểm tra protein tổng số của tế bào ở các dòng đột biến cho thấy
các đột biến không ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện của LacA. Mức độ biểu hiện
LacA giữa các dòng đạt 14,23% - 15,34% protein tổng số của tế bào. Các LacAWT và đột biến được tinh sạch 4,05-5,35 lần qua cột sắc ký ái lực Ni 2+ với hiệu
suất thu hồi đạt 66,23-76,34%và có độ sạch trên 98% khi phân tích bằng phần
mềm Dolphin 1D. Sản phẩmtinh sạch cho một băng duy nhất có khối lượng
khoảng 70 kDa (Hình 3.12).
kDa
116 →
66 →

45 →
35 →
25 →
18 →

1

M

2

kDa
116 →
←

66 →

3

4

5

6

7

M

8

9

10

11

←

45 →
35 →
25 →
18 →

Hình 3.12. SDS-PAGE LacA tinh sạch từ một số dòng đột biến điểm.
Ala301Glu (1), Ala301Tyr (2), Arg120Phe (3), Arg120Thr (4), Arg120Val (5), Trp331Val
(6), Glu371Trp (7), Leu373Met (8), Leu373Cys (9) và His374Pro (10), Wild-type (11);
thang protein chuẩn (M)

LacA-WT và các LacA đột biến sau khi tinh sạch được xác định hoạt tính với
cơ chất oNPG và kết quả cho thấy đột biến Ala301Glu và Ala301Tyr đều làm giảm


15
hoạt tính xuống còn 51,1 và 50,4% so với ban đầu, và giảm ít hơn so với đột biến
A301V (23,69%) (Bảng 3.12). Các đột biến Arg120Phe, Arg120Thr, Arg120Val,
Glu371Trp và His374Pro đều làm LacA gần như mất hoạt tính, giống với kết quả
khi sàng lọc hoạt tính các dòng đột biến. Hai đột biến tại vị trí Leu373 là
Leu373Met và L373Cys hoạt tính giảm còn 72,79% và 29,66% so với ban đầu.
Bảng 3.12. Hoạt tính đặc hiệu của LacA ban đầu và LacA đột biến với cơ chất oNPG

Enzyme

Hoạt tính riêng (IU/mg)

% Hoạt tính so với ban đầu

LacA-WT

2,45 ± 0,045

100

Phe361Tyr

0,59 ± 0,014

44,42

Ala301Val

1,11 ± 0,075

23,69

Ala301Glu

1,25 ± 0,015

51,1

Ala301Tyr

1,23 ± 0,02

50,4

Arg120Phe

0,073 ± 0,003

2,98

Arg120Thr

0,117 ± 0,005

4,77

Arg120Val

0,063 ± 0,003

2,57

Trp331Val

0,229 ± 0,002

9,34

Glu371Trp

0,141 ± 0,011

5,75

Leu373Cys

0,727 ± 0,022

29,66

Leu373Met

1,784 ± 0,044

72,79

His374Pro

0,166 ± 0,003

6,77

1.5Đánh giá tính chất lý hóa của các LacA đột biến
Từ các kết quả tạo đột biến thu được ở trên, các dòng đột biến vẫn giữ được một phần
hoạt tính là Phe361Tyr (44,42%), Ala301Val (23,69%), Ala301Glu (51,1%), Ala301Tyr
(51,1%), Leu373Cys (29,66%) và Leu373Met (72,79%) được tiếp tục xác định tính chất lý
hóa để đánh giá thêm tác động của các axit amin thay thế đến tính chất enzyme.
1.5.1 Nhiệt độ và pH hoạt động tối ưu

Nhìn chung, LacA-WT và các LacA đột biến không có khác biệt nhiều về nhiệt
độ hoạt động tối ưu, các LacA đều hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ 50-55°C và
hoạt động tối ưu ở 55°C. Tuy nhiên ở 60°C, trong khi hoạt tính bắt đầu giảm mạnh ở
LacA-WT và LacA-361Tyr, hoạt tính tương ứng chỉ bằng 33% (8,47 IU/mg) và
36,8% (0,39 IU/mg) so với nhiệt độ tối ưu thì các đột biến thay thế Ala301 bằng
Val, Glu và Tyr vẫn có hoạt tính bằng 71,98, 57,4 và 48,4% so với ở nhiệt độ tối ưu
(Hình 3.13). Đặc biệt LacA-373Cys vẫn hoạt động tốt, hoạt tính đạt 0,81 ± 0,002
IU/mg tương đương 98,7% so với nhiệt độ tối ưu 55°C và ngang bằng với LacA-WT


16
(0,85 ± 0,006 IU/mg) (Hình 3.13). LacA-373Met đạt 1,4 ± 0,047 IU/mg, bằng
70,5% so với ở nhiệt độ tối ưu và cao hơn 1,65 lần so với LacA-WT.
Sự thay đổi axit amin tại vị trí Ala301, Phe361 và Leu373 không làm ảnh
hưởng đến pH hoạt động tối ưu của LacA. LacA-WT và đột biến đều hoạt động
tốt trong khoảng pH 6-7 và đạt cực đại tại pH 6,5.

