Tình hình nhiễm nấm xâm nhập và mức độ kháng thuốc kháng nấm của các chủng nấm phân lập được tại bệnh viện bạch mai từ 2013 đến 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN NHỊ HÀ

TÌNH HÌNH NHIỄM NẤM XÂM NHẬP VÀ MỨC ĐỘ
ĐỀ KHÁNG THUỐC KHÁNG NẤM CỦA CÁC CHỦNG NẤM
PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI TỪ 2013 ĐẾN 2017

Chuyên ngành

: Vi sinh

Mã số

: 62 72 01 15

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
TS PHẠM HỒNG NHUNG

HÀ NỘI – 2017


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này không thể hoàn thành nếu không có sự giúp đỡ quý giá của
những người mà tôi xin phép được gửi lời cảm ơn sâu sắc dưới đây.
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn tới Tiến sĩ Phạm Hồng Nhung, Phó trưởng
Bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Hà Nội, vì sự định hướng và tín nhiệm của Cô
trong quá trình học tập của tôi. Tôi cũng biết ơn Cô vì những lời khuyên quý báu, sự

hướng dẫn tận tình của Cô cho nghiên cứu của tôi cũng như những phê bình chính
xác mà nhờ đó nghiên cứu này mới đi đến kết quả thành công.
Tôi chân thành cảm ơn các giảng viên của Trường Đại học Y Hà Nội, đặc
biệt là Phó giáo sư, Tiến sĩ Nguyễn Vũ Trung – Trưởng Bộ môn Vi sinh Đại học Y
Hà Nội, Trưởng Bộ môn Vi sinh – Kí sinh trùng lâm sàng Đại học Y Hà Nội, Phó
giảm đốc Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung ương, và các giảng viên Bộ môn Vi sinh
Đại học Y Hà Nội, các Thầy Cô đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu về vi
sinh y học mà còn cho tôi những bài học về tác phong sống và làm việc.
Tôi cũng xin được cảm ơn lãnh đạo bệnh viên Bạch Mai, Thạc sĩ Trương
Thái Phương – Trưởng khoa Vi sinh Bệnh viện Bạch Mai, các bác sĩ, kĩ thuật
viên Khoa Vi sinh Bệnh viện Bạch Mai, đặc biệt là Cử nhân Chu Thị Kim Dung
vì sự đón tiếp nhiệt tình, sự giúp đỡ tích cực và những hiểu biết quý giá đã chia
sẻ cho tôi.
Cuối cùng, tôi muốn thể hiện lòng biết ơn sâu sắc của mình với gia đình và
bạn bè, những người luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu của tôi.


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Nguyễn Nhị Hà, học viên Bác sĩ nội trú khóa 40, Trường Đại học Y
Hà Nội, chuyên ngành Vi sinh y học, xin cam đoan:
1. Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của
Tiến sĩ Phạm Hồng Nhung.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được
công bố tại Việt Nam
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung
thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.
Hà Nội, ngày 21 tháng 9 năm 2017
Học viên

Nguyễn Nhị Hà


MỤC LỤC
DANH MỤC VIẾT TẮT.........................................................................................2
DANH MỤC HÌNH ẢNH.......................................................................................3
DANH MỤC SƠ ĐỒ...............................................................................................3
ĐẶT VẤN ĐỀ..........................................................................................................1
CHƯƠNG .1 TỔNG QUAN...................................................................................3
CHƯƠNG .2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP..............................................25
CHƯƠNG .3 KẾT QUẢ........................................................................................33
CHƯƠNG .4 BÀN LUẬN.....................................................................................48
KẾT LUẬN............................................................................................................64
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................65


DANH MỤC VIẾT TẮT
CLSI

Clinical and Laboratory Standards Institute (Viện tiêu chuẩn
xét nghiệm và lâm sàng)

CT80

Cornmeal-Tween 80 (Thạch bột ngô – Tween 80)

SDA

Sabouraud dextrose agar (Thạch sabouraud dextrose)

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Một số hình ảnh về Candida albicans....................................................4
Hình 1.2 Một số hình ảnh về Candida tropicalis..................................................5
Hình 1.3. Một số hình ảnh về Candida parapsilosis.............................................5
Hình 1.4. Một số hình ảnh của Candida glabrata.................................................6
Hình 1.5. Một số hình ảnh của Cryptococcus neoformans...................................7
Hình 1.6. Một số hình ảnh của Aspergillus fumigatus..........................................7
Hình 1.7. Một số hình ảnh của Aspergillus flavus.................................................8
Hình 1.8. Một số hình ảnh của Talaromyces marneffei........................................9
Hình 1.9. Test mực tàu dương tính với Cryptococcus neoformans....................10
Hình 1.10. Hình ảnh dương tính một số test định danh nhanh C. albicans......11

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Quy trình nghiên cứu...........................................................................26


