Nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên cây cam hàm yên tuyên quang và tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng nấm của chúng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
........................

ĐÀO ÁNH VÂN

NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY CAM
HÀM YÊN - TUYÊN QUANG VÀ TIỀM NĂNG SINH
TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG NẤM CỦA CHÚNG

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
Chuyên ngành : Vi sinh vật học
Mã ngành :60 42 01 03

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. PHAN THỊ HỒNG THẢO

Hà Nội - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi .Các số liệu, kế t
quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác .
Tôi xin cam đoan rằ ng mo ̣i sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã

đươ ̣c cảm ơn và các thông tin trić h dẫn trong Luận văn đã đươ ̣c chỉ rõ nguồ n gố c .

Hà Nội, Ngày 25 tháng 11 năm 2015
Học viên

Đào Ánh Vân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phan Thị Hồng Thảo –
Trưởng phòng Vi sinh vật Đất, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam người đã truyền thụ cho tôi những kiến thức chuyên ngành,
hướng dẫn, định hướng nghiên cứu và tận tình giúp đỡ tôitrong suốt quá trình học
tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ Sinh học – Viện
Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong quá trình học tập
Xin chân thành cảm ơn các cán bộ Phòng Vi sinh vật Đất, Viện Công nghệ
Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã động viên, giúp đỡ
và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Tôi xin cám ơn sự hỗ trợ kính phí thực hiện từ đề tài “Nghiên cứu sự đa dạng
của xạ khuẩn nội sinh trên cây có múi đặc sản ở miền Bắc Việt Nam và tiềm năng
sinh tổng hợp các chất kháng khuẩn và kích thích tăng trưởng thực vật của chúng”
Mã số đề tài: VAST.ĐLT.12/15-16 thuộc cấp quản lý Viện Hàn lâm KHCNVN
vàPhòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học đã tạo
điều kiện và cung cấp các thiết bị để tôi có thể tham gia thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn
quan tâm giúp đỡ và động viên tôi để có được thành quả ngày hôm nay.
Hà Nội, Ngày 25 tháng 11 năm 2015

Học viên
Đào Ánh Vân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

STT

Tên viết tắt

Tên đây đủ

1

CFU

Đơn vị hình thành khuẩn lạc

2

DNA

Deoxyribosenucleoic Acid

3

EDTA

Ethylene diamine tetra-acetic acid

4

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

5

ISP

Internationl Streptomyces Project

6

KTCC

Khuẩn ty cơ chất

7

KTKK

Khuẩn ty khí sinh

8

PCR

Polymerase Chain Reaction: Phản ứng khuếch đại gen

9

rDNA

Ribosomal Deoxyribosenucleoic Acid

10

RNA

Ribonucleic acid

11

rRNA

Ribosomal Ribonucleic acid

12

SDS

Sodium dodecyl sulfate

13

TAE

Tris-acetat EDTA

14

VSV

Vi sinh vật

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
1.1
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7

Tên bảng
Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn nội cộng sinh
trên thực vật.
Kết quả phân lập xạ khuẩn nội sinh từ mẫu rễ Cam Hàm Yên Tuyên Quang
trên một số môi trường khác nhau
Tỷ lệ các xạ khuẩn phân lập chia theo đa dạng nhóm màu
Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn
Số lượng các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập có khả năng đối kháng với

các chủng nấm và vi khuẩn kiểm tra
Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng sinh của 4 chủng xạ khuẩn lựa chọn được
nuôi cấy trên môi trường dịch thể ISP2 sau 5 ngày
Đặc điểm nuôi cấy của xạ khuẩn nội sinh C12 và R12-4 trên các môi trường
ISP
Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn sau 14

Trang
13
27
30
30
31
32
33
36

ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30C
Ảnh hưởng của nồng độ NaCl trong môi trường ban đầu đến khả năng sinh
trưởng và phát triển của 4 chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến khả năng sinh trưởng của 4
chủng xạ khuẩn tuyển chọn

37

3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ ban đầu đến khả năng sinh trưởng của 2 chủng xạ
khuẩn tuyển chọn
3.11 khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của các chủng xạ khuẩn
3.12 So sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA của chủng R12-4 với gen tương ứng
của các chủng xạ khuẩn được đăng ký trên GenBank

3.13 Môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm của hai chủng
xạ khuẩn C12 và R12-4
3.14 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi đến sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm
3.15 Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm của hai chủng xạ
khuẩn lựa chọn

37

3.16 Lựa chọn dung môi để chiết hoạt chất kháng nấm từ dịch lên men và sinh
khối
3.17 Ảnh hưởng của các pH chiết khác nhau đến khả năng chiết chất kháng nấm
3.18 Xác định độ bền nhiệt đến hoạt tính kháng nấm của chủng R12-4

42

3.8
3.9

DANH MỤC CÁC HÌNH

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

37

38
39
40
41
41

43
44


Hình
3.1
3.2
3.3
3.4

Tên hình
Hình ảnh minh họa kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh trên
một số môi trường sau 6 tuần nuôi cấy
Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân lập theo bộ phận của cây Cam Hàm Yên –
Tuyên Quang
Khả năng đối kháng của một số chủng xạ khuẩn phân lập với nấm
Xạ khuẩn C12 và R12-4 đối kháng với nấm

3.9

Khuẩn lạc xạ khuẩn C12 trên các môi trường ISP
Khuẩn lạc xạ khuẩn R12-4 trên các môi trường ISP
Cuống sinh bào tử, chuỗi bào tử và hình da ̣ng bào tử của xạ khuẩn
nội sinh C12
Cuống sinh bào tử, chuỗi bào tử và hình da ̣ng bào tử của xạ khuẩn
nội sinh R12-4
Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của chủng xạ khuẩn R12-4 và C12

3.10

sau 14 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 28C
Điện di đồ DNA tổng số của hai chủng xạ khuẩn C12 và R12-4 trên gel

3.5
3.6
3.7
3.8

3.11
3.12

agarose 1,0 %.
Điện di đồ sản phẩm PCR của chủng xạ khuẩn C12 và R12-4 với cặp
mồi sử dụng 27F và 1492R trên gel agarose 1,0%
Mức độ tương đồng di truyền giữa chủng Streptomyces angustmyceticus
C12 với các loài xạ khuẩn có họ hàng gần dựa vào 16S rRNA

Trang
29
29
31
32
34
34
35
35
36
38
38
39

3.13
3.14
3.15
3.16
3.17

Độ bền của chất kháng nấm với nhiệt
Độ bền của chất kháng nấm với pH
Khả năng bền với pH của chất kháng nấm
Hoạt chất kháng nấm của kháng sinh tinh sạch
Hình ảnh quang phổ hấp thu điện tử UV VIS của kháng sinh tinh sạch

44
45
45
46
46

3.18

Hình ảnh phổ hồng ngoại của kháng sinh tinh sạch

47

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3
1.1. Xạ khuẩn nội sinh trong thực vật ......................................................................... 3
1.1.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn .......................................................................... 3
1.1.2. Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật ......................................................................... 6
1.1.3. Mối quan hệ giữa thực vật và xạ khuẩn nội sinh .............................................. 8
1.1.4. Con đường xâm nhập của vi sinh vật vào cây chủ ........................................... 8
1.1.5. Các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh ................................................. 9
1.1.6. Phân loại xạ khuẩn nội sinh .......................................................................... 10
1.2. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh và tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh
.................................................................................................................................... 12
1.2.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh ........................................................ 12
1.2.2. Tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh ................................................... 15
1.3. Cây có múi và khả năng thu nhận các thể nội sinh ............................................ 17
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................ 20
2.1. Vật liệu ................................................................................................................ 20
2.1.1. Mẫu cây ........................................................................................................ 20
2.1.2. Vi sinh vật kiểm định:.................................................................................... 20
2.1.3. Hóa chất và thiết bị ....................................................................................... 20
2.1.4. Môi trường nghiên cứu.................................................................................. 21
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 22
2.2.1. Phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh từ các mô sống của các mẫu thực vật 22
2.2.2. Đánh giá khả năng đối kháng của xạ khuẩn .................................................. 22
2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn ................................................. 23
2.2.4. Phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA ....................................................... 24
2.2.5.Phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng sinh ............................................ 24
2.2.6. Phương pháp xác định một số tính chất của chất kháng nấm và kháng khuẩn 26

