Phân tích cấu trúc một số hợp chất flavonoid tách chiết từ vỏ hạt đậu xanh (vigna radiata) bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THỊ THU HẰNG

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC
MỘT SỐ HỢP CHẤT FLAVONOID TÁCH CHIẾT
TỪ VỎ HẠT ĐẬU XANH (VIGNA RADIATA)
BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THỊ THU HẰNG

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC
MỘT SỐ HỢP CHẤT FLAVONOID TÁCH CHIẾT
TỪ VỎ HẠT ĐẬU XANH (VIGNA RADIATA)
BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Thu Hà

THÁI NGUYÊN - 2017


LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn
GS.TS. Nguyễn Văn Tuyến và TS. Nguyễn Thị Thu Hà đã giao đề tài và tận
tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Hóa sinh ứng dụng – Viện
Hóa học đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành
luận văn.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô khoa Hóa Học - Trường Đại Học Khoa Học
Thái Nguyên đã trang bị cho em kiến thức để tiếp cận với các vấn đề nghiên
cứu khoa học, và các anh chị, các bạn học viên lớp K9B- lớp Cao học Hóa đã
trao đổi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi, bạn bè và
đồng nghiệp của tôi - những người đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này.
Ngày

tháng

năm 2017

Học viên

Phạm Thị Thu Hằng

a

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................a
MỤC LỤC ........................................................................................................ b
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT ......................................................... d
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... f
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... g
DANH MỤC SƠ ĐỒ ................................................................................................. h

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1. Sơ lược về họ Đậu (Fabaceae), Chi Đậu (Vigna) và loài đỗ xanh
(Vigna radiata) .............................................................................................. 3
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học .......................................................................................... 4
1.2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ................................................... 4
1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.................................................... 7
1.3. Hợp chất Flavonoid................................................................................ 8
1.3.1. Phân loại .......................................................................................... 8
1.3.2. Các phương pháp định tính và định lượng.................................... 12
1.3.3. Các phương pháp chiết xuất flavonoid ......................................... 14
1.3.4. Hoạt tính sinh học của lớp chất flavonoid .................................... 15
1.4. Một số phương pháp hóa lí dùng để phân tích cấu trúc hóa học các
hợp chất tự nhiên ......................................................................................... 20
1.4.1. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và

13

C-

NMR ........................................................................................................ 20
1.4.2. Phương pháp phổ khối lượng (MS) .............................................. 22
1.4.3. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)................................................ 23
b


Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 25
2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 25
2.1.1. Đối tượng ...................................................................................... 25
2.1.2. Hóa chất ........................................................................................ 25
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu ....................................................................... 25
2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 26
2.2.1. Phương pháp xử lý và ngâm chiết mẫu thực vật........................... 26
2.2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất tự nhiên ............................... 27
2.3. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các chất phân lập được ........... 28
2.3.1. Hợp chất vitexin (MB1) ................................................................ 28
2.3.2. Hợp chất isovitexin (MB2) ............................................................ 29
2.3.3. Hợp chất luteolin (MB3) ............................................................... 29
2.3.4. Hợp chất Taxifolin (MB4)............................................................. 30
2.3.5. Hợp chất Catechin (MB5)............................................................. 30
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 32
3.1. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất vitexin (MB1) ...................... 32
3.2. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất isovitexin (MB2) ................. 37
3.3. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất luteolin (MB3)..................... 40
3.4. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất Taxifolin(MB4) ................... 43
3.5. Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất Catechin (MB5)................... 45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 50
1. Kết luận ................................................................................................... 50
2. Kiến nghị ................................................................................................. 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 51

PHỤ LỤC ......................................................................................................... 1

c


DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
Kí hiệu/
Tên tiếng anh

Tên tiếng việt

Từ viết tắt
NMR

Nuclear Magnetic Resonance

Phổ cộng hưởng từ
hạt nhân

1

Nuclear Magnetic Resonance-1H

Phổ cộng hưởng từ
proton

Nuclear Magnetic Resonance-1H

Phổ cộng hưởng từ
hạt nhân 13C

H-NMR

13

C-NMR

DEPT

Distortionles
Enhancement
Polarization Transfer

COSY

Homonuclear Correlated Spectroscopy

Phổ COSY

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Correlation

Phổ tương tác di hạt
nhân qua nhiều liên kết

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Coherence

Phổ tương tác trực
tiếp H-C

ESI-MS

Electron Inoniziation-Mass Spectroscopy

Phổ
khối
phun
sương mù điện tử

IR

Infrared spectroscopy

Phổ hồng ngoại

MS

Mass Spectroscopy

Phổ khối lượng

đnc

by

Phổ DEPT

Điểm nóng chảy

TLC

Thin LayerChromatography

DMSO

Dimethyl sulfoxide

d

Sắc ký bản lớp mỏng


Kí hiệu/
Tên tiếng anh

Tên tiếng việt

Từ viết tắt
EtOAc

Ethyl acetate

Ethyl acetat

EtOH

Ethanol

Ethanol

MeOH

Methanol

Methanol
Độ chuyển dịch hóa
học của proton và
cacbon

δH, δC

ppm

Part per million

Phần triệu

s: singlet
dd: doublet of doublets
d: doublet
dt: doublet of triplets
t: triplet
dq: doublet of quartets
q: quartet

