nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử dna trong chọn tạo giống lúa thơm kháng bệnh bạc lá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

DƯƠNG XUÂN TÚ

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA
TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA THƠM
KHÁNG BỆNH BẠC LÁ

LUẬN ÁN TIẾN SỸ
CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN VÀ CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG

HÀ NỘI - 2015
1


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

DƯƠNG XUÂN TÚ

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA
TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA THƠM
KHÁNG BỆNH BẠC LÁ

CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN VÀ CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG
MÃ SỐ: 62 62 01 11

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS. PHAN HỮU TÔN

HÀ NỘI - 2015
2


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả
nghiên cứu được trình bày trong luận án này là trung thực, khách quan và chưa từng
dùng bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được
cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hải Dương, ngày 20 tháng 8 năm 2015
Tác giả luận án

Dương Xuân Tú

i


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của các
thầy, cô giáo, các tập thể và cá nhân cùng các bạn đồng nghiệp.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Phan Hữu Tôn, Học Viện
Nông nghiệp Việt Nam, người hướng dẫn khoa học, đã tận tình hướng dẫn và giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài cũng như hoàn chỉnh luận án
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Quản lý Đào tạo, Học Viện Nông nghiệp Việt
Nam; Các thầy cô giáo Bộ môn Di truyền và chọn giống cây trồng, Khoa Nông học,
Học Viện Nông nghiệp Việt Nam đã đào tạo, hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi để tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm,
các đồng nghiệp thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Cây lương thực và Cây
thực phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ cho tôi trong tiến hành thực hiện
các thí nghiệm của luận án.
Sau cùng là gia đình đã luôn bên cạnh động viên, tạo điều kiện về thời gian
và kinh phí để tôi hoàn thành luận án này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hải Dương, ngày 20 tháng 8 năm 2015
Tác giả luận án

Dương Xuân Tú

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt

vi

Danh mục các bảng

vii

Danh mục các hình

x

MỞ ĐẦU

1

1.

Tính cấp thiết

1

2.

Mục tiêu của đề tài

4

3.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

4

4.

Những đóng góp mới của đề tài

5

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

6

1.1.

Chọn tạo và phát triển lúa thơm chất lượng cao

6

1.2

Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa

9

1.2.1. Một số chỉ thị phân tử ADN được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu di

9

truyền và chọn tạo giống lúa
1.2.2. Một số kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa

1.3.

Nghiên cứu về mùi thơm và chỉ thị phân tử liên kết với gen qui định tính

13
15

trạng mùi thơm ở cây lúa
1.3.1. Chất tạo mùi thơm trong cây lúa

15

1.3.2. Di truyền tính trạng mùi thơm ở cây lúa

19

1.3.3. Chỉ thị phân tử liên kết với gen qui định tính trạng mùi thơm ở cây lúa

22

1.3.4. Kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa thơm

24

1.4.

Nghiên cứu về bệnh bạc lá và chỉ thị phân tử liên kết với gen qui định

28

tính kháng bệnh bạc lá ở cây lúa
1.4.1. Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa

28

1.4.2. Nguồn gen kháng và chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng

31

iii


1.4.3. Kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh

36

bạc lá
1.5.

Nghiên cứu về đa dạng di truyền nguồn gen ở cây lúa

41

Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

47

2.1.

Vật liệu nghiên cứu

47

2.2.

Nội dung nghiên cứu

50

2.3.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu

51

2.4.

Phương pháp nghiên cứu

52

2.4.1. Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn vật liệu lúa thơm kháng bệnh bạc lá

52

2.4.2. Lựa chọn chỉ thị phân tử liên kết với gen qui định mùi thơm và tính

56

kháng với các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa ở các tỉnh phía Bắc

2.4.3. Lai tạo các tổ hợp lai định hướng tạo vật liệu cho chọn lọc dòng lúa mới

58

theo mục tiêu
2.4.4. Sử dụng chỉ thị phân tử chọn cá thể mang kiểu gen thơm và gen kháng

61

bệnh bạc lá từ các thế hệ phân ly, kết hợp với đánh giá kiểu hình để chọn
dòng lúa mới theo mục tiêu
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.

63

Lựa chọn chỉ thị phân tử liên kết với gen qui định mùi thơm và tính

63

kháng với các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa ở các tỉnh phía Bắc
3.1.1. Lựa chọn chỉ thị phân tử liên kết với gen thơm ở cây lúa

63

3.1.2 Lựa chọn chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng với một số chủng vi

71

khuẩn gây bệnh bạc lá lúa phổ biến ở các tỉnh phía Bắc

Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn vật liệu lúa thơm kháng bệnh bạc lá

91

3.2.1. Đánh giá đặc điểm nông sinh học, mùi thơm và khả năng kháng bệnh

91

3.2.

bạc lá của các mẫu giống trong tập đoàn vật liệu
3.2.2 Đánh giá đa dạng di truyền các mẫu giống lúa vật liệu bằng sử dụng chỉ

106

thị phân tử DNA
3.2.3. Định hướng lựa chọn bố mẹ trong lai tạo giống lúa thơm kháng bệnh bạc

iv

111


lá cho các tỉnh phía Bắc
3.3.

