Tài liệu Luận văn thạc sĩ sinh học “Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên” ppt

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH
HỌC







“Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc
chi Streptomyces sinh chất
kháng sinh chống nấm gây
bệnh trên cây chè ở Thái
Nguyên”

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
  

BÙI THỊ HÀ





NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES
SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH
TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN





LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC









THÁI NGUYÊN - 2008

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
  



BÙI THỊ HÀ





NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES
SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH
TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN



Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. VI THỊ ĐOAN CHÍNH




THÁI NGUYÊN - 2008
LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo TS. Vi Thị Đoan Chính
đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Phú Hùng và các cán bộ của bộ
môn Sinh học thuộc Khoa KHTN & XH - ĐHTN đã nhiệt tình giúp đỡ tôi.
Xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Ngô Đình Quang Bính và các cán bộ
phòng Di truyền vi sinh học - Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện khoa học
và công nghệ Việt Nam.
Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học Y - Dƣợc Thái Nguyên,
Khoa Sinh - KTNN, Khoa Sau Đại học - Trƣờng Đại học Sƣ phạm - ĐHTN
đã tạo nhiều điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này.
Xin cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa KHCB, Bộ môn Hóa - sinh đã tạo mọi
điều kiện cho tôi đƣợc học tập và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô, bạn bè đồng nghiệp đã động viên, tạo mọi
điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn.
Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin dành cho gia đình và những ngƣời thân
yêu của tôi.

LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công
bố trong bất kỳ công trình nào khác.


Thái nguyên, ngày 15 tháng 9 năm 2008

Tác giả


Bùi Thị Hà

MỤC LỤC

Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Những chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
MỞ ĐẦU 1

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN 3
1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 4
1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn 5
1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn 6
1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI 8
1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy 8
1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) 9
1.2.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 10
1.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy) 10
1.2.5. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces 11
1.3. CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN 12
1.3.1. Lƣợc sử nghiên cứu chất kháng sinh 12
1.3.2. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn 15
1.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 16
1.4. MỘT SỐ BỆNH HẠI CHÈ DO NẤM GÂY RA VÀ ỨNG DỤNG CỦA
CKS TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT 18
1.4.1. Một số bệnh hại chè do nấm 18
1.4.2. Các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật 21
Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và hóa chất 24
2.1.1. Nguyên liệu 24
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 24
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 27
2.2.1. Phƣơng pháp phân lập nấm gây bệnh từ các mẫu chè 27
2.2.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn 28
2.2.2.1. Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski 28
2.2.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh 28
2.2.2.3.Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh 29

2.2.3. Bảo quản giống 29
2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn 30
2.2.4.1. Đặc điểm hình thái 30
2.2.4.2. Đặc điểm nuôi cấy 31
2.2.4.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 31
2.2.5. Lên men tạo kháng sinh 32
2.2.5.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp 32
2.2.5.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon 33
2.2.5.3. Ảnh hƣởng của nguồn Nitơ 33
2.2.6. Các phƣơng pháp sinh học phân tử trong phân lập gen 16S - rRNA 33
2.2.6.1. Tách chiết DNA của xạ khuẩn bằng đệm CTAB 33
2.2.62. Khuếch đại gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR 34
2.2.6.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose 35
2.2.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu 36
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và thuần khiết các chủng nấm gây bệnh trên chè 37
3.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn 38
3.2.1. Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn 38
3.2.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có HTKN cao 41
3.3. Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của 2 chủng XK Đ1 và R2 42
3.3.1. Đặc điểm hình thái 42
3.3.2.Đặc điểm nuôi cấy 43
3.3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 45
* Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon 45
* Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp 46
* Khả năng chịu muối 46
* Khả năng sinh enzym ngoại bào 47
3.3.4. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 48
3.3.5. Vị trí phân loại của hai chủng xạ khuẩn R2 và Đ1 50
3.4. Khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn 52

