Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc cimetidin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ một số môi trường

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

ĐỖ THỊ THOAN

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG
HẤP THỤ THUỐC CIMETIDIN CỦA
MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN
MEN TỪ MỘT SỐ MÔI TRƢỜNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

ThS. PHẠM THỊ KIM DUNG

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Với lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn ThS.
Phạm Thị Kim Dung, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới các thầy cô trong khoa Sinh - KTNN
cùng các thầy cô tại Trung tâm Nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công
nghệ trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thụận lợi giúp
đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân, bạn bè đã luôn ở
bên động viên, giúp đỡ và khích lệ tôi hoàn thành khóa luận này.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thành khóa luận một cách hoàn

chỉnh nhất. Tuy nhiên do buổi đầu mới làm quen với công việc nghiên cứu
khoa học cũng như hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh
khỏi những thiếu sót nhất định mà bản thân chưa thấy được. Tôi rất mong
được sự góp ý của quý thầy cô để khóa luận được hoàn chỉnh hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, Ngày 15 tháng 4 năm 2017
Sinh viên

Đỗ Thị Thoan


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin khẳng định kết quả khóa luận “Nghiên cứu so sánh khả năng
hấp thụ thuốc Cimetidin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ một số
môi trường” là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự hướng dẫn trực
tiếp của ThS. Phạm Thị Kim Dung, giảng viên khoa Sinh - KTNN trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Đề tài này chưa từng công bố ở đâu và hoàn toàn
không trùng với công trình nghiên cứu của tác giả khác.
Hà Nội, Ngày 15 tháng 4 năm 2017
Sinh viên

Đỗ Thị Thoan


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu................................................................. 3

5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4
1.1. Tổng quan về màng cellulose vi khuẩn...................................................... 4
1.1.1. Vi khuẩn sản sinh cellulose vi khuẩn ..................................................... 4
1.1.2. Cấu trúc của màng cellulose vi khuẩn tạo bởi A. xilynum ..................... 4
1.1.3. Đặc tính của màng cellulose vi khuẩn tạo bởi A. xylinum...................... 5
1.1.4. Chức năng sinh lý của cellulose vi khuẩn tạo bởi A. xylinum ................ 5
1.1.5. Môi trường nuôi cấy A. xylinum nhằm thụ màng cellulose vi khuẩn ..... 5
1.1.6. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng ............................................ 6
1.2. Tổng quan về thuốc cimetidine .................................................................. 8
1.2.1. Công thức ................................................................................................ 8
1.2.2. Tính chất lý hóa ....................................................................................... 8
1.2.3. Tác dụng của cimetidine ......................................................................... 8
1.2.4. Đặc điểm được động học ........................................................................ 9
1.2.5. Dược lực học của cimetidine ................................................................ 10
1.2.6. Tác dụng phụ của cimetidine ................................................................ 10
1.3. Tình hình nghiên cứu về màng cellulose vi khuẩn tại Việt Nam và trên
thế giới ............................................................................................................. 11
1.3.1. Tình hình nghiên cứu về màng cellulose vi khuẩn tại Việt Nam........... 11
1.3.2. Tình hình nghiên về màng cellulose vi khuẩn trên thế giới .................. 12
1.4. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới về cimetidine ......... 13
1.4.1. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam về cimetidine ................................. 13
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về cimetidine ................................. 13


CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 14
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 14
2.1.1 Giống vi khuẩn ....................................................................................... 14
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất ........................................................................ 14
2.2. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................... 14

2.2.1. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 14
2.2.2. Dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu.............................................. 15
2.3. Môi trường lên men thụ màng cellulose vi khuẩn ................................... 15
2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 16
2.4.1. Phương pháp lên men thụ màng từ cellulose vi khuẩn một số môi
trường .............................................................................................................. 16
2.4.2. Phương pháp xử lý màng cellulose vi khuẩn trước khi hấp thụ thuốc. 16
2.4.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng cellulose vi khuẩn ...... 18
2.4.4. Phương pháp dựng đường chuẩn của cimetidine ................................. 18
2.4.5. Phương pháp xác định lượng thuốc cimetidine hấp thụ vào màng
cellulose vi khuẩn ............................................................................................ 20
2.4.6. Phương pháp xử lý thống kê ................................................................. 22
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 23
3.1. Tạo màng cellulose vi khuẩn của A. xylinum trong ba môi trường ......... 23
3.2. Thụ màng cellulose vi khuẩn thô trong ba môi trường ............................ 24
3.3. Quá trình xử lý màng cellulose vi khuẩn trước khi hấp thụ thuốc .......... 24
3.4. Xác định điều kiện nuôi cấy để có độ dày màng cellulose vi khuẩn thích
hợp ................................................................................................................... 26
3.5. Kiểm tra độ tinh khiết của màng cellulose vi khuẩn................................ 27
3.6. Khảo sát khả năng hấp thụ thuốc của màng cellulose vi khuẩn ............. 27
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 36