Lai tạo các tổ hợp lai định hướng tạo vật liệu cho chọn lọc dòng lúa mới

113

theo mục tiêu
3.3.1. Mục tiêu chọn tạo giống lúa mới

113

3.3.2. Lựa chọn bố mẹ cho các tổ hợp lai

113

3.3.3. Kết quả lai tạo

115

3.4.

120

Sử dụng chỉ thị phân tử chọn cá thể mang kiểu gen thơm và gen kháng
bệnh bạc lá từ các thế hệ phân ly, kết hợp với đánh giá kiểu hình để chọn
dòng lúa mới theo mục tiêu

3.4.1. Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết để chọn lọc các thể mang gen mục tiêu

120

từ thế hệ sớm
3.4.2. Đánh giá và chọn lọc theo mục tiêu đối với các các dòng lúa mang gen

124

mục tiêu
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

140

DANH MỤC NHỮNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ LIÊN

142

QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO

143

PHỤ LỤC

155

v


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Nghĩa đầy đủ

2AP

2-acetyl-1-pyrroline

ADN

Acid Deribonucleic

AFLP
BAD

Amplified Fragment Length Polymorphism
Betain Aldehyde Dehydrogenase

BC

Backcross (lai lại)

ĐBSCL

Đồng bằng sông Cửu long

ĐBSH

Đồng bằng sông Hồng

cM

Centi Moocgarn

HAU

Hanoi Agricultural University

IRRI

International Rice Research Institute

FAO

Food and Agriculture Oganization

MABC

Molecular Assissted Backcrossing

MAS

Molecular Assissted Selection

NSLT

Năng suất lý thuyết

NST

Nhiễm sắc thể

NSTT

Năng suất thực thu

PCR

Polymerase Chain Reaction

PIC

Polymorphic Information Content

QTLs

Quantitative Trait Locus

RAPD

Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

SNP

Single Nucleotide Polymorphisms

SRFA

Selective Restriction Fragment Amplication

SSR

Simple Sequence Repeates hay Microsatellite

STS

Sequence Tagged Sites

TGST

Thời gian sinh trưởng

Xoo

Xanthomonas oryzae pv. oryzae

Viện CLT - CTP

Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm

vi


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Tên bảng

Trang

1.1

Một số chất tạo mùi thơm chính được tìm ra ở cây lúa

16

1.2

Nguồn gốc các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa phổ biến được thu
thập tại các tỉnh phía Bắc

30

2.1

Danh sách các dòng lúa vật liệu sử dụng trong nghiên cứu

47

2.2

Các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá sử dụng trong nghiên cứu

49

2.3

Các chỉ thị liên kết với gen thơm fgr trên NST số 8 sử dụng trong
nghiên cứu

49

2.4

Các chỉ thị liên kết với gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5 và Xa7 sử
dụng trong nghiên cứu

50

3.1

Nhận diện gen thơm fgr trong tập đoàn vật liệu lúa thơm bằng các chỉ
thị liên kết

65

3.2

Tỷ lệ phân ly kiểu gen thơm fgr ở quần thể F2 của các tổ lai được nhận
diện bằng sử dụng các chỉ thị phân tử

68

Kết quả phân tích kiểu gen thơm fgr bằng chỉ thị phân tử kết hợp vơi
đánh giá mùi thơm trong hạt ở quần thể phân ly F2

69

3.4

Phản ứng của các mẫu giống lúa vật liệu với một số chủng vi khuẩn
gây bệnh bạc lá trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo

72

3.5

Kiểu gen kháng và mức kháng/nhiễm với các chủng vi khuẩn gây
bệnh bạc lá ở thế hệ F1 của các tổ hợp lai

82

3.6

Tỷ lệ phân ly kiểu gen kháng Xa4, xa5 và Xa7 ở thế hệ F2 của các tổ
lai được nhận dạng bằng chỉ thị phân tử

85

3.7

Kiểu gen kháng được nhận diện bằng chỉ thị phân tử và mức
kháng/nhiễm với vi khuẩn gây bệnh bạc lá ở thế hệ F2 của các tổ hợp
lai

86

3.8

Kết quả kiểm tra gen kháng Xa4, xa5 và Xa7 bằng chỉ thị phân tử trên
các giống lúa vật liệu