DANH MỤC BẢNG
a.Các chi vi khuẩn, nấm gây nhiễm trùng xâm nhập thường gặp nhất theo
bệnh phẩm.............................................................................................................. 35
b.Phân bố của các chi/loài nấm gây nhiễm trùng xâm nhập phân lập được theo
bệnh phẩm.............................................................................................................. 36
c.Các loài Cryptococcus gây nhiễm trùng xâm nhập phân lập được theo bệnh
phẩm*..................................................................................................................... 40
d.Các loài Aspergillus gây nhiễm trùng xâm nhập phân lập được theo bệnh
phẩm....................................................................................................................... 40
e.Các chi vi khuẩn, nấm gây nhiễm trùng xâm nhập thường gặp nhất tại khoa
Hồi sức tích cực theo bệnh phẩm.........................................................................43
f.Phân bố của các chi/loài nấm gây nhiễm trùng xâm nhập phân lập được theo

bệnh phẩm tại khoa Hồi sức tích cực...................................................................44
g.Phân bố của các loài Candida gây nhiễm trùng xâm nhập phân lập được theo
bệnh phẩm tại khoa Hồi sức tích cực*.................................................................45
h.Tỉ lệ chủng nhạy cảm/chủng hoang dại theo loài Candida tại bệnh viện Bạch
Mai từ 1/2013 đến 6/2017......................................................................................47


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
i.Tỷ lệ nấm trên tổng số chủng vi sinh vật gây nhiễm trùng xâm nhập phân lập
được tại bệnh viện Bạch Mai theo năm từ 1/2013 đến 6/2017............................33
................................................................................................................................ 34
ii.Tỷ lệ nấm gây nhiễm trùng xâm nhập trên tổng số căn nguyên gây bệnh
phân lập được theo bệnh phẩm............................................................................34
iii.Phân bố các loài Candida thường gặp từ bệnh phẩm máu theo thời gian (n =
356)......................................................................................................................... 37
iv.Phân bố các loài Candida thường gặp từ bệnh phẩm nước tiểu theo thời gian
................................................................................................................................ 38
v.Phân bố các loài Candida thường gặp phân lập từ bệnh phẩm dịch vô trùng
từ 1/2013 đến 6/2017 (n = 141)..............................................................................39
vi.Tỷ lệ nấm trên tổng số chủng vi sinh vật gây nhiễm trùng xâm nhập phân
lập được tại một số khoa của bệnh viện Bạch Mai..............................................41
vii.Tỷ lệ nấm gây nhiễm trùng xâm nhập trên tổng số căn nguyên gây bệnh
phân lập được theo bệnh phẩm tại khoa Hồi sức tích cực..................................42
viii.Phân bố các loài Aspergillus gây nhiễm trùng xâm nhập phân lập được
theo bệnh phẩm tại khoa Hồi sức tích cực (n = 106)...........................................46


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhiễm nấm xâm nhập là bệnh nhiễm trùng cơ hội, gây bệnh trên các bệnh
nhân suy giảm miễn dịch (bệnh nhân AIDS, ung thư), người lớn tuổi có tiền sử dùng
thuốc kéo dài, và những bệnh nhân điều trị bằng các liệu pháp nội khoa và ngoại
khoa xâm lấn, bao gồm kháng sinh phổ rộng, hóa chất, và ghép tạng [1]. Hiện nay,
cùng với sự bùng nổ của đại dịch HIV/AIDS và sự ứng dụng rộng rãi các tiến bộ về
thuốc và thủ thuật trong y học, nhiễm nấm xâm nhập đang bùng phát trên toàn thế
giới [2], [3], [4], [5], [6]. Với vai trò là tác nhân quan trọng trong nhiễm trùng bệnh
viện gây bệnh cảnh lâm sàng nặng, triệu chứng đa dạng, khó chẩn đoán, nấm làm
tăng tỷ lệ tử vong, thời gian điều trị, chi phí điều trị của các bệnh nhân nội trú [7],
[8].
Thêm vào đó, việc chỉ định điều trị của bác sĩ và tuân thủ điều trị của bệnh
nhân nhiễm nấm còn hạn chế do các thuốc kháng nấm có độc tính cao và phác đồ
điều trị đòi hỏi điều trị lâu dài. Sự ra đời của các thế hệ thuốc kháng nấm mới, độc
tính thấp hơn, hiệu quả cao hơn so với các thế hệ đầu mới cải thiện tiên lượng của
các bệnh nhân nhiễn nấm xâm nhập nay lại vấp phải sự xuất hiện của các chủng
kháng thuốc và đa kháng thuốc khiến việc điều trị gặp nhiều khó khăn [9], [10],
[11], [12], [13].
Trong bối cảnh đó, việc nghiên cứu nhiễm nấm xâm nhập và mức độ đề
kháng thuốc kháng nấm để đề ra biện pháp dự phòng nhiễm nấm xâm nhập, lựa
chọn thuốc điều trị phù hợp và dự phòng kháng thuốc đang trở nên bức thiết và đã
được thực hiện tại nhiều quốc gia trên thế giới.
Tại Việt Nam, căn nguyên nấm cũng ngày càng được quan tâm, kĩ thuật
nuôi cấy và định danh nấm đã trở thành xét nghiệm thường quy có trong danh mục
xét nghiệm Vi sinh của Bộ Y tế nhưng chưa có nhiều nghiên cứu về nhiễm nấm
xâm nhập được công bố rộng rãi. Nhằm đóng góp thêm về hiểu biết về nhiễm nấm
xâm nhập và mức độ đề kháng thuốc kháng nấm, chúng tôi thực hiện nghiên cứu


2

“Tình hình nhiễm nấm xâm nhập và mức độ kháng thuốc kháng nấm của các
chủng nấm phân lập được tại bệnh viện Bạch Mai từ 2013 đến 2017” với hai
mục tiêu:
1. Mô tả tình hình nhiễm nấm xâm nhập tại bệnh viện Bạch Mai từ
2013 đến 2017.
2. Xác định mức độ đề kháng thuốc kháng nấm của các chủng nấm
men phân lập được tại bệnh viện Bạch Mai từ 2013 đến 2017.