e

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất MB1 ............... 34
Bảng 3.2. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất MB2 ................. 39

f


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1:
Hình 1.2:
Hình 3.1.
Hình 3.2.
Hình 3.3.
Hình 3.4.
Hình 3.5.
Hình 3.6.
Hình 3.7.
Hình 3.8.
Bảng 3.2.
Hình 3.9.
Hình 3.10.
Hình 3.11.
Hình 3.12.
Hình 3.13.
Hình 3.14.
Hình 3.15.
Hình 3.16.
Hình 3.17.

Hình 3.18.
Hình 3.19.
Hình 3.20.
Hình 3.21.
Hình 3.22.
Hình 3.23.
Hình 3.24.

Cây Đậu xanh (Vigna radiata) ..................................................... 3
Một số hợp chất flavonoid phân lập từ hạt Đậu xanh
(Vignaradiata) .............................................................................. 7
Phổ ESI-MS của hợp chất MB1 ................................................. 32
Phổ 1H-NMR của hợp chất MB1 ................................................ 33
Phổ DEPT của hợp chất MB1..................................................... 33
Phổ HSQC của hợp chất MB1 .................................................... 35
Phổ HMBC của hợp chất MB1 ................................................... 36
Công thức cấu tạo và một số tương tác chính trên phổ HMBC
của chất vitexin ........................................................................... 36
Phổ ESI-MS của hợp chất MB2 ................................................. 37
Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất MB2................................ 38
Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất MB2 ............. 39
Phổ 13C-NMR của hợp chất MB2 ............................................... 40
Công thức cấu tạo của hợp chất isovitexin ................................. 40
Phổ ESI-MS của hợp chất MB3 ................................................. 41
Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất MB3................................ 42
Phổ 13C-NMR của hợp chất MB3 ............................................... 42
Công thức cấu tạo của hợp chất luteolin..................................... 43
Phổ ESI-MS của hợp chất MB4 ................................................. 43
Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất MB4................................ 44
Phổ 13C-NMR của hợp chất MB4 ............................................... 45

Công thức cấu tạo của hợp chất taxifolin ................................... 45
Phổ ESI-MS của hợp chất MB5 ................................................. 46
Phổ 1H-NMR dãn rộng của hợp chất MB5 ................................. 47
Phổ DEPT của hợp chất MB5..................................................... 47
Phổ HMBC của hợp chất MB5 ................................................... 48
Công thức cấu tạo và một số tương tác chính trên phổ HMBC
của hợp chất catechin .................................................................. 48
Các hợp chất phân lập được từ dịch chiết EtOAc vỏ hạt đỗ
xanh (Vigna radiata)................................................................... 49

g


DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ ngâm chiết vỏ hạt đậu xanh (Vigna radiata) .............. 26
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn EtOAc của vỏ đậu xanh
(Vigna radiata) ........................................................................... 28

h


MỞ ĐẦU
Từ thời xa xưa ông cha ta đã biết sử dụng và bào chế ra những phương
thuốc Y học cổ truyền từ những dược liệu có nguồn gốc tự nhiên. Ngày nay
cùng với sự phát triển của kỹ thuật tiên tiến và hiện đại, nhiều loại thuốc đã
được ra đời. Nhờ sự phát triển của hóa học và dược học, một số hoạt chất có
trong dược liệu thảo mộc được phân lập, tinh chế, xác định cấu trúc hóa học,
tác dụng dược lý và sử dụng dưới dạng tinh khiết. Tuy nhiên, đối với thuốc có
nguồn gốc hóa dược, ngoài những ưu điểm nổi bật như hiệu quả điều trị cao,
dễ sản xuất, dễ sử dụng và bảo quản, thì vấn đề hạn chế lớn nhất cần phải