89

3.9

Phân nhóm theo khả năng đẻ nhánh của các mẫu giống lúa vật liệu

93

3.3

3.10 Phân nhóm về chiều cao cây của các mẫu giống lúa vật liệu

94

3.11 Phân nhóm các mẫu giống lúa vật liệu theo tỷ lệ hạt chắc

96

vii


3.12 Phân nhóm theo năng suất của các mẫu giống lúa vật liệu

98

3.13 Nguồn gen kháng bệnh bạc lá trên các mẫu giống lúa vật liệu

102

3.14 Phân nhóm các mẫu giống lúa vật liệu theo hàm lượng amylose trong
gạo

105

3.15 Phân nhóm các mẫu giống lúa vật liệu theo nhiệt hóa hồ

105

3.16 Hệ số PIC, số allele thể hiện của 31 chỉ thị trên 51 mẫu giống lúa vật
liệu

107

3.17 Vật liệu lúa thơm, chất lượng cao được lựa chọn làm vật liệu cho các
tổ hợp lai định hường

111

3.18 Vật liệu lúa kháng bệnh bệnh bạc lá (nguồn gen kháng) được lựa chọn
làm vật liệu cho các tổ hợp lai định hướng

112

3.19

Các dòng giống lúa được lựa chọn làm vật liệu lai tạo

114

3.20

Danh sách các tổ hợp lai theo định hướng

115

3.21

Kiểm tra gen thơm fgr ở con lai F1 của các tổ hợp lai

116

3.22

Quan sát con lai thế hệ F1 của các tổ hợp lai

117

3.23

Kết quả lai tạo các tổ hợp lai 4 bố mẹ

118

3.24

Kết quả lai tạo các tổ hợp lai BC5 trong vụ mùa 2013 và đánh giá con
lai BC5F1 trong vụ xuân 2014

119

3.25

Kết quả chọn cá thể mang gen mục tiêu trên quần thể F3 của các tổ
hợp lai trong vụ mùa 2012

123

3.26

Bảng ký hiệu dòng chọn

124

3.27

Kết quả chọn dòng lúa thơm kháng bệnh bạc lá ở thế hệ F4 trong vụ
xuân 2013

124

3.28

Kết quả chọn dòng lúa thơm kháng bệnh bạc lá ở thế hệ F5 trong vụ
mùa 2013

125

3.29

Danh sách các dòng lúa thơm kháng bệnh bạc lá thế hệ F6 được chọn
trong vụ mùa 2013

126

3.30

Kết quả kiểm tra gen mục tiêu ở các dòng lúa chọn thế hệ F6

127

3.31

Mức kháng/nhiễm của các dòng giống lúa được chọn ở thế hệ F6 đối

129

viii


với một số chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá phổ biến
3.32

Kết quả đánh giá mùi thơm trong hạt của các dòng lúa mới

131

3.33

Đặc điểm sinh trưởng của các dòng lúa mới

132

3.34

Phản ứng của các dòng lúa mới với một số sâu bệnh hại chính

133

3.35

Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng lúa mới

135

3.36

Phân tích chất lượng của các dòng lúa mới

137

ix


DANH MỤC CÁC HÌNH
Tên hình

STT

Trang

1.1

Cấu tạo 2-acetyl-1-pyrroline

17

1.2

Sơ đồ mối quan hệ giữa BAD và sự tổng hợp 2AP

17

1.3

Sơ đồ cấu trúc của gen fgr

20

1.4

Một số hình ảnh điển hình về biểu hiện triệu chứng của bệnh bạc lá lúa

29

1.5

Bản đồ phân bố các chủng vi khuẩn Xoo ở miền Bắc Việt Nam

31

1.6

Vị trí của gen kháng Xa4 được định vị bằng chỉ thị R1505

33

1.7

Vị trí của gen kháng Xa4 được định vị với chỉ thị Npb78 và Npb181

34

1.8

Gen kháng xa5 được định vị với chỉ thị RG556 và RM390

34

1.9

Cấu trúc của gen kháng xa5 trên NST số 5

35

1.10 Gen Xa7 được định vị với chỉ thị liên kết gần nhất là M3 – M5

35

3.1

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR mẫu ADN của các giống, sử dụng các
chỉ thị RG28, RM342, RM223, L06 và BADH2

64

3.2

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR mẫu ADN cá thể F2 của tổ hợp lai
BT7 x Q5, HT1 x KD18. Sử dụng chỉ thị RG28, RM342, RM223, L06
và BADH2

67

3.3

Hình ảnh lây nhiễm của các chủng vi khuẩn gây bệnh trên một số mẫu
giống lúa nghiên cứu trong vụ xuân 2011

75

3.4

Hình ảnh điện di trên máy điện di mao quản sản phẩm PCR sử dụng
mồi Npb181 và RM224 trên các mẫu giống lúa

77

3.5

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi RG556 và RM122

78

3.6

Hình ảnh điện di trên máy điện di mao quản sản phẩm PCR sử dụng
mồi P3 và RM5509 trên các mẫu giống lúa

78

3.7

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng các mồi chỉ thị phân tử
Nbp181, RG556, RM122, P3 và RM5509 trên quần thể F2 của các tổ
hợp lai giữa các mẫu giống lúa nhiễm chuẩn và kháng chuẩn