3

CHƯƠNG .1 TỔNG QUAN
.1.1.

Đại cương về nấm

.1.1.1.

Đặc điểm chung của nấm

Nấm, thuộc Giới nấm, là sinh vật đơn bào hoặc đa bào, có nhân thực; thành
tế bào cấu tạo chủ yếu từ chitin và glucan; sống dị dưỡng; sinh sản bằng bào tử [14].
Nấm sinh sản nhanh và dễ dàng phát triển trong mọi mọi môi trường, ngay
cả môi trường hầu như không có chất dinh dưỡng. Chỉ cần một phần tử sinh sản là
bào tử, nấm cũng có thể phát triển thành một quần thể rất nhiều nấm gọi là khuẩn
lạc nấm [14]. Nấm có thể phát triển được ở nhiệt độ từ 1 - 37 0C, nhiệt độ phát triển
tối ưu từ 25 – 350C và phát triển mạnh khi độ ẩm môi trường cao (>70%) [15]. Mặt
khác, do không quang hợp, nấm phát triển không cần ánh sáng mặt trời [14]. Do đó,
nấm ở khắp nơi và trên cơ thể vật chủ, nấm có thể xâm nhập vào tất cả các cơ quan,
tổ chức từ nông đến sâu.

.1.1.2.

Phân loại nấm

Giới nấm được phân loại dựa trên cấu trúc sinh sản và phương thức hình thành
bào tử của nấm. Alexopous và cộng sự (1996) phân giới nấm thành 4 ngành:
Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota, trong đó, Chytridiomycota
bao gồm các loài không gây bệnh cho người [16].
1.
Ngành
Zygomycota
Basidiomycota

Phân loại đơn giản của giới nấm quan trọng trong y học

Bộ
Chi đại diện
Mucorales
Absidia, Rhizopus
Filobasidiales
Cryptococcus
Pneumocystidales Pneumocystis
Saccharomycetales Candida
Ascomycota
Onygenales
Trichophyton
Euascomycetes
Eurotiales
Aspergillus
Trong vi sinh lâm sàng, nấm được phân loại dựa trên hình thái sinh dưỡng:

-

Lớp
Zygomycetes
Basidiomycetes
Arachiascomycetes
Hemiascomycetes

Nấm men: có cấu tạo đơn bào, hình cầu hoặc trái xoan, kích thước 3 – 15µm.
Khuẩn lạc thường nhẵn, giống khuẩn lạc của vi khuẩn. Ví dụ: Candida spp.

-

Nấm sợi: gồm những sợi nấm có cấu tạo đa bào, gồm những sợi có nhánh
dài, rõ rệt, tế bào có nhiều nhân. Nấm sợi được chia thành 2 loại:


4

o Nấm sợi có vách ngăn: tế bào được chia bởi các vách ngang hoàn toàn
hoặc không hoàn toàn, mỗi tế bào chứa 1 hay nhiều nhân.
o Nấm sợi không có vách ngăn bao gồm: Rhizopus và Absidia.
-

Hiện tượng lưỡng hình: hình thể nấm thay đổi tùy theo điều kiện môi trường.
Talaromyces marneffei, Histoplasma capsulatum… khi ký sinh hoặc nuôi
cấy ở 370C có dạng men, khi hoại sinh hoặc ở nhiệt độ phòng có dạng sợi.

.1.1.3.
-

Một số loài nấm gây bệnh thường gặp [17]

Candida albicans:
o Tế bào nấm men tròn hoặc bầu dục (3,5-7x4-8µm). Trên CornmealTween 80 (CT80) (250C, 72 giờ) các cụm bào từ trần nảy chồi quanh
sợi nấm giả (một số sợi thật). Bào tử áo thường đơn lẻ, to, thành dày.
o Mọc nhanh trong 3 ngày. Khuẩn lạc trơn, nhẵn, màu kem. Trên môi
trường dinh dưỡng (thạch máu hay thạch chocolate), khuẩn lạc thường
lan rộng dạng chân sao. Khuẩn lạc xanh trên ChromIDTM Candida.
o Là căn nguyên thường gặp nhất gây Candidiasis – nhiễm trùng cấp,
bán cấp hoặc mạn tính có thể gặp ở bất kỳ bộ phận nào của cơ thể.
Sinh vật này được coi là vi hệ ở da, miệng, âm đạo và đường tiêu hoá.

(a) Khuẩn lạc trên thạch máu (b) Khuẩn lạc trên CAN2

(c) Soi tươi

(c) Nhuộm Gram

Hình 1.1. Một số hình ảnh về Candida albicans.
- Candida tropicalis (trước đây là Candida paratropicalis):
o Tế bào nấm men tròn hoặc bầu dục (3,5-7x5,5-10µm). Trên CT80
(250C, 72 giờ) bào tử trần nảy chồi riêng lẻ hoặc nhóm nhỏ, dọc sợi
nấm giả (có thể sợi thật). Đôi khi có bào tử áo dạng giọt nước.
o Mọc nhanh trong 3 ngày. Khuẩn lạc dạng kem, bờ nhăn nheo. Khuẩn
lạc có màu tím trên ChromIDTM Candida.