3.4.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp 52
3.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon 54
3.4.3. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ 56
3.5. Phân loại các chủng xạ khuẩn theo phƣơng pháp sinh học phân tử 57
3.5.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng xạ khuẩn 57
3.5.2. Kết quả nhân gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR 58
Chƣơng 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận 60
4. 2. Kiến nghị về những nghiên cứu tiếp theo 61
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO 63




NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN


XK : Xạ khuẩn
VSV : Vi sinh vật
CKS : Chất kháng sinh
HSCC : Hệ sợi cơ chất
HSKS : Hệ sợi khí sinh
KTKS : Khuẩn ty khí sinh
HTKS : Hoạt tính kháng sinh
HTKN : Hoạt tính kháng nấm
MT : Môi trƣờng
KHVQH : Kính hiển vi quang học
KHVĐT : Kính hiển vi điện tử
DNA : Deoxyribonucleic Acid

RNA : Ribonucleic Acid
ISP : International Streptomyces Project
TE : Tris - Ethylendiamin tetracetic acid
SDS : Sodiumdodecyl sulfat
TAE : Tris - Acetate - Ethylendiamin tetracetic acid
PCR : Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase)












DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1. Đặc điểm một số mẫu chè làm nguồn phân lập các chủng nấm 37
Bảng 3.2. Xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu 39
Bảng 3. 3.Tính đối kháng của xạ khuẩn với 3 chủng nấm gây bệnh trên chè 40
Bảng 3. 4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn 41
Bảng 3.5. Đặc điểm nuôi cấy của chủng R2 và Đ1 44
Bảng 3.6. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2 45
Bảng 3.7. Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp của 2 chủng R2 và Đ1 46
Bảng 3.8. Khả năng chịu muối của 2 chủng R2 và Đ1 47

Bảng 3.9. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 với 3 chủng nấm
kiểm định 48
Bảng 3.10. So sánh đặc điểm phân loại của chủng R2 với S. misawaensis 50
Bảng 3.11. So sánh đặc điểm phân loại của chủng Đ1 với A. brunneofungu.52
Bảng 3.12: Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn trên các môi trƣờng
lên men khác nhau 53
Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp CKS
của 2 chủng R2 và Đ1 55
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp CKS của 2
chủng R2 và Đ1 56











DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 3.1. Ba chủng nấm phân lập từ các mẫu chè bị bệnh 38
Hình 3. 2. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu 39
Hình 3.3. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm 40
Hình 3.4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn 42
Hình 3.5. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng R2 42

Hình 3.6. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng Đ1 43
Hình 3.7. Khả năng hình thành sắc tố melanin của 2 chủng 44
Hình 3.8. Hoạt tính enzym của các chủng xạ khuẩn 47
Hình 3.9. Hoạt tính kháng 3 chủng nấm kiểm định của 2 chủng Đ1 và R2 49
Hình 3.10: Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến khả năng tổng hợp CKS 54
Hình 3.11: Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp CKS 55
Hình 3.12 : Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp CKS 57
Hình 3.13. Ảnh điện di DNA tổng số của 2 chủng xạ khuẩn 58
Hình 3.14. Ảnh điện di sản phẩm PCR của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu 59

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
-1-
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Việt Nam là nước nông nghiệp nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm.
Mưa là điều kiện rất thuận lợi cho VSV phát triển, đặc biệt là các VSV gây
bệnh thực vật. Vì vậy việc sử dụng hoá chất trong bảo vệ thực vật từ lâu đã phổ
biến ở Việt Nam. Song việc sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật thường là độc hại
và khi tồn dư trong đất, nước và nông sản sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức
khoẻ con người, gây ô nhiễm môi trường và mất cân bằng sinh thái.
Chính vì vậy, Hội nghị tư vấn khu vực châu Á Thái bình dương của FAO
năm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của chương trình IPM
(Quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lược là sử dụng tác nhân sinh học để hạn
chế sự phát triển của các quần thể ký sinh. Một trong những hướng nghiên cứu
theo xu hướng này là sử dụng các tác nhân sinh học để hạn chế các quần thể
VSV gây bệnh. Trong số các tác nhân sinh học thường được sử dụng để ức chế
VSV gây bệnh, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì tỷ lệ loài có khả
năng sinh CKS cao, trong đó có nhiều CKS có khả năng chống nấm mạnh.
Thái nguyên là tỉnh giàu tiềm năng về nông, lâm nghiệp. Trong đó cây
chè là cây loại cây chủ đạo và hàng năm các bệnh do nấm cũng đã gây ra