quan tâm chính là những tác dụng phụ và độc tính kèm theo, đặc biệt trong
trường hợp điều trị lâu dài đối với các bệnh mãn tính. Vì vậy ngày nay người
ta có xu hướng trở về với tự nhiên.
Do Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và
ẩm, được thiên nhiên ưu đãi nên nước ta được xem là mảnh đất màu mỡ cho
sự phát triển của các chủng loại cây cỏ có thảm thực vật phong phú và đa
dạng, với khoảng hơn 14.000 loài thực vật bậc cao. Trong đó, không ít loại
cây được sử dụng làm thuốc rất hiệu quả, theo nghiên cứu có khoảng gần
4.000 loài được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền. Nước ta có nền Y
học cổ truyền hết sức đa dạng và đặc sắc, với bề dày hàng nghìn năm lịch sử,
nền y học dân tộc cũng không ngừng phát triển qua các thời kỳ đó. Có những
loại dược liệu thảo mộc hết sức thông dụng trong dân gian, nhưng lại được
các nhà khoa học chứng minh là có tác dụng trị liệu không thua kém gì so với
các loại thuốc tân dược hiện nay. Chính vì thế việc nghiên cứu để khai thác,
kế thừa, ứng dụng và phát triển nguồn thực vật làm thuốc đã, đang và sẽ là
vấn đề có ý nghĩa khoa học, kinh tế và xã hội rất lớn ở nước ta.

1


Cây Đậu xanh (Vigna radiata) là cây thực phẩm quan trọng thứ 3, sau
cây Đậu tương và cây Lạc. Ngày càng nhiều các nghiên cứu khoa học cho
thấy tác dụng tích cực của hạt Đậu xanh đối với sức khỏe con người. Các
nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy các hợp chất chính hạt Đậu xanh
chứa chủ yếu các hợp chất flavonoid, với nhiều hoạt tính sinh học quí như
chống oxy hóa, kháng viêm, chống miễn dịch, chống dị ứng, ngăn ngừa sinh
tổng hợp và hấp thu cholesterol. Do vậy, sự lựa chọn vỏ của hạt đậu xanh làm
đối tượng nghiên cứu của đề tài “PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP
CHẤT FLAVONOID TÁCH CHIẾT TỪ VỎ HẠT ĐẬU XANH (VIGNA
RADIATA) BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI” được đặt

ra với mục tiêu và nội dung nghiên cứu như sau:
* Mục tiêu nghiên cứu
1. Phân lập được một số hợp flavonoid từ vỏ của hạt đậu xanh (Vigna
radiata).
2. Phân tích cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp
hóa lí hiện đại như: phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D; phổ hồng ngoại
IR; phổ khối lượng MS và đo điểm nóng chảy Mp.
* Nội dung nghiên cứu
1. Thu thập mẫu lớn vỏ của hạt đậu xanh (Vigna radiata) để tiến hành
nghiên cứu.
2. Phân lập một số hợp flavonoid từ vỏ của hạt đậu xanh
3. Phân tích cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp
hóa lí hiện đại như: phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D; phổ hồng ngoại
IR; phổ khối lượng MS và đo điểm nóng chảy Mp.

2


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Sơ lược về họĐậu(Fabaceae),Chi Đậu (Vigna) và loàiđỗ xanh (Vigna
radiata)
Những cây thuộc họ Đậu, chi Đậu thường là những cây bụi, cỏ, đứng
thẳng hay leo trườn. Lá đơn hoặc kép 1 lần lông chim. Đặc trưng bởi hoa rất
không đều (hoa cánh bướm), tràng tiền khai lợp úp; nhị 10, tất cả dính nhau
thành ống hoặc chỉ 9 dính với nhau còn chiếc thứ 10 tự do; noãn cong hình
móng ngựa và có chân ngắn [1]
Loài Đậu xanh hay đỗ xanh có tên khoa học là Vigna radiata, là loại cây
thảo, mọc đứng cao cỡ 50cm. Lá có 3 lá chét, có lông ở cả hai mặt. Chùm hoa ở

nách lá. Hoa màu vàng lục. Quả đậu hình trụ mảnh, có lông, chứa nhiều hạt nhỏ
hình trụ ngắn, gần hình cầu, thường có màu xanh. Hoa tháng 8 - 10; quả tháng 311. Bộ phận thường dùng là hạt, hay còn gọi là Lục dâu đậu xanh [2].