84

3.8

Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa 51 giống lúa
nghiên cứu

110

x


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực hàng đầu ở Việt Nam, là cây
trồng truyền thống gắn bó lâu đời với người nông dân Việt Nam. Từ một nước phải

nhập khẩu lương thực trước những năm 80 của thế kỷ 20, Việt Nam đã vươn lên tự
túc được lương thực và là nước xuất khẩu gạo lớn thứ 2 thế giới trong những năm
đầu của thế kỷ 21. Đây là một bước tiến rất lớn trong sản xuất lúa gạo ở Việt Nam.
Tuy nhiên, gạo của Việt Nam phần lớn là không thơm, chất lượng thấp, giá xuất
khẩu thấp nhiều so với giá gạo xuất khẩu của các nước trong khu vực như Thái Lan,
Ấn Độ. Bên cạnh đó, nhu cầu tiêu dùng nội địa đối với gạo thơm, chất lượng cao
ngày càng tăng cả về số lượng và chất lượng. Thực tế đối với ngành sản xuất lúa gạo
của ta hiện nay là mới chỉ phát triển về mặt số lượng, còn hạn chế về mặt chất lượng,
sản phẩm có tính cạnh tranh thấp dẫn đến hiệu quả sản xuất thấp. Do vậy, chọn tạo
và phát triển các giống lúa thơm, chất lượng cao phục vụ cho sản xuất là yêu cầu cấp
thiết trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa ở Việt Nam hiện nay.
Bộ giống lúa thơm, chất lượng hiện đang được sản xuất tại các vùng miền ở
Việt Nam còn đơn điệu, khả năng thích ứng kém, năng suất thấp và đặc biệt là khả
năng chống chịu kém với một số sâu bệnh hại chính như rầy nâu, bệnh đạo ôn, đặc
biệt là bệnh bạc lá … do vậy nên sản xuất mang tính rủi ro cao, hiệu quả sản xuất
thấp, khó mở rộng diện tích. Hiện tại, ở các tỉnh phía Nam, người dân vẫn gieo trồng
các giống lúa chất lượng có nguồn gốc từ Thái như Khaodatmali, Jasmin mặc dù
những giống lúa này chưa thực sự phù hợp với điều kiện sinh thái của Việt Nam. Tại
các tỉnh phía Bắc, các giống lúa chất lượng cao được trồng vẫn chủ yếu là các giống
cổ truyền như Tám thơm, Dự… là những giống cảm quang, dài ngày, chống chịu
sâu bệnh kém, năng suất thấp và rủi ro cao; Các giống lúa được nhập nội từ Trung
Quốc như Bắc thơm số 7 (BT7), Hương thơm số 1 (HT1) và các giống lúa chọn tạo
trong nước như T10, AC5, TL6... là những giống lúa chất lượng, ngắn ngày, có thể
trồng được cả 2 vụ nhưng năng suất không cao, khả năng chống chịu sâu bệnh kém
đặc biệt là bệnh bạc lá vi khuẩn.
1


Một trở ngại lớn trong sản xuất lúa thơm, chất lượng cao hiện nay là sâu bệnh
hại, đặc biệt là bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo). Đây

là loại bệnh hại nguy hiểm nhất đối với cây lúa ở khu vực Châu Á (Mew et al.,1993).
Bệnh bạc lá lúa được ghi nhận làm hao hụt năng suất lúa ở Châu Á từ 50% đến 80%
(Khush and Ogawa, 1989). Ở Việt Nam, bệnh bạc lá lúa phổ biến ở tất cả các vùng
trồng lúa trong cả nước, từ vùng núi cao đến vùng ven biển, gây thiệt hại đến 60%
năng suất lúa hoặc có thể mất trắng. Bộ giống lúa chất lượng được trồng phổ biến
hiện nay ở các tỉnh phía Bắc như BT7, AC5, T10 nhiễm bệnh bạc lá rất nặng. Trong
những năm gần đây, tại một số tỉnh thuộc khu vực phía Bắc như Hà Nội, Nam Định,
Hải Dương đã hạn chế hoặc không đưa vào cơ cấu sản xuất đối với giống lúa BT7
và T10 trong vụ mùa. Đây là nguyên nhân hạn chế đến mục tiêu tăng sản lượng lúa
chất lượng tại các tỉnh phía Bắc trong những năm qua.
Công tác chọn tạo giống lúa của ta hiện nay vẫn chủ yếu là phương pháp
truyền thống dựa trên lai tạo và chọn lọc kiểu hình. Phương pháp này có hạn chế là
mất nhiều thời gian, kém hiệu quả, không chính xác vì biểu hiện kiểu hình còn phụ
thuộc vào môi trường, đặc biệt là rất khó để chọn đồng thời nhiều tính trạng mong
muốn. Để chọn tạo được giống lúa kháng hiệu quả và bền vững với nhiều chủng vi
khuẩn gây bệnh bạc lá thì giống lúa đó phải mang nhiều gen kháng với nhiều chủng
hoặc phải chứa 2 hoặc 3 gen kháng hữu hiệu. Bằng phương pháp chọn lọc truyền
thống thì rất khó để thực hiện, tốn nhiều thời gian để tạo ra được giống lúa kháng.
Phương pháp này càng khó hơn khi chúng ta tiến hành chọn giống lúa đồng thời có
mùi thơm và kháng bệnh bạc lá. Hiện nay, chỉ thị phân tử DNA đã được sử dụng như
là một công cụ hỗ trợ có hiệu quả trong các chương trình chọn tạo giống cây trồng
trên thế giới. Bằng phân tích kiểu gen kiểm soát các tính trạng mong muốn các nhà
chọn giống có thể tiến hành chọn ở bất cứ giai đoạn sinh trưởng nào của cây trồng,
chọn lọc có thể tiến hành ngay ở các thế hệ sớm và đặc biệt là có thể chọn được
giống mang nhiều tính trạng mong muốn trong cùng thời điểm.
Những kết quả nghiên cứu đã được công bố trên thế giới về di truyền tính
trạng mùi thơm và tính kháng bệnh bạc lá ở cây lúa là cơ sở cho việc nghiên cứu
2