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
A. xylinum

Acetobacter xylinum

CNM

Cao nấm men

cs

cộng sự

ĐHSP

Đại học Sư phạm

MT1

Môi trường 1

MT2

Môi trường 2

MT3

Môi trường 3

FDA

Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ

OD

Mật độ quang phổ

Nxb

Nhà xuất bản


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của cellulose vi khuẩn ............................... 5
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của thuốc cimetidine ........................................... 8
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình thụ nhận màng cellulose vi khuẩn......................... 17
Hình 2.2. Phương trình đường chuẩn của cimetidine ..................................... 19
Hình 3.1. Màng cellulose vi khuẩn nuôi trong môi trường nước dừa già ...... 22
Hình 3.2. Màng cellulose vi khuẩn nuôi trong môi trường chuẩn .................. 23
Hình 3.3. Màng cellulose vi khuẩn nuôi trong môi trường nước vo gạo........ 23
Hình 3.4. Thu màng cellulose vi khuẩn thô ở khoảng thời gian khác nhau
trong MT2......... ............................................................................................. .24
Hình 3.5. Màng cellulose vi khuẩn thô được ngâm trong NaOH 3%............. 25
Hình 3.6. Màng cellulose vi khuẩn ngâm trong HCl ...................................... 25
Hình 3.7. Màng cellulose vi khuẩn được rửa dưới vòi nước .......................... 25
Hình 3.8. Màng cellulose vi khuẩn tinh khiết ................................................. 24
Hình 3.9. Kết quả thử sự hiện diện của đường glucose .................................. 26
Hình 3.10. Chuẩn bị hấp thụ thuốc cimetidine ở độ dày 0,3cm màng cellulose
vi khuẩn ........................................................................................................... 27
Hình 3.11. Màng cellulose vi khuẩn đang hấp thụ thuốc ............................... 27
Hình 3.12. Dung dịch lấy ra để đo quang phổ ................................................ 27
Hình 3.13. Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ của màng cellulose vi khuẩn lên
men từ 3 môi trường với thao tác không sấy .................................................. 32
Hình 3.14. Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ của màng cellulose vi khuẩn lên
men từ 3 môi trường với thao tác sấy 50% ..................................................... 33
Hình 3.15. Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ của màng cellulose vi khuẩn lên

men từ 3 môi trường với thao tác sấy 100% ................................................... 33
Hình 3.16. Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ của màng cellulose vi khuẩn lên
men từ 3 môi trường với với độ dày 0,3 cm ................................................... 34
Hình 3.17. Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ của màng cellulose vi khuẩn lên
men từ 3 môi trường với với độ dày 0,5 cm ................................................... 34


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần của nước dừa già ........................................................... 6
Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo ........................................ 7
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo màng cellulose vi khuẩn ......................... 15
Bảng 2.2. Nồng độ cimetidine và giá OD tương ứng (n = 3) ......................... 19
Bảng 3.1. Kết quả thụ màng cellulose vi khuẩn tươi ở các độ dày khác nhau 26
Bảng 3.2. Giá trị OD hấp thụ thuốc của màng cellulose vi khuẩn trong môi
trường chuẩn (n = 3)........................................................................................ 28
Bảng 3.3. Giá trị OD hấp thụ thuốc của màng cellulose vi khuẩn trong môi
trường nước dừa già (n = 3) ........................................................................... 29
Bảng 3.4. Giá trị OD hấp thụ thuốc của màng cellulose vi khuẩn trong môi
trường nước vo gạo (n = 3) ............................................................................. 29
Bảng 3.5. Lượng thuốc hấp thụ vào các màng cellulose vi khuẩn tại thời điểm
2 giờ ................................................................................................................. 30
Bảng 3.6. Hiệu suất thuốc hấp thụ vào các màng cellulose vi khuẩn khác nhau
với độ dày màng khác nhau trong 2h .............................................................. 32


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Đau bao tử hay loét dạ dày là bệnh phổ biến, thường gặp ở nước ta cũng
như trên thế giới, bệnh do hiệu ứng ăn da của acid và pepsin làm mất lớp niêm
mạc dạ dày hành tá tràng có thể lan xuống lớp dưới niêm mạc, lớp cơ thậm chí