Phần III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 27
3.1. Phân lập và sàng lọc các chủng xạ khuẩn nội sinh có khả năng sinh tổng hợp
hoạt chất kháng nấm trên cây Cam Hàm Yên – Tuyên Quang. .............................. 27
3.1.1. Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây cam Hàm Yên – Tuyên
Quang ..................................................................................................................... 27
3.1.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh có khả năng sinh chất kháng nấm,
kháng khuẩn ........................................................................................................... 30
3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn ....... 32
3.2.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý và đặc điểm nuôi cấy của chủng xạ khuẩn lựa
chọn........................................................................................................................ 32
3.2.2. Đặc điểm sinh học của hai chủng xạ khuẩn lựa chọn .................................... 35
3.3. Nghiên cứu môi trƣờng và điều kiện sinh tổng hợp chất kháng nấm của hai
chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn ............................................................................. 40
3.3.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng
nấm ........................................................................................................................ 40
3.4. Nghiên cứu một số tính chất hoá lý của hoạt chất kháng nấm thu nhận từ
chủng R12-4. .............................................................................................................. 42
3.4.1. Tách chiết chất kháng nấm ............................................................................ 42
3.4.2. Khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh ....................................................... 43
3.4.3. Khả năng bền với pH của chất kháng nấm .................................................... 45
3.4.4. Tinh sạch và thu nhận chất kháng sinh ......................................................... 46
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 48
KẾT LUẬN .................................................................................................................... 48
KIẾN NGHỊ................................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 49
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 53

Luận văn tốt nghiệp

Đào Ánh Vân

MỞ ĐẦU
Cây có múi là tên gọi chung của nhóm cây cam, chanh, quýt, bưởi... cùng họ
Rutaceae. Cây ăn trái có múi được trồng ở hơn 100 quốc gia. Đây là loại quả có tầm quan
trọng hàng đầu thế giới, với sản lượng năm 2009 đạt hơn 120 triệu tấn, trong đó cam chiếm
54% [15, 42, 46], bao gồm cả Việt Nam, tại vùng cam nổi tiếng Hàm Yên - Tuyên Quang
hiệu quả kinh tế thu về khá cao. Tuy nhiên, việc trồng cây có múi phải đối mặt với một số
vấn đề là cây tăng trưởng chậm, côn trùng, sâu bệnh... [41].Bên cạnh đó, sự phát triển
nhanh chóng các vùng trồng và sử dụng lượng hóa chất nông nghiệp thiếu kiểm soát trong
nước dẫn đến những tác động tiêu cực về sản xuất, môi trường, chất lượng đất, sức khỏe
con người, vật nuôi và ngày càng nhiều vi sinh vật gây bệnh có khả năng kháng các loại
thuốc bảo vệ thực vật thông dụng. Vì vậy, việc tìm kiếm và ứng dụng các vi sinh vật để
kiểm soát sinh học, kích thích tăng trưởng thực vật là một phương pháp thay thế để giảm
sử dụng hoá chất nông nghiệp. Trong số các loài vi sinh vật, xạ khuẩn có vị trí quan trọng
do sự đa dạng cao, khả năng sinh tổng hợp nhiều chất có hoạt tính sinh học như enzym,
chất kích thích sinh trưởng thực vật, thuốc kháng sinh dùng trong nông nghiệp và y học...
Đặc biệt là các loài xạ khuẩn nội sinh trong mô thực vật sống (lá, cành, rễ). Các loài xạ
khuẩn sống nội sinh trong thực vật có khả năng tích hợp với cây chủ và sinh tổng hợp một
số chất chuyển hóa thứ cấp có lợi cho cây chủ của mình. Đó là một trong những hệ sinh
thái đặc biệt và khó tiếp cận, nơi mà xạ khuẩn nội sinh có vai trò quan trọng trong sự phát
triển của cây chủ, chúng có thể ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây bằng con đường đồng
hóa các chất dinh dưỡng, kích hoạt hệ thống miễn dịch và sản xuất các chất chuyển hóa thứ
cấp, giúp cây chủ hạn chế bệnh và kích thích sinh trưởng cho cây[22, 23]. Trong mối quan
hệ tương hỗ với cây chủ, vi sinh vật nội sinh cũng nhận được từ cây chủ các chất dinh
dưỡng để sinh trưởng. Đến nay, đã có nhiều nghiên cứu công bố về khả năng sản sinh các
chất thứ cấp tiêu diệt nhiều loài nấm bệnh và sinh tổng hợp các kháng sinh mới như
munumbicin, kakadumycin và coronamycin của các loài xạ khuẩn nội sinh. Như vậy, xạ

khuẩn nội sinh thực sự là những ứng cử viên tiềm năng trong kiểm soát sinh học cho tương
lai. Tuy nhiên, số lượng các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên cây cam và cây có múi
nói chung tại Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi thực
hiện nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên cây Cam Hàm Yên- Tuyên
Quang và tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng nấm của chúng”
Mục tiêu cơ bản của đề tài:

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

1


Luận văn tốt nghiệp

Đào Ánh Vân

Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây Cam tại Hàm Yên
Tuyên Quang có tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng nấm cao.
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
1. Phân lậpcác chủng xạ khuẩn nội sinh trên rễ và cành trên các mẫu rễ và cành của
cây cam Hàm Yên- Tuyên Quang.
2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây cam Hàm Yên –Tuyên Quang có
khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn và kháng nấm cao.
3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn.
4. Nghiên cứu môi trường và điều kiện sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm của các
chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn
5. Nghiên cứu một số tính chất hoá lý của hoạt chất kháng nấm thu nhận từ xạ khuẩn
R12-4.
Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật đất, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn
lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

2


Luận văn tốt nghiệp

Đào Ánh Vân

PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Xạ khuẩn nội sinh trong thực vật
1.1.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn
Theo hệ thống phân loại hiện nay xạ khuẩn thuộc nhóm Prokaryote, thuộc giới
Monera trong 5 giới của Whittaken, còn theo hệ thống phân loại chia sinh giới thành 7 giới
thì xạ khuẩn thuộc giới Prokaryote. Xạ khuẩn có mặt chủ yếu trong đất, trong nước ao hồ,
trong bùn và trong chất hữu cơ khác, thậm trí trong cả cơ chất mà các vi khuẩn và nấm
mốc không sinh trưởng được [9].
a. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
* Cấu tạo tế bào xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn G(+), toàn bộ cơ thể chỉ là một tế
bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất
nhân và các thể ẩn nhập. Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 ÷ 20 nm
có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: Lớp
ngoài cùng dày khoảng 60 ÷ 120Å, khi già có thể đạt tới 150 ÷ 200Å, lớp giữa rắn chắc,
dày khoảng 50Å, lớp trong dày khoảng 50Å. Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp
glucopeptide bao gồm các gốc N - axetyl glucozamin liên kết với N - axetyl muramic bởi
các liên kết 1,4 - β glucozit. Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulose và kitin nhưng
chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất
qua màng tế bào[3, 9].

Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm
chính, bao gồm:
Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic (L ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này.
Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic
(meso - ADP) và glyxin. Thuộc nhóm này gồm các chi : Micromonospora, Actinoplanes,
Ampullarriella…
Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -diaminopimelic.
Thuộcnhóm này có các chi: Dermatophilus, Geodermatophilus, Frankia…

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

3


Luận văn tốt nghiệp

Đào Ánh Vân

Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -diaminopimelic,
arabinose và galactose. Thuộc nhóm này gồm các chi: Mycobacterium, Nocardia,
Pseudonocardia…[8,11].
Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo chủ yếu
bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong
quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn.
Tế bào chất của xạ khuẩn có chứa mezoxom, thể nhân, và các vật thể ẩn nhập gồm
các hạt poliphotphat và polixacarit. Nhân của tế bào xạ khuẩn không có cấu trúc điển
hình, chỉ là những nhiễm sắc thể không có màng. Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có 1
nhiễm sắc thể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty…[8, 11].
* Khuẩn lạc, khuẩn ty xạ khuẩn
Hình thái của khuẩn lạc xạ khuẩn rất khác nhau, kích thước và hình dạng của chúng

thay đổi phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, độ ẩm…). Trên môi
trường đặc, xạ khuẩn sinh trưởng thành những khuẩn lạc khô, kích thước thay đổi. Mặt
khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng đá vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo,
có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ và bám sâu [8]. Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có 3 lớp:
lớp vỏ ngoài có các sợi bện chặt, lớp trong đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn
lạc xạ khuẩn thường có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, tím, nâu… tùy thuộc vào
từng loại và điều kiện ngoại cảnh như: pH, nhiệt độ, thành phần môi trường nuôi cấy.
Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn được phân biệt ở hướng sinh trưởng trong và ngoài môi
trường tạo thành khuẩn ty cơ chất (KTCC) và khuẩn ty khí sinh (KTKS). Các KTCC cắm
sâu vào môi trường để lấy chất dinh dưỡng, còn KTKS thì phát triển ra ngoài không khí,
phần cuối của khuẩn ty này thường biến thành cuống sinh bào tử. Khuẩn ty xạ khuẩn mảnh
hơn khuẩn ty của nấm mốc và có đường kính thay đổi trong khoảng từ 0,2 ÷ 1,0 m đến 2
÷ 3 m. Đa số xạ khuẩn có khuẩn ty không có vách ngăn và không tự đứt đoạn [3].
Xạ khuẩn giống nấm mốc ở chỗ có thể tạo thành hệ sợi, nhưng lại là cơ thể đơn bào,
Gram (+), không có nhân thực và có kích thước giống vi khuẩn. Mặc dù thuộc nhóm sinh
vật nhân sơ nhưng xạ khuẩnthường sinh trưởng dưới dạng sợi và tạo nhiều bào tử. Một bào
tử xạ khuẩn khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ trương lên, sau 1÷ 2 giờ xuất hiện quá trình tổng
hợp ARN, nhân các gen cần thiết từ hệ gen và tiến hành tổng hợp protein hình thành
KTKS. Đầu KTKS kéo dài và phát triển hệ sợi theo phương pháp mọc chồi phân nhánh
(khoảng 30 m phân 1 nhánh). Độ dài khuẩn ty xạ khuẩn trong giai đoạn phát triển khoảng
11 m/1 giờ và nhân của xạ khuẩn sắp xếp đều đặn theo chiều dài của khuẩn ty [9].
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

4


Luận văn tốt nghiệp

Đào Ánh Vân

b. Đặc điểm sinh trưởng của xạ khuẩn
Phần lớn xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, nhưng không phải là hiếu khí nghiêm ngặt.
Tùy theo xuất xứ mà chúng là vi sinh vật ưa ấm hoặc ưa nhiệt, thậm chí có loài phát triển
được ở những nhiệt độ bằng hoặc cao hơn 50°C. Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh trưởng
tốt ở dải nhiệt độ từ 25 ÷ 37°C, còn các chủng ưa nhiệt phát triển tốt ở 45 ÷ 50°C. Xạ
khuẩn phát triển tốt ở môi trường trung tính và hơi kiềm, phát triển chậm hoặc không phát
triển khi pH của môi trường quá axit hoặc kiềm. Xạ khuẩn thuộc loài dị dưỡng, chúng sử
dụng nguồn cacbon là tinh bột, các loại đường (glucose, maltose, saccarose…) và các hợp
chất polysacaride. Nguồn nitơ vô cơ thường là: nitrate, muối amon…, nitơ hữu cơ thường
là: pepton, cao ngô, cao nấm men. Khả năng đồng hóa các chất này ở các chủng xạ khuẩn
khác nhau là không giống nhau. Phần lớn xạ khuẩn phát triển tốt ở môi trường có pH trung
tính và hơi kiềm; ở môi trường pH thấp hoặc hơi quá kiềm xạ khuẩn không phát triển hoặc
phát triển kém. Các chủng xạ khuẩn phát triển được ở nồng độ muối 3 ÷ 5% (w/v), còn ở
nồng độ cao hơn có thể bị ức chế hoặc tiêu diệt [3].
c. Đặc điểm của bào tử xạ khuẩn
Cũng như các vi khuẩn sinh bào tử khác, xạ khuẩn thường sinh bào tử khi gặp điều
kiện bất lợi về dinh dưỡng hoặc điều kiện hóa lý của môi trường (nhiệt độ, độ ẩm, độ pH).
Bào tử của xạ khuẩn có dạng hình cầu hay hình bầu dục, hình que, hình trụ hay hình quả
dưa… Dưới kính hiển vi quang học, hình dạng của bào tử ổn định, nhưng khi quan sát
dưới kính hiển vi điện tử thì hình dạng của chúng không đồng nhất, thậm chí trong một
chuỗi bào tử hình thái của các bào tử cũng có thể khác nhau. Ngược lại, kết cấu bề mặt
ngoài của bào tử (trơn, thô, nhám, nhăn nheo, có mấu lồi hoặc có gai) thì lại là đặc điểm
tương đối ổn định. Dựa vào hình thái, kích thước cuống sinh bào tử và của bào tử ở nhiều
chi xạ khuẩn có thể phân loại được xạ khuẩn. Cuống sinh bào tử thường có dạng thẳng
hoặc hơi cong (RF), dạng xoắn thật hay xoắn lò xo (S) và chuỗi bào tử không sinh trưởng
hoặc xoắn đơn giản hình móc câu (RA). Cuống sinh bào tử dạng xoắn có chiều dài và số
vòng khác nhau. Cuống sinh bào tử dạng thẳng có thể dài hoặc ngắn hơn với các dạng lỏng
cứng hoặc có thể thon lại, uốn cong hay kéo dài. Những đặc điểm này rất quan trọng khi
xác định tên xạ khuẩn [3]. Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh
bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, hình cầu, hình que

với mép nhẵn hoặc xù xì, ở một số loài, bào tử có hình thành ở các mấu lồi với các dạng
khác nhau. Việc hình thành cuống bào tử diễn ra mạnh mẽ hơn khi môi trường có chứa
một số nguyên tố vi lượng [9].

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

5


Luận văn tốt nghiệp

Đào Ánh Vân

Cuống sinh bào tử xạ khuẩn hình thành bào tử theo 3 phương thức sau:
 Phương thức sinh trưởng toàn bộ: toàn bộ hay một bộ phận của khuẩn ty hình
thành nên thành của bào tử.
- Phương thức sinh trưởng trong thành: thành bào tử sinh ra từ tầng nằm giữa màng
nguyên sinh chất và thành khuẩn ty. Trường hợp này gặp ở xạ khuẩn thuộc chi
Planomonospora.
- Phương thức sinh trưởng thành bào tử nội sinh thật: thành khuẩn ty không tham gia
vào quá trình hình thành ra bào tử Thermoactynomyces[3].
1.1.2. Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật
Vi sinh vật nội sinh bắt đầu được nghiên cứu từ giữa thế kỷ XIX, nhưng không
chiếm được sự chú ý do hệ sinh thái của chúng rất đặc biệt[58]. De Bary (1866) lần đầu
tiên đề xuất định nghĩa về endophyte: đó là các VSV cư trú ở các mô bên trong của thực
vật, phân biệt với thực vật biểu sinh (epiphyte) sống ở trên bề mặt thực vật, khái niệm này
đã gây ra nhiều tranh cãi[58]. Năm 1975, Smith và cộng sự đã đưa ra khái niệm xạ khuẩn
nội sinh khi phân lập thành công xạ khuẩn Microsmonospora sp. có khả năng ức chế nấm
gây bệnh Fusarium oxysporum trong mô cây cà chua không nhiễm bệnh [45].Vào năm
1991, Pentrini đưa ra khái niệm về “endophyte”và đã được chấp nhận rộng rãi: Endophyte