5

o Gây nhiễm trùng đặc biệt là ở những đối tượng suy giảm miễn dịch,
có độc lực cao ở những người bị bệnh bạch cầu hoặc ung thư khác.
Cũng có thể tìm thấy C. tropicalis mà không có triệu chứng của bệnh.

(a) Khuẩn lạc trên CAN2

-

(b) Bào tử và sợi nấm trên CT80

(c) Nhuộm Gram

Hình 1.2 Một số hình ảnh về Candida tropicalis
Phức hợp Candida parapsilosis:
o Tế bào nấm men dạng trứng (2,5-4x3-8µm). Trên CT80 (25 0C, 72
giờ) các bào tử trần đứng riêng lẻ hoặc thành cụm nhỏ dọc sợi nấm
giả ngắn, cong hoặc gấp khúc.
o Mọc nhanh trong 3 ngày. Khuẩn lạc dạng kem.
o Gây nhiễm trùng ở những đối tượng đặc biệt nhạy cảm như trẻ sơ
sinh, người bị tổn thương hệ miễn dịch, điều trị kháng sinh,
corticosteroid hoặc các thuốc gây độc tế bào kéo dài, đặt catheter nội
mạch, mắc đái tháo đường hoặc tiêm chích ma tuý.

(a) Bào tử và sợi nấm trên CT80

(b) Nhuộm Gram

Hình 1.3. Một số hình ảnh về Candida parapsilosis
- Candida glabrata (trước đây là Torulopsis glabrata)
o Trên CT80 (250C, 72 giờ) tế bào nấm men nhỏ, bầu dục (2-3x3-4 µm)

có một chồi ở đầu. Đôi khi có chuỗi ngắn các tế bào hình trứng.


6

o Mọc nhanh trong 3-5 ngày, chậm hơn so với các loài Candida khác.
Khuẩn lạc giống nấm men nhỏ, sền sệt, nhẵn, màu trắng hoặc kem.
o Thường gây nhiễm trùng máu hoặc tiết niệu sinh dục, đôi khi ở phổi
và các vị trí khác. Có ở người khoẻ mạnh, chỉ gây bệnh ở những đối
tượng đặc biệt nhạy cảm.

(a) Tế bào nấm men trên CT80

(b) Nhuộm Gram

Hình 1.4. Một số hình ảnh của Candida glabrata
- Cryptococcus neoformans
o Trên CT80 (250C 72 giờ) tế bào hình tròn (đường kính 4-8µm), vách
đậm và có chồi. Thường không thấy sợi.
o Mọc nhanh trong 3 ngày. Khuẩn lạc phẳng hoặc hơi phồng, bóng,
ướt, thường nhầy, bờ nhẵn, ban đầu màu kem, sau chuyển nâu nhạt.
o Gây Cryptococcosis, một nhiễm trùng bán cấp hoặc mạn tính thường
gặp nhất ở hệ thần kinh trung ương, đôi khi cũng gây tổn thương da,
xương, phổi hoặc các cơ quan nội tạng khác.


7

(a) Khuẩn lạc trên thạch máu

(b) Tế bào nấm men trên CT80

(c) Nhuộm Gram

Hình 1.5. Một số hình ảnh của Cryptococcus neoformans
- Aspergillus fumigatus:
o Sợi có vách; cuống bào đài nhẵn, ngắn (300x5–10µm). Cuống bào tử
xếp sát nhau ở 2/3 trên bào đài, đối xứng qua cuống bào đài. Bào tử
tròn, nhẵn hoặc hơi xù xì, đường kính 2–3,5 µm.
o Mọc nhanh trong 3 ngày. Bề mặt khuẩn lạc mịn như nhung hoặc có
bột, màu sắc thay đổi từ xanh lá cây có viền trắng hẹp lúc mới mọc
sang xám nhạt khi già. Bề mặt màu từ trắng tới nâu.
o Phân bố rộng rãi trong tự nhiên, là căn nguyên thường gặp nhất của dị
ứng Aspergillus, Aspergillus xâm nhập (IA) và viêm xoang do nấm.

(a) Khuẩn lạc

(b) Bào tử nhuộm lactophenol cotton blue

Hình 1.6. Một số hình ảnh của Aspergillus fumigatus
- Aspergillus flavus
o Sợi có vách; cuống bào đài dài (400–800x8–18µm), xù xì điển hình;
chúng xòe ra thưa thớt, có thể tập hợp lại thành các cột bào tử khi già.
Bào tử đường kính 3–6µm với vách nhẵn hoặc hơi xù xì.


8

o Mọc nhanh trong 3 ngày. Khuẩn lạc mịn, bề mặt thường vàng nhạt tới
nâu, nhiều bụi vàng; có thể có viền trắng..

o Phân bố rộng rãi trong tự nhiên, là căn nguyên phổ biến thứ hai của IA.