đến lớp thanh mạc và có thể gây thủng dạ dày. Cimetidine là thuốc kháng H2 ra
đời đầu tiên và là sự lựa chọn đầu tay của các bác sĩ trong những năm 80 của
thế kỉ trước để chữa đau bao tử hay loét dạ dày. Cimetidine lần đầu tiên có
mặt tại thị trường Anh năm 1976, sau 12 năm được nghiên cứu bởi tập đoàn
dược phẩm Smith, Kline và French (SK & F nay là GlaxoSmithKline). Các
nhà khoa học của SK & F đã nhận thấy vai trò kích thích tiết acid dạ dày của
histamin trong cơ thể từ năm 1964, nhưng ở thời điểm đó các kháng histamin
cổ điển không có tác dụng để ức chế hoạt động này. Và kể từ khi họ chứng
minh được sự hiện diện của receptor histamin H2 ở tế bào thành dạ dày, mục
đích duy nhất của nhóm nghiên cứu là tìm ra một chất có khả năng ức chế
cạnh tranh với histamin, gắn vào receptor histamin H2 nhưng lại ức chế tiết
acid. Chất đó chính là chất kháng histamin H2 [9], [22]. Vào tháng 11 năm
1976, cimetidine sau khi trải qua hàng loạt các thử nghiệm với kết quả thành
công mỹ mãn, đã được ra mắt trên thị trường với tên Tagamet. Vào ngày 01
tháng 01 năm 1979, cimetidine chính thức được Cục quản lí dược và mỹ
phẩm Hoa Kỳ kê đơn [9].
Tuy nhiên, khả năng hòa tan trong nước của cimetidine thấp làm giảm
hiệu quả điều trị, sinh khả dụng thực tế của cimetidine ở người đau dạ dày
khoảng 56 - 68%, nửa đời thải trừ của cimetidine là 2 giờ [25].
Trong những năm gần đây, đã có sự chú ý đặc biệt về việc sử dụng các
vật liệu sinh học trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe vì khả năng tái tạo,
tương thích sinh học và phân hủy sinh học của chúng. Một trong những vật

1


liệu sinh học có những đặc tính trên được chú ý là cellulose. Cellulose vi
khuẩn hay màng sinh học là sản phẩm của một loài vi khuẩn, đặc biệt là
chủng A. xylinum. Cellulose vi khuẩn có một số tính chất hóa lí đặc biệt như:
độ bền cơ học và khả năng thấm hút cao, độ polymer hóa lớn, có khả năng

phục hồi độ ẩm ban đầu, có thể bị phân hủy bởi enzyme … Vì vậy cellulose
vi khuẩn đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ như: thực
phẩm, công nghệ giấy, công nghệ pin, trong lĩnh vực y học cellulose vi khuẩn
được dùng làm màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng da [2], [6].
Ngoài ra, cellulose vi khuẩn còn là một hàng rào cản oxi và các sinh vật
khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và ngăn cản tác động
của UV, ổn định về kích thước và hướng, vì thế màng cellulose vi khuẩn còn
có ý nghĩa giữ thuốc và kéo dài thời gian giải phóng thuốc [10], [12].
Các nghiên cứu cho thấy màng cellulose vi khuẩn được tạo ra từ các
nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp. Môi
trường nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum rất đa dạng như nước dừa già,
nước mía, nước vo gạo …
Với mục đích tạo ra màng cellulose vi khuẩn dựa trên loài vi khuẩn
thuộc chủng Acetobacter xylinum, từ đó chế tạo màng sinh học để khắc phục
được những tác dụng phụ của thuốc cimetidine trong chữa trị bệnh viêm loét
dạ dày ở môi trường thích hợp nhất, tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu so sánh
khả năng hấp thụ thuốc cimetidin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ
một số môi trường”.
2. Mục đích nghiên cứu
So sánh khả năng hấp thụ thuốc cimetidine từ một số môi trường nhằm
tìm ra môi trường hấp thụ nhiều thuốc nhất, phát huy được hiệu quả tốt trong
chữa trị bệnh viêm loét dạ dày ở người.

2


3. Nội dung nghiên cứu
Tạo màng cellulose vi khuẩn từ một số môi trường
Cho thuốc cimetidine hấp thụ qua màng trong một khoảng thời gian
nhất định, xác định lượng thuốc hấp thụ ở các môi trường đó.

So sánh lượng thuốc cimetidine hấp thụ qua màng được xử lí trong một
số trường hợp.
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: So sánh khả năng hấp thụ thuốc cimetidin của
màng cellulose vi khuẩn lên men từ một số môi trường.
Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong quy mô của
phòng thí nghiệm.
Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu khoa học và
Chuyển giao công nghệ trường ĐHSP Hà Nội 2.
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
* Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu về màng cellulose vi khuẩn để tăng thêm hiểu biết về ứng
dụng của màng cellulose vi khuẩn . Mở ra những hướng nghiên cứu khả năng
nạp thuốc và hấp thụ thuốc của màng cellulose vi khuẩn trên nhiều các loại
thuốc khác nhau nhằm tăng sinh khả dụng và kéo dài thời gian giải phóng của
các loại thuốc đó, và tìm ra môi trường có khả năng nạp thuốc và hấp thụ
thuốc cimetidine tốt nhất.
* Ý nghĩa thực tiễn
Việc sử dụng màng cellulose vi khuẩn làm tác nhân trong quá trình hấp
thụ thuốc cimetidine có thể làm tăng khả dụng sinh học của thụốc từ đó làm
tăng hiệu quả điều trị của thuốc đối với bệnh viêm loét dạ dày, tá tràng.