Hình 3.13. Nhiệt độ hoạt động tối ưu của LacA-WT và các LacA đột biến.

1.5.2 Ảnh hưởng của pH đến độ bền LacA tự nhiên và đột biến
Kết quả xác định hoạt tính còn lại của LacA-WT và các LacA đột biến
Ala301Glu, Ala301Val, Ala301Tyr, Phe361Tyr, Leu373Cys và Leu373Met tại các
thời điểm khác nhau trong 72 giờ cho thấy độ bền pH 4-9 của cả LacA-WT và các
LacA đột biến không có nhiều khác biệt. Các enzyme đều bền ở pH 5-9, vẫn giữ
được trên 90% hoạt tính so với ban đầu sau 72 giờ ủ ở 30°C. Ở pH 4, hoạt tính của
LacA-WT và các LacA đột biến đều giảm rất nhanh, còn 41,52-57% so với ban đầu
sau 6 giờ và 16,21-32,62% sau 72 giờ ủ.
1.5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền LacA tự nhiên và đột biến
3.3.3.1 Độ bền nhiệt độ của LacA-WT và các LacA đột biến trong dung dịch đệm
LacA-WT và các LacA đột biến được ủ trong đệm 0,1 M Na-photphate pH 7,0 ở

nhiệt độ từ 30-50°C. Hoạt tính còn lại của enzyme sau khi ủ ở 30 và 40°C từ 6-72
giờ cho thấy LacA-WT và các LacA đột biến Ala301Val, Al301Glu, Ala301Tyr,
Phe361Tyr, Leu373Cys và Leu373Met bền ở nhiệt độ 30 và 40°C, hoạt tính còn lại
sau 72 giờ ủ vẫn giữ được từ 92-98%.
Khi tăng nhiệt độ ủ lên 45 và 50°C, độ bền giữa LacA đột biến và LacA tự
nhiên có sự khác biệt. Ở 45°C, các LacA đột biến đều bền hơn so với LacA-WT
(Hình 3.16A). LacA-WT mất hoạt tính sau 12 giờ ủ ở 45°C, trong khi các LacA đột
biến Ala301Val, Ala301Glu, Ala301Tyr, Leu373Cys, Leu373Met vẫn giữ được
16,15%-50,41% tại thời điểm này. Đặc biệt là đột biến thay thế Phe bằng Tyr tại vị
trí 361 làm tăng rõ rệt độ bền của LacA ở 45°C với thời gian bán hủy là 83,89 ±
0,78 giờ, cao gấp 26,8 lần so với LacA ban đầu (3,13 ± 0,14 giờ). Thời gian bán


17
hủy của các LacA đột biến Ala301Val, Ala301Glu, Ala301Tyr, Leu373Cys cũng
cao hơn từ 1,32 đến 2,4 lần so với LacA-WT (Bảng 3.14).
Với nhiệt độ ủ là 50°C, ngoài LacA-361Tyr vẫn cho thấy độ bền tốt hơn so với
LacA-WT và các LacA đột biến khác, LacA-373Cys cũng khá bền ở nhiệt độ này
(Hình 3.16B). Thời gian bán sống của LacA-361Tyr và LacA-373Cys lần lượt là
5,42 và 1,39 giờ, gấp 12,9 và 3,31 lần so với LacA-WT (0,42 giờ) (Bảng 3.14).
Khi tăng nhiệt độ ủ lên 55°C, hoạt tính thủy phân của LacA-WT và các LacA
đột biến đều bị mất rất nhanh, hoạt tính mất hoàn toàn sau 20 phút ủ.

A

B

Hình 3.16. Độ bền của LacA-WT và các LacA đột biến ở 45°C (A) và 50°C (B).