(a) Khuẩn lạc

(b) Bảo tử nhuộm bằng lactophenol cotton blue

Hình 1.7. Một số hình ảnh của Aspergillus flavus
- Talaromyces marneffei (Tên cũ là Penicillium marneffei)
o Ở 25–300C, cuống bào đài nhẵn với 4–5 tiểu bào đài tận, mỗi tiểu bào
đài mang 4–6 cuống bào tử. Bào tử nhẵn hoặc hơi xù xì và có hình
tròn đến oval (2–3x2,5-4µm) và tạo chuỗi. Ở 35–37 0C, bào tử tạo các
bào tử vô tính đơn bào từ tròn đến oval (đường kính 3–5µm) vách
ngăn rõ, dạng giống nấm men, không có chồi.
o Mọc nhanh trong 3 ngày (25 – 300C). Trên SDA, khuẩn lạc phẳng, có
bột hay mịn, nâu nhạt, sau chuyển vàng đỏ với viền vàng hoặc trắng;
thường xanh xám ở giữa. Chất màu màu đỏ đậm khuếch tán vào môi
trường sau 3–7 ngày. Dạng men phát triển chậm hơn (35 – 370C).
o Gây nhiễm nấm sâu tại chỗ hoặc lan tỏa, chủ yếu ở bệnh nhân suy
giảm miễn dịch (HIV dương tính) và các cá thể có đáp ứng miễn dịch
sống hoặc đi du lịch ở vùng dịch tễ của T. marneffei (Đông Nam Á).
Loài này có thể được phân lập từ máu, tủy xương, da, phổi, cơ, hạch,
nước tiểu, phân, dịch não tủy và nhiều cơ quan nội tạng.

(a) Khuẩn lạc trên thạch máu (370C)

(b) Nhuộm Gram từ bệnh phẩm (370C)


9

(c) Khuẩn lạc trên SDA (250C)

.1.2.

(d) Bảo tử nhuộm bằng lactophenol cotton blue

Hình 1.8. Một số hình ảnh của Talaromyces marneffei
Chẩn đoán nhiễm nấm xâm nhập

.1.2.1.

Khái niệm nhiễm nấm xâm nhập

Bệnh do nấm có thể được phân loại dựa trên vị trí nhiễm nấm: nấm bề mặt,
nấm da, nấm dưới da và nấm sâu (hay nấm xâm nhập). Nấm bề mặt, nấm da và nấm
dưới da gây tổn thương chủ yếu trên bề mặt, da và dưới da, chủ yếu gây cảm giác
khó chịu, giảm tính thẩm mĩ dẫn đến làm giảm chất lượng sống. Trong khi đó, nấm
xâm nhập gây nhiễm các cơ quan nội tạng như phổi, thận, lách, màng bụng, xương
và hoặc hệ thần kinh trung ương, và có thể gây rối loạn chức năng sinh lý của các
cơ quan nội tạng, thậm chí đe dọa tính mạng bệnh nhân.
.1.2.2.

Triệu chứng lâm sàng nhiễm nấm xâm nhập

Bệnh nấm xâm nhập là tình trạng bệnh do nhiễm nấm xâm nhập. Bệnh nhân
có thể sốt, mạch nhanh, nhiễm độc cấp tính hoặc mạn tính. Tuy nhiên, các triệu
chứng này không điển hình, khó phân biệt với nhiễm vi khuẩn. Các triệu chứng tại
chỗ thay đổi, tùy thuộc căn nguyên và đáp ứng miễn dịch của người bệnh [18]. Do
đó, việc khám lâm sàng có giá trị định hướng để chỉ định các xét nghiệm phù hợp.
.1.2.3.

Xét nghiệm vi sinh y học nhiễm nấm xâm nhập

Hiện nay có nhiều phương pháp để chẩn đoán căn nguyên nấm [19], [20].
-

Soi tươi
Phát hiện nấm trong mô và bệnh phẩm vô trùng bằng soi trực tiếp có giá trị

chẩn đoán nhiễm nấm xâm nhập [21]. Mặt khác, phát hiện các phần tử nấm đặc hiệu
qua soi có thể giúp phòng xét nghiệm chọn môi trường nuôi cấy phù hợp nhất với
bệnh phẩm. Ví dụ, có sợi của một sinh vật lớp Zygomycetes gợi ý việc sử dụng
thạch mạch nha hoặc bánh mì vô khuẩn không có chất bảo quản để phân lập.


10

Kỹ thuật này đơn giản, cho kết quả nhanh. Một số căn nguyên nấm có hình
thái đặc trưng có thể định danh đặc hiệu bằng soi trực tiếp. Ví dụ, nếu thấy những tế
bào nấm men điển hình, các bào tử hoặc các cấu trúc khác bằng kính hiển vi, có thể
đặt chẩn đoán căn nguyên nhiễm trùng là H. capsulatum, Cryptococcus neoformans,
phức hợp C. immitis và Pneumocystis jiroveci. Trong các nhiễm trùng khác như
aspergillosis và candidiasis, hình thái học có thể đưa đến chẩn đoán loại căn nguyên
nhưng không định danh được loài của tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên, soi trực tiếp có
độ nhạy thấp nên đã bỏ sót một tỷ lệ khá lớn (20–40%) các trường hợp bị bệnh.
-

Nhuộm soi
Một số kĩ thuật và thuốc nhuộm khác nhau có thể được sử dụng giúp phát

hiện sự có mặt của nấm bằng soi trực tiếp. Phổ biến nhất là soi bệnh phẩm trong
KOH 10–20% chứa thuốc nhuộm huỳnh quang Calcofluor trắng, nhuộm Gram,
Giemsa, Periodic Acid Schiff, hoặc phối hợp các phương pháp nhuộm trên.
Test mực tàu có giá trị chẩn đoán xác định C. neoformans. Nhuộm Gram có
giá trị phát hiện Candida spp., Cryptococcus spp. và các phần tử sợi của nấm sợi
như Aspergillus, các loài thuộc chi Zygomycetes, và Fusarium spp. Điển hình nấm
bắt màu Gram dương nhưng có thể bắt màu không đều hoặc Gram âm.