là các vi sinh vật sống trong các tổ chức của thực vật trong một giai đoạn nhất định của
cuộc đời và không có khả năng gây bệnh [37]. Sau đó Sikora đã mở rộng định nghĩa của
endophyte: đó là một sinh vật xâm chiếm trong mô của một thực vật trong suốt vòng đời
của chúng, mà không biểu hiện bất cứ triệu chứng bệnh rõ ràng nào cho cây chủ[43]. Theo
định nghĩa được thừa nhận rộng rãi nhất của Bacon và White (2000) thì “các thể nội sinh
(endophytes) là những vi sinh vật sinh trưởng ở các mô sống bên trong thực vật, mà không
gây ra hiệu ứng xấu rõ ràng và trực tiếp nào cho cây”. Theo Bacon và While (2000) thì
định nghĩa này hàm chứa một ý nghĩa rất quan trọng: vì bản chất không gây triệu chứng
bệnh cho cây nên việc các thể nội sinh chiếm cứ mô thực vật đã khiến chúng ta nghĩ đến
mối quan hệ hỗ sinh (mutualistic) giữa thể nội sinh và cây chủ của chúng[16]. Vì vậy, các
VSV nội sinh được mô tả là những VSV thiết lập được mối quan hệ cộng sinh với thực vật
hoặc được định nghĩa là bất cứ VSV nào không gây ra tác động có hại với thực vật, và có
thể được phân lập từ bề mặt của các mô thực vật đã được khử trùng hoặc được chiết xuất
từ phần bên trong của thực vật. Mối liên kết giữa nội sinh và thực vật đã được tìm thấy
trong rất nhiều cơ quan của thực vật như rễ, cuống, lá, quả, hoa và hạt [35].

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

6


Luận văn tốt nghiệp

Đào Ánh Vân

Theo Kandpal1 và cộng sự (2012), trong số gần 300.000 loài thực vật tồn tại trên trái
đất thì mỗi loại cây là cây chủ cho một hoặc nhiều loài VSV nội sinh[29].Các VSV nội
sinh tồn tại rộng rãi trong nhiều cơ quan thực vật mà chưa được biết đến, ước tính lên đến
một triệu loài [58]. Chúng không những không gây bệnh cho cây chủ mà còn có khả năng
thúc đẩy sự phát triển của cây bằng cách sản xuất các chất kích thích tăng trưởng và bảo vệ

thực vật. Tiếp tục đi sâu nghiên cứu, các VSV nội sinh được xác định có khả năng sản xuất
ra nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau có giá trị to lớn trong sinh thái học, y
học và bệnh lý học. Vi sinh vật nội sinh đem lại một triển vọng lớn trong việc ứng dụng để
phát triển các nguồn thuốc và ngăn chặn dịch bệnh, côn trùng trong nông nghiệp và công
nghiệp, có hiệu quả cao, độc tính thấp và thân thiện với môi trường. Thêm nữa, vi sinh vật nội
sinh cũng là nguồn tài nguyên quý giá của vi sinh vật cũng như nguồn gen. Nhiều cây có ý
nghĩa kinh tế quan trọng có chứa các thể nội sinh giúp cây tăng trưởng, chống chịu các tác
động bất lợi bên ngoài như khô hạn, đồng thời cũng như giúp cây chống lại côn trùng và vi
sinh vật gây bệnh [16].
Trong số các VSV nội sinh, xạ khuẩn được chú ý bởi hơn 70 % các chủng xạ khuẩn
đã biết có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh có thể ức chế nhiều nhóm VSV gây
bệnh[31]. Với các tác dụng nhận được từ xạ khuẩn nội sinh, một số nhà sinh học đã
nghiên cứu sử dụng xạ khuẩn nội sinh như một yếu tố kiểm soát sinh học (Biocontrol)
trong suốt hai thập kỷ qua [47]. Khi sử dụng trong kiểm soát sinh học, vai trò xạ khuẩn đã
được chứng minh giúp tăng cường, thúc đẩy tăng trưởng của cây chủ, giảm nguy cơ nhiễm
mầm bệnh và tăng cường khả năng sống sót của cây chủ trong các điều kiện khác nhau ...
[58].Nói chung, số chủng loại và số lượng VSV nội sinh trong thực vật vùng nhiệt đới và
cận nhiệt đới nhiều hơn vùng lạnh và khô, trong cây tăng trưởng nhanh và lâu năm nhiều
hơn trong cây tăng trưởng chậm và ngắn ngày, trong cây khỏe mạnh nhiều hơn trong cây
phát triển ở môi trường ô nhiễm[58].
Xạ khuẩn đại diện cho một phần lớn cộng đồng vi sinh vật vùng rễ, đây là yếu tố
thuận lợi để chúng xâm nhiễm vào thực vật và trở thành thể nội sinh. Cộng đồng xạ khuẩn
nội sinh bao gồm cả các loài Streptomyces và các loài khác không thuộc Streptomyces, đều
có thể có mặt trong mô thực vật [45].
Theo một số tác giả,tương tự các loài vi sinh vật khác, sự sinh ra hormone thực vật
như IAA ở xạ khuẩn nội sinh là một trong những cơ chế để kích thích sự tăng trưởng của
cây chủ, tăng trọng lượng khô của lá, rễ và chiều dài rễ khiến cho cây phát triển khỏe mạnh
hơn. Mối liên hệ giữa xạ khuẩn nội sinh với cây chủ và việc sản sinh ra các sản phẩm tự

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

7


Luận văn tốt nghiệp

Đào Ánh Vân

nhiên có hoạt tính sinh học tạo ra cơ hội tìm ra các loại chế phẩm đặc hiệu có tiềm năng
ứng dụng trong bảo vệ thực vật và kiểm soát nấm bệnh. Xạ khuẩn nội sinh có khả năng hạn
chế nấm gây bệnh trên cây chủ yếu dựa vào khả năng sinh tổng hợpcác chất có hoạt tính
sinh học như kháng sinh và các enzyme phá hủy thành tế bào. Xạ khuẩn nội sinh cũng
được công bố là có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch thực vật (ISR) [34, 43].
1.1.3. Mối quan hệ giữa thực vật và xạ khuẩn nội sinh
Vi sinh vật nội sinh có lợi với thực vật trong hầu hết các trường hợp. Thực vật che
chở và cung cấp chất dinh dưỡng cho thể nội sinh, và thể nội sinh sẽ giúp tăng trưởng thực
vật. Ví dụ, xạ khuẩn nội sinh giúp tăng cường sự phát triển của rễ, hòa tan phosphate làm
tăng khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng của thực vật từ đất [58], cố định nitơ và bảo vệ rễ
chống nhiễm nấm [47, 53]Thông qua những hoạt động đó, endophyte có thể thúc đẩy tăng
trưởng cây chủ và giúp cây chủ chống chịu tốt hơn với điều kiện bất lợi của môi trường.
Mối quan hệ cộng sinh khá phổ biến giữa endophytes và thực vật, nhưng mối quan hệ này
có thể biến đổi từ hỗ sinh thành ký sinh, nếu một gen đơn (single gene) bị biến đổi, có thể
ảnh hưởng đến cơ chế hoạt động của VSV nội sinh với cây chủ[58].
1.1.4. Con đường xâm nhập của vi sinh vật vào cây chủ
Có một số cách thức để vi sinh vật xâm nhập vào bên trong cây và trở thành thể nội
sinh. Quá trình này thường bắt đầu từ sự tập trung của chúng ở vùng rễ. Khi đã sinh trưởng
được ở vùng rễ thì vi sinh vật bắt đầu bám lên bề mặt rễ. Đây là bước quan trọng cho quá
trình xâm nhập sau này. Một số tác giả cho rằng vi sinh vật bám được lên bề mặt rễ nhờ
một số thành phần trên bề mặt tế bào như lông tơ (pilli), liposaccharide hoặc
exopolysaccharide v.v. Những vị trí mà vi sinh vật lựa chọn để bám và xâm nhập thường là

