Nghiên cứu hệ enzyme phân giải cellulose của các vi khuẩn chịu nhiệt từ bã nấm

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-------  -------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

“Nghiên cứu hệ enzyme phân giải cellulose của các vi khuẩn chịu nhiệt từ
bã nấm”

Sinh viên thực hiện

:

Ngành
:
Giảng viên hướng dẫn :

Mông Mạnh Linh
Công nghệ sinh học
TS. Đặng Xuân Nghiêm

“Khóa luận đệ trình khoa CNSH, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam là
một phần yêu cầu của trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học”, năm học
2014 – 2015.

HÀ NỘI 2014


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong luận văn này là trung thực và chưa được sử dụng công bố trong các luận

văn, luận án và các công trình nghiên cứu khoa học trước đây.
Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn được sử dụng trong luận văn
đều được ghi rõ nguồn gốc, đảm bảo trích dẫn theo đúng quy định.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan này!

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2014

Sinh viên

2

2


LỜI CÁM ƠN
Sau một thời gian thực tập tại bộ môn Công nghệ Vi sinh, được sự quan tâm,
giúp đỡ và dìu dắt tận tình của các thầy cô giáo, các cán bộ tại Phòng thí nghiệm
của Bộ môn, cùng sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, tôi đã hoàn thành khóa luận
tốt nghiệp của mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong và ngoài khoa Công nghệ
Sinh học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức vô cùng quan trọng và quý báu
trong suốt thời gian học tập, rèn luyện tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Tôi xin
bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Đặng Xuân Nghiêm đã tận tình
hướng dẫn và dạy dỗ tôi trong suốt thời gian học tập cũng như nghiên cứu. Tôi xin
bày tỏ lòng biết ơn tới TS. Nguyễn Văn Giang, ThS. Trần Thị Đào, các anh chị
cùng toàn thể bạn bè đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt

thời gian thực tập.
Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các Phòng, Ban của khoa
Công nghệ sinh học và toàn thể bạn bè đã giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực tập tốt nghiệp.
Và cuối cùng, với tất cả tấm lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, tôi xin gửi lời
cảm ơn tới Bố, Mẹ, Ông, Bà và những người thân của tôi đã nuôi nấng, động viên
và tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu.
Sinh viên

3

3


MỤC LỤC

4

4


DANH MỤC CÁC BẢNG

5

5


DANH MỤC CÁC HÌNH

6

6


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
BNĐV:

bã nấm Đồng Văn

BNVG:

bã nấm Văn Giang

CMC:

carboxymethyl cellulose

CBD:

Cellulose – binding Domains

cs:

cộng sự

HEC:

hydroxyethyl cellulose

SDS:

sodium dodecyl sulfate

VSV:

vi sinh vật

7

7


TÓM TẮT
Với mục đích tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi
khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong bã thải cơ chất trồng nấm, từ đó có
những ứng dụng trong sản xuất và đời sống, chúng tôi đã tiến hành phân lập và
đánh giá một số đăc điểm hóa sinh và sinh học của các chủng vi khuẩn. Từ 2 nguồn
cơ chất trồng nấm khác nhau Văn Giang, Hưng Yên và Đồng Văn, Hà Nam, 15
chủng vi khuẩn đã được phân lập. Các chủng vi khuẩn được định danh sơ bộ dựa
trên các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, các đặc tính sinh hóa của
chúng.
Sử dụng phương pháp cấy chấm điểm có bổ sung cơ chất và khuếch tán đĩa
thạch, 11 chủng vi khuẩn xác định có hoạt tính cellulase. Các chủng này được đánh
giá ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt độ và khả năng hoạt động của cellulase.
Nhận thấy, cellulase của các chủng vi khuẩn hoạt động mạnh trong dải nhiệt độ từ
30˚C đến 60˚C. 2 chủng còn giữ được hoạt tính ở 75˚C là BNĐV.6 và BNVG.8.
Khả năng hoạt động của các chủng vi khuẩn trong dải pH từ 4,5 – 10. Môi trường
tối ưu cho hoạt động của cellulase của các chủng vi khuẩn là ở pH trung tính
(pH=7,0).