Hình 1.1: Cây Đậu xanh (Vigna radiata)
Nơi sống và thu hái: Cây của vùng nhiệt đới, được trồng rộng rãi ở
đồng bằng và vùng núi. Ở Việt Nam đậu xanh là loại đậu thường được sử
dụng để làm xôi, làm các loại bánh ngọt, bánh đậu xanh, chè, hoặc được ủ cho
lên mầm thành giá đỗ để làm thức ăn.
3


Tính vị, tác dụng: Đậu xanh có thành phần dinh dưỡng cao, hạt chứa
nước 14%; protid 23,4%, lipid 2,4%, glucid 53,10%, cellulose 4,7%. Còn có
các nguyên tố vi lượng Ca, P, Fe và các vitamin (tiền sinh tố A, B1, B2, PP,C).
Còn có phosphatidyl choline, phosphatidylethanolamine, phosphtidylinositol,
phosphatidylserine; phosphatidicacid.
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học
Đậu xanh (Vigna radiata) là cây thực phẩm quan trọng thứ 3, sau cây
Đậu tương và cây Lạc. Ngày càng nhiều các nghiên cứu khoa học cho thấy
tác dụng tích cực của hạt Đậu xanh đối với sức khỏe con người. Cây Đậu
xanh là một vị thuốc quý giá mà thiên nhiên ban tặng và được mệnh danh là
“Thực phẩm của tương lai”.
1.2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Loài đậu xanh (Vigna radiata) có nguồn gốc ở Ấn Độ và Trung Á, từ
đó lan sang nhiều khu vực khác của châu Á và trên thế giới. Cây đậu xanh có
khả năng thích ứng rộng, chịu hạn khá và có thể thích nghi với các vùng có
điều kiện khắc nghiệt. Ở châu Á cây đậu xanh được trồng nhiều ở các quốc
gia như: Ấn Độ, Pakistan, Bangladesh, Sri Lanka, Nepal, Trung Quốc,
Mianma, Thái Lan, Việt Nam, Campuchia, Lào, Philippines, Malaysia và

Indonesia. Sau này cây đậu xanh còn được trồng ở Trung Phi, các vùng khô
và nóng ở Nam Âu, phía Đông Bắc châu Úc, Nam Mỹ và miền Nam Hoa
Kỳ. Nó được sử dụng như một thành phần trong các món ăn mặn và ngọt.
Trong Đông y, hạt Đậu xanh có vị ngọt, hơi tanh, tính mát, không
độc, có tác dụng điều hòa ngũ tạng, mát gan và buồng mật, bổ nguyên khí,
chữa lở loét, làm sáng mắt. Theo Y học hiện đại, Đậu xanh có thành phần
dinh dưỡng rất cao với nhiều vitamin, acid folic và các khoáng chất, là nguồn
cung cấp chất xơ hòa tan loại bỏ các độc tố trong cơ thể, ngăn ngừa các bệnh
ung thư. Trong đậu xanh còn có thành phần hạ mỡ máu hữu hiệu, giúp cho cơ
4


thể phòng chống chứng xơ cứng động mạch và bệnh cao huyết áp, đồng thời
làm ổn định lượng đường trong máu nên rất tốt cho người bệnh tiểu đường.
Chuyên gia dinh dưỡng tại Đại học Kentucky - Lexington (Mỹ) và là tác giả
của chương trình “Magic Bean” - hạt đậu xanh kỳ diệu, đã thực hiện rất nhiều
nghiên cứu và ghi nhận nếu sử dụng đậu xanh nấu chín mỗi ngày có thể hạ
thấp 20% lượng cholesterol trong 3 tuần, giảm đến 40% nguy cơ mắc bệnh
tim mạch và huyết áp. Các nghiên cứu trong những năm gần đây đã chỉ mầm
hạt đậu xanh có các chất chuyển hóa thứ cấp phong phú hơn và hoạt tính sinh
học đa dạng hơn dạng hạt ban đầu [3].
Nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy hạt và mầm hạt Đậu xanh
chứa chủ yếu các hợp chất flavonoid, với thành phần chủ yếu là vitexin
(apigenin-8-C-β-glucopyranoside) và isovitexin (apigenin-6-C-β-glucopyranoside),
chiếm hàm lượng khoảng 51,1 và 51,7 mg/g; 12 axit phenolic; 21 axit hữu cơ
và 16 chất béo đã được phát hiện bằng phương pháp sắc ký khí/phổ khối
(GC/MS) [4].
Trong các ghi chép cổ, đậu xanh được biết đến với tác dụng giải độc và
thanh lọc cơ thể. Trên mô hình thực nghiệm, các protein, polypeptide,
polysaccharides và polyphenol từ hạt, mầm và vỏ của đậu xanh đều cho thấy

hoạt tính chống oxy hóa tiềm năng. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết
này trên hệ DPPH và 2,2'-azino-di- (3-etyl-2,3-dihydrobenzthiazoline -6sulfonate) (ABTS) lần lượt là 11,33 ± 0,24 và 36,65 ± 0,63 mmol/g [5]. Các
nhà khoa học đã chứng minh khả năng bắt giữ gốc tự do của 100 g đậu xanh
tương đương với 36,3 g trà xanh khô và 1462 mg vitamin C. Hoạt chất
Vitexin ức chế khoảng 60% gốc tự do DPPH ở 100 mg/mL và ngăn chặn hiệu
quả các tế bào da chết do tia UV gây ra [6].