vùng đầu rễ, nơi có lớp thành tế bào mỏng của đỉnh sinh trưởng, hoặc vùng lông rễ, hoặc
vùng gốc rễ nơi có những vết nứt nhỏ để rễ phụ trồi ra. Tại những vị trí đó vi sinh vật sinh
trưởng thành các khuẩn lạc siêu nhỏ gồm vài trăm tế bào. Để có thể xâm nhập dễ dàng thì
các vi sinh vật nội sinh phải có hệ enzyme phân hủy cellulose để phá lớp ngoài của thành
tế bào. Các enzyme phân hủy thành tế bào của vi khuẩn cũng được cho là kích thích các cơ
chế bảo vệ trong cây vì rất nhiều protein tham gia vào quá trình bảo vệ và phục hồi đều
nằm ở thành tế bào, được sinh tổng hợp nhằm ngăn chặn sự lan truyền của mầm bệnh trong
cây. Để trở thành thể nội sinh thì các vi sinh vật này phải có khả năng tránh được đáp ứng
miễn dịch của cây, hoặc làm giảm nó một cách đáng kể, một trong những cách đó là xâm
nhập vào cây từ các vết nứt nơi rễ phụ trồi ra, đây là trường hợp được giả thiết cho
Azoacus và Burkholderia vietnamiensis[33].

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

8


Luận văn tốt nghiệp

Đào Ánh Vân

Sau khi tế bào vi sinh vật đã vượt qua được lớp biểu bì ngoài, chúng có thể nằm ngay
tại chỗ, hoặc di chuyển sâu hơn và xâm chiếm khoảng giữa các tế bào (apoplast) trong vỏ
cây. Vi sinh vật nội sinh khác vi khuẩn nốt sần ở cây họ đậu ở chỗ chúng không xâm nhập
vào bên trong tế bào thực vật và tạo ra các tổ chức hình thái đặc biệt như trường hợp của vi
khuẩn nốt sần. Tuy vậy, cũng có trường hợp vi sinh vật nội sinh cũng tạo ra các nốt sần.
Chỉ có một số vi sinh vật có thể đi qua lớp bảo vệ bên trong và xâm nhập hệ mạch
dẫn (xylem) của thực vật. Tại đây vi sinh vật có thể sử dụng các chất dinh dưỡng được vận
chuyển trong hệ mạch như nước, ion và một số chất hữu cơ có phân tử lượng thấp như
đường, axit amin và axit hữu cơ. Mặc dù nồng độ các chất dinh dưỡng trong hệ mạch là rất

thấp nhưng cũng đủ để duy trì sự sinh trưởng của thể nội sinh. Vi sinh vật nội sinh có khả
năng sử dụng các nguồn cac bon mà thông thường vi sinh vật vùng rễ không sử dụng được,
ví dụ D-sorbitol, D-galacturonic acid và L-arabinose là nguồn các bon có sẵn trong hệ
mạch dẫn của cây. Như vậy để trở thành thể nội sinh thì điều kiện tiên quyết là vi sinh vật
đó phải có khả năng sử dụng một số hợp chất trao đổi chất của thực vật [33].
Thông thường thì nồng độ của chất dinh dưỡng trong hệ mao quản thực vật giảm dần
theo độ cao của cây. Điều này giải thích cho thực tế là tính đa dạng và mật độ quần thể vi
sinh vật nội sinh giảm dần theo khoảng cách từ rễ trở lên, và chỉ một phần nhỏ vi sinh vật
đạt tới những phần trên của cây, lá và cơ quan sinh sản (hoa, quả và hạt). Một số vi sinh
vật có thể xâm nhập vào cây qua các vị trí khác như khí khổng trên lá và trở thành nội sinh.
Chúng cũng có thể xâm nhập vào cây từ hoa quả và hạt, nhưng trường hợp này thì thường
là vi sinh vật gây bệnh [33].
1.1.5.Các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh
Xạ khuẩn nội sinh cư trú trong mô thực vật bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường
như: pH của đất, thành phần chất vô cơ và chất hữu cơ trong đất, lượng mưa, cường độ ánh
sáng mặt trời, không khí, nhiệt độ… Thêm vào đó, mật độ xạ khuẩn nội cộng sinh nhìn
chung thấp và phụ thuộc vào loại mô khác nhau trên thực vật[39].
Theo các kết quả nghiên cứu đã công bố, quá trình phân lập xạ khuẩn nội sinh cần xử
lý bề mặt thực vật nhằm loại bỏ vi khuẩn, vi nấm trên bề mặt. Vì vậy, phải khử trùng bề
mặt mẫu và cắt mẫu thành từng mảnh bằng dụng cụ đã khử trùng trước khi phân lập.
Sodium hypochlorite (NaOCl) là một trong những tác nhân oxy hóa phổ biến được sử dụng
để khử trùng bề mặt, mẫu thực vật có thể được ngâm trong ethanol nồng độ 70 ÷ 90 %
trong thời gian 1 ÷ 5 phút, sau đó được ngâm trong dung dịch NaOCl nồng độ 1 ÷ 5 %
trong khoảng thời gian 3 ÷ 20 phút, tiếp theo rửa nhiều lần bằng nước vô trùng nhằm loại

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

9

Luận văn tốt nghiệp

Đào Ánh Vân

bỏ lượng NaOCl còn dư. Ngoài ra, hydroperoxide và clorua thủy ngân cũng được sử dụng
như chất khử trùng bề mặt hiệu quả [43]. Năm 1992, Sardi và cộng sự công bố sử dụng hơi
của propylene oxit để khử trùng bề mặt thay vì hóa chất khử trùng dạng lỏng[41]. Hiệu quả
khử trùng bề mặt được tăng cường bằng việc sử dụng các chất hoạt hóa bề mặt như Tween
20 và Tween 80, làm tăng hiệu quả tác động của cơ chất khử trùng với bề mặt thực vật
[43].
Phần mẫu đã khử trùng được đặt vào trên môi trường thạch thích hợp, nuôi cấy ở
nhiệt độ thích hợp từ 25 ÷ 30oC. Trong quá trình phân lập, các nhà nghiên cứu thường gặp
phải VSV phát triển mạnh trong hai tuần đầu tiên vi khuẩn hoặc nấm tạp nhiễm trên phần
mẫu thực vật. Để ngăn chặn sự sinh trưởng của vi khuẩn và nấm không mong muốn cũng
như tìm kiếm loại xạ khuẩn mới, một số môi trường chọn lọc đã được sử dụng như: môi
trường humic acid - vitamin, môi trường thạch casein tinh bột, cao nấm men… bổ sung
thêm các hợp chất kháng sinh như nystatin hoặc cycloheximide - ampicilin, acid nalodixic
và trimethoprim… Để ức chế vi khuẩn, nấm nội cộng sinh và nâng cao khả năng phát triển
chọn lọc của xạ khuẩn vì xạ khuẩn phát triển chậm hơn so với vi khuẩn và nấm ... [43].
1.1.6. Phân loại xạ khuẩn nội sinh
Các phương pháp phân loại xạ khuẩn thường dùng hiện nay là phương pháp phân
loại truyền thống (dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy), phương pháp phân
loại bằng kỹ thuật phân tử (lai AND, ARN và phân tích rADN 16S) và phân loại số (dựa
trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa các vi sinh vật theo một độ lớn các
đặc điểm, chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. Để so sánh các chủng với
nhau từng đôi một.
a. Phương pháp phân loại truyền thống
Krainski (1914) lần đầu tiên đề ra các chỉ tiêu về đặc điểm sinh lý và coi đó là mấu
chốt trong nguyên tắc phân loại để sơ loại 17 chủng thuộc chi Actinomyces. Waksman và
Curtis (1916) đã đề cập đến những dạng trung gian trong mô tả phân loại của mình và coi