Hình 1.9. Test mực tàu dương tính với Cryptococcus neoformans
Tuy nhiên độ nhạy của nhuộm soi còn thấp (nhuộm Gram độ nhạy là 54 –
73%, nhuộm Giemsa độ nhạy là 54 – 75%) nên vẫn bỏ sót căn nguyên gây bệnh.
-

Nuôi cấy phân lập và định danh
Hầu hết các trường hợp cần nuôi cấy để định danh căn nguyên gây bệnh và

đánh giá độ nhạy cảm in vitro với các loại thuốc kháng nấm, nếu có chỉ định.


11

Bệnh phẩm được cấy vào môi trường Sabouraud, để ở nhiệt độ 300C theo dõi
hàng ngày. Hình thái trên kính hiển vi, đặc điểm ở môi trường nuôi cấy, màu sắc,
tốc độ phát triển và sắc tố là đặc điểm để nhận định sơ bộ loài nấm.
Phương pháp cấy kinh điển có nhược điểm là đòi hỏi thời gian dài hơn so với
vi khuẩn. Nấm có thể mọc sau 2 – 3 ngày. Một số loài nấm cần 5 – 7 ngày, thậm chí
tới 4 – 6 tuần. Có nhiều loại nấm khó nuôi cấy hoặc chưa nuôi cấy được.
Phiên giải kết quả cấy nấm khó do chúng thuộc vi hệ của một số vị trí trên cơ
thể (như đường hô hấp, dạ dày ruột và sinh dục tiết niệu) và bệnh phẩm hoặc môi
trường nuôi cấy có thể nhiễm các loài nấm có khả năng gây bệnh cơ hội trong môi

trường. Trong khi hầu hết các chủng Candida và C. neoformans phân lập từ máu có
ý nghĩa lâm sàng, các loài khác như Aspergillus (trừ A. terreus) và Talaromyces (trừ
T. marneffei) nhiều khả năng là giả nấm máu hoặc nhiễm. Aspergillus phân lập từ
bệnh phẩm đường hô hấp đặc biệt khó phiên giải, do sinh vật này phổ biến trong
môi trường và có thể cư trú trong đường hô hấp mà không gây bệnh.
Việc định danh nấm tới chi và loài ngày càng quan trọng khi phổ của các tác
nhân gây bệnh cơ hội tiếp tục mở rộng. Định danh tác nhân gây bệnh có thể có giá
trị trong kiểm soát nhiễm trùng. Trong trường hợp của các bệnh nấm hiếm gặp hơn,
việc định danh căn nguyên đặc hiệu có thể cung cấp thông tin để bác sĩ lâm sàng
tham khảo y văn về khả năng gây bệnh và đáp ứng với điều trị tác nhân gây bệnh.
Do C. albicans chiếm đa số trong các nấm men phân lập được từ bệnh phẩm
lâm sàng, một số xét nghiệm nhanh và đơn giản được đặt ra để phân biệt nó với các
nấm men khác như test mầm giá hoặc sinh bào tử màng dày trên nuôi cấy lam kính.

(a) Thử nghiệm mầm giá

(b) Bảo tử màng dày

Hình 1.10. Hình ảnh dương tính một số test định danh nhanh C.
albicans


12

Một số xét nghiệm có thể sử dụng để chẩn đoán sơ bộ C. neoformans gồm
urease (dương tính), nitrate (dương tính) và sinh phenol oxidase (dương tính).
Nhìn chung để định danh xác định nấm men cần thực hiện các test sinh vật
hóa học. Hiện nay đã có các kit thương mại như API AUX, máy định danh Vitek.
Khác với nấm men, định danh nấm sợi chủ yếu dựa trên hình thái như hình
thái khuẩn lạc đại thể và hình thái vi thể. Hình thái khuẩn lạc phụ thuộc vào môi

trường hoặc chủng nên đặc điểm này không thể dùng làm tiêu chuẩn định danh đơn
độc. Kết cấu bề mặt, hình thể, màu sắc, sắc tố mặt dưới, mọc ở 370C, và nhu cầu các
vitamin đặc hiệu đều là những đặc tính có giá trị. Định danh xác định của hầu hết
nấm sợi dựa vào hình thái học vi thể. Bệnh phẩm soi kính hiển vi phải được chuẩn
bị bằng phương pháp hạn chế tối đa mọi sự đứt gãy liên kết của bào tử với các cấu
trúc sinh sản tương ứng, tốt nhất là nuôi cấy lam kính. Sắc tố đen vách tế bào và
tính lưỡng hình khi thay đổi nhiệt độ cũng là những đặc điểm quan trọng.


13

-

Các phương pháp chẩn đoán huyết thanh
Mặc dù còn những băn khoăn về sự đào thải nhanh chóng khỏi máu của các