5


Trên mô hình tăng lipid máu, thỏ thử nghiệm được cho ăn một hỗn hợp
70% bột đậu xanh và mầm đậu xanh và kết quả làm giảm triệu chứng của
bệnh động mạch vành [7]. Khi nghiên cứu trên chuột khỏe mạnh được ăn dịch
chiết đậu xanh trong 7 ngày, hàm lượng cholesterol tổng số đã giảm đáng kể.
Tác dụng này được cho là do thành phần phytosterol của đậu xanh, chúng có
khả năng ngăn ngừa sinh tổng hợp và hấp thu cholesterol [8].
Ở liều 600 mg peptide/kg thể trọng, sau khi chuột được tiêm dịch chiết
mầm va hạt đậu xanh từ 3-9 giờ đã làm giảm đáng kể huyết áp tâm thu và
duy trì trong thời gian thử nghiệm từ tuần 1-4 [9].
Tác giả Yao Y và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu năm 2008 về tác
dụng điều trị của dịch chiết mầm và vỏ hạt đậu xanh trên 2 loại chuột bị tiểu
đường. Các lô chuột được uống trong 5 tuần với nồng độ dịch chiết mầm đậu
xanh là 2 g/kg và vỏ hạt đậu xanh là 3 g/kg thể trọng. Kết quả cho thấy có sự
giảm lượng glucose, cholesterol tổng số, triglycerides và urê máu, đồng thời
nồng độ của insulin ở cả 2 lô chuột còn cải thiện rõ rệt [10].
Đậu xanh được chứng minh có khả năng chống tăng sinh tế bào qua thử
nghiệm MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide]
trên dòng tế bào ung thư biểu mô (CAL27) và một số dòng tế bào ung thư
khác như DU145, SK-OV-3, MCF-7, và HL-60) [11]. Ở nồng độ 10 mmol/L
và sau 72 giờ, trypsin phân lập từ hạt đậu xanh có khả năng làm giảm xấp xỉ

50% sự di căn và tăng sinh của dòng tế bào ung thư ruột kết (SW480) so với
nhóm đối chứng [12].
Các nhà nghiên cứu đã phân tích tác dụng chống viêm của dịch chiết
cồn hạt đậu xanh bao gồm các polyphenol, acid gallic, vitexin, và isovitexin
trên đại thực bào của chuột. Kết quả hoạt động của các đại thực bào giảm rõ
rệt thông qua việc ngăn ngừa biểu hiện gen gây viêm [13]. Điều này cho thấy
dịch chiết ethanol có tiềm năng rất lớn để cải thiện các triệu chứng lâm sàng
của các bệnh liên quan đến viêm, như bệnh dị ứng và bệnh tiểu đường [14]. Ở
6


nồng độ 20 mg/mL, genistein, acid phytic và acid syringic đã gây phản ứng
miễn dịch, thúc đẩy sản xuất IFN-γ, mở ra nhiều triển vọng trong việc sử
dụng hạt Đậu xanh để điều chế thuốc miễn dịch [15].

Hình 1.2: Một số hợp chất flavonoid phân lập từ hạt Đậu xanh
(Vigna radiata)
Dịch chiết polyphenol từ mầm đậu xanh cũng được chứng minh có hoạt
tính kháng vi khuẩn Helicobacter pylori và chủng loại nấm như Rhizoctonia
solani, Coprinus comatus, Mycosphaerella arachidicola, Botrytis cinerea và
F. oxysporum [16]. Dịch chiết nước từ vỏ đậu xanh thể hiện khả năng kháng
khuẩn trên mô hình in vitro và in vivo [17].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở nước ta, Đậu xanh đã được trồng từ lâu đời ở các vùng đồng bằng,
trung du và miền núi suốt từ Bắc đến Nam. Đậu xanh không chỉ là thực phẩm
mà còn được sử dụng làm thuốc chữa bệnh. Sách "Nam dược thần hiệu" của

