Nghiên cứu khả năng hấp thu thuốc curcumin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

NGÔ THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
CURCUMIN CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN
LÊN MEN TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận nghiên cứu, em đã nhận được sự
hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị và các bạn tại Viện
Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Với lòng
kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: TS.
Nguyễn Phúc Hưng – người đã hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ em trong suốt quá
trình hoàn thành khóa luận này.
Em cảm ơn chân thành tới các thầy cô làm việc tại Viện Nghiên cứu Khoa
học và Ứng dụng trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, các thầy cô và các bạn sinh
viên đang học tập và làm việc tại Bộ môn Sinh lý người và động vật, khoa Sinh KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo mọi điều
kiện thuận lợi trong quá trình hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Do bước đầu đi vào thực tế và sáng tạo trong nghiên cứu khoa học, kiến
thức của em còn hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ. Do vậy, không tránh khỏi những
thiếu sót là điều chắc chắn, em rất mong nhận được sự góp ý quý báu của quý
thầy cô và các bạn sinh viên để đề tài khóa luận tốt nghiệp của em được hoàn

thiện hơn nữa.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 28 tháng 04 năm 2017
Sinh viên
Ngô Thị Thu Hiền

Ngô Thị Thu Hiền


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật. Đây
là kết quả nghiên cứu của riêng tôi. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ
thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt,
không trùng với kết quả đã công bố. Trong tài liệu này tôi có sử dụng một số
tài liệu của một số tác giả, tôi xin phép tác giả để bổ sung cho luận văn của
mình.
Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, ngày 28 tháng 04 năm 2017
Sinh viên
Ngô Thị Thu Hiền
Ngô Thị Thu Hiền


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Lí do chọn đề tài .............................................................................................. 1
2. Mục đích nghiên cứu ....................................................................................... 2
3. Phạm vi nghiên cứu ......................................................................................... 3
4. Ý nghĩa của đề tài ............................................................................................ 3

4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ......................................................................... 3
4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài .......................................................................... 3
Chương 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4
1.1. Tổng quan về curcumin ................................................................................ 4
1.1.1. Cấu trúc hóa học và đặc tính hóa lý của curcumin ................................... 4
1.1.2. Dược tính ................................................................................................... 6
1.1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước. .............................................. 8
1.2. Tổng quan về CVK .................................................................................... 10
1.2.1. Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum ................................................ 10
1.2.2. Đặc điểm của A. xylinum ......................................................................... 10
1.2.3. Cấu trúc đặc tính của màng CVK tạo bởi A. xylinum ............................. 11
1.2.4. Tính chất độc đáo của CVK .................................................................... 11
1.2.5. Sinh tổng hợp CVK ................................................................................. 12
1.2.6. Ứng dụng của màng CVK ....................................................................... 12
1.2.7. Môi trường nuôi cấy A. xylinum .............................................................. 13
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................... 16
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 16
2.2. Nội dung nghiên cứu. ................................................................................. 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 16
2.3.1. Phương pháp tạo màng và xử lí màng CVK ........................................... 16


2.3.2. Phương pháp xác định hàm lượng Cur .................................................... 19
2.3.3. Tạo màng CVK nạp Cur .......................................................................... 21
2.3.4. Phương pháp xác định lượng Cur nạp vào màng CVK........................... 21
2.3.5. Phương pháp xử lý thống kê.................................................................... 22
2.4. Địa điểm tiến hành nghiên cứu................................................................... 22
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 23
3.1. Tạo màng CVK của A. xylinum trong môi trường nước dừa già ............... 23
3.2. Độ dày màng CVK trong các điều kện nuôi cấy. ....................................... 24

3.3. Tinh chế màng CVK ................................................................................... 24
3.4. Khả năng hấp thụ thuốc Cur của màng CVK ............................................. 26
3.5. Màng CVK sau khi nạp Cur ....................................................................... 28
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 30
4.1. Kết luận....................................................................................................... 30
4.2. Kiến nghị .................................................................................................... 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 31
PHỤ LỤC .......................................................................................................... 33


DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ
Sơ đồ 1.1: Sơ đồ quy trình nuôi cấy thu nhận CVK.............................................. 18
Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn Cur OD 427nm ..................................................... 20
Hình 3.1. Màng CVK khi nuôi cấy tĩnh ngày thứ 6 .............................................. 23
Hình 3.2. Màng CVK với thời gian nuôi cấy khác nhau ....................................... 24
Hình 3.3a: Màng CVK ngâm với NaOH 3% ........................................................ 25
Hình 3.3b: Màng CVK ngâm với HCl 3% ............................................................ 25
Hình 3.3c: Màng CVK ngâm với nước cất ........................................................... 26
Hình 3.3d: Màng CVK sau khi tinh chế ................................................................ 26
Hình 3.4. Màng CVK đang hấp thụ thuốc Cur...................................................... 27
Hình 3.5: Màng CVK sau khi loát thuốc. .............................................................. 29