kháng nguyên nấm và độ tin cậy của các xét nghiệm kháng thể trên bệnh nhân suy
giảm miễn dịch, các xét nghiệm phát hiện kháng nguyên nấm đặc hiệu, kháng thể
vẫn được đặt ra để rút ngắn thời gian chẩn đoán nhiễm nấm xâm nhập.
β-D-glucan là thành phần cấu tạo vách tế bào các loài Candida, Aspergillus
và nhiều loài nấm khác. Kết quả dương tính thật với β-D-glucan gợi ý khả năng
nhiễm nấm xâm nhập. Vấn đề chính của xét nghiệm này là độ đặc hiệu thấp và
dương tính giả cao, đặc biệt trên các nhóm bệnh nhân Hồi sức tích cực do ở các
bệnh nhân này thường gặp các yếu tố gây dương tính giả như: nhiễm trùng hệ thống
(nhiễm khuẩn huyết do các vi khuẩn Gram âm và Gram dương), một số kháng sinh
(amoxicillin – clavulanate dùng đường tĩnh mạch), lọc máu, nấm cư trú, truyền
albumin hoặc immunoglobulin. Do đó xét nghiệm này chỉ có ý nghĩa khi dương tính
nhiều lần liên tiếp hoặc trên những bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng hoặc yếu tố
nguy cơ đặc trưng gợi ý nhiễm nấm xâm nhập. Ngoài ra, thử nghiệm β-D-glucan
chưa được nghiên cứu đầy đủ trên trẻ em nên không được khuyến cáo sử dụng trong

nhi khoa [21].
Mannan là glycoprotein vách tế bào Candida. Độ nhạy/độ đặc hiệu trong
chẩn đoán nhiễm Candida xâm nhập của mannan và antimannan IgG đơn độc lần
lượt là 58%/93% và 59%/83% [22]. Giá trị của xét thử nghiệm phối hợp là 83% và
86%, tốt nhất với nhiễm C. albicans, C. glabrata và C. tropicalis. Tuy nhiên, thử
nghiệm này mới được công nhận tại châu Âu và chưa được sử dủng rộng rãi tại Mỹ.
Galactomannan là thành phần vách tế bào Aspergillus. Galactomannan huyết
thanh và dịch rửa phế quản là chỉ dấu chính xác cho chẩn đoán nhiễm Aspergillus
xâm nhập ở nhóm bệnh nhân người lớn và trẻ em mắc bệnh máu ác tính hoặc ghép
tế bào gốc tạo máu. Ở các bệnh nhân đã sử dụng thuốc chống nấm sợi,
galactomannan có thể áp dụng với bệnh phẩm dịch phế quản. Các xét nghiệm β-Dglucan và galactomannan trong máu hoặc dịch rửa phế quản ở những bệnh nhân


14

không có triệu chứng hoặc bệnh nhân nguy cơ cao có sốt giúp làm giảm điều trị dự
phòng không cần thiết [23].
-

Các phương pháp chẩn đoán dựa trên acid nucleic
Các phương pháp chẩn đoán dựa trên khuếch đại acid nucleic cung cấp cách

định danh nấm men và nấm sợi khách quan và nhanh hơn so với các phương pháp
truyền thống. Gần đây, công nghệ real-time PCR khếch đại đích nhanh, phát hiện
tức thời bản sao gắn huỳnh quang và phân tích biểu đồ vừa phát hiện vừa định danh
căn nguyên nấm gây bệnh. Hầu hết các kết quả trong y văn cho thấy độ nhạy của
chẩn đoán dựa trên PCR bằng hoặc cao hơn các kĩ thuật chẩn đoán đang được sử
dụng khác. Phương pháp này đặc biệt có giá trị trong định danh các nấm sợi không
sinh bào tử không thể định danh bằng các phương pháp thông thường. Hạn chế
chính của cách tiếp cận này là việc thiếu phương pháp chuẩn và dữ liệu phê duyệt

phương pháp đa trung tâm.
.1.2.4.

Tiêu chuẩn chẩn đoán nhiễm nấm xâm nhập

Nhiễm nấm xâm nhập gồm ba mức độ [24]:
-

Nhiễm nấm xâm nhập xác định: Có bằng chứng xét nghiệm vi sinh hoặc giải
phẫu bệnh trên bệnh phẩm vô trùng dương tính với nấm (Bảng 1.2.).

-

Nguy cơ cao nhiễm nấm xâm nhập: Có yếu tố vật chủ, 1 tiêu chuẩn lâm sàng
và 1 tiêu chuẩn cận lâm sàng nấm học (Bảng 1.3.)

-

Có thể nhiễm nấm xâm nhập: Có yếu tố vật chủ, 1 tiêu chuẩn lâm sàng
nhưng không có tiêu chuẩn cận lâm sàng nấm học (Bảng 1.3.)


15

2.

Tiêu chuẩn chẩn đoán xác định nhiễm nấm xâm nhập trừ các

bệnh nấm tại chỗ [24]
Kỹ thuật

Nấm sợia
Nấm mena
Vi
thể: Giải phẫu bệnh học, tế bào học, Giải phẫu bệnh học, tế bào học, hoặc
hoặc soi trực tiếpb bệnh phẩm soi trực tiếpb bệnh phẩm chọc hút

Bệnh

phẩm vô chọc hút kim nhỏ hoặc sinh kim nhỏ hoặc sinh thiết từ vị trí
trùng

thiết thấy sợi hoặc dạng giống thường vô khuẩn (trừ các niêm mạc)
nấm men bắt màu đen kèm theo thấy các tế bào nấm men – ví dụ, các
bằng chứng tổn thương mô kèm loài Cryptococcus là các nấm men có
theo.

vỏ có chồi hoặc các loài Candida

Nuôi cấy:

sinh sợi giả hoặc sợi thậtc.
Phân lập được nấm sợi từ nuôi Phân lập được nấm sợi từ nuôi cấy