3


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về màng cellulose vi khuẩn
1.1.1. Vi khuẩn sản sinh cellulose vi khuẩn
Cellulose vi khuẩn là sản phẩm của một số loài vi khuẩn như:
Acetobacter, Achromobacter, Agrobecterium. Trong đó Acetobacter xylinum

sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn hiệu quả nhất và được nghiên cứu nhiều nhất
vì năng suất cellulose vi khuẩn cao, cấu trúc cellulose vi khuẩn phù hợp cho
nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau [2].
A. xylinum thụộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter. Là loại hiếu
khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất cellulose ngoại bào [2].
Theo khóa phân loại của Bergey, A. xylinum thuộc:
Lớp: Schizomycetes
Bộ: Pseudomonadales
Bộ phụ: Pseudomonadieae
Họ: Pseudomonadaceae
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang
khoảng 0,6 - 0,8 µm, dài khoảng 2-3 µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram
âm, không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào
già hay do điều kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào
dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [2].
1.1.2. Cấu trúc của màng cellulose vi khuẩn tạo bởi A. xilynum
Cellulose vi khuẩn cấu tạo bởi những chuỗi polymer β - 1,4
glucopyranose không phân nhánh.

4


Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của cellulose vi khuẩn
Theo AJ. Brown (1886), cellulose vi khuẩn gồm nhiều sợi siêu nhỏ có
bản chất là hemicellulose, đường kính 1,5 nm, kết hợp với nhau thành bó,
nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100 nm, rộng khoảng 3 - 8 nm
[2].
1.1.3. Đặc tính của màng cellulose vi khuẩn tạo bởi A. xylinum
Trong nuôi cấy tĩnh, cellulose vi khuẩn tích lũy trên bề mặt môi trường
dinh dưỡng lỏng thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô

tạo thành sản phẩm tương tự như giấy da với độ dày 0,01 - 0,5 nm. Sản phẩm
này có những tính chất rất đặc biệt như: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi
tốt, độ kết tinh và độ bền cơ học cao, có thể bị phân hủy sinh học, bề mặt tiếp
xúc lớn hơn gỗ thường, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu
nhiệt tốt, đặc biệt là khả năng cản khuẩn [2]. Với các tính chất này cellulose
vi khuẩn được ứng dụng rất nhiều trong các ngành công nghiệp khác nhau
trong đó có y học.
1.1.4. Chức năng sinh lý của cellulose vi khuẩn tạo bởi A. xylinum
A. xylinum là vi khuẩn tổng hợp polysaccharid ngoại bào, những tế bào
vi khuẩn này nằm trong mạng lưới polymer giúp tế bào bám chặt vào bề mặt
môi trường và thụ nhận chất dinh dưỡng dễ dàng hơn so với tế bào vi khuẩn
không nằm trong mạng lưới polymer.
Cellulose có các đặc tính như độ bền cơ học cao, tính thấm và tính hút
cao, trạng thái kết tinh giúp A. xylinum kháng lại sự thay đổi của môi trường
như việc thay đổi xuống 1 hay 2 đơn vị pH trong thời gian nuôi cấy hay do
lượng nước bị giảm đi, các chất chuyển hóa được sinh ra [2].
1.1.5. Môi trường nuôi cấy A. xylinum nhằm thụ màng cellulose vi khuẩn

5


Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn
dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các
yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng. Nhu cầu sử dụng đường ở
A.xylinum rất lớn và giữ vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp cellulose
vi khuẩn nên có rất nhiều nghiên cứu đề nghị sử dụng các sản phẩm thứ cấp
trong các ngành công nghiệp khác nhau như: rỉ đường, chất thải trong công
nghệ sản xuất khoai tây và phomat, chất thải của nhà máy sản xuất bột ngọt,
nước dừa già, nước mía,… để làm nguyên liệu trong nuôi cấy A. xylinum.
1.1.6. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng

Các vitamin như: Vitamin B6, vitamin B3 được xác định là cần thiết
cho sự tăng trưởng tế bào và tổng hợp cellulose, trong khi vitamin B2 và
vitamin B5 cho kết quả ngược lại.
Nước dừa già là nguyên liệu chủ yếu được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn
A. xylinum thụ màng cellulose vi khuẩn. Tùy theo giống dừa, tuổi của quả dừa
mà các thành phần hóa học trong nước dừa có khác nhau. Lượng đường và
protein trong nước dừa tăng lên khi dừa gần già (cao nhất là vào tháng thứ 9, sau
đó giảm dần).
Bảng 1.1. Thành phần của nước dừa già
Nước (%)

94,99

Đồng (mg/100g)

Protein (%)

0,72

Mangan (mg/100g)

Chất béo toàn phần (%)
Cacbohydrat (%)

0,2

Selen (µg/100g)

0,142
1

Vitamin C (mg/100g)

2,4

2,16

Vitamin B1 (mg/100g)

0,03

Canxi (mg/100g)

24

Vitamin B2 (mg/100g)