Các chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulase được khảo sát khả năng phân giải
cơ chất là giấy và rơm. Khả năng phân giải giấy và rơm mạnh nhất được thể hiện ở
2 chủng BNĐV.6 và BNVG.8 có tỷ lệ phân giải giấy và rơm lần lượt là 60%, 35%
(đối với chủng BNĐV.6) và 52%, 33% (đối với chủng BNVG.8).
Protein tổng số của 11 chủng vi khuẩn được xác định trong khoảng 10 – 150
kDa bằng điện di SDS – PAGE. Đồng thời chúng tôi xác định khối lượng phân tử
của 11 mẫu bằng phương pháp điện di zymogram. Bằng phương pháp sinh học

8

8


phân tử đã xác định sơ bộ hai chủng BNĐV.6 và BNVG.8 gần với loài Bacillus
circulan và Bacillus subtilis subsp. Spizizennii.

9

9


MỞ ĐẦU
Cellulose là một polymer sinh học tự nhiên phong phú trên trái đất và nó
cũng chiếm lượng lớn trong chất thải nông nghiệp (Tomme, 1995). Nó là sản phẩm
của sự quang hợp trong các môi trường trên trái đất, và là nguồn tài nguyên sinh
học phong phú được sinh ra trong sinh quyển. Sinh khối cellulose là nguồn nguyên
liệu tái tạo trong chuyển hóa sinh học của vi sinh vật làm tăng giá trị của chất thải
nông nghiệp (Javis, 2003). Sự thủy phân cellulose triệt để bằng enzyme cần có sự
hoạt động phối hợp đồng thời của 3 loại enzyme cellobiohydrolase (exoglucanase),
endoglucanase hay carboxymethycellulase (CMCase) và ß-glucosidases (Pratima

Gupta, 2012).
Cellulase là một trong những enzyme có vai trò quan trọng trong quá trình
chuyển hóa vật chất hữu cơ trong thiên nhiên. Cellulase có thể thu nhận từ nhiều
nguồn khác nhau như động vật, thực vật và vi sinh vật. Nhưng hiệu quả kinh tế
nhất vẫn là nguồn cellulose thu được từ quá trình lên men của vi sinh vật (Maiti,
2013). Mặc dù cellulase được nghiên cứu và ứng dụng chậm hơn so với amylase và
protease, nhưng cellulase lại có ý nghĩa rất lớn đối với con người. Cellulase được
sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, bao gồm: thực phẩm, sản xuất
thức ăn chăn nuôi, sản xuất dung môi hữu cơ, sản xuất giấy và bột giấy, sản xuất
phân bón vi sinh và xử lý rác thải bảo vệ môi trường.
Vi khuẩn chịu nhiệt là nhóm vi sinh vật có khả năng sống trong điều kiện
nhiệt độ khắc nghiệt. Chúng là một trong những nhóm vi sinh vật được nghiên cứu
và ứng dụng rộng rãi trong đời sống và sản xuất. Đã có nhiều nghiên cứu về các
chủng vi khuẩn được phân lập từ đống ủ compost, đống ủ mùn cưa, suối nước
nóng hay các khu vực gần núi lửa v.v.và đã phát hiện được nhiều ứng dụng rộng rãi
của các enzyme bền nhiệt có nguồn gốc từ chúng. Tuy nhiên, còn rất ít những
10

10


nghiên cứu đầy đủ nào về hệ enzyme phân hủy cellulose của vi khuẩn phân lập từ
bã nấm và khả năng ứng dụng của nó.
Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu hệ enzyme phân giải cellulose của các vi khuẩn chịu nhiệt từ bã nấm”.

11

11

A) Mục đích nghiên cứu
-

Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu nhiệt có trong bã nấm. Phân loại
và mô tả đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn tuyển chọn được.

-

Khảo sát hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng
đến hoạt tính cellulase của chúng đồng thới định danh các chủng có tiềm năng
ứng dụng lớn trong đề tài.

B) Yêu cầu nghiên cứu
-

Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu nhiệt có trong bã nấm.

-

Phân loại và mô tả đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
được.

-

Khảo sát hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng
đến hoạt tính cellulase của chúng.

-

Định danh các chủng có tiềm năng ứng dụng lớn trong đề tài.