3.3.3.2 Độ bền nhiệt độ của LacA-WT và các LacA đột biến trong điều kiện có cơ chất

Cũng ở 45 và 50°C nhưng trong đệm có bổ sung cơ chất oNPG ở các nồng độ
5-15%, LacA-WT và các LacA đột biến Leu373Cys và Leu373Met có độ bền tăng
mạnh so với khi ủ trong đệm và tăng cao nhất ở nồng độ 5% cơ chất. Thời gian bán
sống của LacA-373Cys và LacA-373Met tăng 1,38-10,94 lần ở 45°C và 1,2-5,6 lần
ở 50°C khi có mặt cơ chất. Trong đó đáng chú ý, ở 45°C trong điều kiện có cơ chất
trong đệm ủ, thời gian bán sống của LacA-373Met cao gấp 1,4-2,04 lần so với
LacA-WT và cao gấp 1,7-2,3 lần LacA-373Cys (Bảng 3.14). Trong khi đó, đột
biến Phe361Tyr chỉ tăng nhẹ và các đột biến ở vị trí Ala301 hầu như không thay
đổi (Bảng 3.14). Tuy nhiên trong đệm bổ sung 5% cơ chất, thời gian bán sống của
Phe61Tyr vẫn gấp 3,4 lần LacA-WT ở 45°C và 1,6 lần ở 50°C.


18


19
1.5.4 Động học của LacA tự nhiên và đột biến
Động học của các LacA với cơ chất oNPG được xác định dựa vào phương
trình tuyến tính với dải nồng độ cơ chất 1- 6 mg/ml. Tất cả các LacA đột biến đều
có hằng số Michaelis (Km) giảm so với LacA-WT, tuy nhiên mức giảm không đáng
kể. Như vậy các đột biến tại vị trí Ala301, Phe361 và Leu373 đều làm tăng ái lực
của LacA với cơ chất oNPG. Mặc dù vậy, tốc độ quay vòng (K cat) khi thủy phân cơ
chất oNPG của các LacA đột biến giảm dẫn đến hiệu suất xúc tác (K cat/Km) cũng
giảm so với LacA-WT (Bảng 3.15).
Bảng 3. 15. Các thông số động học của LacA-WT và đột biến với cơ chất oNPG
Enzyme

Vmax
(IU/mg)

Km
(mM)

Kcat
(s-1)

Kcat/Km
s-1 mM-1

Kcat/Km
(%)

LacA-WT

2,61 ± 0,12

9,28 ± 0,72

21,74 ± 0,99

2,35 ± 0,08

100

LacA-301Val

0,76 ± 0,02

5,57 ± 0,56

3,72 ± 0,09

0,67 ± 0,08

28,65

LacA-301Glu

0,89 ± 0,02

7,49 ± 0,71

7,40 ± 0,17

0,99 ± 0,02

42,08

LacA-301Tyr

1,01 ± 0,07

7,48 ± 0,19

9,14 ± 1,88

1,22 ± 0,22

51,90

LacA-361Tyr

1,03 ± 0,03

8,02 ± 0,27

8,56 ± 0,24

1,07 ± 0,01

45,50

LacA-373Cys

0,89 ± 0,07

7,81 ± 1,25

7,38 ± 0,60

0,95 ± 0,07

40,56

LacA-373Met

1,61 ± 0,07

7,27 ± 0,6

13,39 ± 0,61

1,85 ± 0,07

78,56

1.5.5 Ảnh hưởng của đột biến đến khả năng tạo oligosaccharide
β-Galactosidase xúc tác thủy phân cơ chất qua hai giai đoạn với 2 kiểu phản ứng
là thủy phân và chuyển gốc galactosyl. Để đánh giá thêm ảnh hưởng của các đột
biến đến tính chất enzyme trong bước phản ứng chuyển phần galactosyl từ sản
phẩm trung gian đến chất nhận chứa nhóm hydroxyl, 0,25 IU LacA-WT và các
LacA đột biến được bổ sung vào phản ứng chuyển hóa cơ chất oNPG với chất nhận
cellobiose để kiểm tra khả năng tạo sản phẩm chuyển hóa của các LacA. Phản ứng
được thực hiện ở 40°C (nhiệt độ bền cho cả LacA-WT và các LacA đột biến).
C

1

2

3

4

5

6
← oNPG
← Galactose
← Cellobiose

← Sản phẩm
chuyển hóa

1 giờ

3 giờ

Hình 3.17A. Sắc ký bản mỏng
sản phẩm chuyển hóa của
LacA-WT và các LacA đột
biến tại vị trí 301.
Hỗn hợp cơ chất oNPG và
cellobiose (C); Ala301Val (1,
4), Ala301Glu (2, 5),
Ala301Tyr (3, 6)