ứng dụng chỉ thị DNA trong chọn tạo giống lúa thơm, kháng bệnh bạc lá. Đối với
mùi thơm ở cây lúa, chất 2-acetyl-1-pyrroline (2AP) đã được công bố là chất chính
(key compound) tạo nên mùi thơm ở cả các giống lúa thơm, đặc trưng là mùi thơm
của giống Jasmine và Basmati (Buttery et al., 1983; Bradbury et al., 2005a). Chất
2AP được xác định do gen fgr nằm trên NST số 8 kiểm soát tổng hợp (Huang et al.,
1994; Bradbury et al., 2005a). Gen fgr đã được tìm ra các chỉ thị liên kết với những
khoảng cách di truyền khác nhau và trên các nguồn vật liệu khác nhau (Ahn et al.,
1992; Louriex et al., 1996; Garland and Henry, 2001; Bradbury et al., 2005b). Đối
với bệnh bạc lá lúa, hiện nay trên thế giới đã được công bố có trên 30 chủng vi
khuẩn Xoo gây bệnh trên lúa (Nino-Liu et al., 2006). Ở Việt Nam cũng đã có một số
nghiên cứu về các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa tại các vùng trồng lúa trong
cả nước (Furuya et al., 2003; Phan Hữu Tôn và Bùi Trọng Thủy, 2004; Nguyễn Thị
Liên và cs., 2012). Các gen kháng với các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá tại các
vùng trồng lúa trên thế giới luôn được nghiên cứu và cập nhật. Theo Chun et al.
(2012), đã phát hiện trên 36 gen kháng chính với các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc
lá trên các giống lúa trồng và lúa hoang dại trên thế giới. Di truyền của 36 gen
kháng này đã được công bố, trong đó 28 gen đã được định vị trên các NST và có chỉ
thị liên kết đã được đưa ra. Ở Việt Nam, các gen kháng Xa4, xa5, Xa7 và Xa21 đã
được công bố là có khả năng kháng hữu hiệu với các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc
lá lúa ở các tỉnh phía Bắc (Phan Hữu Tôn và Bùi Trọng Thủy, 2004; Taura et al.,
2004; Lã Vĩnh Hoa và cs., 2010; Vũ Hồng Quảng và cs., 2011). Đây là những công
bố có giá trị trong nghiên cứu ứng dụng chỉ thị DNA trong các chương trình chọn
tạo giống lúa thơm kháng bệnh bạc lá. Tuy nhiên, những chỉ thị phân tử liên kết với
gen mùi thơm và gen kháng bệnh bạc lá đã được công bố với những khoảng cách di
truyền khác nhau và trên những nguồn vật liệu khác. Do vậy, khi ứng dụng các chỉ
thị phân tử đã được công bố trong các chương trình chọn tạo giống trên nguồn vật
liệu cụ thể thì cần phải tiến hành kiểm tra và lựa chọn chỉ thị có độ tin cậy và chính
xác cao.
3

Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa thơm, chọn tạo giống lúa
kháng bệnh bạc bạc lá ở Việt Nam cũng đã được tiến hành ở một số cơ quan nghiên
cứu. Tuy nhiên, việc làm này vẫn còn rời rạc, chưa thành một hệ thống, chưa có
nhiều kết quả đưa ra. Đặc biệt, việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống
lúa đồng thời mang gen mùi thơm và các gen kháng bệnh bạc lá vẫn còn là mới ở
Việt Nam hiện nay.
2. Mục tiêu của đề tài
Lựa chọn chỉ thị phân tử liên kết với gen mùi thơm và gen kháng hữu hiệu
với các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá phổ biến, có độ chính xác cao sử dụng trong
lai tạo và chọn lọc giống lúa thơm kháng bệnh bạc lá cho các tỉnh phía Bắc
Chọn tạo được một số dòng lúa thơm kháng bệnh bạc lá (mang gen thơm và 1
hoặc 2 gen kháng hữu hiệu với các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá), năng suất khá
cho phát triển sản xuất và làm vật liệu cho công tác lai tạo tiếp.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học
Cung cấp dẫn liệu thông tin khoa học về di truyền gen kiểm soát mùi thơm,
gen kháng bệnh bạc lá ở cây lúa và khả năng ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết trong
chọn tạo giống lúa thơm kháng bệnh bạc lá.
Khẳng định hiệu quả của phương pháp lai tạo và chọn lọc kiểu hình kết hợp
với sử dụng chỉ thị phân tử DNA chọn kiểu gen mục tiêu (MAS) trong chọn tạo
giống lúa thơm kháng bệnh bạc lá.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Chọn tạo được 15 dòng lúa thơm mới, mang 1 – 2 gen kháng bệnh bạc lá
(trong các gen Xa4, xa5 và Xa7), thể hiện kháng tốt với các chủng vi khuẩn gây
bệnh bạc lá phổ biến ở các tỉnh phía Bắc. Các dòng lúa này được sử dụng làm vật
liệu lai tạo trong các chương trình chọn giống lúa thơm kháng bệnh bạc lá tiếp theo.
Trong đó, 2 dòng lúa là T7.19-2 (mang gen thơm fgr và gen kháng Xa7) và dòng
T25.82-3 (mang gen thơm fgr và gen kháng xa5) đáp ứng được mục tiêu chọn tạo về
4