12

12


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Cellulose
Cellulose là một hợp chất hữu cơ, một polysaccharide được hình thành từ
các liên kết mắt xích β-D-Glucose, với công thức (C 6H10O5)n trong đó n có thể nằm
trong khoảng 5000 - 14000, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật
(Bayer EA, 1998). Cellulose là sản phẩm của sự quang hợp trong các môi trường
trên Trái Đất, là nguồn nguyên liệu sinh học phong phú được sinh ra trong sinh
quyển (100 tỷ tấn khối lượng khô/năm) mà có thể tái tạo lại được (Trần Non Nước,
2012). Tỷ lệ cellulose có trong bông sợi là 90%, trong gỗ là 40-50%, trong rơm lúa
gạo là 33%, trong rơm lúa mạch là 44% và trong bã mía là 80-85% (Piotrowski,
2011).
Cellulose được sử dụng nhiều chủ yếu để sản xuất các tông và giấy. Số
lương nhỏ hơn được chuyển đổi thành một loạt các sản phẩm phát sinh như giấy
bóng kính và rayon (tơ nhân tạo). Chuyển đổi cellulose thành nhiên liệu sinh học
như ethanol đang được nghiên cứu như là nguồn nguyên liệu thay thế. Cellulose
được dùng trong công nghiệp chủ yếu được lấy từ bột gỗ và bông.
1.1.1. Cấu trúc cellulose
Cellulose có công thức hóa học là (C6H10O5)n bao gồm nhiều đơn vị β-Dglucose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside. Mức độ polyme hóa trong
khoảng 5000 - 14000 đơn vị (Klemm, Heublein, Fink, & Bohn, 2005). Các đơn vị
lặp đi lặp lại nhỏ nhất trong cellulose là cellobiose, trong đó bao gồm hai đơn vị
glucose. Trong chuỗi cellulose tinh thể dính vào nhau bởi liên kết hydro và lực van
der Waals để tạo thành cấu trúc bậc cao không hòa tan.

13

13


Cellulose là một chuỗi polymer mạch thẳng: không giống như tinh bột
không có sự cuộn xoắn hoặc phân nhánh xảy ra. Chuỗi mạch thẳng tạo nên cấu
trúc dạng sợi cho cellulose, đơn vị nhỏ nhất gọi là sợi sơ cấp có đường kính
khoảng 3 nm chỉ bao gồm các phân tử β – D - glucose. Giữa các sợi sơ cấp hình
thành nên các liên kết hydro với nhau hình thành nên vi sợi (microfibril). Các vi
sợi này lại tập hợp thành những bó lớn hơn (fibril) và có thể nhìn được dưới kính
hiển vi quang học. Chính nhờ cấu trúc này mà cellulose có độ bền cao và khó bị
phân hủy (Nishiyama, và cộng sự, 2002).

Hình 1.1: Cấu trúc Cellulose. ( nguồn: )
Cellulose bao gồm tinh thể và vùng vô định hình. Các tinh thể cellulose
được tạo thành do cấu trúc vi sợi kết tinh trong đó các chuỗi cellulose gắn kết với
nhau nhờ liên kết hydro và có tính tổ chức trật tự rất cao nên bền vững với tác động
của điều kiện bên ngoài. Đối với vùng vô định hình của cellulose, được hình thành
với cấu trúc không chặt chẽ và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài. Nhờ hai
vùng này mà cellulose vừa có tính bền vừa có tính linh động, trong đó cellulase dễ
dàng tác động vào vùng vô định hình, còn đối với vùng tinh thể cellulase chỉ tác
động lên bề mặt (Peng, 2011).

