Đề tài Quy trình định lượng S.Aureus bằng phương pháp đếm đĩa

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA THỦY SẢN
MÔN:MÔN:

MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI: QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG S.AUREUS BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM ĐĨA

GVHD: NGUYỄN THỊ KIM OANH

NHÓM THỰC HIỆN: 7


1. Tổng quan về vi khuẩn staphylococcus aureus:
Đặc điểm:
- Hiếu khí hay kị khí tùy ý
- Cầu khuẩn, Gram (+), chùm nho
- Có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNA, phosphatese
- Khả năng lên men đường manitol, trehalose, sucrose
- Phản ứng đặc trưng: phản ứng đông tụ huyết tương
Phân bố:
- Thịt, cá, rau quả,sữa, trứng,…qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến. Ngoài ra
còn có trên lông, mụn nhọt, vết thương,…


- Có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl.
- Hầu hết các vòng tan máu đều tạo sắc tố vàng sau 1 – 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng.
- Tạo độc tố Enterotoxin bền nhiệt.

staphylococcus aureus


Quy trình định lượng
S.aureus


2.1 Phạm vi áp dụng:
- Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 4830 – 1: 2005

( ISO 6888-1 : 1999)

- *TCVN 4830-1:2005 : tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng Staphylococci có phản ứng dương
tính với coagulase trên đĩa thạch có mặt trong các sản phẩm dùng cho con người hoặc thức ăn chăn nuôi, bằng
0
0
cách đếm số khuẩn lạc thu được trên môi trường đặc ( môi trường Baird-Packer) ở 35 C – 37 C.


2.2 Nguyên tắc:
- Cấy lên bề mặt của môi trường chọn lọc, một lượng mẫu qui định (sản phẩm ở dạng lỏng hoặc
huyền phù).
o
- Ủ các đĩa ở điều kiện hiếu khí ở 37 C và kiểm tra 24h hoặc 48h.
- Tính số lượng Staphylococcus aureus trong một ml hoặc một gram mẫu từ những khuẩn lạc điển
hình và không điển hình trên các đĩa ở độ pha loãng khác nhau và khẳng định bằng kết quả thử
coagulase dương tính.


2.3 Môi trường và hóa chất:

Môi trường

Công dụng

Dung dịch Saline Peptone Water (SPW)

Dung dịch đẳng trương để pha loãng mẫu

Môi trường Baird – Parker

Môi trường chọn lọc để nuôi cấy S.aureus

Môi trường Trypticase Soy Agar (TSA)
Bảo quản và phục hồi vsv trong quá trình nuôi cấy
Brain heart broth (BHI)

Huyết tương thỏ

Dùng để khẳng định S.aureus

HCl 10%
Chỉnh pH môi trường
NaOH 10%


2.5 Qui trình phân tích:


Chương 3: Thuyết minh qui trình

Bước 1: chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu

Lấy 10g ( mẫu rắn) hoặc hút 10ml ( mẫu

90ml dung dịch pha loãng SPW

lỏng)

( hoặc túi nhựa vô trùng )

Cho vào máy dập mẫu (mẫu rắn) hoặc lắc đều (mẫu lỏng)
Đồng nhất mẫu


Bước 2: Pha loãng mẫu

Hút 1ml dd 10

DD 10

-1

-2

9ml SPW

Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10
hợp.

-3
-4
-5
, 10 , 10 ,… cho đến khi đạt được độ pha loãng thích


Bước 3: Phân lập trên môi trường chọn lọc

Hút 0.1ml dd mẫu

BPA


Bước 4: quan sát, đếm số khuẩn lạc

Đánh dấu khuẩn lạc
Sau 24h

điển hình

Sau 24h tiếp theo
Khuẩn lạc S.aureus dương tính,đánh dấu khuẩn lạc
không điển hình


Bước 5+6: Phục hồi và khẳng định
Cấy 5 khuẩn lạc điển hình và 5 khuẩn lạc không điển hình từ BPA sang các
ống nghiệm tương ứng chứa 5ml môi trường BHI

o

Ủ 37 ± 1 C trong 24 ± 3h

Hút 0,1 ml dịch nuôi cấy BHI vào ống nghiệm có kích thước 10mm × 75mm đã chứa
0,3 ml huyết tương thỏ ( hoặc theo hướng dẫn của nhà sản xuất)


Kiểm tra sự động tụ của huyết tương sau 4, 6, 8, 24h

Xác định tỷ lệ khẳng định dựa trên số khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng.


Báo cáo kết quả

-

Âm tính: không có khối đông, hỗn hợp dung dịch vẫn đồng nhất như ống không cấy.
Dương tính: có khối động tụ huyết tương chiếm ¾.

Âm tính

Dương tính


Bước 7: báo cáo kết quả


Ví dụ

Nồng độ pha
loãng

10

10

Số khuẩn lạc thử nghiệm

Số phản ứng coagulase

phản ứng coagulase

(+)

 

5

 

47

5

 

Nt

Na

Ht

Ha

30

5

5/5

 

5

2

 

2/5

 

5

5

5/5

 

8

5

1

 

1/5

-2

-3


Kết quả


Cảm ơn cô và các bạn đã chú ý lắng nghe