7

danh Y Tuệ Tĩnh viết: “Đậu xanh không độc, thanh nhiệt, có thể làm sạch mát
nước tiểu, chữa lở loét, làm sáng mắt, trị được nhiều bệnh”… Đề cập đến tác
dụng chữa bệnh của đậu xanh, đặc biệt là vấn đề giải độc, sách "Bản thảo
cương mục" của Lý Thời Trân (đời Minh) có ghi nếu ăn uống bị ngộ độc,
buồn bực trong người, có thể dùng đậu xanh để chữa trị. Loại thực phẩm này
có tác dụng giải độc khi uống nhầm thuốc (thủy ngân, thạch tín...); uống thuốc
quá liều (ô đầu, phụ tử…); giải độc do ngộ độc thức ăn, ngộ độc sắn, nấm...
Các nghiên cứu về vỏ hạt đậu xanh ở nước ta cho đến nay cũng không
có nhiều. Năm 1996, nhóm nghiên cứu của Trần Lê Vân Hiền và cộng sự đã
công bố thành phần hóa học của chủ yếu trong vỏ hạt đậu xanh là flavonoid,
chủ yếu là vitexin và isovitexin có tác dụng bảo vệ cơ thể chống phóng xạ,
chống đột biến nhiễm sắc thể, ức chế rõ các phản ứng peroxide hóa trong cơ
thể. Trong một nghiên cứu khác, tác giả Nguyễn Thị Hương cũng đã phân lập
được hai hoạt chất
vitexin và isovitexin từ vỏ của loài đậu này [18].
1.3. Hợp chất Flavonoid [19]
1.3.1. Phân loại
Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực
vật, có ở phần lớn các bộ phận của các loại thực vật bậc cao, đặc biệt là ở hoa
(màu vàng trong hoa hòe...).Về cấu trúc hoá học Flavonoid có khung cơ bản
là C6-C3-C6 gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 cacbon,
cấu trúc có thể là vòng kín hoặc mở.

Trong đa số trường hợp thì mạch 3 cacbon đóng vòng với vòng A và
tạo nên 1 dị vòng có oxy (vòng C). Tuỳ theo vị trí gắn của vòng bezen B vào
dị vòng ở C2 hoặc C3, ta có các hợp chất Flavonoid có nhân Flavan hay
8


Isoflavan. Tại các vòng có đính một hoặc nhiều nhóm hydroxyl tự do hoặc đã

thay thế một phần, vì vậy về bản chất chúng là các polyphenol có tính axit.
Trong thực vật, Flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai dạng: dạng tự do
(aglycol) và dạng liên kết với glucid (glycozit). Trong đó, dạng aglycol
thường tan trong các dung môi hữu cơ như ete, aceton, cồn nhưng hầu như
không tan trong nước, còn dạng glycozit thì tan trong nước nhưng không tan
trong các dung môi không phân cực như aceton, benzen, chloroform.
Flavonoid có cấu trúc mạch C6C3C6 đều có 2 vòng thơm. Tuỳ thuộc vào
cấu tạo của mạch C trong bộ khung C6C3C6, flavonoid được phân thành các
nhóm sau:
 Eucoflavonoid: Flavon, flavonol, flavanon, flavanol, chalcon,
antocyanin, anthocyanidin.
 Isoflavonoid: isolavon, isoflavanon, rotenoid.
 Neoflavonoid: calophylloid.
 Biflavonoid và triflavonoid.
1.3.1.1. Eucoflavonoid
Eucoflavonoid bao gồm các nhóm: anthocyanidin, flavan, flavan 3-ol,
flavan 4-ol, flavan 3,4-diol, flavanon, 3-hydroxy flavanon, flavon, flavonol,
dihydrochalcon, chalcon, auron.

9


1.3.1.2. Isoflavonoid
Isoflavonoid bao gồm nhiều nhóm khác nhau: isoflavan, isoflav-3-ene,
isoflavan-4-ol, isoflavanon, isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3arylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon, dihyroisochalcon,
homo-isoflavon.

Isoflavonoids tất cả không có màu sắc. Nó được tạo thành từ axetat
theo cơ chế đóng vòng với phenylalamine, cinnamate dẫn xuất được sát nhập
vào vòng B và C-2,3, và-4 của dị vòng.

10


1.3.1.3. Neoflavonoid
Neoflavonoid chỉ có giới hạn trong một số loài thực vật.
4-arylchroman
Ví dụ chất brasilin có trong cây tô mộc - Caesalpinia sappan
O

O

OH

OH

OH
OH
Brasilin

4-aril croman

4-aryl coumarin
Ví dụ calophyllolid trong cây mù u - Calophyllum inophyllum.

1.3.1.4. Biflavonoid và triflavonoid
Những flavonoid dimer và trimer đã có nói đến trong phần flavan-3-ol
và flavan 3,4 diol. Những hợp chất đó được gọi là proanthocyanidin. Ở đây là
những biflavonoid tạo thành từ flavon, flavanon, dihydroflavonol, chalcon,
dihydro chalcon, auron, isoflavon. Biflavon cấu trúc gồm 2 đơn vị flavon

được biết trước tiên. Chất điển hình là amentoflavon tạo thành từ 2 phân tử
apigenin nối theo dây nối cacbon-cacbon ở vị trí 3', 8''.