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Thành phần của nước dừa già. .............................................................. 14
Bảng 2.1: Môi trường nuôi cấy A. xylinum tạo màng CVK. ................................. 17
Bảng 2.2. Bảng nồng độ Cur và giá trị OD427nm (n = 3) .................................... 20
Bảng 3.1. Giá trị OD hấp thụ thuốc Cur của màng CV (n = 3)............................. 27
Bảng 3.2. Khối lượng Cur được hấp thụ, tỷ lệ hấp thụ và cường độ hấp thụ Cur
của màng CVK (n =3) ........................................................................................... 28

BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt

Tên Tiếng Anh

Tên Tiếng Việt

A. xylinum

Acetobacter xylinum

Vi khuẩn Acetobacter xylinum

CVK

Bacterial cellulose

Màng cellulose vi khuẩn

Cur

Curcumin

Curcumin

E. coli

Escherichia coli

Vi khuẩn đại tràng

PC

Plant cellulose

Cellulose thực vật

TS

Doctor

Tiến sĩ


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Từ ngàn xưa, nghệ vàng đã được xem là một loài cây thuốc quý được các
nhà khoa học, chuyên môn đánh giá cao trong y học cổ truyền. Theo y học
phương Đông, nghệ có tác dụng làm lành vết thương, trị các chứng viêm loét, đau
dạ dày, giải độc gan, vàng da, hoạt huyết, làm tan máu bầm, giúp co hồi tử cung
sau sinh,… Chúng cũng được sử dụng như một chất tạo màu, làm đẹp da và liền
sẹo, cũng như dùng trong chế biến các món ăn. Nghệ vàng, tên khoa học là
Curcuma long L, thuộc họ Gừng (Zingiberacaea), được trồng nhiều ở những
vùng khí hậu nóng ẩm ở khu vực Đông Nam Á trong đó có Việt Nam. Nghiên
cứu của các nhà khoa học vào cuối thế kỷ 20 đã xác định curcumin đóng vai trò
quan trọng trong các hoạt tính sinh học của củ nghệ. Nhiều nghiên cứu cho thấy
rằng curcumin có nhiều tính chất dược lý quan trọng như chống oxy hóa, kháng
khối u, kháng viêm, kháng nấm, kháng vi khuẩn, kháng virus, chữa các bệnh tim

mạch thần kinh,… và đặc biệt là khả năng kháng nhiều loại bệnh ung thư khác
nhau. Gần đây, nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng curcumin có khả năng
ức chế sự tăng sinh tế bào trên nhiều dòng tế bào ung thư in vitro và đã được
dùng để ngăn ngừa và điều trị nhiều bệnh ung thư in vivo. Quan trọng hơn,
curcumin không độc hại với các tế bào khỏe mạnh. Tuy nhiên, rào cản lớn khiến
tinh chất nghệ curcumin chưa được ứng dụng rộng rãi là do curcumin tan rất ít
trong nước (0,001%), sinh khả dụng thấp, sự chuyển hóa nhanh và sự đào thải lớn
khi vào cơ thể.
Trong tự nhiên có một số vi khuẩn có khả năng sinh ra màng cellulose. Khi
nuôi cấy những vi khuẩn này trong môi trường có chứa glucose, glycerol hoặc
một số nguồn cacbon hữu cơ khác nhau chúng có khả năng hình thành trên bề
mặt một số lớp màng cellulose sinh học thuần khiết và được gọi là màng sinh học
bacterial cellulose (viết tắt là CVK).
Màng CVK là sản phẩm của một loài vi khuẩn, đặc biệt là chủng
Acetobacter xylinum. Màng sinh học (CVK) có cấu trúc và đặc tính rất giống với
1


cellulose của thực vật cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực vật nhưng có
một số đặc tính lí hóa đặc biệt như: độ bền cơ học, khả năng thấm hút nước cao,
đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi
độ ẩm ban đầu. Nhờ những đặc tính độc đáo đó mà màng CVK là một nguồn
polymer mới, là một giải pháp trong nghiên cứu sinh học hiện đại. Hiện nay màng
CVK đã được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau: thực
phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, mỹ phẩm, đặc biệt là trong y học
(màng CVK đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị
bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo, điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ
dưỡng da cho con người). Ngoài ra, màng CVK còn được dùng làm chất màng
đặc biệt cho các sợi pin và tế bào năng lượng (Brown, 1989), làm các sợi truyền
quang, là môi trường cơ chất trong sinh học sử dụng để cố định protein hay cho