14

14


Hình 2: Cấu trúc của cellulose a; cấu trúc cellulose. b; nanofibril có

chứa cellulose dạng tinh thể và dạng vô định hình. c; tinh thể nano cellulose
sau khi thủy phân bằng acid (Dodson, 2012).
1.1.2. Tính chất của cellulose
Cellulose không có hương vị, không mùi, không hòa tan trong dung môi hữu
cơ và nước, nhưng cellulose có thể trương lên do hấp thu nước. Phân tử cellulose
rất bền vững, với thời gian bán rã là 5-8 triệu năm cho sự phân cắt liên kết β – 1,4
– glucoside tại 25˚C. Cellulose bắt đầu bị phân hủy từ 180˚C. Quá trình sinh học
thường diễn ra nhanh hơn và cung cấp nguồn carbon cho khí quyển (Falkowski P,
2000).
Trong cấu trúc của cellulose, vị trí C1 – OH tại mỗi đầu phân tử glucose là
một nhóm aldehyde mang tính khử và vị trí C4 – OH là đầu không có tính khử. Do
đó mà cellulose tan trong các thuốc thử như cupriethylenediamine (CED),
cadmiumethylenediamine (Cadoxen), N -methylmorpholine N -oxide , và lithium
chloride /dimethylacetamid (Stenius, 2000). Cellulose gồm tinh thể và vùng vô
định hình. Bằng cách xử lý cellulose với kiềm hoặc axit mạnh ở nồng độ cao, vùng
vô định hình có thể được chia nhỏ tạo ra các nanocrystalline cellulose, một loại vật
15

15


liệu với nhiều tính chất mới (Peng, 2011). Gần đây, nanocrystalline cellulose đã
được sử dụng làm chất độn trong giai đoạn sinh học polymer hóa để sản xuất
nanocomposites với tính chất chịu nhiệt và độ bền cơ học cao (Pranger &
Tannenbaum, 2008)
Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemiccellulose, pectin,
lignin tạo nên phức hệ lignocellulose. Cấu trúc đó ảnh hưởng lớn đến hoạt động
thủy phân cellulose của cellulase (Dodson, 2012).
1.1.3. Nguồn gốc cellulose
Cellulose là chất hữu cơ được tổng hợp tự nhiên nhiều trên thế giới hiện nay,

có khoảng từ 60 đến 90 tỷ tấn hàng năm được các loài thực vật tạo ra. Đây cũng là
loại polymer được sử dụng nhiều nhất (gỗ xây dựng, bột giấy, sợi dệt vải v.v.). Ở
cấp độ sinh quyển, hàng tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần được phân hủy,
nếu không chúng sẽ lại tích tụ và gây nguy hiểm cho hệ sinh thái.
Cellulose là thành phần chính của tế bào thực vật. Cellulose có nhiều trong
sợi bông (95%), sợi lanh (71%), sợi đay (71%). Ngoài ra, cellulose còn có trong
gỗ, thực vật dưới nước (tảo, rong v.v.), sản phẩm phụ của nông nghiệp (rơm, rạ, lõi
ngô.)

16

16


Bảng 1: Thành phần cellulose có trong một số loài thực vật (ArsèneI và
cs, 2013)
1.2. Cellulase
Cellulase là hệ enzyme khá phức tạp xúc tác cho quá trình chuyển hóa
cellulose thành các sản phẩm hòa tan thông qua xúc tác thủy phân liên kết β – 1,4 –
glucoside (Bayer EA, 1998).
1.2.1. Phân loại cellulase và cơ chế hoạt động
Nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học về cellulase như (WA., 1959)
(Coughlan, 1989), Enari và cs (2002) cho thấy hệ cellulase chủ yếu gồm ba loại
enzyme (Exoglucanase, Endoglucanases, β – Glucosidases):
17

17


a.

Exoglucanase (EC 3.2.1.91)

Exoglucanase (EC 3.2.1.91) hay có tên gọi khác là 1,4-β-D-glucanase,
C1,

Cellobiohydrolases,

CBH1,

cellulobiosidase,

cellobiohydrolase, exo – β glucancellobiohydrolase,

avicelase,

exo

–

β - 1,4 – glucan

cellubiosidase.
Enzyme này thủy phân liên kết β - 1,4 – glucoside từ đầu không khử của
chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose hoặc glucose; không thủy phân cellulose
dạng kết tinh và dạng hòa tan mà chỉ làm thay đổi tính chất lý hóa của chúng.
b.