đặc điểm hình thái của bào tử là đặc tính quan trọng của các cá thể. Do vậy họ đã đưa ra
một số loài mới ý nghĩa. Tiếp đó Millard và Burr (1926) tìm ra 17 loài, Jensen (1930-1931)
– hai loài, Dunche (1934) -13 loài. Baldacci và cộng sự đã bắt đầu nghiên cứu xạ khuẩn từ
năm 1936 và cho đến năm 1953 công bố một khóa phân loại chi Streptomyces dựa trên cơ
sở màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và một số đặc điểm trung gian khác nhau.
Năm 1943, Waksman và Henrici đã đưa ra một số hệ thống phân loại và cho đến năm
1961 có sửa đổi. Trong hệ thống này, xạ khuẩn được xếp thành nhóm gồm 3 họ, chia thành

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

10


Luận văn tốt nghiệp

Đào Ánh Vân

10 chi và mô tả chi tiết hơn 250 loài thuộc chi Streptomyces. Krassilnikov là một trong
những chuyên gia nổi tiếng về nghiên cứu và phát triển khóa phân loại xạ khuẩn. Từ năm
1941 đến năm 1949 ông đã phát hiện thêm 38 loài mới. Năm 1970, ông lại công bố hệ
thống phân loại mới dựa trên hệ thống đã công bố năm 1949 [56].Trong đó xạ khuẩn được
chia thành 6 họ, gồm 26 chi. Theo ông Actinomyces được dùng như một tên gọi chung cho
những loài thuộc chi Streptomyces mà Waksman và Henrici đã phác họa năm 1943.Một số
nhà nghiên cứu người Đức cho rằng chi Streptomyces là một nhóm lớn. Lần đầu tiên họ sử
dụng kính hiển vi điện tử để nghiên cứu đặc điểm bào tử của chi này. Kutzner đã phát triển
một số khóa phân loại Streptomyces dựa trên cơ sở hình dáng cuống sinh bào tử, cấu trúc
hiển vi điện tử của bào tử, sự tạo sắc tố tan, hoạt phổ kháng khuẩn và một số đặc điểm sinh
lí khác.Năm 1957, Gause và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới. Hệ thống này dựa
vào màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS), khuẩn ty cơ chất (KTCC), hình dạng bào tử và
cuống sinh bào tử. Hệ thống này cũng được chỉnh lý và tái bản năm 1983. Số lượng hệ

thống phân loại xạ khuẩn ngày một tăng trong những năm gần đây. Đó là hình thức phân
loại truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy. Hình thức này hiện nay
vẫn đang được sử dụng phổ biến.
b. Phương pháp phân loại sinh học phân tử
Ngày nay nhờ sự phát triển cao của khoa học kĩ thuật, phương pháp phân loại phân
tử đã được sử dụng vào phân loại xạ khuẩn. Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay
người ta vẫn dùng ba phương pháp chính: lai AND, ARN và phân tích rADN 16S. Kết quả
được biểu hiện bằng số phần trăm sự thống nhất (homology). Hiện nay, đại đa số các nhà
khoa học đồng ý với quan niệm hai chủng được coi là hai loài riêng biệt nêu chúng giống
nhau dưới 70% khi tiến hành lai AND. Phân tích rADN 16S để liệt kê thứ tự nucleotit đặc
trưng của các cá thể và so sánh với bảng liệt kê của các cá thể khác để xác định mức độ
giống nhau của chúng. Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa
hai trình tự rADN 16S là 98,6% thì xác suất để mức độ giống nhau trong phép lai AND
thấp hơn 70% sẽ là 99%. Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự rADN 16S được coi
là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau. Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá
trị này là 98% [30] .
c. Phân loại số
Phân loại số đã được Williams và cộng sự (1983) sử dụng để phân loại chi
Streptomyces và các chi có quan hệ gần gũi [57]. Phương pháp này dựa trên sự đánh giá về
số lượng mức độ giống nhau giữa các vi sinh vật theo một số các đặc điểm, chủ yếu là các

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

11


Luận văn tốt nghiệp

Đào Ánh Vân

đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. Để so sánh các chủng với nhau từng đôi một, Sneath
Ns .100

(1974) đề nghị tính hệ số giống nhau S (similarity) theo phương trình sau: %S = Ns + Nd
Trong đó:
Ns – tổng số các đặc điểm dương tính của 2 chủng so sánh.
Nd – tổng số các đặc điểm dương tính của chủng này và âm tính của chủng kia.
Kết quả phân tích số được biểu diễn bằng sơ đồ nhánh mà trên đó các chủng tùy theo
mức độ giống nhau được nhóm thành từng cụm (Cluster). Bằng phân loại số, người ta chia
xạ khuẩn chi Streptomyces thành 21 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13 cụm với những đại diện
duy nhất. Trên cơ sở nhận được, người ta đưa ra thuật toán học để xác định những chuẩn
xạ khuẩn chưa biết. Mặc dù nguyên tắc là giảm số lượng các đặc điểm, nhưng cũng còn tới
139 đặc điểm đã được sử dụng trong phân loại số.
Cả ba phương pháp phân loại trên hiện vẫn còn đang được sử dụng độc lập kết hợp
với nhau để định tên loài một cách chính xác trong phân loại xạ khuẩn hiện nay. Mỗi
phương pháp có một ưu điểm nhất định, tuy nhiên vì lý do thực dụng, người ta chủ yếu vẫn
dựa vào phương pháp phân loại truyền thống.
1.2. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh và tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh
1.2.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh
1.2.1.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên thế giới
Trong vài thập kỷ qua đã có nhiều thành tựu trong tìm kiếm các loài xạ khuẩn và các
hợp chất mới có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn trong mô tế bào thực vật. Đáng chú ý, hầu
hết mỗi loại thực vật đều là nơi cư trú của rất nhiều vi sinh vật nội sinh tạo nên sự đa dạng
sinh học. Tuy nhiên, mới chỉ có một phần nhỏ thực vậtđã được nghiên cứu và tìm kiếm các
thể nội sinh, nên cơ hội để tìm ra các loài mới và sản phẩm có hoạt tính sinh học có nguồn
gốc tự nhiên còn rất lớn. Do tiềm năng ứng dụng lớn của xạ khuẩn nội sinh nên đối tượng
vi sinh vật này đang được quan tâm và nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới [26, 48, 49,
50, 51, 52].
Sơ lược về tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên thực vật trong hơn 10 năm
gần đây được thể hiện trong bảng 1.1.

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

12


Luận văn tốt nghiệp

Đào Ánh Vân

Bảng 1.1. Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn nội cộng sinh
trên thực vật
Xạ khuẩn nội sinh

Cây chủ

Tác động

Tác giả

Streptomyces

Đậu tương

Thu nhận các vi lượng (Fe,
Mo) và chất kháng khuẩn.

[53]

Streptomyces spp,

Nocardia spp,
Mycobacterium sp,
Microbispora..

Lúa mì

- Chất kháng khuẩn
- Tăng trưởng thực vật

[18, 20]

Streptomyces,
Microbispora,
Micromonospora,
Nocardiodes …

Aquilaria
crassna
Quýt

Sinh tổng hợp IAA

[35, 43]

Streptomyces,
Saccharopolyspora,
Micromonospora,
Actinopolyspora..

Lô hội, bạc

hà, hương
nhu tía

- Hòa tan phosphat
- Sinh indole-3 axit axetic
(IAA), hydroxamate
- Tạo ra catechol.