Bệnh

cấy bệnh phẩm lấy bằng quy bệnh phẩm lấy bằng quy trình vô

phẩm vô trình vô khuẩn từ một vị trí khuẩn (bao gồm dẫn lưu mới đặt
trùng

thường vô khuẩn và có bất (dưới 24 giờ)) từ mội vị trí thường vô
thường về lâm sàng hoặc X- khuẩn có bất thường về lâm sàng
quang phù hợp với bệnh lý hoặc X-quang phù hợp với bệnh cảnh
nhiễm trùng, bao gồm dịch rửa nhiễm trùng.
phế quản phế nang, bệnh phẩm
xoang sọ và nước tiểu.
Cấy máu ra nấm sợid (như Cấy máu ra nấm men (như các loài

Máu

Fusarium sp.) trong bệnh cảnh Cryptococcus hoặc Candida) hoặc

Huyết

nhiễm trùng phù hợp.

nấm dạng nấm men (như các loài

Không ứng dụng được.

Trichosporon).
Kháng nguyên Cryptococcus trong

thanh

dịch não tủy cho thấy nhiễm

học : dịch

Cryptococcus lan tỏa.

não tủy
a

Nếu có thể nuôi cấy, trả kết quả định danh đến mức độ giống hoặc loài.

b

Mô và các tế bào lấy cho nghiên cứu giải phẫu bệnh học hoặc tế bào học

nên được nhuộm bạc methenamine Grocott-Gomorri hoặc nhuộm Periodic Acid


16

Schiff, để dễ quan sát các cấu trúc nấm. Bất cứ khi nào có thể, bệnh phẩm từ ổ bệnh
liên quan nên được nhuộm bằng thuốc nhuộm huỳnh quang (như calcofluor hoặc
blankophor).
c

Candida, Trichosporon và các loài Geotrichum dạng nấm men và

Blastoschizomyces capitatus cũng có thể tạo sợi giả hoặc sợi thật.
d

Phân lập được các loài Aspergillus từ cấy máu luôn do nhiễm.

3.

Tiêu chuẩn nguy cơ cao nhiễm nấm xâm nhập trừ các bệnh

nấm tại chỗ [24]
-

Yếu tố vật chủ:
o Tiền sử giảm bạch cầu gần đây (< 0,5 G/l trên 10 ngày) liên quan đến
thời điểm khởi phát bệnh nấm;
o Bệnh nhân ghép tế bào gốc đồng loài;
o Sử dụng corticoid kéo dài (ngoại trừ các bệnh nhân nhiễm Aspergillus
phế quản phổi dị ứng) với liều trung bình tối thiểu 0,3 mg/kg/ngày
đương lượng prednisone trên 3 tuần;
o

Điều trị bằng các chất ức chễ miễn dịch tế bào T đã biết khác,
như cyclosporine, thuốc chẹn TNF-α, kháng thể đơn dòng đặc
hiệu (như alemtuzumab), hoặc các chất tương tự nucleoside
trong 90 ngày gần đây;

o Thiếu hụt miễn dịch bẩm sinh nặng (như bệnh u hạt mạn tính hoặc
-

thiếu hụt miễn dịch kết hợp nặng).
Tiêu chuẩn lâm sàng:
o Bệnh nấm đường hô hấp dướic : Có 1 trong 3 biểu hiện trên CT :
 Tổn thương đặc, viền rõ, có/ không có dấu hiệu quầng sáng;
 Dấu hiệu hình liềm hơi;
 Hang.
o Viêm khí phế quản:
 Có loét khí phế quản, cục nhỏ, giả mạc, mảng bám hoặc vảy

17

trên soi phế quản.
o Nhiễm trùng mũi xoang: Chẩn đoán hình ảnh cho thấy viêm xoang và
ít nhất một trong ba triệu chứng:
 Đau cấp khu trú (bao gồm cả đau lan lên mắt);
 Loét mũi với mảng bám màu đen;
 Mở rộng các xoang mũi bên qua các thành mũi, bao gồm cả
vào ổ mắt.
o Nhiễm trùng dịch não tủy: Một trong hai dấu hiệu sau:
 Tổn thương khu trú trên chẩn đoán hình ảnh;
 Dày màng não trên MRI hoặc CT.
o Bệnh Candida lan tỏa: ít nhất một trong hai triệu chứng thực thể sau
đây sau một giai đoạn nhiễm Candida máu trong 2 tuần trước đó:
 Các ổ apxe nhỏ dạng bia bắn ở gan hoặc lách;
-

 Xuất tiết võng mạc tiến triển khi khám mắt.
Tiêu chuẩn nấm học:
o Xét nghiệm trực tiếp: (tế bào học, soi trực tiếp hoặc nuôi cấy)
 Nấm sợi trong đờm, dịch rửa phế quản, chải phế quản, hoặc
bệnh phẩm hút xoang, cho thấy một trong các dấu hiệu sau:
• Có các phần tử nấm gợi ý nấm sợi;
• Phân lập được nấm sợi từ nuôi cấy (ví dụ Aspergillus,
Fusarium, Zygomycetes, hoặc các loài Scedosporium).
o Xét nghiệm gián tiếp (phát hiện kháng nguyên hoặc thành phần vách
tế bào):
 Aspergillosis : Phát hiện kháng nguyên galactomannan trong
huyết tương, huyết thanh, dịch rửa phế quản hoặc dịch não tủy.

-

Nhiễm nấm xâm nhập trừ bệnh do Cryptococcus và các nấm lớp
Zygomycetes : Phát hiện β-D-glucan trong huyết thanh.