Endoglucanases (EC 3.2.1.4)

Endoglucanases (EC 3.2.1.4) còn có tên gọi khác là: endo – β – 1,4 –
glucanase; CMCase, endocellulase, celludextrinase, cellulosin AP, alkali cellulase .
Enzyme này thủy phân liên kết β-1,4-glucoside một cách ngẫu nhiên bên
trong chuỗi cellulose để giải phóng cellodextrin, cellobiose và glucose; nó có tác
động mạnh mẽ đến cellulose vô định hình nhưng tác động yếu đến cellulose kết
tinh.
c.

β – Glucosidases (EC 3.2.1.21)

β – Glucosidases hay cellobiase β – D – glucosidase, β – 1,6 – glucosidase, p
– nitrophenyl – β – glucosidase, salicinase. Enzyme này thủy phân cellobiose,
cellodextrin và các cello – oligosaccharide mạch ngắn tạo thành glucose.
1.2.2. Cấu trúc và tính chất của cellulase
a. Cấu trúc
Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các tiểu đơn vị là acid amin
được nối với nhau liên kết peptide – CO – NH - . Cellulase có 2 vùng chức năng:
18

18


trung tâm xúc tác và trung tâm tạo liên kết với cellulose. Hai vùng này nối với
nhau thông qua các vùng không xúc tác (Ainsworth, 1995).
Trung tâm xúc tác là vị trí diễn ra hoạt động phản ứng xúc tác tạo phản
ứng. Thông thường cellulase chứa duy nhất 1 trung tâm xúc tác, ngoại trừ một số
trường hợp đặc biệt.
Trung tâm tạo liên kết với cellulose tạo liên kết bền vững với cellulose.
Đơn vị chức năng này giữ vai trò chủ đạo trong quá trình định hướng cơ chất là
cellulose đến trung tâm xúc tác của cellulase. Bên cạnh đó, một số cellulase cũng

tham gia vào quá trình xúc tác bằng cách cắt những chuỗi cellulose liên kết dạng
tinh thể. Một số khác lại có xu hướng liên kết với cellulose vô định hình thay vì
cellulose dạng tinh thể (David, 2007).
Trung tâm liên kết tạo với cellulose không phải là đơn vị chức năng đặc
trưng cho enzyme thủy phân cellulose mà nó cấu thành nên tiểu đơn vị xúc tác cấu
trúc cellulosome.
Trung tâm tạo liên kết với cellulose liên kết thuận nghịch với cellulose nên
nó được ứng dụng trong công nghệ sản xuất protein (Teeri, 1997).
Vùng không xúc tác giữ vai trò cầu nối giữa trung tâm tạo liên kết với
cellulose và trung tâm xúc tác (Ainsworth, 1995).
b. Tính chất
Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethyl
cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC). Cellulase cắt liên kết β – 1,4
– glucoside trong cellulose, lichenin và các β – D – glucan của ngũ cốc.
Độ bền và tính đặc hiệu cơ chất của cellulose có thể khác nhau. Cellulose từ
nguồn gốc khác nhau có những đặc điểm khác nhau về pH tối ưu, độ hòa tan và
19

19


thành phần amino acid. Cellulase hoạt động ở pH từ 3,0 – 7,0 nhưng pH tối ưu
trong khoảng từ 4,0 – 5,0. Nhiệt độ tối ưu từ 40˚C - 50˚C.
Cellulase cũng chịu ảnh hưởng mạnh bởi các ion kim loại. Các ion kim loại
có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa hoạt động của cellulase. Các ion kim loại nặng ở
nồng độ nhất định có thể gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme.
Các ion Hg2+ ức chế hoàn toàn hoạt tính cellulase, ion Ca2+ lại làm tăng hoạt tính
cellulase của Bacillus sp D04 lên 40% so với đối chứng (Sharma và cộng sự,
1995). Còn Mg2+ làm giảm nhẹ hoạt tính (hoạt tính còn lại 92%) và Zn 2+ ức chế
mạnh hoạt tính cellulase (hoạt tính chỉ còn 37% so với đối chứng) (Han và cộng