sắc kí. Trong lĩnh vực dược phẩm, lợi dụng những đặc tính quý báu của màng
CVK để tăng khả năng hấp thụ của thuốc.
Nước dừa già là một môi trường rất tiềm năng trong việc nuôi cấy màng
CVK lên men từ vi khuẩn vì trong đó có chứa rất nhiều vi chất dinh dưỡng,
vitamin, axit hữu cơ, đường, đặc biệt có chứa những hợp chất quan trọng trong
nuôi cấy in vitro là myoinositol, các hợp chất có tính auxin, các glucosit của
xytokinin. Vì vậy A. xylium rất thích hợp phát triển trong môi trường này.
Từ các nghiên cứu về màng CVK và một số hạn chế của Curcumin trong
quá trình điều trị. Với mục đích làm tăng khả năng hấp thụ thuốc dựa trên màng
CVK giúp curcumin có thể khắc phục tính khả dụng sinh học, xét thấy đây là
hướng nghiên cứu mới và triển vọng. Đó là lí do chúng tôi đã chọn đề tài:
“Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc curcumin của màng cellulose vi khuẩn
lên men từ môi trường nước dừa già”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Tạo ra hệ thống màng CVK nạp thuốc curcumin từ môi trường nước dừa
già.
- Tìm hiểu khả năng nạp thuốc curcumin vào màng CVK trong môi trường
2


nước dừa già bằng một số cách hấp thu khác nhau với các màng CVK có kích
thước và độ dày khác nhau nhằm thiết kế hệ thống hấp thụ thuốc curcumin định
hướng sử dụng khắc phục tính hấp thu kém, sự chuyển hóa và đào thải lớn trong
cơ thể.
3. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm.
4. Ý nghĩa của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Nghiên cứu tìm hiểu khả năng hấp thụ của màng CVK để tăng thêm hiểu
biết về tiềm năng hấp thụ của màng CVK lên men từ môi trường nước dừa già.

Đánh giá những ưu nhược điểm của màng CVK nạp curcumin để từ đó đề
xuất hướng nghiên cứu trên các loại thuốc khác.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Định hướng cho việc có thể chọn ra được trường hợp hấp thụ tốt nhất thuốc
curcumin vào màng CVK lên men từ môi trường nước dừa già. Từ đó ứng dụng
vào cải thiện những nhược điểm của thuốc, nâng cao hiệu quả điều trị.

3


Chương 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về curcumin
Curumin là thành phần của củ nghệ vàng Curcuma longa L. Curumin có dạng bột
màu vàng, là thành phần chủ yếu tạo nên màu vàng của nghệ. Cùng với tinh dầu,
các hợp chất curcuminoid tạo nên vị cay và mùi hăng đặc trưng cho củ nghệ.
Curcumin tương đối trơ và không gây độc.
1.1.1. Cấu trúc hóa học và đặc tính hóa lý của curcumin
1.1.1.1 Cấu trúc hóa học của curcumin
- Tên IUPAC: (1E, 6E)-1,7-bis (4-hydroxy-3-metoxyphenyl)-1,6-heptadien-3,5dion.
- Công thức phân tử: C21H20O6.
- Phân tử khối: 368,38 g/mol.
- Nhiệt độ nóng chảy: 183°C (361 K).
- Năm 1913, cấu trúc hóa học của curcumin được Lampe xác định qua một loạt
cơ chế phản ứng [4].
- Khi đun curcumin với kiềm tạo thành vanilic acid và ferulic acid.
- Curcumin nóng chảy với kiềm cho protocatechuic acid.
- Oxy hóa bằng permanganat tạo thành vanilin.
- Tác dụng với hydroxylamin tạo dẫn xuất isoxozol.
- Hydro hóa dẫn xuất diacetyl của curcumin cho hỗn hợp dẫn xuất haxahydro và
tetrahydro.

- Các curcuminoit là các polyphenol và là chất tạo màu vàng cho củ nghệ.
- Hiện tại người ta phát hiện Cur tồn tại ở 4 dạng hợp chất:

4


+ Cur là hợp chất chính chiếm 60%

Curcumin
+ Demetoxy - Curcumin chiếm 24% có công thức cấu tạo như sau:

Demetoxy - Curcumin

+ Bis - Demetoxy - Curcumin chiếm 14%:

Bis - Demetoxy – Curcumin
+ Và một hợp chất mới phát hiện là Xiclocurcumin chiếm khoảng 1%:

5


Xiclocurcumin

1.1.1.2. Tính chất vật lí
- Curcumin là một polyphenol và là sắc tố tạo nên màu vàng đặc trưng của củ
nghệ.
- Màu của Curumin bền với nhiệt độ, không bền với ánh sáng và khi có sự hiện
diện của SO2 với nồng độ ≥ 10 ppm.
- Curumin không tan trong nước, tan trong cồn, aceton, methanol,
diclorolmethan, benzen,…