0,057

Magiê (mg/100g)

25

Vitamin B3 (mg/100g)

0,08

0,29

Vitamin B5 (mg/100g)

0,043

20

Vitamin B6 (mg/100g)

0,032

Kali (mg/100g)

250

Vitamin B9 (µg/100g)

3

Natri (mg/100g)

105

Kẽm (mg/1 00g)

Đường (%)

Sắt (mg/100g)
Photpho (mg/100g)

3,17

0,04

6

0,1


Nước dừa già là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong
nước dừa chứa nhiều chất dinh dưỡng và chất kích thích tố tăng trưởng như
1,3 - diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol… Vì vậy, A.xylinum
thích hợp phát triển trong môi trường này [2].
Nước dừa sau khi thu hoạch được sử dụng không quá 3 ngày, tránh để
lâu làm cho đường và các chất dinh dưỡng khác giảm đi dẫn đến cho hiệu suất
kém [2], [7].
Ngoài ra, trong nước dừa còn có nhiều khoáng chất, vitamin, axit
amin... phù hợp cho quá trình sinh trưởng và quá trình hình thành màng
cellulose vi khuẩn của vi khuẩn A. xylinum [4]. Môi trường nuôi cấy A.
xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn dinh dưỡng cần thiết như nguồn
cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi
lượng. Ngoài ra, nước vo gạo cũng được xem là môi trường thích hợp trong
nuôi cấy A.xylinum. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo được trình bày
như trong bảng 1.2 [8].
Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo
Thành phần

Hàm lƣợng

Vitamin nhóm B ( B1 , B2, B5, B6)

30% - 60%

Protein

15,7%

Đường

2%

Khoáng chất

Fe (7% - 8%), Zn (12% - 13%)

Acid amin

Leucine, valine, lysine

Nước vo gạo là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong
nước vo gạo chứa nhiều chất dinh dưỡng và các chất kích thích tố tăng trưởng
như nhóm vitamin B1, B3, B5, nhóm khoáng chất như sắt, đồng, kẽm và các
acid amin.

7


Nước vo gạo sau khi vo được sử dụng không quá 3 giờ, tránh để nước
bị chua làm cho đường, vitamin và các chất dinh dưỡng khác giảm đi dẫn đến
cho hiệu suất kém. Trong quá trình tăng trưởng, nitơ là một trong những
nguồn dinh dưỡng để sinh tổng hợp các cấu tử của tế bào. Vì vậy, pepton có
ảnh hưởng rõ rệt đến sự tăng trưởng của vi khuẩn trong khi cao nấm men

không ảnh hưởng nhiều đến sự tăng trưởng của A. xylinum [7], [8].
1.2. Tổng quan về thuốc cimetidine
1.2.1. Công thức
Cimetidine là một chất kháng histamin H2 có chứa vòng imidazole và
cấu trúc tương tự histamin [1].
Công thức phân tử: C10H16N6S
Phân tử lượng: 252,3 đvC
Độ nóng chảy: 1420C
Tên khoa học: N" - cyano - N methyl - N' - [2 - [[(5 - methyl - 1H imidazol - 4 - yl) methyl] thio] - ethyl] - guanidin [1 ]
Công thức cấu tạo:

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của thuốc cimetidine
1.2.2. Tính chất lý hóa
Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng [1].
Tan trong acid clohydric (HCl), khó tan trong nước [1].
1.2.3. Tác dụng của cimetidine
Tác dụng chủ yếu của thuốc cimetidine là ức chế tế bào thành dạ dày
tiết acid với chỉ định rộng rãi trong điều trị chứng ợ nóng và loét dạ dày. Tuy

8


nhiên, trong quá trình sử dụng cimetidine, các nhà lâm sàng đã phát hiện rất
nhiều tác dụng của nó trong một số bệnh nhờ cơ chế ức chế thụ thể histamin
H2 của tế bào T ức chế. Vì thế, ngoài tác dụng kháng tiết acid trong bệnh viêm
loét dạ dày được FDA Hoa Kỳ công nhận, cimetidine còn được sử dụng trong
điều trị một số bệnh da liễu [26].
1.2.4. Đặc điểm được động học
Hấp thụ và sinh khả dụng
Cimetidine được hấp thụ nhanh chóng, không hoàn toàn ở đường tiêu