thời gian sinh trưởng, năng suất, chất lượng, mùi thơm và kháng bệnh bạc lá sẽ được
tiếp tục phát triển cho sản xuất tại các tỉnh phía Bắc trong thời gian tới.
4. Những đóng góp mới của đề tài
Đã lựa chọn được các chỉ thị phân tử liên kết với gen mùi thơm (fgr) và gen
kháng bệnh bạc lá (Xa4, xa5 và Xa7) phù hợp để sử dụng cho chọn tạo giống lúa
thơm, kháng bệnh bạc lá trên nguồn vật liệu nghiên cứu của đề tài.
Đã đánh giá đa dạng di truyền nguồn vật liệu để làm cơ sở chọn bố mẹ trong
các phép lai tạo giống lúa thơm và kháng bệnh bạc lá ở Việt Nam
Chọn tạo được 2 dòng lúa thơm, kháng bệnh bạc lá là T7.19-2 và T25.83-3
đáp ứng được mục tiêu tạo giống, có triển vọng sản xuất lúa chất lượng tại các tỉnh
phía Bắc.

5


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Chọn tạo và phát triển lúa thơm chất lượng cao
Nghiên cứu chọn tạo và phát triển lúa thơm chất lượng cao là một trong những
ưu tiên hàng đầu của hầu hết các nước sản xuất lúa gạo trên thế giới. Do nhu cầu sử
dụng gạo thơm tăng cao trong trong những năm gần đây, người tiêu dùng sẵn sàng
trả giá cao cho gạo thơm, chất lượng. Hai nhóm lúa thơm nổi tiếng trên thế giới là
Jamine và Basmati có giá gạo thương phẩm thường cao gấp 2 – 3 lần so với giá gạo
của các giống lúa thường không thơm. Giá gạo của lúa Jasmine và Basmati cao là
bởi vì không chỉ do nhu cầu mùi thơm và đặc thù của hạt gạo mà còn là lượng cung
cấp có hạn (Bradbury, 2009). Mặc dù Ấn Độ là vùng cung cấp gạo Basmati lớn nhất,
chiếm khoảng một phần ba diện tích trên thế giới nhưng năng suất so với giống lúa
không thơm là rất thấp (Garg et al., 2006). Năng suất của giống lúa Jasmine cũng rất

thấp, một phần do di truyền của giống, phần nữa là do các giống lúa Jasmine rất mẫn
cảm với các loại sâu bệnh hại (Lorieux et al., 1996; Toojinda et al., 2005). Mặt khác,
giống lúa thơm cũng rất kén vùng trồng, điều này sẽ ảnh hưởng đến sự mở rộng diện
tích. Lúa thơm sẽ thể hiện mùi thơm cao hơn khi được trồng trong điều kiện thích
hợp. Hầu như giống lúa Jasmine ở Thái Lan được trồng trong vùng Isan, Đông Bắc
của Thái Lan, đây là vùng đất cát, nhiễm mặn, thường bị ngập úng và hạn nên năng
suất lúa rất thấp, bù lại mùi thơm rất cao, gạo chất lượng cao và trở thành thương
hiệu đặc thù của Thái lan (Itani et al., 2004). Ảnh hưởng của môi trường dẫn đến
năng suất thấp ở các giống lúa thơm là nguyên nhân dẫn đến việc hạn chế sản xuất
các giống lúa này ở Mỹ và những nước sản xuất lúa gạo truyền thống khác
(Bradbury, 2009). Một số nước có nền sản xuất lúa gạo truyền thống thường tập
trung khai thác theo hướng năng suất cao với hệ thống tưới tiêu và tăng cường phân
bón, nhưng mùi thơm và chất lượng bị giảm. Nhiều nước trong mạng lưới xuất khẩu
gạo trên thế giới như Mỹ cũng phải nhập khẩu một khối lượng lớn gạo thơm từ Thái
Lan, Ấn Độ và Pakistan bởi vì họ không thể sản xuất được gạo thơm chất lượng cao
tại đất nước của họ (Boriss, 2006). Từ khi bắt đầu cuộc cách mạng xanh, hầu hết các
chương trình chọn giống lúa trên thế giới tập trung vào cải tiến khả năng chống chịu