- Trong môi trường trung tính, dung dịch curcumin có màu vàng. Môi trường
acid, dung dịch có màu vàng ánh lục. Dung dịch có màu từ cam tới đỏ tím
trong môi trường kiềm.
- Dung dịch curcumin trong dung môi hữu cơ có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng
khoảng 420- 430nm.
1.1.1.3. Tính chất hóa học đặc trưng
- Curcumin dễ dàng bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng hoặc trong môi
trườn pH thích hợp.
- Phản ứng tạo phức với kim loại.
- Phản ứng cộng hydro.
- Phản ứng của nhóm OH trên vòng benzen.
- Phản ứng amin hóa.
1.1.2. Dược tính
6


- Hiện nay, trong y học curcumin được sử dụng nhiều nhất trong điều trị viêm
loét dạ dày, tá tràng, phòng chống ung thư, làm đẹp cho phụ nữ sau sinh.
- Cur là chất hủy diệt tế bào ung thư vào loại mạnh nhất theo cơ chế hủy diệt
từng bước các tế bào ác tính. Cur được coi là chất tiêu biểu nhất cho thế hệ
mới các chất chống ung thư vừa rất hiệu lực vừa an toàn, không gây tác dụng
phụ [9].
- Cur có khả năng giải độc và bảo vệ gan, bảo vệ và làm tăng hồng cầu, loại bỏ
cholesterol xấu, điều hòa huyết áp, hạ mỡ máu, ngăn chặn béo phì, làm cho da
dẻ hồng hào, tăng cường sắc đẹp, sức lực và cả tuổi thọ,…
- Cur giúp cơ thể chống lại các vi khuẩn sống kí sinh trong ruột, đặc biệt tốt cho
hệ tiêu hóa. Các nghiên cứu cho thấy, nghệ có thể kích thích tiêu hóa và giải
phóng các enzim tiêu hóa, phá vỡ liên kết cacbonhydrat và các chất béo. Chất
Cur có tự nhiên trong củ nghệ được các nhà khoa học chứng minh có khả
năng dễ dàng thẩm thấu và tiếp cận tới từng tế bào viêm do có khả năng [5]:

+ Tăng tiết chất nhầy mucin, bảo vệ niêm mạc dạ dày khỏi tác động ăn
mòn gây loét của acid dịch vị.
+ Ức chế và tiêu diệt tới 65 chủng vi khuẩn Hp (Helicobacter pylori)
nguyên nhân của hơn 90% trường hợp đau dạ dày mà không sợ kháng thuốc.
+ Tái tạo niêm mạc dạ dày , giúp các vết loét nhanh chóng được phục hồi.
Tuy nhiên, do vi khuẩn Hp rất dễ lây qua đường ăn uống và đường
miệng nên khả năng tái nhiễm vi khuẩn này là rất cao. Vì vậy, cần phải phối
hợp Cur với nhiều chất khác ví dụ như Thymomodulin để ngăn chặn viêm
loét dạ dày một cách hiệu quả [5].
- Mặc dù, các nghiên cứu thử nghiệm cho thấy khả năng trị liệu tuyệt
vời đó của Cur, tuy nhiên thách thức lớn nhất là Cur ít tan trong nước. Khi
dùng theo đường uống, Cur hòa tan một phần rất nhỏ vào các dịch thể của ống
tiêu hóa, chỉ 7 - 10% Cur được hấp thu vào máu, lại bị chuyển hóa nhanh qua
gan, làm cho sinh khả dụng thực tế của Cur chỉ đạt 2 - 3%, nên Cur chưa được
ứng dụng nhiều trong phòng và trị bệnh [5].
7


1.1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nhiều nghiên cứu trong vài thập kỷ gần đây cho thấy polyphenol có nhiều
tác dụng sinh học quý như tác dụng chống oxy hóa (anti-oxydant), kháng viêm,
chống nhiễm khuẩn, chống nấm, chống ký sinh trùng, và đặc biệt là chống ung
thư. Vì vậy, các nhà nghiên cứu đã rất nhanh chóng chuyển sự chú ý sang
curcumin.
Vì curcumin có một số nhược điểm về sinh khả dụng như ít tan trong nước,
khó hấp thu, dễ bị thải trừ nên các nhà khoa học đã sản xuất curcumin dưới dạng
nano, là dạng tiểu phân có kích thước khoảng 100 nanomet.
Bằng sáng chế đầu tiên về curcumin dạng nano được mang mã số EP
103266 A2 ngày 30/5/2001 (Ib-8) và tài liệu nghiên cứu đầu tiên về nano