hóa sau khi uống thuốc. Theo Pedersen P.U, Miller R (1980), sinh khả dụng của
thuốc ở trong khoảng từ 56 - 68% ở bệnh nhân loét [23]. Nồng độ của
cimetidine trong huyết tương đảm bảo làm giảm đến 50% lượng acid tối đa là
0,5 - 1,0 mcg/ml [13].
Phân phối
Thể tích phân phối của cimetidine ở mức xấp xỉ 0,8 - 1,39 L/kg. Tuổi
bệnh nhân càng tăng thì thể tích phân phối càng giảm. cimetidine phân bố
rộng khắp phần lớn trong dịch cơ thể, các cơ quan và mô người, không có
trong mô mỡ [11].
Tỉ lệ phân phối trung bình của cimetidine giữa dịch não tủy và huyết
thanh thay đổi từ 0,03 - 0,18. Tỷ lệ này là 0,2 - 0,5 ở người bệnh gan hay
thận. Tỉ lệ gắn protein huyết tương của cimetidine là 18 - 26,3% ở mức nồng
độ giữa 0,05 - 50 mcg/ml. Ở những bệnh nhân loét dạ dày tá tràng thì tỉ lệ này
đạt khoảng 13 - 25% (trung bình 19%) [11].
Chuyển hóa và thải trừ
Cimetidine và chất chuyển hóa của nó được đào thải qua thận. Khoảng
50 - 80% tổng lượng cimetidine dùng đường tiêm tĩnh mạch tồn tại dưới dạng
không đổi trong nước tiểu. Tỉ lệ này là 40% nếu dùng thuốc đường uống. Sự
chuyển hóa cimetidine chỉ chiếm khoảng 25 - 40% tổng lượng thải trừ của
cimetidine và quá trình này phụ thuộc vào độ tuổi [11]. Nửa đời thải trừ của

9


cimetidine khoảng 2 giờ, tăng lên khi suy thận. Sulphoxide cimetidine được
chứng minh là chất chuyển hóa chính của cimetidine [16].
Độ tuổi đóng một vai trò quan trọng trong dược động học của
cimetidine. Tuổi càng trẻ thì độ thanh thải càng lớn, trừ trẻ sơ sinh, độ thanh
thải này giảm một nửa từ độ tuổi 30 - 65 [11]. Một lượng nhỏ liều thụốc tiêm
tĩnh mạch được đào thải qua mật (Spence và cs, 1977) và phân (Griffiths và

cs, 1977; Taylor và cs 1978). Cimetidine có thể qua hàng rào nhau thai, được
bài tiết qua sữa mẹ và ở những người mẹ cho con bú, thuốc vào được cơ thể
trẻ nhiều mg/ngày [11].
1.2.5. Dược lực học của cimetidine
Các thử nghiệm trong ống nghiệm cho thấy cimetidine là một chất đối
kháng cạnh tranh chọn lọc với thụ thể histamin H2 mà không có tương tác có
ý nghĩa nào với catecholamin, thụ thể β, thụ thể histamin H1, thụ thể
muscarinic và không có tác dụng kháng cholinergic. Cimetidine làm giảm bài
tiết và giảm nồng độ acid dạ dày cả ở điều kiện cơ bản (khi đói) và khi được
kích thích bởi thức ăn, histamin, pentagastrin, insulin và cafein [25]. Vì quá
trình tiết acid cơ bản dài nhất xảy ra vào ban đêm nên việc dùng thuốc sau ăn
tối hoặc trước khi ngủ sẽ đạt hiệu quả tối ưu. Cimetidine cũng ức chế enzym
cytochrome P - 450, cytochrome P - 448 trong gan đồng thời với các hệ thống
chức năng oxidase, đối kháng dihydrotestosterone (hoạt động kháng
androgen).
Ngoài ra, cimetidine tăng cường sự bảo vệ niêm mạc dạ dày và có khả
năng chữa khỏi các rối loạn liên quan đến acid, đặc biệt là loét và chảy máu
dạ dày do stress, bằng cách tăng sản xuất chất nhầy dạ dày, tăng tiết chất nhầy
do bicarbonat, tăng lưu lượng máu ở niêm mạc dạ dày, tăng tổng hợp
prostaglandin nội sinh và tăng tốc độ tái tạo tế bào biểu mô [25].
1.2.6. Tác dụng phụ của cimetidine
- Trên đường tiêu hóa: Tiêu chảy (nhẹ), tần suất 1/100 bệnh nhân [18].
10


- Trên hệ thần kinh trung ương: Đau đầu (nhẹ đến nặng), chóng mặt và
buồn ngủ (nhẹ). Các rối loạn tâm thần như kích động, trầm cảm, lo âu, ảo
giác, mất phương hướng, mất đi sau 3 - 4 ngày ngừng thuốc [20].
- Trên tuyến nội tiết: Chứng vú to đã được báo cáo. Theo báo cáo của
L.A. Garcia Rodriguez và Hershel Jick tác dụng phụ này gặp ở những người