6


sâu bệnh hại và đặc biệt là tăng năng suất hạt. Để tăng sự quan tâm và phát triển trở
lại các giống lúa thơm trên thế giới, thời gian gần đây các nỗ lực trong công nghệ
sinh học và chọn giống đã tập trung vào tăng năng suất và khả năng chống chịu của
các giống lúa thơm nhưng vẫn giữ mùi thơm và chất lượng của các giống lúa này.
Việc làm này là rất khó đối với giống lúa Basmati bởi với một số chỉ tiêu chất lượng
so với các giống lúa thơm chất lượng khác như là độ kéo dài hạt khi nấu, độ mềm và
chất lượng nấu nướng (Garg et al., 2006). Mặc dù đã có những cố gắng, nhưng kết
quả của một số chương trình chọn tạo giống trong việc cải tạo năng suất và khả năng
chống chịu của giống lúa Basmati bị giới hạn bởi phương pháp chọn lọc truyền

thống (Bradbury, 2009). Một số tác giả sử dụng phương pháp chọn giống đột biến
(Soomro et al., 2003) hoặc sử dụng chuyển gen (Garg et al., 2006) nhưng vẫn chưa
có giống lúa thơm nào được cải tiến di truyền được đưa ra (Bradbury, 2009). Mặc dù
còn có những hạn chế về kết quả trong cải tiến các giống lúa thơm so với các giống
lúa không thơm, nhưng kết quả của các chương trình chọn giống với mục đích cải
tạo tăng năng suất cho giống lúa Jasmine ở Thái Lan đã thu được kết quả đáng kể,
thành công hơn so với việc cải tiến năng suất của giống lúa Basmati (Toojinda et al.,
2005).
Tại Nhật Bản, để thỏa mãn nhu cầu của người tiêu dùng, việc nghiên cứu và
chọn tạo giống lúa chất lượng cao đã được ưu tiên hàng đầu và hầu hết các giống lúa
trong sản xuất đều là các giống thơm có hạt gạo trong, ít bạc bụng, hàm lượng
amylose thấp (từ 15-20%), cơm mềm, dẻo, ngon. Đây cũng là xu hướng chung đã và
đang diễn ra tại các nước sử dụng lúa gạo là cây lương thực chính như Đài Loan,
Hàn Quốc. Tại Trung Quốc, các giống lúa dạng Japonica cho cơm mềm, dẻo ngon
đã và đang được phát triển mạnh (Chen et al., 2006). Tại Úc, trong chương trình
nghiên cứu về lúa, chính phủ Úc cũng đã dành tới 49% kinh phí cho nghiên cứu về
lúa để nghiên cứu và chọn tạo giống mới, đặc biệt là các giống lúa cho năng suất cao,
ổn định trong điều kiện thay đổi thời tiết, khí hậu và có chất lượng cao phù hợp tiêu
chí xuất khẩu, nhất là cho thị trường Nhật Bản (Blakeney, 2008). Nghiên cứu và sản
xuất lúa chất lượng cao cũng đặc biệt được quan tâm tại Thái Lan. Để tăng cường
tính cạnh tranh trên thị trường lúa gạo thế giới, Thái Lan đã có những chương trình
nghiên cứu lớn, hàng năm đầu tư hàng triệu đô la Mỹ cho việc phát triển các giống
7


lúa thơm, hạt dài và có chất lượng cao (Vanavichit et al., 2004). Thái Lan là nước
xuất khẩu gạo thơm, chất lượng cao lớn nhất và có giá cao nhất trên thế giới, khoảng
700 USD/tấn, cao hơn gạo chất lượng của Mỹ và Việt Nam là 34 USD và 150USD
theo thứ tự (FAOSTAT, 2013).
Ở Việt Nam, lúa thơm, chất lượng cao được trồng trên cả ba miền Bắc, Trung,