curcumin dành cho mục đích y học được công bố vào năm 2005 [9]. Từ đó là sự
bùng nổ các nghiên cứu và bằng phát minh về nano curcumin: năm 2005 có 18
bằng thì đến năm 2010 đã lên đến gần 100. Để đánh giá tiềm năng ứng dụng của
curcumin dạng nano trong lĩnh vực y học, 254 bằng phát minh có liên quan đã
được phân tích, cho thấy 24% bằng liên quan đến bệnh ung thư, sau đó là các
bệnh tim mạch 13%, các chứng viêm 12%, bệnh tiểu đường 11%,bệnh khớp 10%
và bệnh tiêu hóa 9% [9].
Theo các tài liệu trước đã thống kê đã có rất nhiều các bài báo khoa học và
các bằng phát minh về curcumin trên thế giới những tác giả đầu tiên đã nghiên
cứu trên thực nghiệm để chứng minh tác dụng điều trị của curcumin, đó là tác
dụng chống tăng đường huyết (Srinivasan, M. 1972), tác dụng chống viêm
(Srimal, R.C. 1973), tác dụng chống oxy hóa (Sharma, O.P. 1976), tác dụng
chống thấp khớp (Deodhar, S.D. 1980), tác dụng bảo vệ gan (Kiso, Y. 1983), tác
dụng chống ung thư (Kuttun. R. 1985), tác dụng ức chế tắc mạch (Srivastava, R.
1995), tác dụng phòng nhồi máu cơ tim (Dikshit, M. 1995), tác dụng kháng khuẩn
(Jordan, W.C. 1996), tác dụng bảo vệ thận (Venkatesan, N. 2000), tác dụng chống
việm loét dạ dày (Ronita De, 2009),…[12].
8


Nghiên cứu năm 2011 của Bambang Kuswandi và các cộng sự về CUR /
CV trong việc phát hiện sự hư hỏng của tôm [10].
Nghiên cứu năm 2012 của Min Sun, Xun Su, Buyun Ding, Xiuli He, Xiuju
Liu, Aihua Yu, Hongxiang Lou, Guangxi Zhai về những tiến bộ trong 15 hệ
thống phân phối cho chất CUR dựa trên công nghệ nano [11].
Năm 2013, các nhà khoa học của Trung tâm Da Liễu, Đại học y
khoa Rochester, New York, Hoa Kỳ đã nghiên cứu Curcumin về khả năng làm
giảm mức độ nghiêm trọng của biến chứng viêm da do trị xạ. Và cũng vào năm
đó, tại Viện giải phẫu, Đại học Munich, Đức các nhà khoa học Shakibaei M,
Mobasheri A, Lueders C, Busch F, Shayan P, Goel A đã nghiên cứu curcumin

làm tăng tác dụng của hóa trị liệu chống lại tế bào ung thư đại trực tràng thông
qua con đường NF-κB/PI-3K/Src. Kết quả nghiên cứu cho thấy dùng curcumin
giảm đáng kể cả hai tế bào HCT116 và CH3. Curcumin tiêu diệt tế bào ung thư
bằng cách gây thoái hóa ty lạp thể và giải phóng cytochromec.
1.1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Tại Việt Nam, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu liên quan đến curcumin
nhưng chủ yếu là các công trình nghiên cứu liên quan đến tách chiết và chế tạo
vật liệu nanocurcumin từ củ nghệ vàng như Viện hóa học, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Viêt Nam (Viện HLKHVCNVN), Trung tâm nghiên cứu triển
khai Khu công nghệ cao TP.HCM, Đại học Dược Hà Nội. Trong đó Viện hóa
học, Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam là đơn vị đầu tiên chuyển giao thành
công đề tài nghiên cứu để đưa Nano Curcumin ra thị trường.
Trịnh Hoàng Dương, Hà Diệu Ly,Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP. Hồ Chí
Minh đã nghiên cứu chiết xuất curcumin từ củ nghệ vàng và xây dựng bộ dữ
liệu chuẩn của curcumin để thiết lập chất chuẩn chiết từ dược liệu [2]. Hay
nhóm các nhà nghiên cứu Dương Thị Hồng Ánh, Phạm Văn Giang, Nguyễn
Trần Linh Trường Đại học Dược Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu bào chế tiểu
phân nano curcumin bằng phương pháp nghiền bi kết hợp với đồng nhất hóa
tốc độ cao [3].
9


Các nghiên cứu về curcumin trên thế giới và ở Việt Nam hầu như hướng
tới nghiên cứu về nanocurcumin và ứng dụng trong điều trị các bệnh về ung thư
là chủ yếu. Do đó, đề tài mở ra một hướng đi mới trên cơ sở sử dụng màng CV
làm vật liệu hấp thụ thuốc để làm tăng sinh khả dụng của curcumin, khắc phục
các yếu điểm của thuốc trong điều trị bệnh.
1.2. Tổng quan về CVK
1.2.1. Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum
Acetobacter xylinum (A. xylinum) thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi

Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, là loại hiếu khí bắt buộc, có nhu mao và
sản xuất cellulose ngoại bào [5].
Theo khóa phân loại của Bergey [15], A. Xylinum
thuộc: Lớp: Schizomycetes
Bộ: Pseudomonadales
Bộ phụ: Pseudomonadieae
Họ : Pseudomonadaceae
1.2.2. Đặc điểm của A. xylinum
* Đặc điểm hình thái:
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang
khoảng 0,6 – 0,8µm, dài khoảng 2 – 3µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram
âm, không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào
già hay do điều kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biển đổi: tế bào
dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [5].
* Đặc điểm sinh lí và sinh hóa của A. xylinum:
Vi khuẩn có khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic, phản ứng
catalase dương tính, không tăng trưởng trên môi trường Hoyer, không tạo sắc
tố nâu, có khả năng tổng hợp cellulose, chuyển hóa glucose thành acid,
chuyển hóa glycerol thành dihydroaceton.
A. xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc
vào chủng mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất.
10


Nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển là từ 25 - 30°C; vi khuẩn tăng
trưởng trong khoảng pH từ 3 – 8, pH tối ưu để sản xuất cellulose là 5,5 [5, 15].
1.2.3. Cấu trúc đặc tính của màng CVK tạo bởi A. xylinum
- Màng CVK cấu tạo bởi những chuỗi polimer β-1,4-glucopyranose
không phân nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản
của CVK giống cellulose của thực vật, tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc

đại thể [13, 28].
- Theo AJ. Brown (1886), CVK gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là
hemicellulose, đường kính 1,5nm, kết hợp với nhau. Các sợi này kết hợp với
nhau thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng
khoảng 3 – 8nm.
- Đặc tính cấu trúc của CVK phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy:
+ Khi nuôi cấy theo phương pháp tĩnh (S - CVK: Static-Bacterial
Cellulose), A. xylinum tạo ra cellulose nhiều hơn và tạo thành màng dày trên bề
mặt môi trường. Màng CVK thu được dẻo dai, dày, có màu trắng trong hơi ngả
màu vàng.
+ Khi nuôi cấy động (A - CVK: Agitated-Bacterial Cellulose), một lượng
nhỏ cellulose được hình thành dưới dạng hyền phù phân tán trong đó chuỗi β1,4-glucan xếp một cách ngẫu nhiên. CVK được tạo ra bằng phương pháp
nuôi cấy động dưới dạng các hạt nhỏ, các sợi rối rắm, cong và không trật tự
do sự dao động của môi trường nuôi cấy.
+ Lượng CVK được sinh ra giữa hai phương pháp nuôi cấy động và tĩnh
cũng khác nhau: khối lượng màng khô của phương pháp nuôi cấy động nhỏ
hơn so với nuôi cấy tĩnh [5, 16].
1.2.4. Tính chất độc đáo của CVK
Độ tinh khiết cao: CVK là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp không
có chứa ligin hay hemicellulose. Do đó CVK có thể bị vi khuẩn phân hủy hoàn
toàn.
Độ bền dai cơ học lớn: Cellulose có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao, trọng
11


lượng nhỏ, độ bền đáng kể.
Khả năng hút nước cực cao ở trạng thái ẩm: màng cellulose vi khuẩn có khả
năng giữ nước rất lớn, có thể hút 600-700 lần trọng nước của nó.
Màng cellulose được hình thành trực tiếp trong quá trình tổng hợp: Có khả
năng hình thành các sợi biến động, tạo các bền theo một trục.

Màng cellulose được biến đổi trực tiếp trong quá trình tổng hợp: Khi thêm
chất phụ gia hay cơ chất nhất định vào trong quá trình tổng hợp CVK thì có thể
làm thay đổi những thuộc tính của CVK. Nếu cho thuốc nhuộm vào môi trường
nuôi cấy có thể kiểm soát các tính chất vật lí của cellulose trong quá trình tổng
hợp.
Tổng hợp trực tiếp các dẫn xuất của cellulose nhờ vào sự tác động gen liên
quan đến quá trình tổng hợp cellulose từ đó giúp kiểm soát hình dạng cellulose,
khiểm soát trọng lượng phân tử cellulose,…
1.2.5. Sinh tổng hợp CVK
Các vị trí tổng hợp cellulose của A. xylinum là những lỗ nằm trên bề mặt
tế bào, có đường kính 3,5nm sắp xếp song song trên đường thẳng trục dọc của
vi khuẩn. Mỗi lỗ bao phủ một tiểu phần 10 nm chứa các enzym có chức năng
trong sự polyme hóa để tổng hợp cellulose và các protein hỗ trợ liên quan đến
các chức năng khác [5].
A. xylinum hấp thu đường glucose vào trong tế bào, kết hợp với một acid
béo tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào, sau đó tiền chất này được tiết ra
ngoài tế bào cùng với enzym để thực hiện quá trình polyme hóa tạo cellulose.
Các sợi siêu nhỏ 1,5nm tạo nên các dãy glucan tạo thành các sợi, sau đó kết
hợp với nhau thành bó sợi nhỏ. Các bó sợi này sẽ được phun vào môi trường
nuôi cấy [5].
1.2.6. Ứng dụng của màng CVK
Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều những công trình nghiên cứu ứng
dụng màng CVK trên nhiều các lĩnh vực khác nhau như: lĩnh vực thực phẩm
(màng bảo quản trái cây, chất ổn định thực phẩm,…). Gần đây, người ta sử dụng
12