dùng cimetidine > 1g/ngày trong thời gian từ 7 - 12 tháng, hiện tượng này
thường trở lại bình thường khi ngừng điều trị [16,19]. Theo S.M. Sabesin, nếu
uống cimetidine kéo dài với liều > 5g/ngày mới có thể gây bất lực và chứng
vú to ở nam giới [27].
- Quá mẫn: Sốc phản vệ và viêm mạch máu quá mẫn.
- Trên thận: Tăng creatinin huyết thanh (tăng nhẹ). Có thể gặp viêm
thận kẽ và bí tiểu phải ngừng điều trị.
- Trên hệ tim mạch: Nhịp tim chậm, nhanh và block nhĩ thất đã được
báo cáo với thuốc đối kháng thụ thể H2. S.Saltissi (1981) cho thấy không có
sự thay đổi đáng kể nào lên hệ tim mạch của 24 bệnh nhân dùng 400 mg
cimetidine /ngày trong 4 tuần [21].
- Cơ xương khớp: Đau khớp và đau cơ tự hồi phục.
- Da và phần phụ: Phát ban nhẹ, hội chứng Stevens - Johnson, hoại tử
thượng bì nhiễm độc, hồng ban đa dạng, đỏ da bong vảy toàn thân, rụng tóc.
1.3. Tình hình nghiên cứu về màng cellulose vi khuẩn tại Việt Nam và
trên thế giới
1.3.1. Tình hình nghiên cứu về màng cellulose vi khuẩn tại Việt Nam
Tại Việt Nam việc nghiên cứu và sử dụng màng cellulose vi khuẩn từ
vi khuẩn A. xylinum ngày càng được quan tâm. Nguyễn Văn Thanh và cs
(2006) [2] đã tiến hành nuôi cấy, tinh chế và thu màng cellulose vi khuẩn từ
A. xylinum đạt hiệu cao. Đồng thời nhóm nghiên cứu trên cũng đã tiến hành
thử nghiệm invivo trong ứng dụng màng cellulose vi khuẩn điều trị bỏng với 2

11


loại màng cellulose vi khuẩn gồm cho thêm hoạt chất tái sinh mô và hoạt chất
kháng khuẩn. Kết quả cho thấy màng cellulose vi khuẩn có cho thêm hoạt
chất tái sinh mô từ dầu mù u làm gia tăng hiệu quả trị bỏng là ưu điểm mà các
loại màng khác trên thế giới không có.

Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như
Quỳnh [5] đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn
Acetobacter xylinum tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị
bỏng”, kết quả cho thấy màng cellulose vi khuẩn tạo bởi A. xylinum BNH2
tổng hợp có sợi cellulose nhỏ, dai, độ bền kéo, độ thấu khí cao, độ hút nước
tốt có triển vọng ứng dụng làm màng trị bỏng.
1.3.2. Tình hình nghiên về màng cellulose vi khuẩn trên thế giới
Nghiên cứu về màng cellulose vi khuẩn từ vi khuẩn A. xylinum và những
ứng dụng của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown
(1989), dùng màng cellulose vi khuẩn làm môi trường phân tách cho quá trình
xử lý nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào.
Brown (1989), Jonas và Farad, 1998, dùng màng như là một chất để biến đổi
độ nhớt, để làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học,
thực phẩm [2].
Cellulose vi khuẩn được ứng dụng trong ngành dược phẩm và mỹ
phẩm. Các tác giả Hamlyn và cs (1997), Cienchanska (2004), Legeza và cs
(2004), Wan và Milon (2005), Czaja và cs (2006) sử dụng màng cellulose vi
khuẩn đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt. Đặc biệt
tác giả Wan (Canada) đã được đăng kí bản quyền về làm màng cellulose vi
khuẩn từ A. xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad (1998), Czaja
và cs (2006) đã dùng màng cellulose vi khuẩn làm da nhân tạo, mặt nạ dưỡng
da cho phụ nữ [2].

12


1.4. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới về cimetidine
1.4.1. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam về cimetidine
Ở Việt Nam, phần lớn cimetidine được sử dụng là một loại thụốc để
chữa trị bệnh viêm loét và trào ngược dạ dày, ngăn ngừa tái phát sau khi bị

viêm loét dạ dày. Ngoài ra, cimetidine còn được ứng dụng trong chữa các
bệnh về da liễu, Hà Nguyễn Phương Anh của trường Đại học Y dược đã
thành công với luận án: Nhiễm Human papillomavirus trên bệnh nhân bị
nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục và tác dụng của cimetidine
trong phòng tái phát bệnh sùi mào gà [1].
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về cimetidine
Fukuda M và cs đã chứng minh hiệu quả của cimetidine là một chất đối
kháng thụ thể histamin H2 điều trị tổn thương dạ dày cấp tính, ung thư đại trực
tràng [15].
Arisawa T và cs có công trình nghiên cứu sự kết hợp cimetidine và
Rabeprazole đơn trị liệu điều trị các tổn thương dạ dày cấp tính thông qua
đường uống tái tạo mô liên kết [12].
Nghiên cứu của Franco I. (2000) dùng cimetidine với liều 30 - 40
mg/ngày, dùng trong 3 tháng liền để chữa mụn cóc trên bốn trẻ em. Kết quả là
bốn trẻ đều khỏi mụn cóc [14].