[24]

Streptomyses spp
EN27 và
Micromonospora sp
EN43

Arabidopsi
s thaliana

- Tăng sức đề kháng
- Đối kháng vsv gây bệnh
- Giảm stress cho cây chủ

[19]

Streptomyces,
Nocardioides spp,
Pseudonocardia…

Cây thuốc

Kháng nấm

[34]

Streptomyces sp

Cây Ngô

Streptomyces sp

Cây chuối

Kháng nấm Fusarium

[17]

Xạ khuẩn

Sâm

Kích thích sinh tổng hợp
ginsenosides

[25]

[21]

Xạ khuẩn
Thuốc lá
Kháng nấm

[27]
Hiện nay, xạ khuẩn nội sinh được phân lập từ nhiều loài cây trồng như lúa mì, gạo,
khoai tây, cà rốt, cà chua, cây gỗ, nho, rêu và dương xỉ … [26, 38, 39] và chi được phân
lập nhiều nhất thuộc chi Streptomyces, chúng thường cư trú trong rễ, thân và lá của cây,
mà nhiều nhất trong rễ. Loài Streptomyces, loài Microbispora là hai loài thường xuyên
nhất phân lập được từ mô thực vật. Inderiati và Muliani (2008) báo cáo rằng phần lớn các
xạ khuẩn nội sinh thu nhận từ cây thuốc lá đã được phân loại là loài Streptomyces [27].
Tương tự như vậy, Sardi và cộng sự (1992) báo cáo rằng 482 trong 499 chủng phân lập từ
một loạt các thực vật là Streptomyces sp [41]. Hơn nữa, Verma và cộng sự (2009) nghiên
cứu cho thấy Streptomyces sp. chiếm khoảng 50 % trong 55 chủng riêng biệt lấy từ cây tử
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

13


Luận văn tốt nghiệp

Đào Ánh Vân

đinh hương Ấn Độ [55]. Tan và cộng sự (2006) đã phân lập được 619 chủng xạ khuẩn từ
các loại cây cà chua khác nhau và tất cả các chủng đó đều thuộc chi Streptomyces [52]. Từ
36 cây dược liệu ở Thái Lan, nhóm nghiên cứu của Taechowisan đã phân lập được 330
chủng xạ khuẩn thuộc 4 chi khác nhau (Streptomyces, Microbispora, Nocardia,
Micromonospora) [48]. Hơn nữa Verma và cộng sự (2009) cho thấy Streptomyces sp. có
chiếm khoảng 50 % trong tổng số 55 chủng thu nhận từ cây sầu đâu (Azadirachta indica
A.Juss) tại Ấn Độ [55]. Tổng hợp các nghiên cứu trên cho thấy Streptomyces sp. có khả
năng thích ứng, phát triển mạnh hơn so với xạ khuẩn thuộc chi khác. Điều thú vị là, phần
lớn các loài Streptomyces nội sinh thường xuyên phân lập được từ nhiều nước khác nhau là
các loài S. aureus, S. galilaeus, S. caviscabies, S. setonii, S. cyaneus và S.
thermocarboxydus điều này cho thấy các loài này có thể có một khả năng tương thích cao

với một loạt các thực vật so với các loài khác. Bên cạnh chi Streptomyces, nhiều chủng xạ
khuẩn nội sinh thuộc chi Microbispora cũng đã được phân lập. Trong nghiên cứu của De
Arau'jo et al. (2000), trong tổng số 53 xạ khuẩn nội sinh phân lập từ ngô thì có tới 33 là
Microbispora spp. và chỉ 6 là Streptomyces spp[21]. Theo Lee và cộng sự (2008), chi
Microbispora spp. (67 %) là phổ biến nhất trên bắp cải Trung Quốc, tiếp theo là
Streptomyces spp. (12 %) và Micromonospora spp. (11 %) [31]. Takahashi và Omura
(2003) phân lập được 33 chủng Microbispora, 32 Streptomyces và 10 xạ khuẩn hiếm khác
từ lá rụng trong chín chi thực vật bậc cao [51]. Như vậy, các chi Streptomyces và
Microbispora có thể sinh sống được trong cả đất và nội sinh thực vật, mặc dù chỉ có một
số lượng hạn chế của các loài có thể có sinh sống theo hai cách này. Lưu ý rằng
Microbispora spp. được phân lập thường xuyên hơn từ lá cây hơn từ đất. El-Tarabily và
cộng sự (2006) ước tính mật độ xạ khuẩn nuôi cấy được trong dưa chuột (Cucummis
sativus) và rễ của cây họ đậu (Glycine max) đạt 105 CFU/g khối lượng củ/rễ tươi [22]. So
với thân và lá, tập hợp các chủng xạ khuẩn phân loại từ rễ nhìn chung đa dạng hơn. Cho
đến nay, hơn 40 loài xạ khuẩn mới đã được tìm thấy bằng nhiều phương pháp phân lập và
phân loại khác nhau, bao gồm 4 chi mới thuộc nhóm Plantactinospora, Actinophytocola,
Phytohabitans và Jishengella [38, 39].
1.2.1.2. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật nội sinh trong nước
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh mới chỉ dừng lại ở một số nấm và
vi khuẩn nội sinh. Tuy nhiên, những nghiên cứu này mới chỉ là các phát hiện bước đầu và
ở quy mô thí nghiệm. Nghiên cứu của Nguyễn Sỹ Giao (1971) về ứng dụng một số chủng
nấm cộng sinh trong nuôi trồng cây non phục vụ cho nghề trồng rừng, quy mô nghiên cứu

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

14


Luận văn tốt nghiệp

Đào Ánh Vân

dừng lại ở bầu cây ươm [10]. Các nghiên cứu của Lê Thị Xuân, Lê Mai Hương (1997) [6]
về thăm dò khả năng tạo chất taxol từ cây thông đỏ ở Việt Nam, các tác giả này đã tách
được từ lớp lõi của cây thông đỏ chủng nấm Mucor circinolloides var. tieghem và tách
chiết được một chất gần giống với 10-deacetil baceatin III ở cây chủ. Lê Mai Hương và
cộng sự (2005) [5] cũng đã phân lập được chủng nấm nội sinh Aspergillus awamori
Nakazawa trên cây sảng Sterculia lanceolata Cav và trên cây thuốc tại một số vùng trong
nước, đồng thời nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của chủng nấm nội sinh
nói trên. Bên cạnh nấm về vi khuẩn, Cao Ngọc Điệp và Phan Thị Nhã (2011) [2] đã nghiên
cứu vi khuẩn nội sinh trên cây Khóm trên đất phèn Đồng Bằng sông Cửu Long, đã phân
lập được 45 dòng vi khuẩn nội sinh có ba đặc tính tốt như cố định đạm, hòa tan lân, tổng
hợp IAA. Trong đó, hai dòng vi khuẩn có ba đặc tính tốt nhất có độ tương đồng cao với
dòng vi khuẩn Burkholderia tropica đã được thử nghiệm vào sản suất phân bón sinh học
cho cây chủ. Trong một nghiên cứu khác, Lương Thị Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp (2011)
[7] đã phân lập được 37 dòng vi khuẩn nội sinh trên cây cúc xuyên chi, qua phân loại cho
thấy các dòng vi khuẩn chủ yếu là Bacillus sp và Acinetobacter antiviralis. Theo Nguyễn
Văn Minh và cộng sự (2014) [14] đã sàng lọc được 21 chủng vi khuẩn nội sinh và 14
chủng vi nấm nội sinh trên cây cao su từ Thành phố Hồ Chí Minh, tỉnh Bình Phước và tỉnh
Bình Dương. Trong đó chủng Bacillus thuringiensis T9 và T6 có khả năng kiểm soát sinh
học nấm Corynespora cassiicola gây bệnh rụng lá cao su. Hiện nay, hướng nghiên cứu về
các chủng xạ khuẩn nội sinh trong nước chưa nhiều đặc biệt là xạ khuẩn nội sinh trên cây
có múi.
1.2.2. Tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh
a. Sinh chất kháng sinh
Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật có khả năng hình thành nhiều loại CKS sử dụng trong
y học. Có đến 80 % chủng xạ khuẩn phân lập được tiết CKS có giá trị trong y học, trong
đó 1/3 các CKS là do xạ khuẩn hiếm sinh ra [13].
Trong những năm gần đây, nhu cầu tìm kiếm chất có hoạt tính kháng, ức chế ung thư
từ xạ khuẩn nội sinh đang là hướng nghiên cứu mới của các nhà khoa học trên thế giới.