màng CVK làm vật liệu mang thuốc curcumin để nhận biết sự thay đổi pH của
sản phẩm thủy sản bằng cách đánh giá cảm quan sự thay đổi màu sắc của
curcumin [8]. Trong lĩnh vực y học người ta ứng dụng màng CVK để: tạo ruột

giả, màng trị bỏng, mạch máu nhân tạo trong điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt
nạ dưỡng da [1],… Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên cứu
ứng dụng CVK trong vận tải và phân phối thuốc đã được báo cáo [9], trong đó có
9 nghiên cứu với màng CVK tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi màng
CVK và 7 với các vật liệu nanocomposite. Như vậy, trong lĩnh vực này cần tiếp
tục được tiến hành nghiên cứu.
1.2.7. Môi trường nuôi cấy A. xylinum
Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn
dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các
yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng [5].
A. xylinum là loài có khả năng tổng hợp cellulose từ nguồn
cacbonhydrat. Nguồn cacbonhydrat mà A. xylinum sử dụng là glucose,
fructose, maninol, sorbitol nếu sử dụng glycerol, galactose, lactose, sucrose
cho hiệu suất thập hơn, không nên sử dụng mannose, cellobiose, erythriol,
acetate. Việc sử dụng các loại đường cũng như nồng độ các loại đường trong
môi trường còn phụ thuộc vào những chủng A. xylinum khác nhau [5].
Nhu cầu sử dụng đương ở A. xylinum rất lớn và giữ vai trò quan trọng
trong quá trình tổng hợp CVK nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử
dụng các sản phẩm: rỉ đường, chất thải trong công nghiệp sản xuất khoai tây
và pho mát, nước dừa già và nước mía... để làm nguyên liêu nuôi cấy A.
xylinum. Trong đó nước dừa già được xem là môi trường kinh điển trong
nuôi cấy A. xylinum [5].
Trong nước dừa chưa rất nhiều chất dinh dưỡng và chất kích thích tố
tăng trưởng như hexitol, cytolunin, sorbitol,…Vì vậy A. xylinum rất thích
hợp phát triển trong môi trường này. Nước dừa sau khi thu hoạch được sử
dụng không quá 3 ngày, tránh để lâu làm cho đường và các chất dinh dưỡng
13


khác giảm dẫn đến hiệu suất kém [5, 11]. Thành phần dinh dưỡng của nước

dừa được trình bày trong bảng 1.1 [5].
Bảng 1.1: Thành phần của nước dừa già.
Nước (%)
Protein (%)

94,9
0,729

Kẽm (mg/100g)
Đồng (mg/100g)

0,1
0,0

Chất béo toàn phần

0,72

Mangan (mg/100g)

0,1
4

3,17

Selenium (µg/100g)

421

2,16

Vitamin C (µg/100g)

2,4

Thiamin (mg/100g)

0,0

Riboflavin (mg/100g)

0,0
3

(%) Carbonhydrat (%)
Đường (%)
Calcium (mg/100g)
Sắt (mg/100g)

24
0,29

Magie (mg/100g)

25

Niacin (mg/100g)

0,0
57

Phosphorus (mg/100g)

20

Acid Pathenic

0,0
8

Kali (mg/100g)

250 (mg/100g)
Vitamin B6 (mg/100g)

43
0,0

Natri (mg/100g)

105

323

Folate (µg/100g)

1.2.8. Các phương pháp sản xuất CVK từ A. xylinum
1.2.8.1. Lên men tĩnh
Môi trường dinh dưỡng để lên men A. xylinum được cho vào các khay
lên men có bề mặt thoáng rộng. Trong quá trình lên men các khay được đậy

bằng giấy báo có độ xốp, giúp tạo độ thông khí giữa môi trường lên men và
môi trường bên ngoài nhưng vẫn tránh được khả năng nhiễm khuẩn. Nhiệt độ
thích hợp cho quá trình lên men 28 - 30ᴼC. Sợi cellulose mới được tổng hợp sẽ
di chuyển lên bề mặt của môi trường nuôi cấy tạo thành lớp màng cellulose
nằm ở mặt phân cách giữa môi trường lỏng và không khí. Cellulose tiếp tục
được tổng hợp bám lên màng cellulose bên trên. Sau 7-10 ngày có thể thu CVK
[5,16]