sự, 1995).
Ngoài việc chịu ảnh hưởng của các ion kim loại, cellulase cũng chịu ảnh
hưởng bởi các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rửa. Nghiên cứu của Trịnh Đình Khá
(2007) trên chủng Penicillium sp DTQ-HK1cho thấy, các dung môi hữu cơ như
methanol, ethanol, isopropanol và acetone đều ức chế hoạt động của cellulase. Các
chất tẩy rửa như Tween 20, Tween 80, SDS và Triton X-100 đều làm giảm hoạt
tính cellulase ở mức độ khác nhau, trong đó SDS làm giảm hoạt tính cellulase
xuống chỉ còn 18 – 34%.
1.3. Cơ chế thủy phân cellulose
Quá trình thủy phân cellulose cần có sự tham gia của cả ba loại enzyme
cellulose: endoglucanase, exoglucanase và β – glucoside. Thiếu một trong ba loại
enzyme trên thì không thể thủy phân phân tử cellulose đến sản phẩm cuối cùng
(Bhat, 2000).
Đầu tiên, endoglucanase hoạt động trên các sợi cellulose ở vùng không định
hình một cách ngẫu nhiên. Sự phân cắt các liên kết β – 1,4 – glucoside tạo ra các
sợi cellulose tự do.Sau đó, exoglucanase hoạt động trên các đầu tự do của sợi
20

20


cellulose tạo ra cellobiose. Các cellobiose lại được phân hủy bằng β – glucoside
tạo ra sản phẩm cuối cùng là các phân tử glucose (Singhania, 2009).

Hình 1.3: Quá trình thủy phân cellulose (Singhania, 2009).
Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủy
cellulose bằng enzyme, ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độ, pH, nồng độ cơ
chất, lượng enzyme và một yếu tố hết sức quan trọng là tính đồng bộ của hệ
enzyme từ nhiều nguồm enzyme vi sinh vật khác nhau. Mỗi loại vi sinh vật chỉ
tổng hợp ưu việt một loại enzyme. Chính vì thế, việc khai thác enzyme từ nhiều

nguồn vi sinh vật khác nhau là cần thiết.
1.4. Hệ thống cellulase vi khuẩn
Cellulase là hệ enzyme khá phổ biến ở hầu hết các loài vi sinh vật có trong
tự nhiên bao gồm nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn. Nhiều nghiên cứu cho thấy
cellulase được sinh ra bởi nhiều sinh vật, phổ biến là nấm và vi khuẩn (Bahkali,
1996). Cả nấm và vi khuẩn đều được nghiên cứu và khai thác nhằm sản xuất một
loạt các cellulase và hemicellulases. Hầu hết chú trọng vào việc sử dụng các loại
nấm nhằm sản xuất enzyme vì khả có khả năng sản xuất số lượng dồi dào, thường
ít phức tạp hơn vi khuẩn, dễ tách chiết và tinh sạch hơn (Maiti, 2013). Tuy nhiên,
21

21


những nghiên cứu về đặc tính cellulase của vi khuẩn mới gần đây khiến cho việc
khai thác celluase từ vi khuẩn trở nên rộng rãi hơn. Có một số lý do chính mà vi
khuẩn gần đây được khai thác mạnh mẽ nhằm sản xuất được nhiều celluase hơn là
do vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng cao hơn so với nấm. Cellulase của vi khuẩn
thường phức tạp hơn và khu phức hợp đa enzyme làm tăng khả năng phân hủy
cellulose. Vi khuẩn có khả năng sống và tạo celluase trong các điều kiện stress như
nhiệt, lạnh, mặn v.v. Do đó, các chủng vi khuẩn có thể tồn tại và sản xuất các
enzyme cellulolytic trong các điều kiện khắc nghiệt và có thể sử dụng trong quá
trình bioconversion (Maiti, 2013). Điều này làm tăng tỷ lệ enzyme thủy phân, quá
trình lên men và thu hồi sản phẩm. Các nhà khoa học hiện nay đang tập trung
nghiên cứu vào việc sử dụng và cải tiến enzyme để sử dụng trong các ngành công
nghiệp và nhiên liệu sinh học. Nhiều vi khuẩn có thể sản sinh cellulase và phát
triển trên cơ chất có cellulose. Chúng có khả năng phân hủy các dẫn xuất của
cellulose hoặc cả các vùng vô định hình của tinh thể cellulose. Tuy nhiên, chỉ có
rất ít vi khuẩn tổng hợp được hệ thống enzyme hoàn chỉnh để có thể phân hủy các
dẫn xuất của cellulose hay cellulose tinh thể đến sản phẩm cuối cùng. Những vi