13


CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn A. xylinum thuần chủng được cung cấp bởi phòng thí
nghiệm vi sinh trường ĐHSP Hà Nội 2.
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất
Nguyên liệu: nước dừa, nước vo gạo, nước cất 2 lần, gạc vô trùng.
Hóa chất:
- Thuốc cimetidine dạng tinh khiết 99,6%, nguồn gốc Trung Quốc
- Sử dụng hóa chất đặc biệt: cao nấm men
- Các hóa chất thông thường: amoni sunfat, diamoni phosphat, acid

acetic, NaOH, HCl, đường glucose, pepton
- Hóa chất dùng pha môi trường pH: HClđđ, KCl, acid citric,
Na2HPO4.12H2O, ethanol 960, thuốc thử fehling
- Các hóa chất trên đều có nguồn gốc từ Việt Nam và Trung Quốc.
2.2. Thiết bị và dụng cụ
2.2.1. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu
- Bể ổn nhiệt 1013
- Bể rung siêu âm S60/H
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus)
- Cân kĩ thụật TE412
- Cân phân tích (Sartorius - Thụy sỹ)
- Khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức)
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản)
- Nồi hấp khử trùng HV - 110/ HIRAIAMA
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức)

14


2.2.2. Dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu
Hộp nhựa để lên men tạo màng cellulose vi khuẩn, ống nghiệm, cốc
đong thủy tinh, đũa thủy tinh, bình thủy tinh (500ml) có nút xoáy, lọ
penicilin, đèn cồn, kẹp gỗ, bình hút ẩm, giấy lọc, giấy quỳ tím, bình định mức
loại 100ml, 500ml, 1000ml, pipet chính xác 1ml, 5ml, 10ml, thước kẹp
panme,... và nhiều dụng cụ hóa sinh khác.
2.3. Môi trƣờng lên men thụ màng cellulose vi khuẩn
Tạo màng cellulose vi khuẩn có cải tiến từ môi trường chuẩn Hestrin Schramm [17] được trình bày trong bảng 2.1
MT1: môi trường chuẩn
MT2: môi trường nước dừa già
MT3: môi trường nước vo gạo

Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo màng cellulose vi khuẩn
Môi trƣờng

Thành phần
MT1

MT2

MT3

Glucose

20g

30g

30g

Pepton

5g

10g

10g

2,7g

0,3g

0,3g

0,5g

0,5g

2%

2%

Diamoni phosphate
Amoni sulfat
Cao nấm men

5g

Acid citric

1,5g

Acid acetic

2%

Nước dừa già

1000ml

Nước vo gạo
Nước cất 2 lần

Dịch giống A.xylinum

1000ml
1000ml
10%

10%

15

10%


Môi trường được hấp khử trùng ở 1130C trong 15 phút. Tiếp tục khử
trùng bằng tia UV trong 30 phút.
Để nguội môi trường sau đó bổ sung 10% dịch giống và 2% acid
axetic. Sau đó nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 260C trong 6 - 14 ngày [2].
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp lên men thu màng cellulose vi khuẩn từ một số môi
trường
- Bước 1: Chuẩn bị môi trường như bảng 2.1.
- Bước 2: Hấp khử trùng các môi trường đó ở 1130C trong 15 phút.
- Bước 3: Lấy các môi trường ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút
rồi để nguội môi trường.
- Bước 4: Bổ sung 10% dịch giống và 2% acid acetic, lắc đều tay cho
giống phân bố đều trong dung dịch.
- Bước 5: Dùng gạc vô trùng bịt miệng lọ, ủ tĩnh trong khoảng 4 – 10
ngày ở 260C.
- Bước 6: Thu màng cellulose vi khuẩn thô, rửa sạch chúng dưới vòi
nước.

2.4.2. Phương pháp xử lý màng cellulose vi khuẩn trước khi hấp thụ thuốc.
Sau khi nuôi cấy tĩnh 4 - 10 ngày ở 26oC, màng cellulose vi khuẩn được
nhúng vào nước cất. Sau đó màng cellulose vi khuẩn được tinh chế nhiều lần
theo quy trình được trình bày trên sơ đồ 1 [2].

16


Tách màng cellulose vi khuẩn
Ép loại nước
Ngâm trong NaOH 3%
48h, rửa và ép
Ngâm trong HCl 3%
48h, rửa và ép
Ngâm trong nước
48h, kiểm tra nạp
Màng cellulose vi khuẩn tinh chế

Hình 2.1. Sơ đồ quy trình thụ nhận màng cellulose vi khuẩn
- Tách cellulose vi khuẩn: Trong môi trường nuôi cấy tĩnh cellulose vi
khuẩn tạo thành màng dày ở mặt môi trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi
trường.
- Ngâm NaOH: Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy ngâm
màng trong NaOH 3% để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc
tố của vi khuẩn.
- Ngâm HCl: Màng cellulose vi khuẩn sau khi được ngâm bằng NaOH
rửa nước cất 2 lần rồi ép màng. Sau đó ngâm với HCl 3% khoảng 48 giờ để
trung hòa hết NaOH.

17