11


1.3.2. Các phương pháp định tính và định lượng
1.3.2.1. Định tính
Một số phản ứng định tính (chủ yếu với nhóm euflavonoid)
- Tác dụng của FeCl3: Tùy theo nhóm flavonoid và tùy theo số lượng vị
trí nhóm OH trong phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu.
- Tác dụng của kiềm. Nếu hơ một tổ chức thực vật như cánh hoa, nhát
cắt của gỗ hoặc tờ giấy thấm có nhỏ dịch chiết trên miệng lọ ammoniac thì có
màu vàng tăng lên tùy theo nồng độ flavonoid và tùy theo nhóm flavonoid.
Flavon và flavonol cho màu vàng sáng, anthocyanidin cho màu xanh dương.
Chalcon và auron có thể cho màu đỏ da cam. Một số nhóm khác như flavan3-ol, flavanon, Error! Hyperlink reference not valid.màu không thay đổi. Tuy
nhiên nếu thực hiện trong ống nghiệm với dung dịch alkali thì một số dẫn chất
flavan-3-ol lại cho màu vì dễ bị oxy hoá, còn flavanon dễ bị isomer hoá thành
chalcon nên nếu để một lúc lại cho màu vàng đậm đến đỏ.
- Tác dụng của H2SO4 đậm đặc: Axit H2SO4 khi nhỏ lên các dẫn chất
flavon, flavonol thì cho màu vàng đậm. Đối với chalcon và auron cho màu đỏ,
đỏ thắm, đỏ tươi. Error! Hyperlink reference not valid.cho màu đỏ cam rồi đỏ
thắm, có thể do chuyển flavanon thành chalcon.
- Phản ứng cyanidin (Phản ứng Shinoda hay Willstater)
Đây là phản ứng khử hay được sử dụng nhất để tìm sự có mặt của các
dẫn chất nhóm flavonoid. Dung dịch flavonoid trong ethanol, thêm bột Mg rồi
nhỏ từ từ HCl đậm đặc. Sau 1 đến 2 phút sẽ có màu đỏ cam, đỏ thẩm hoặc đỏ
tươi với các dẫn chất flavon, flavonol, flavanonol, flavanon. Màu sắc đôi khi
có thể bị thay đổi tùy theo loại, số lượng, vị trí nhóm thế ví dụ các dẫn chất
methoxy flavon (Tangeretin, Nobiletin) thì âm tính. Để phân biệt giữa

flavonoid glycosid và aglycon của chúng, Bryant đem lắc dung dịch có màu
với octanol, nếu màu ở lớp dưới lên hết ở lớp octanol, chất thử là aglycon,
nếu lớp octanol không màu, chất thử là glycosid.

12


- Tác dụng của chì acetat trung tính hoặc kiềm
Phản ứng thực hiện trên giấy thấm. Nhiều dẫn chất flavonoid tạo thành
muối hoặc phức có màu khi nhỏ thêm dung dịch chì acetat trung tính hoặc
kiềm. Màu phụ thuộc vào các dẫn chất flavonoid. Nếu tiến hành trong ống
nghiệm, chì acetat kièm cho tủa màu với hầu hết các flavonoid phenol còn chì
acetat trung tính tạo tủa với những dẫn chất có nhóm dihydroxyphenol.
- Phản ứng ghép đôi với muối diazoni
Các dẫn chất flavonoid có nhóm OH ở vị trí 7 có thể phản ứng với
muối diazoni để tạo thành chất màu azoic vàng cam đến đỏ.

1.3.2.2. Định lượng
Tuỳ vào từng loại Flavonoid mà ta có phương pháp định lượng cụ thể
khác nhau.
 Flavon hoặc flavonol
+ Phương pháp cân: ứng dụng khi nguyên liệu giàu có flavon hoặc
flavonol và dịch chất ít tạp chất.
+ Đo màu: bằng phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với muối
diazoni, tạo phức màu với AlCl3, Muối titan, chrom…
+ Phương pháp đo phổ tử ngoại.
 Chalcon
 Phương pháp phân tích HPLC (sắc kí lỏng cao áp). Với pha động
là dung dịch acetonitrile và acid H 3PO4 1% (phương pháp chuẩn trong
phân tích).

