PHÂN LẬP, ĐỊNH TÍNH, NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG CỦA QUERCETIN RHAMNOPYRANOSIDE GALLATE

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUẾ
KHOA HÓA HỌC
----------

TIỂU LUẬN
Đề tài: PHÂN LẬP, ĐỊNH TÍNH, NGHIÊN CỨU
KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ ĐIỀU TRỊ
VẾT THƯƠNG CỦA QUERCETIN-3-O-α-LRHAMNOPYRANOSIDE-2’’-GALLATE
(Tác giả: R. Manivannan, K. Prabakaran, S. Ilayaraja)

Môn: Một số vấn đề chọn lọc trong hóa hữu cơ

Huế, tháng 12 năm 2016
1


NỘI DUNG
1. Giới thiệu
Flavonoid là một trong những nhóm hợp chất phong phú và đa dạng nhất trong
thiên nhiên. Nó được coi là các “chất bổ sinh học tự nhiên” vì bằng thực nghiệm,
flavonoid được chứng minh là có khả năng hoạt động trực tiếp như thuốc kháng sinh
bằng cách phá vỡ cấu trúc chức năng của vi rút, vi khuẩn; làm thay đổi phản ứng của
cơ thể đối với các chất gây dị ứng, chất gây ung thư.
Việc điều trị các bệnh nhiễm trùng đã cho hiệu quả rõ rệt từ khi phát hiện ra các
loại thuốc kháng sinh, tuy nhiên sự xuất hiện của một số mầm kháng thuốc cũng như
các tác dụng phụ không mong muốn của một sô loại thuốc kháng sinh đã dẫn đến nhu
cầu tìm kiếm những nguồn kháng sinh mới, đắc biệt là từ các cây thuốc.
Trái với các loại thuốc tổng hợp, kháng sinh có nguồn gốc thực vật không gây
ra nhiều tác dụng phụ và có tiềm năng điều trị các bệnh lây nhiễm rất lớn. Nhiều
nghiên cứu đã chỉ ra rằng cây thuốc sản sinh ra một lượng lớn các chất chuyển hóa thứ
cấp với tác dụng kháng khuẩn trên các mầm bệnh. Vì vậy, việc nghiên cứu các hoạt

tính kháng khuẩn của cây thuốc cổ truyền Ấn Độ cũng như ứng dụng của chúng đã trở
thành một mối quan tâm và cũng là một thách thức lớn.
Vết thương là bất kỳ những tổn thương nào làm rách da hoặc các mô cơ bản.
Các tổn thương có thể bị gây ra bởi tai nạn, vết mổ sau phẫu thuật hoặc các chấn
thương khác. Quá trình chữa lành vết thương là quá trình sinh hóa để tái lập lại sự toàn
vẹn về cấu trúc, lấy lại sức mạnh của mô bị thương. Các phương pháp được chọn để
điều trị là các phương pháp cải thiện được một hay nhiều giai đoạn chữa lành vết
thương mà không gây ra những tác dụng phụ có hại một cách lý tưởng nhất.
Từ những lý do trên, nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá hoạt động
kháng khuẩn và điều trị vết thương của cao chiết clorofom của cây Salvia leucantha.
2. Thực nghiệm
2.1. Phân lập và định tính
Hoa tươi (2kg) của cây S. leucantha được thu thập từ những đoạn đường dốc
vùng Kodaikanal, Dindugul,Tỉnh Tamilnadu, Ấn Độ và được định danh bởi Prof. N.
Ramakrishnan (Khoa thực vật học); mẫu được gửi đến Khoa thực vật học Trường đại
học Bharathidasan, Ấn Độ.
2


Hoa của cây S. leucantha được chiết với metanol 90% bằng phương pháp hồi
lưu. Dịch chiết ancol được cô đặc trong chân không thu được cao chiết. Sau đó cao
chiết được phân đoạn bằng ete và cloroform.

Hình 1. Sơ đồ phân lập
Phân đoạn ete được cô đặc trong chân không và làm lạnh trong khoảng một
tuần, thu được chất rắn màu vàng. Đem lọc, kết tinh lại với metanol thì thấy những
tinh thể hình kim màu vàng nhạt được tách ra, có nhiệt độ nóng chảy: 313 - 315 0C (kí
hiệu là Chất 1). Nó tan dễ dàng trong dung môi hữu cơ và tan ít trong nước nóng. Chất
1 khử được AgNO3/NH3 khi làm lạnh và thuốc thử Fheling khi đun nóng. Ngoài ra,
chất 1 còn tác dụng với thuốc thử Horhammer-Hansal, Wilson’s boric acid và Gibb’s.