20
1

2

3

5

4

6

7

C1

8
← oNPG

← Galactose
← Cellobiose

← Galactose
← Cellobiose
← Sản phẩm
chuyển hóa

← Sản phẩm
chuyển hóa
1 giờ

C2

← oNPG

3 giờ

Hình 3.17B. Sắc ký bản mỏng sản phẩm chuyển hóa của LacA-WT và các LacA đột
biến tại vị trí Phe361 và Leu373.
Hỗn hợp cơ chất oNPG và cellobiose (C1), cellobiose (C2); WT (1, 7), Phe361Tyr (2, 8),
Leu373Cys (3, 5) và Leu373Met (4, 6)

Kết quả cho thấy trong điều kiện nồng độ cơ chất oNPG cao, với cùng số đơn
vị hoạt độ (0,25 IU) nhưng sản phẩm chuyển hóa tạo ra từ phản ứng của LacA301Glu, LacA-301Val và LacA-301Tyr sau 1 và 3 giờ ủ (Hình 3.18A, làn 1-3 và 46) đều thấp hơn so với LacA-WT và các LacA đột biến Phe361Tyr, Leu373Cys,
Leu373Met (Hình 3.18B, làn 1-4 và 6-8). Sản phẩm chuyển hóa của các LacA đột
biến Phe361Tyr, Leu373Cys, Leu373Met sau 1 giờ là tương đương nhau và tương
đương với LacA-WT. Hầu hết galactose từ oNPG đều được chuyển đến chất nhận
cellobiose để tạo thành sản phẩm chuyển hóa là galactose-cellobiose.
1.6Phân tích sự ảnh hưởng của các đột biến đến cấu trúc của LacA
Theo kết quả sàng lọc hoạt tính từ các thư viện đột biến tại cho thấy hầu hết
các vị trí Ala301, Arg120, Asn158, Trp331, Phe361, Glu371, His372, Leu373 và
His374 cho thấy hầu hết các vị trí đều làm mất hoạt tính của LacA khi bị thay thế
bằng các axit amin khác. Chỉ có ba vị trí Ala301, Phe361 và Leu373 vẫn tìm được
các đột biến chỉ làm giảm mà không làm mất hoàn toàn hoạt tính cũng như có một
số thay đổi về tính chất của LacA. Do đó LacA đột biến tại ba vị trí này được tiếp
tục phân tích cấu trúc bằng chương trình Phyre2 và 3DLigandSite để thấy rõ hơn
những ảnh hưởng của các đột biến đễn cấu trúc cũng như mối tương tác với cơ chất
trong vùng xúc tác.
1.6.1 Ảnh hưởng của Ala301 đến cấu trúc của LacA
Kết quả phân tích cấu trúc bậc hai đã cho thấy axit amin Glu, Tyr và Val khi
thay thế cho Ala ở vị trí 301 đều làm thay đổi xoắn anpha ở vị trí 96-97, 196-197,
463-464 trong cấu trúc bậc hai của LacA, dẫn đến thay đổi mối tương tác, số liên
kết cũng như khoảng cách liên kết giữa các axit amin với cơ chất trong vùng
trung tâm xúc tác (Hình 3.20).


21

Ca

LacA-WT

Ca

Ca

Ala301Glu

Zn

Ca

Ala301Tyr

Ala301Val

Hình 3.20. Mối tương tác với cơ chất trong vùng trung tâm LacA-WT và các đột biến tại Ala301.
Mối liên kết giữa các axit amin trong vùng trung tâm được dự đoán liên kết với cơ chất có
màu xanh lam. Trong đó các liên kết với galactose được xây dựng dựa trên cấu trúc βgalactosidase (1kwk_A) của T. thermophilus và 1xc6_A của Penicillium sp.; các liên kết với
glucose dựa trên beta-amylase (1j18_A, 1veo_A) từ B. cereus, 1j18_A của B. cereus var.
mycoides. Các liên kết của các axit amin khác với ion Ca, glucose, galactose (màu xanh lục,
vàng) được dự đoán dựa vào endoglucanase 1qhz_ A và 1qi0_A từ Bacillus agaradhaerens

1.6.2 Ảnh hưởng của Phe361 đến cấu trúc của LacA

Ca

LacA-WT

Ca

Phe361Tyr

Hình 3.23. Phân tích mối tương tác với cơ chất trong vùng trung tâm LacA-WT và LacA-361Tyr.
Các mối tương tác (màu xanh lam) trong vùng trung tâm hoạt động của LacA-WT và LacA-361Tyr
được xác định bằng chương trình 3DLigandSite. Các liên kết tại vị trí 361 nằm trong khoanh màu đỏ.