13


 Phương pháp so màu: có nhiều phương pháp so màu khác.
 Ciocalteu:

(hỗn

hợp

muối

phức

Phương

pháp

Folin

polyphosphotungstate- molydate).
+ Rất nhạy đối với chất khử, trong môi trường kiềm nhẹ thì sẽ bị khử
thành sản phẩm phức molydenium tungsten có màu xanh.
+ Sau đó đem đo độ hấp thu A (chalcon chỉ hấp thu mạnh ở 400 nm).
Phương pháp Prussian Blue:
+ Hỗn hợp thuốc thử là FeCl3 và K3Fe(CN) 6 bị khử bởi các hợp chất
phenol và tạo thành phức ferric (III) hexacyanoferrate (II) có màu xanh.
+ Để yên dung dịch trong 15 phút, sau đó đem đo độ hấp thu A.
 Phương pháp Diazotized

+ Dựa vào khả năng phản ứng ghép đôi với hợp chất diazo trong môi
trường acid tạo thành hợp chất có màu vàng đặc trưng.
+ Lắc đều, để yên dung dịch trong 1 giờ, sau đó đem đo độ hấp thu.
 HCl: Tạo thành hợp chất có màu đỏ: Phương pháp Vanillin
1.3.3. Các phương pháp chiết xuất flavonoid
Không có phương pháp chung nào để chiết xuất các flavonoid vì chúng
rất khác nhau về độ tan trong nước và các dung môi hữu cơ. Các flavonoid
glycosid thường dễ tan trong các dung môi phân cực, các flavonoid aglycon
dễ tan trong dung môi kém phân cực. Các dẫn chất flavon, flavonol có OH tự
do ở vị trí 7 hòa tan được trong dung dịch kiềm loãng, dựa vào đó để chiết.
Thông thường để chiết các flavonoid glycosid, người ta phải loại các chất
thân dầu bằng ether dầu hỏa sau đó chiết bằng nước nóng hoặc methanol hay
etanol. Cồn ở các nồng độ khác nhau và nước thường chiết được phần lớn các
flavonoid.
Đôi khi để tinh chế hoặc tách flavonoid, người ta dùng muối chì để kết
tủa.sau khi thu tủa người ta tách chì bằng cách sục dihydrosulfid

thì

flavonoid được giải phóng. Để phân lập từng chất flavonoid người ta áp dụng

14


phương pháp sắc ký cột.chất hấp phụ thông dụng nhất là polyamid. Có thể
dùng celluose, silicagel. Silicagel dùng để tách các chất flavanon, isoflavon,
flavonol. Muốn có đơn chất tinh khiết thì cần phải sắc ký cột lại vài lần .
1.3.4. Hoạt tính sinh học của lớp chất flavonoid
1.3.4.1. Hoạt tính chống oxy hóa [20-22]
Quá trình oxi hóa khử là quá trình quan trọng và phổ biến trong mọi cơ

thể sống. Bình thường, các gốc tự do được tạo ra trong cơ thể để chống lại một
số các loại virut và vi khuẩn gây bệnh, tuy nhiên khi ở hàm lượng cao, các gốc
tự do này phản ứng với protein, lipit, ADN là nguyên nhân làm tăng tốc độ quá
trình lão hóa cơ thể con người và là một trong các nguyên nhân của hơn 60
bệnh thường gặp: ung thư, các bệnh tim mạch như cao huyết áp, xơ vữa động
mạch, nhồi máu cơ tim, mất trí nhớ tuổi già và nhất là quá trình lão hóa cơ thể.
Vì vậy, việc đưa các chất chống oxy hoá như flavonoid vào cơ thể để bảo vệ tế
bào thì có thể ngăn ngừa hoặc hỗ trợ điều trị các loại bệnh này.
Flavonoid có hai tính chất quan trọng là bẫy gốc tự do và khả năng tạo
phức với kim loại. Cả hai chức năng kể trên đều có tính chất chống oxy hóa
bằng cách cho electron và bẻ gãy chuỗi phản ứng tạo gốc tự do. Cơ sở sinh
hóa quan trọng nhất để flavonoid thể hiện được hoạt tính chống oxy hóa của
chúng là khả năng kìm hãm các quá trình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởi các
gốc tự do hoạt động. Bên cạnh đó flavonoid có khả năng tạo phức với các ion
kim loại chuyển tiếp như Fe+2, Cu+2… để chúng không thể xúc tác cho phản
ứng Fenton sinh ra các gốc hoạt động nên có tác dụng như những chất xúc tác
ngăn cản các phản ứng oxy hóa. Các flavonoid có các nhóm hydroxyl ở vị trí
3, 5, 3', 4' có khả năng liên kết tốt với các ion kim loại tạo phức oxycromon,
oxycacbonyl hoặc 3', 4' orthodioxyphenol.
Khả năng ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do của một số
flavonoid theo thứ tự: myricetin > quercetin > rhammetin > morin >
diosmetin > naringenin > apigenin > catechin > 5,7 dihydroxy-3', 4', 5'
trimethoxy flavon > robinin > kaempferol > flavon.
15