Quá trình sắc kí và dữ liệu phổ UV của nó đều tương tự như aglycone flavonoid. Chất
1 được xác định là quercetin, được định tính bằng sắc kí bản mỏng và nhiệt độ nóng
chảy (so sánh với chất chuẩn là quercetin được phân lập từ Physalisminima). Giá trị Rf
được trình bày ở bảng 1.
3


Bảng 1. Giá trị Rf (x100) của thành phần của hoa Salvia leucantha

Hợp chất:
1) Aglycone - Quercetin
2) Glycoside - Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside-2”-gallate
Hệ dung môi:
a) Dung dịch acid actic 15%
b) Dung dịch acid actic 30%
c) Dung dịch acid actic 60%
d) n-Butanol : acid acetic : nước = 4:1:5
e) Dung dịch phenol bão hòa
Phân đoạn cloroform được cô đặc trong chân không là được làm lạnh trong vài
ngày cũng thu được một chất rắn màu vàng. Kết tinh lại với metanol thì cũng tách ra
được những tinh thể màu vàng nhạt, nhiệt độ nóng chảy: 316 - 318 0C (kí hiệu là Chất
2). Chất 2 khử được AgNO3/NH3 nhưng không tác dụng với thuốc thử Fheling. Nó
hiện vết màu tím dưới tia UV và màu vàng xanh với NH 3. Chất 2 phản ứng với các
thuốc thử Wilson’s boric acid, Molisch, Gibb’s nhưng không phản ứng với thuốc thử
Horhammer-Hansal.

4


Dựa vào các dữ liệu phổ UV và NMR cho thấy chất 2 có cấu trúc của glycoside

flavonol.

2.2. Thủy phân Glycoside
Glycoside được thủy phân toàn phần bằng dung dịch H 2SO4 5% ở 1000C trong
khoảng 2 tiếng và thủy phân từng phần bằng acid formic 10% trong cyclohexane.
(mục đích của việc thủy phân glycoside là để tách phần phi đường và phần đường, sau
đó xác định cấu trúc của từng phần).
2.3. Thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
Hoạt động kháng khuẩn của hợp chất phân lập từ cao chiết cloroform được thực
hiện bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch (National Committee for Clinical
Laboratory Standards) ở hai nồng độ khác nhau. Chất sau khi được đưa vào đĩa đã cấy
vi khuẩn được ủ trong 24h; nhiệt độ 37 0C; đường kính vùng bị ức chế được đo bằng
mm. Chất chuẩn để so sánh là các chất kháng sinh Novobiocin (30μg),
Chloramphenicol (30μg).
2.4. Điều chế Gel
Từ 1gam chất phân lập được từ dịch chiết cloroform điều chế được 100gam
Vaselin.
2.5. Hoạt động chữa lành vết thương bằng mô hình
Lựa chọn các con vật có trọng lượng phù hợp với thí nghiệm và chia thành 4
nhóm. Chúng được gây mê và gây các vết thương tương đương nhau, có kích thước
2,5cm ×0,2cm. Nhóm 1 được để lành tự nhiên ở điều kiện bình thường. Nhóm 2, nhóm
3 được điều trị bằng chất phân lập được với liều lượng 100 mg và 200 mg. Nhóm 4
được điều trị bằng thuốc kháng sinh Soframycin. Theo dõi 4 nhóm trong 16 ngày, diện
tích vùng bị thương được đo ở các ngày 0,4, 8, 12, 16 cho tất cả các nhóm.
5


2.6. Phân tích thống kê
Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng các phương pháp thống kê (trung
bình, anova).

3. Kết quả và thảo luận
Hoa của cấy S. leucantha có chứa quercetin và quercetin-3-O-α-Lrhamnopyranoside-2”-gallate.
 Quercetin
Phổ UV của quercetin có hai pic chính ở 370nm và 250 nm, điều này cho thấy
chất có bộ khung flavonoid. Sự phân hủy xảy ra khi thêm NaOMe vào aglycone.
Flavonoid mà có chứa các nhóm -OH tự do ở vị trí C-3, C-3’ và C-4’ thì không bền
trong NaOMe và pic hấp thụ bị suy biến trong vài phút; điều này chứng tỏ rằng có các
nhóm -OH ở vị trí C-3, C-3’, C-4’ trong hợp chất. Có sự gia tăng bước sóng +58 nm
khi thêm AlCl3/HCl chứng tỏ sự có mặt của nhóm -OH tự do tại vị trí C-5 ở vòng A.
Sự dịch chuyển +30nm được quan sát thấy trong trường hợp thêm AlCl 3 nhưng không
có mặt của HCl cho thấy vòng B có nhóm O-dihydroxyl. Khi thêm NaOAc có sự gia
tăng bước sóng + 20nm chứng tỏ có nhóm -OH ở vị trí C-7. Ngoài ra nhóm dihyroxyl
ở vòng B còn được xác định bở sự dịch chuyển bước sóng +16 nm khi thêm H 3BO3.

Quercetin có cấu trúc:

 Glycoside flavonol
Phổ UV của glycoside flavonol từ phân đoạn cloroform cho thấy có pic hấp thụ
ở 255 nm và 340 nm. Sự gia tăng bước sóng +54 nm khi thêm NaOMe chỉ ra sự có
6


mặt của nhóm -OH tự so ở vị trí C-4’. Khi thêm AlCl 3/HCl bước sóng dịch chuyển
+60 nm chứng tỏ có nhóm -OH tự do ở C-5. Dải hấp thụ I trong phổ AlCl 3 tăng +30nm
suy ra có nhóm O-dihydroxyl ở vòng B. Sự có mặt của -OH tự do ở C-7 được xác định
bởi sự gia tăng bước sóng +17 khi thêm NaOAc. Nhóm dihydroxyl ở vòng B cũng
được xác định bởi sự gia tăng bước sóng +27 nm khi thêm H3BO3.