khuẩn như vậy được gọi là vi khuẩn “cellulolytic true”. Còn vi khuẩn mà chỉ có
khả năng sản xuất endoglucanase và β – glucosidase, nhưng không phải là hệ thống
hoàn chỉnh thì được gọi là “pseudocellulolytic” (Wood, 1988).
Tuy nhiên, việc nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng vi
khuẩn nhìn chung vẫn còn khiêm tốn so với nghiên cứu trên nấm (Crawford, 1986;
Li and Gao, 1996, Ekperigin, 2006). Dù vậy, đặc điểm phân giải cellulose của vài
nhóm vi khuẩn như Cellulomonas, Cellovibrio, Pseudomonas, Sporosphytophaga
spp. (Nakamura và Kappmura, 1982); Bacillus và Micrococcus (Immanuel, 2006)
đã được báo cáo.

22

22


1.5. Hình thức hoạt động của cellulase trong vi khuẩn
Các nhà nghiên cứu đã tập trung vào 4 cấu trúc được cho là quan trọng trong
việc bám dính cụ thể vào cellulose của enzyme. Bao gồm: 1) phức hợp đa thành
phần hay còn gọi là cellulosomes, 2) fimbriae hay pili dính, 3) Carbohydrate của vi
khuẩn lớp glycocalyx, 4) miền gắn enzyme (Wood, 1988).
1.5.1. Phức hợp cellulosome
Để có thể xâm nhập vào bên trong vật liệu cellulose, vi khuẩn phải tìm ra
một cơ chế hữu hiệu cho sự phân hủy cellulose khi có sự hiện diện, cạnh tranh của
các loài vi khuẩn khác và bị giới hạn bởi ATP cho sự tổng hợp cellulase. Điều này
dẫn đến sự phát triển của “Hệ thống cellulase phức hợp”, được gọi là cellulosome
(Susan và Leschine, 1995).
Cellulosome có kích thước lớn và ổn định, trọng lượng phân tử từ 2 – 16
MDa. Các cellulosome kết hợp với nhau tạo thành các polycellulosome, được gắn
kết trên vách tế bào, có đường kính khoảng 60 – 200 nm và có khối lượng có thể
lên tới 100 MDa. Thành phần quan trọng của cellulosome là protein scaffoldin

không có hoạt tính xúc tác nhưng lại có chức năng tập hợp các tiểu đơn vị
cellulase. Các tiểu đơn vị chứa những vùng dockerin. Mối quan hệ này được thể
hiện thông qua vùng cohesin trên scaffoldin, gắn kết vùng dockerin trên enzyme và
CBD trên scaffoldin liên kết với phức hợp cellulose. Các cellulosome phức tạp
nhất và được nghiên cứu tốt nhất là cellulosome của vi khuẩn ưa nhiệt Clostridium
thermocellum (Shoham và Lamed, 1999)
1.5.2. Fimbriae
Fimbriae hay pili liên quan đến độ bám dính của vi khuẩn trên bề mặt
cellulose. Nó có chiều rộng từ 5 – 7 nm, chiều dài 100 – 200 nm và được tìm thấy
trong vi khuẩn gram âm (Pell AN, 1993). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các tiểu
đơn vị trong cấu trúc của fimbriae chịu trách nhiệm về độ bám dính. Một số tiểu
23

23


đơn vị trong các vi khuẩn gram dương Actinomyces viscocus và Sanguis
Streptococus (Lindberg, 1987).
1.5.3. Độ bám dính qua Carbohydrates epitope của vi khuẩn Glycocalyx
Một số nghiên cứu cho rằng các lớp chất nhờn xung quanh Ruminococus
albus và Ruminococus flavefaciens đã được hình thành từ glycoprotein (dư lượng
Carbohydrate) đã tham gia vào độ bám dính của vi khuẩn (Cheng, 1980). Nếu
carbohydrate glycocalyx được xử lý bởi quá trình oxy hóa với protease và
dextranase thì độ bám dính của Ruminococus albus với cellulose giảm đáng kể.
1.5.4. Sự bám dính qua Cellulose – binding Domains của cellulolytic enzyme
Có hai chức năng chính được tìm thấy trong cấu trúc của cellulase. Các miền
xúc tác hoạt động chịu trách nhiệm về sự phân tách thủy phân của glucosizit và các
miền ràng buộc chịu trách nhiệm về việc gắn kết enzyme của vi khuẩn lên bề mặt
của nó. Các miền ràng buộc cellulose – binding Domains (CBD) được liên kết với
lõi xúc tác bởi mối liên kết giàu axit amin. Vùng liên kết carbohydrate (CBD) liên