Nhiều công bố khẳng định, xạ khuẩn nội sinh có mối quan hệ phức tạp, chặt chẽ với cây
chủ. Một số giả thuyết nhận định rằng gen liên quan tới tổng hợp các chất có hoạt tính sinh
học được tiếp nhận từ quá trình trao đổi chất giữa VSV và thực vật thông qua hệ thống
chuyển gen ngang (horizontal gene transfer, HGT). Nhờ đó các nhà VSV học đã mở ra
triển vọng sản xuất các hợp chất sinh học có nguồn gốc từ thực vật nhờ quá trình nuôi cấy

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

15


Luận văn tốt nghiệp

Đào Ánh Vân

VSV. Ví dụ như chất kháng ung thư paclitaxel phổ biến trên cây thông đỏ được tách chiết
từ xạ khuẩn Kitasatopora sp. và một số nấm cộng sinh khác.
Một số nghiên cứ gần đây cho thấy, tỷ lệ phát hiện ra các kháng sinh mới trên xạ
khuẩn nội sinh có tỷ lệ khá cao so với xạ khuẩn phân lập từ đất mới trên xạ khuẩn nội sinh
có tỷ lệ khá cao so với xạ khuẩn phân lập từ đất hoặc bề mặt thực vật. Chẳng hạn kháng
sinh mới có tên naphthomycin K (dẫn xuất của kháng sinh ansamycin có gắn thêm nhóm
chức chlorine) được phát hiện lần đầu tiên từ Streptomyces sp. CS nội cộng sinh trong cây
mỹ đăng mộc (Maytenus hookeri) - loại cây thuốc có tác dụng điều trị ung thư. Kết quả
kiểm tra hoạt tính sinh học của naphthomycin K cho thấy, hoạt tính gây độc ức chế dòng tế
bào p388 và A - 549 ở nồng độ ức chế lần lượt là 0,07 và 3,17 µM, nhưng không có hoạt
tính kháng Staphylococcus và vi khuẩn lao.
Ngoài năm chất mới thuộc phân lớp 16 của nhóm macrolides được tách chiết và cho
kết quả ức chế mạnh dòng tế bào MDA - MB - 435 trong điều kiện in vitro, hai chất mới
thuộc nhóm macrolides thu nhận từ Streptomyces sp. 131 gần đây được phân lập trên cây
mỹ đăng mộc (M. hookeri), trong đó hợp chất dimeric dinactin có tác động kháng ung thư

mạnh và hoạt tính kháng nhiều loại vi khuẩn gây bệnh cao.
Trước đây, hai hợp chất 5,7 - dimetoxy - 4 - phenylcoumari và 5,7 -dimetoxy - 4 - p methoxylphenylcoumarin có hoạt tính kháng ung thư mạnh, thường thu nhận từ nhiều loại
cây thực vật khác nhau. Nhưng gần đây, nhiều công trình công bố rằng hai hợp chất này
cũng được tìm thấy trong S. aureofaciens CMUAc130 nội cộng sinh. Hoạt tính kháng ung
thư của hai chất trên không chỉ hình thành nhóm nitric oxide, prostaglandin E2 và tác nhân
hoại tử khối u (TNF - α), mà còn cảm ứng nitric oxide synthase và cyclooxygenase - 2
trong lipopolysaccharide gây đại thực bào tế bào RAW 264,7. Tác dụng ức chế phụ thuộc
vào nồng độ chất và ức chế sự hình thành TNF – α[48, 49].
b. Ứng dụng trong kiểm soát sinh học và kích thích tăng trưởng thực vật
Khi đã ổn định trong cây, vi sinh vật nội sinh có thể tác động tích cực đến sự sinh
trưởng và phát triển của cây một cách trực tiếp (kích thích sinh trưởng) hoặc thông qua
kiểm soát bệnh dịch. Vi sinh vật nội sinh trực tiếp kích thích sinh trưởng nhờ cung cấp
dinh dưỡng cho cây, hay sinh tổng hợp hoặc điều hòa các phytohormone, đặc biệt là IAA.
Nhiều chủng vi sinh vật nội sinh sinh tổng hợp IAA (indole-3- acetic acid đồng thời cũng
có khả năng giảm lượng ethylene trong cây nhờ enzyme (1-aminocyclopropane-1carboxylate)-deaminase. Điều này rất có ý nghĩa, bởi nồng độ ethylene cao khi cây bị
stress làm ức chế quá trình phát triển của bộ rễ. Ngoài ra, vi sinh vật nội sinh còn có khả

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

16


Luận văn tốt nghiệp

Đào Ánh Vân

năng sinh tổng hợp các phytohormone khác như abscisic acid (ABA), cytokinin và
gibberellin (GBs) [33].
Khả năng kiểm soát bệnh dịch của vi sinh vật nội sinh dựa trên một số cơ chế như
đối kháng (antibiosis) giúp cây chủ hạn chế bệnh bằng cách chúng sinh ra các chất kháng

khuẩn [34], các enzyme phân hủy thành tế bào của nấm bệnh [43], cạnh tranh về dinh
dưỡng và nơi cư trú, và kích thích tính chống chịu hệ thống của cây chủ [33].
Sự khu trú của vi sinh vật nội sinh trong cây chủ có thể gây ra một số biến đổi của
thành tế bào như tích tụ callose, pectin, cellulose và các hợp chất có phenol, dẫn tới hình
thành một hàng rào cấu trúc tại vị trí bị tác nhân gây bệnh tấn công. Ngoài ra, cây có vi
sinh vật nội sinh khi bị tác nhân gây bệnh tấn công thường có phản ứng là tăng cường sinh
tổng hợp các protein phòng vệ như peroxidase, chitinase và β-1,3-glucanase, có tác dụng
ngăn chặn sự lan truyền của mầm bệnh. Hơn nữa, nhiều loài vi sinh vật nội sinh thưòng thể
hiện kết hợp nhiều cơ chế kháng bệnh, vì một số hợp chất kháng tác nhân gây bệnh cũng
đồng thời kích thích đáp ứng miễn dịch hệ thống [35]. Ngoài ra, xạ khuẩn nội sinh có vai
trò quan trọng trong sự phát triển của cây chủ, do chúng có thể ảnh hưởng đến sinh trưởng
của cây bằng con đường đồng hóa các chất dinh dưỡng (ví dụ, sự tương hỗ về thu nhận các
vi lượng như Fe hoặc Mo hòa tan trong đất cố định nitơ tự do ) [53].Một số tác giả chứng
minh khả năng bảo vệ thực vật chủ chống lại các tác nhân gây bệnh từ đất như Aspergillus
niger, Aspergillus flavus, Alternaria brassicicola, Botrytis cinerea, Penicillium digitatum,
Fusarium oxysporum, Penicillium pinophilum, Phytophthora dresclea và Colletotrichum
fulcatum[17, 24]. Gangwar và cộng sự (2014) đã phân lập từ các cây lô hội, bạc hà, hương
nhu tía được 12 chủng xạ khuẩn nội sinh có khả năng hòa tan phosphat, 16 chủng sản xuất
indole-3 axit axetic (IAA), 9 chủng được sản xuất hydroxamate và 4 chủng có thể tạo ra
catechol[24]. Chúng thực sự là các ứng cử viên cho nghiên cứu kiểm soát sinh học nông
nghiệp trong tương lai.
1.3. Cây có múi và khả năng thu nhận các thể nội sinh
Cây có múi là tên gọi chung của nhóm cây cam, chanh, quýt, bưởi... cùng họ
Rutaceae. Cây ăn trái có múi được trồng ở hơn 100 quốc gia. Đây là loại quả có tầm quan
trọng hàng đầu thế giới, với sản lượng năm 2009 đạt hơn 120 triệu tấn, trong đó cam chiếm
54% [42].
Với điều kiện đất đai, khí hậu thuận lợi và hiệu quả kinh tế cao, cây có múi ở nước ta
được trồng từ lâu đời, qua quá trình chọn lọc đã hình thành nên những loại quả đặc sản gắn

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

17