những thiệt hại nặng nề, làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm. Vì vậy
việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống
nấm gây bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo
vệ thực vật và xây dựng nền nông nghiệp an toàn và bền vững.
Xuất phát từ những lý do trên, từ xu hướng nghiên cứu trên thế giới
hiện nay cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong
phú của Thái Nguyên. Chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn
thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây
chè ở Thái Nguyên”.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
-2-
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có
hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây chè.
- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một
số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh, có nhiều triển vọng ứng
dụng.
3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài
* Đối tượng nghiên cứu
- Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất
Thái Nguyên.
- Các chủng vi nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên.
* Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập các chủng nấm gây bệnh trên cây chè để sử dụng làm VSV
kiểm định.
2. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm
từ các mẫu đất khác nhau.
3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một
số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh đã được lựa chọn.

4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng
tạo thành CKS của các chủng đã lựa chọn.








Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
-3-
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN
1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân
bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng,
bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển
được. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức
độ canh tác và thảm thực vật.
Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000
mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số VSV [43].
Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường,
chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5.
Xạ khuẩn có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất
rất kiềm, số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm.
Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng
hình thành chất kháng sinh, 60 - 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả

năng sinh chất kháng sinh.
Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì
có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [6]. Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc
từ các loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes,
Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn
hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như
gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi.
Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá
nhiều hợp chất trong đất, nước. Dùng để sản xuất nhiều enzym như proteaza,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
-4-
amylaza, xenluloza…một số axit amin và axit hữu cơ. Một số xạ khuẩn có thể
gây bệnh cho người, động vật [7].
1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
* Khuẩn lạc
Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh
mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ
sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng
0,2 1 m đến 2 3 m, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [10],[22].
Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc
vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Kích thước của hệ sợi xạ khuẩn là một
trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm
mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn, thay đổi từ 5 50 m, dễ
quan sát bằng mắt thường.
Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng
nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ,
da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh.
Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ
vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm…

Đường kính mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 2 mm nhưng cũng có khuẩn
lạc đạt tới đường kính 1cm hoặc lớn hơn.
Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương
đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong.
Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản
phẩm trong quá trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzym, vitamin, axit
hữu cơ…có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được
tiết ra trong môi trường.


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
-5-
* Khuẩn ty
Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một
loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất substrate
mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng. Một loại phát triển trên bề
mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh aerial mycelium) với chức
năng chủ yếu là sinh sản.
Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại (như chi
Sporichthya) lại chỉ có hệ sợi khí sinh. Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh
sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng.
Độ dài của khuẩn ty xạ khuẩn trong giai đọan phát triển là 11 m/giờ
[43] và chất nhân của tế bào xạ khuẩn sắp xếp đều đặn theo chiều dài của sợi.
Do đó một đoạn sợi (mầm xạ khuẩn) hoặc một bào tử xạ khuẩn gặp điều kiện
thuận lợi sẽ trương lên, sau đó 1 - 2 giờ xuất hiện quá trình tổng hợp ARN,
nhân các gene cần thiết từ genom và tiến hành tổng hợp protein, cứ như vậy
sợi được hình thành và phát triển. Một số xạ khuẩn có sinh ra nang bào tử bên
trong chứa các bào tử nang [7].
1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn
Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty

khí sinh - gọi là cuống sinh bào tử. Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ
khuẩn. Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất
trong phân loại xạ khuẩn.
Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóng (RF),
dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có
hình móc câu (RA). Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của
cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ,
ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành
dạng lông [9].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
-6-
Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng muco polysaccharide giàu
protein với độ dày khoảng 300 400 A
0
chia 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào
tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ,
pH…Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những
tính trạng tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại
xạ khuẩn. Tuy nhiên những tính trạng này cũng có thể có những thay đổi nhất
định khi nuôi cấy trên môi trường có nguồn nitơ khác nhau [13].
Muốn kích thích sự hình thành bào tử trước hết phải kích thích sự sinh
trưởng của khuẩn ty khí sinh. Nếu môi trường giàu dinh dưỡng quá thì quá
trình sinh bào tử thường bị kìm hãm. Trong nhiều trường hợp khi kích thích
sự hình thành bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp CKS giảm đi.
1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn
bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng
sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.
Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác

dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp:
Lớp ngoài cùng dày khoảng 60 120A
0
, khi già có thể đạt tới 150
200A
0
, lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50A
0
, lớp trong dày khoảng 50A
0
. Các
lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N - axetyl
glucozamin liên kết với N - axetyl muramic bởi các liên kết 1,4 - glucozit.
Khi xử lý bằng lyzozym, các liên kết 1,4 - glucozit bị cắt đứt, thành tế bào
bị phá huỷ tạo thành thể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ
khi xử lý tế bào với hỗn hợp este chlorofom và các dung môi hoà tan lipit
khác. Nguyên nhân là do lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipit (thành
HSKS có nhiều lipit hơn so với HSCC) khác với nấm. Thành tế bào xạ khuẩn
không chứa xenllulose và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
-7-
trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào [25],[30],
[32], [35] [36].
Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành
4 nhóm chính [6], [8].
Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6
diaminopimelic (L - ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này.
Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -
diaminopimelic (m - ADP) và glyxin.

Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -
diaminopimelic.
Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -
diaminopimelic, arabinose và galactose.
Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu
tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc
biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử
của xạ khuẩn.
Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so
với tế bào vi khuẩn. Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom
và các thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm
sudan III và các hạt polysaccharide bắt màu với dung dịch lugol).
Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote
ở chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong DNA, thường lớn hơn 55%, trong
khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 45% [11].
Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên ngoài yếu tố di truyền
trong nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có
thể tự nhân lên mà được Lederberg gọi là plasmid. Các plasmid đem lại cho tế
bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
-8-
chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển
gene, sản xuất các chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn [3].
Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng
là đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ là
protein, pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối
amôn…Khả năng đồng hoá các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau
là khác nhau.
1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI

Cùng với sự phát triển mạnh của sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh
học nên việc định tên một chủng xạ khuẩn được tiến hành tương đối nhanh
chóng và chính xác với nhiều phương pháp mới như phân loại số, nghiên cứu
chủng loại phát sinh Song người ta vẫn chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình
thái, nuôi cấy đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử.
1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy
Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin
quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Để làm cho các chủng xạ khuẩn cần định
loại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, người ta thường xuyên nuôi cấy chúng
trên môi trường dinh dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian
nhất định. Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình
thái và nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình dạng và
bề mặt bào tử.
Theo Pridham và cộng sự [38], cuống sinh bào tử chia thành 3 nhóm:
RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng. RA cho những cuống
sinh bào tử xoắn, thô sơ và ngắn. S cho những cuống sinh bào tử phát triển
mạnh và xoắn.
Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là
những dữ liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên như ta đã biết

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
-9-
xạ khuẩn rất không bền vững về mặt di truyền, thường xuyên xảy ra sự sắp
xếp lại trong phân tử DNA. Trong cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau
về hình thái hay những loài khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái. Vì
vậy để phân loại được chính xác, ngày nay người ta phải dùng thêm các chỉ
tiêu khác bổ sung như các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học hay sinh
học phân tử [45].
1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy)
Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng

20 năm trở lại đây. Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc
định tính và định lượng thành phần hóa học của tế bào VSV.
Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:
- Typ thành tế bào dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần
peptit và đường trong thành tế bào hay các polysaccarit gắn vào thành tế bào.
- Typ peptidoglycan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu
trúc của mạch tetrapeptit của PG cầu nối peptit và các liên kết giữa các mắt
xích của PG.
- Axit mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi
Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium và cornebacter. Đây là đặc điểm phân
loại cơ bản cho các chi đó.
- Axit béo thường được sử dụng trong phân loại là axit béo bão hòa
mạch thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteiso metyl
hóa ở nguyên tử cacbon thứ 10. Sự có mặt của axit 10 - metylloctade canoit
(axit tubereulostearinoic) là đặc điểm để phân loại đến chi [11].
- Photpholipit có 5 typ photpholipit (P
I
, P
II
, P
III
, P
IV
, P
V
) có thành phần
đặc trưng có ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
-10-

Trong phân loại xạ khuẩn thì typ thành tế bào là đặc điểm quan trọng
nhất. Khi muốn đưa ra một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó,
người ta không thể nào không xác định thành tế bào.
1.2.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa
Để phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt các đặc
điểm sinh lý, sinh hóa khác như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ,
nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau
nhờ hệ thống enzym. Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng
chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm
sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất
kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất
đặc trưng khác của xạ khuẩn.
Hopwood (1975) khẳng định rằng phần lớn các đặc điểm sinh lý - sinh
hóa cùng đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động và có giá trị thấp về mặt phân
loại. Do tính không ổn định và biến dị cao của xạ khuẩn mà ngày nay những
nguyên tắc sử dụng các đặc điểm sinh lý - sinh hóa để phân loại xạ khuẩn
cũng phải thay đổi [29].
1.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy)
Để phát hiện những loài mới trên cơ sở sự khác nhau về đặc điểm sinh
lý, sinh hóa người ta còn sử dụng các kết quả dựa trên phân loại số.
Phương pháp này dựa trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau
giữa các VSV theo một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình
thái, sinh lý, sinh hóa.
Để so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau từng đôi một, người ta căn cứ
vào hệ số giống nhau (hệ số S - Similarity) có 2 công thức tính hệ số S hay
được sử dụng.
- Công thức của Sokal và Michener (S
SM
)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
-11-

100
NNN
NN
S
d
SS
SS
SM
(AB)


Trong đó:
(AB)
SM
S
: Mức độ giống nhau giữa hai cá thể A, B (%)
N
S+
: Số các tính trạng giống nhau
N
d
: Số các tính trạng khác nhau
N
S-
:
Số các tính trạng đối lập nhau.
- Công thức của Jacard (S

J
)

100
NN
N
S
dS
S
J
(AB)

Trong đó:
(AB)
J
S
: mức độ giống nhau giữa hai chủng A, B (%)
N
S
: Tổng số các đặc điểm dương tính (giống nhau) của hai chủng
so sánh.
N
d
: Tổng số các đặc điểm khác nhau (tổng số các đặc điểm
dương tính của chủng này và âm tính của chủng kia).
Kết quả cuối cùng của phân loại số là vẽ được sơ đồ phân nhánh (kiểu
"rễ cây") của các thông số. Ở sơ đồ này những chủng giống nhau nhiều nhất
được xếp vào một nhóm. Bằng phân loại số người ta chia xạ khuẩn chi
Streptomyces thành 2 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13 cụm với những đại diện
nhất định [44].

1.2.5. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces
Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Wakman và
Henrici đặt tên năm 1943 [43]. Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn
nhất. Các đại diện chi này có HSKS và HSCC phát triển phân nhánh. Đường
kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 - 10 µm, khuẩn lạc thường không lớn có đường
kính khoảng 1 - 5 mm. Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất. Bề

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
-12-
mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi KTKS dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi
khi có tính kỵ nước.
Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử. Trên đầu sợi
khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào tử có
những hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng
Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp
phân đoạn và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình
cầu với đường kính khoảng 1,5 µm. Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp
nhăn tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy.
Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucoza, các bào tử
biểu hiện các đặc điểm rất rõ. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng
rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi
khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau. Vì vậy mà ủy ban Quốc tế về phân
loại xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trường chuẩn và phương pháp chung để
phân loại nhóm VSV này.
Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn
Gram dương, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là
25 - 30
0
C, pH tối ưu 6,5 - 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn
hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh).

Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các CKS ức
chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật.
Cho đến nay để xác định thành phần loài của chi Streptomyces, các nhà
phân loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác
nhau [48],[49].
1.3. CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN
1.3.1. Lƣợc sử nghiên cứu chất kháng sinh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
-13-
Theo định nghĩa của Outchinnikov [48]. Chất kháng sinh là chất có
nguồn gốc thiên nhiên và các sản phẩm cải biến của chúng bằng con đường
hóa học có khả năng tác dụng chọn lọc đối với sự phát triển của VSV, tế bào
ung thư ở ngay nồng độ thấp.
Người đầu tiên đặt nền móng cho khoa học nghiên cứu CKS là
Alexander Fleming - Nhà sinh vật học người Anh, đã phát hiện ra penixillin
vào tháng 10 năm 1928.
Sau một thập kỷ, nhờ sự nỗ lực hợp tác của các nhà vi sinh học và sinh
hóa học Anh, Mỹ, penixillin đã được nghiên cứu, sản suất với số lượng lớn và
trở thành "một loại thuốc thần kỳ". Năm 1945, A.Fleming, E. Chain và
H.W.Florey đã được nhận giải thưởng Nobel vì đã khám phá ra giá trị to lớn
của penixillin mở ra một kỷ nguyên mới trong y học - kỷ nguyên kháng sinh.
Những năm 1940 - 1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên
cứu CKS với hàng loạt CKS mới liên tiếp được phát hiện như: gramixidin,
tiroxidin do Rene
'
Jules Dubos phát hiện năm 1939, streptomycin do
Waksman phát hiện năm 1941, erythomycin do Gurre phát hiện năm 1952
Cùng với việc phát hiện ra các CKS mới, công nghệ lên men sản xuất CKS
cũng ra đời và dần được hoàn thiện [31].

Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc
phòng chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng.
CKS thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực
khác nhau trên thế giới.
Tốc độ tìm kiếm các CKS trong thời gian gần đây vẫn diễn ra nhanh
chóng, nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông
nghiệp tại nhiều nước trên thế giới vẫn liên tục phát hiện được hàng loạt các
CKS mới có giá trị ứng dụng trong thực tiễn.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
-14-
Năm 1999 một kháng sinh mới khác được phát hiện có tác dụng ngăn
chặn hiện tượng cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của
chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh.
Đó là kháng sinh loposomal HA - 92, được tách ra từ xạ khuẩn Streptomyces
CDRLL - 312.
Năm 2003, nhiều nước trên thế giới vẫn tiếp tục phát hiện được hàng
loạt các CKS mới. Tại Nhật Bản, chất kháng sinh mới là yatakemycin đã
được tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp. TP - A0356 bằng phương pháp
sắc kí cột. CKS này có khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus
fumigalus và Candida albicans. Ngoài ra chất này còn có khả năng chống lại
các tế bào ung thư với giá trị Mic là 0,01- 0,3 mg/ml [15].
Năm 2007, tại Hàn Quốc đã phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces
sp. C684 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã
kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin [47].
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ
trợ của nhiều ngành khoa học khác đã giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng
CKS đạt được những thành tựu rực rỡ. Để sản xuất CKS con người không chỉ
tìm kiếm những chủng VSV sinh CKS từ tự nhiên mà còn cải tạo chúng bằng
nhiều phương pháp như dùng kỹ thuật di truyền và công nghệ gene, gây đột

biến định hướng, chọn dòng gene sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần
để tạo ra các chủng có HTKS cao, đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm các loại
kháng sinh mới và quý trong thời gian ngắn [7],[41].
Những thành tựu gần đây trong sinh học phân tử như tái tổ hợp ADN,
kỹ thuật tách dòng gene và biểu hiện tổng hợp ở vi khuẩn E.coli không những
đem lại kết quả to lớn trong phát triển chủng giống mà còn mở ra phương
hướng đầy triển vọng trong sản xuất các CKS.