kết chặt chẽ cellulosome với cơ chất cellulose. CBD liên kết với cellulose tinh thể
hiệu quả hơn là đối với cellulose vô định hình (Wood, 1988).
1.6. Bã thải sau trồng nấm (SMS – Spent Mushroom Substrate)
Spent Mushroom Substrate - SMS là một sản phẩm phụ của quá trình sản
xuất nấm. Sau quá trình sản xuất nấm, các chất dinh dưỡng trong chất nền không
còn thuận lợi cho sự phát triển của nấm nữa, chất nền đó được thải ra gọi là bã thải
sau trồng nấm (Mingxin Guo, 2001).
Quá trình thu hoạch nấm kết thúc, tuy không thể trồng nấm tiếp do hết chất
dinh dưỡng cần thiết cho nấm có trong đó nhưng bã thải sau trồng nấm (SMS) vẫn
còn chứa một lượng sinh khối nấm còn lại cùng với sự phong phú của các chủng
nấm và vi khuẩn dị dưỡng (Ahlawat, 2007). SMS cũng có khả năng phân hủy các
24

24


chất hữu cơ và vô cơ có trong đất và nước nhờ hệ vi sinh vật ở trong đó. Các
enzyme ngoại bào ligninolytic của vi khuẩn và nấm trong SMS đặc biệt là
Pleurotus ostreatus, Pleurotus florida, Pleurotus flabellatus và P. Sajor-caju đã
được báo cáo là có vai trò trong phân hủy thuốc nhuộm (Ntougias, 2004). Do đó
mà các SMS có khả năng hấp thụ và phân hủy các chất ô nhiễm trong nước thải dệt
may.
Trong SMS, hệ vi sinh vật bao gồm nhiều loài khác nhau như Psedomonas
fluorescens, Rummelibacillus và Bacillus subtilis. Vi khuẩn tồn tại trong SMS chủ
yếu là vi khuẩn Gram dương và quan trọng là vi khuẩn Bacillus, Paenibacillus,
Brevibacterium, Microbacterium và Arthrobacter (Nelson, 1944).
Sự đa dạng vi sinh vật trong SMS còn bị ảnh hưởng rất nhiều bởi nguồn gốc
của vật liệu ủ ban đầu, bổ sung chất dinh dưỡng và quá trình xử lý thanh trùng –
nhiệt. Trong quá trình ủ nhiệt, một số vi sinh vật vẫn có khả năng sinh trưởng
chúng được gọi là các vi sinh vật ưa nhiệt. Vi sinh vật ưa nhiệt này có nhiều tính

năng độc đáo, có thể được sử dụng khai thác trong các ngành khác nhau như công
nghệ sinh học, công nghiệp v.v. Nhiều nghiên cứu quan tâm đến tiềm năng của
nhóm sinh vật này bởi các khả năng như sản xuất các enzyme chịu nhiệt hữu dụng,
các acid hữu cơ, các chất kháng sinh và hợp chất trao đổi thứ cấp có tầm quan
trọng trong nhiều lĩnh vực (Ahlawat, 2007).
1.7. Vi khuẩn ưa nhiệt
Dựa vào nhiệt độ của môi trường và khả năng sinh trưởng của chúng mà vi
sinh vật được chia làm 4 nhóm chính (Deacon, 2011):
- Nhóm ưu lạnh: có thể phát triển ở 0˚C hoặc thấp hơn nữa, giới hạn nhiệt độ trên
của chúng là khoảng 25˚C
- Nhóm ưu ấm: phát triển mạnh trong nhiệt độ vừa phải, từ 20˚C đến 45˚C.
25

25