14


1.2.8.2. Lên men động
Vi khuẩn A. xylinum thường được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy lắc.
Cấy dịch huyền phù vi khuẩn đã được hoạt hóa vào môi trường nuôi cấy đã
chuẩn bị sẵn trong các bình erlen rồi đem đi lắc trong các máy lắc ổn nhiệt ở 2830ᴼC, 180-200 vòng/phút. CVK được tạo ra từ môi trường lắc có dạng hạt nhỏ,
hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trường. Lượng O2
hòa tan trong môi trường ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và khả năng tổng
hợp CVK của vi khuẩn A. xylinum. Do đó, quá trình lên men đạt hiệu quả cao,
các reactor có sục khí thường xuyên được sử dụng để lên men [5, 16].

15


Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Thuốc CUR (95%) có nguồn gốc từ Ấn Độ.
- Etanol 96º có nguồn gốc Việt Nam.
- Màng CVK (99% hàm lượng nước) được sản xuất bằng cách sử dụng
vi khuẩn A. xylinum (Phòng thí nghiệm Vi sinh, Trường ĐHSP Hà Nội 2) lên
men từ nước dừa già.

- Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản); Cân phân tích
(Sartorius – Thụy Sỹ); Nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA; Buồng cấy
vô trùng (Haraeus); Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức); Khuấy từ gia nhiệt (IKA –
Đức); Máy rung siêu âm TCP 280; Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu và nhiều
dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
- Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng CV: Glucose,
Pepton, KH2PO4, (NH4)2SO4, Nước dừa, Axit acetic, HCl, NaOH,… đạt
tiêu chuẩn phân tích.
2.2. Nội dung nghiên cứu.
- Tạo màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum.
- Xử lý màng CVK thô để thu được màng CVK tinh chế.
- Cho màng CVK nạp thuốc curcumin trong đó:
+ Dùng các phương pháp khác nhau để hấp thụ curcumin vào màng CVK.
+ Làm thí nghiệm với các màng CVK có kích thước và độ dày khác nhau.
- Sau khi thu xong, dùng các phương pháp kĩ thuật để xác định lượng thuốc
hấp thụ vào trong từng trường hợp từ đó chọn ra hệ thống màng cho khả năng hấp
thụ thuốc tốt nhất.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tạo màng và xử lí màng CVK
2.3.1.1. Chuẩn bị màng CVK lên men từ môi trường nước dừa già.
- A. xylinum được nuôi cấy để tạo màng CVK trong môi trường cải biên
từ môi trường chuẩn Hestrin – Schramm [14] được trình bày trong bảng 2.1.
16


Bảng 2.1: Môi trường nuôi cấy A. xylinum tạo màng CVK.
Hóa chất

Khối

Nước dừa

lượng
1000

Glucose

ml20 g

Pepton

5g

(NH4)2SO4

3g

KH2PO4

2g

Acid acetic

2%

Dịch giống A.

10%

xylinum

- Dùng máy khuấy từ để khuấy đều môi trường nuôi cấy (môi trường
chưa có acid acetic và dịch giống) cho đến khi bão hòa.
- Cho dung dịch vào nồi hấp thanh trùng ở 113ᴼC trong 15 phút để diệt
khuẩn và nấm mốc.
- Đặt môi trường tạo màng trong buồng cấy vô trùng, để dưới đèn tím 30
phút. Khi môi trường đã nguội hoặc ở nhiệt độ khoảng 30 - 35ᴼC.
- Sau đó cho dịch giống vào môi trường (10% thể tích của môi trường);
thêm vào môi trường 2% acid axetic để hạn chế nấm.
- Cho dung dịch vào hộp đựng có nắp đậy và đậy kín lại hoặc sử dụng
vải xô để đậy nắp hộp.
2.3.1.2. Thực hiện quá trình nuối cấy tĩnh
-

Để khay đựng môi trường tạo màng vào nơi thoáng khí, có nhiệt độ ổn

định và không di chuyển dung dịch trong khay từ 6 - 14 ngày để dung dịch lên
màng.
-

Trong quá trình nuôi cấy tĩnh cần mở nắp hộp đựng mỗi ngày một

khoảng thời gian để giảm lượng khí CO2 trong hộp đựng. Nếu sử dụng vải xô để
đậy nắp hộp thì không cần mở mỗi ngày.
2.3.1.3. Thu màng CVK
17