Trong phổ 1H-NMR của hơp chất phân lập được xuất hiện các pic ở δ 5,9 ppm
và δ 6,2 ppm tương ứng với hiđro ở C-6, C-8. Hidro của nhóm 5-OH cộng hưởng ở δ

12,7 ppm và các singulet ở δ 7,3 ppm tương ứng với các hiđro ở C-2’ và C-6’. Các
hiđro ở C-5’ xuất hiện ở δ 6,8 ppm. Hiđro ở vị trí 1” của đường rhamnose cộng hưởng
ở δ 4,4 ppm. Ba hiđro nhóm -CH3 của rhamnose xuất hiên ở δ 0,9 ppm. Các hiđro còn
lại của đường xuất hiện trong khoảng δ 3,2 - 3,9 ppm.

Dữ liệu phổ 13C-NMR cho thấy có 27 cacbon trong hợp chất, trong đó có 15
cacbon là điển hình cho bộ khung flavone, những cacbon còn lại là của glycoside. Các
pic ở δ: 102,0; 71,9; 71,7; 71,3; 70,6, 17,3 là của đường và được đối chiếu với α-Lrhamnopyranoside.
Phổ 1H-NMR cho thấy sự có mặt của H anome ở δ 5,30 ppm suy ra có liên kết
α-glycoside. Mặt khác phổ 13C-NMR có C-3 ở δ 133,4 ppm chứng tỏ rằng có sự axyl
7


hóa ở C-3. Căn cứ vào những dữ liệu trên, chất phân lập được từ cao chiết cloroform
có cấu trúc là:

3.2. Nghiên cứu hoạt động kháng khuẩn
Nhiều loài cây và thành phần của chúng đã được nghiên cứu về hoạt tính kháng
khuẩn. Quercetin được sử dụng để ức chế các loại vi khuẩn - nguyên nhân gây bệnh
về hô hấp, đường tiêu hóa, rối loạn về da và đường tiết niệu. Trong nghiên cứu này,
các tác giả khảo sát hoa của S. leucantha và hoạt tính kháng khuẩn của nó bằng
phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Thử nghiệm với cao chiết cloroform ở 3 nồng
độ khác nhau: 50, 100, 200 μg. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết cloroform được
so sánh với các chất kháng sinh chuẩn là Novobiocin và Chloramphenicol (bảng 2).
Thông thường, miền ức chế của thuốc kháng sinh thương mại là từ 26,0 và 36,0 mm ở
50μg; sự ức chế của quercetin glycosides là từ 2,0 đến 28 μg. Căn cứ vào những kết
quả trên, ở nồng độ 200 μg, cao chiết cloroform có vùng ức chế cao nhất, nó ức chế
được hầu hết các vi sinh vật thử nghiệm (trừ C. albicans).
Bảng 2. Kết quả khả năng kháng khuẩn của quercetin glycoside
(Vùng bị ức chê - mm)

3.3. Hoạt động chữa lành vết thương
8


Hệ thống cây thuốc cổ truyền của Ấn Độ, đặc biệt là hệ thống Ayurveda, Siddha
và Unani có một số lượng lớn các cây thuốc để điều trị các tổn thương về da bao gồm
vết cắt và bỏng. Cuộc điều tra khảo sát khả năng chữa lành vết thương của hợp chất
quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside-2”-gallated được chiết từ S. leucantha được so
sánh với thuốc chuẩn (Soframycin). Kết quả được trình bày ở bảng sau:
Nghiên cứu trên mô hình vết thương do bị cắt cho thấy cả 4 nhóm đều giảm vùng bị
thương qua từng ngày và hợp chất phân lập được cũng có tác dụng điều trị vết thương
(khi so sánh với với nhóm được để tự nhiên và nhóm được điều trị bằng thuốc).

4. Kêt luận
Nghiên cứu này đã chứng minh rằng hợp chất quercetin-3-O-α-Lrhamnopyranoside-2”-gallated phân lập từ S. leucantha có khả năng kháng khuẩn và
chữa lành vết thương. Những thuốc này có khả năng ức chế sự sinh trưởng của vi sinh
vật. Vùng có hiệu quả ức chế cao nhất được quan sát thấy ở khuẩn S. aureus (28mm)
và E. coli (24mm). Từ đó xác định được giá trị của cây S. leucantha và thấy được
hướng nghiên cứu cần được quan tâm để phát triển các loại thuốc mới.
---------------------------------TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. R. Manivannan, K. Prabakaran, S. Ilayaraja (2014), “Isolation, Identification and
Antibacterial and Wound Healing Studies of Quercetin-3-O-α-L-Rhamnopyranoside2”-Gallate”, International Journal of Applied Science and Engineering, 99-106.

9


10