Nam. Miền Nam có các giống lúa thơm chất lượng nổi tiếng như Nàng Thơm Chợ
Đào, Nàng Hương, Tàu Hương; miền Trung nổi tiểng với lúa Gié An Cựu và Lúa
thơm; Miền Bắc đặc trưng với nhóm lúa Tám, Dự và gần đây có giống BT7, T10,
AC5 cũng được xếp vào nhóm lúa thơm chất lượng cao. Tập đoàn lúa Tám của Việt
Nam là đặc sản độc đáo nổi tiếng từ ngàn xưa với hạt gạo nhỏ, trong, cơm dẻo, thơm
ngon. Một số giống bản địa ở Việt Nam yêu cầu vùng đất trồng phù hợp như giống
Nàng Thơm Chợ Đào chỉ trồng ở xã Mỹ Lệ, huyện Cần Đước, tỉnh Long An; giống
Séng Cù ở vùng cao biên giới tỉnh Lào Cai, Mường Khương, Bát Xát, Simakai thì
cơm mới ngon (Nguyễn Văn Luật, 2009). Chọn tạo giống lúa thơm chất lượng cao
phục vụ cho sản xuất trong những năm vừa qua đã có mục tiêu, định hướng rõ ràng
và được tiến hành ở nhiều cơ quan nghiên cứu trên cả nước như Viện Cây lương
thực và Cây thực phẩm, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Lúa đồng bằng sông
Cửu long, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam... Kết quả cũng đã đưa ra được một số
giống lúa thơm, chất lượng cao phục vụ cho sản xuất. Kết quả nghiên cứu của đề tài
“Nghiên cứu phát triển một số giống lúa đặc sản cho một số giống lúa đặc sản cho
một số vùng sinh thái của Việt Nam” giai đoạn 2001-2005, đã cải tiến và tạo ra một
số giống lúa thơm như Nếp 87, OM3536, OM2524, HT1, Nàng Thơm chợ đào dòng
5 và một số giống khác như nếp DT12, nếp DS101, nếp PD2, TK106, LT2...
(Nguyễn Hữu Nghĩa, 2006). Các giống lúa thơm chất lượng cao mới chọn tạo như
Hương Cốm do Học Viện Nông nghiệp Việt Nam chọn tạo; giống lúa CL8, CL9 do
Viện Di truyền nông nghiệp chọn tạo; giống lúa HT9, AC5, T10, HDT8 do Viện
Cây lương thực và Cây thực phẩm chọn tạo đã được đưa vào sản xuất tại các tỉnh
phía Bắc trong thời gian gần đây. Các giống lúa OM43-26, OM39, OM201,
OM2031, OM1490, OMCS2000, OM4900 do Viện Lúa Đồng bằng Sông Cửu long
chọn tạo cũng đã đang được đưa vào sản xuất và phát triển trong sản xuất tại các
tỉnh phía Nam. Tuy nhiên, cho đến nay các giống lúa thơm chất lượng mới chọn tạo
8


vẫn còn hạn chế như chất lượng chưa cao, chỉ ở mức trung bình nên rất khó để cạnh

tranh với chất lượng của các giống lúa như Jasmine, Basmati... đã có thương hiệu
trên thế giới; Khả năng chống chịu sâu bệnh hại kém, thích ứng hẹp nên độ rủi ro
cao. Thực tế sản xuất hiện nay cho thấy: các giống lúa thơm chất lượng cao mới
được chọn tạo trong thời gian được đưa ra nhiều về số lượng giống nhưng diện tích
của các giống này trên sản xuất là rất ít. Tại các tỉnh phía Bắc, các giống lúa thơm
chất lượng cao mới chọn tạo vẫn chưa thể thực sự thay thế được giống lúa BT7, là
một giống lúa chất lượng cao có nguồn gốc từ Trung Quốc đã bộc lộ rất nhiều hạn
chế về khả năng chống chịu sâu bệnh hại, đặc biệt là bệnh bạc lá trong vụ mùa. Đây
là thách thức lớn đối với các nhà chọn tạo giống lúa ở Việt Nam trong thời gian tới.
1.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa
Trong những năm gần đây, chỉ thị phân tử DNA đã được đưa vào sử dụng
phổ biến trong chọn tạo giống trên nhiều đối tượng cây trồng theo các mục tiêu khác
nhau. Trong đó, cây lúa là đối tượng cây trồng được các nhà nghiên cứu quan tâm và
đưa ra nhiều kết quả nghiên cứu ứng dụng theo các mục tiêu như: năng suất, chất
lượng, ngắn ngày, chống chịu với điều kiện bất thuận (abiotic stress) và sâu bệnh hại
(biotic stress). Với những kết quả đã đạt được, vai trò của chỉ thị phân tử DNA đã
được khẳng định như là một công cụ mới giúp cho công tác chọn tạo giống cây
trồng có hiệu quả hơn, chính xác hơn và nhanh hơn.
1.2.1. Một số chỉ thị phân tử DNA được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu di
truyền và chọn tạo giống lúa
1.2.1.1. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA: Chỉ thị đa hình chiều dài các đoạn cắt giới
hạn - RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Chỉ thị này được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên
cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người (Botstein et al., 1980). Ở thực
vật, chỉ thị này lần đầu tiên được áp dụng trong nghiên cứu gen kiểm soát tổng hợp
ARN ribosom trong vùng cấu trúc nhân của lúa mì (Appels and Dvorak, 1982). Ở
lúa, chỉ thị RFLP được sử dụng nhiều trong lập bản đồ QTLs cho các tính trạng chất
lượng và năng suất lúa (Lin et al., 1995), các gen kháng đạo ôn (Hittalmani et al.,
1995), gen kháng rầy nâu (Hirabayashi and Ogawa, 1995), các gen kháng bệnh bạc
9

lá (Yoshimura et al., 1998; Yer and McCouch, 2004; He et al., 2006) và nhiều các
tính trạng khác như khả năng chịu mặn, hạn… Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội, có
khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng một locus gen, do vậy có thể phân biệt
được các cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử. Đây là đặc điểm ưu việt của loại chỉ thị
RFLP. Hạn chế của phương pháp này là tốn nhiều thời gian cần có mẫu dò đánh dấu
và enzyme cắt giới hạn, đòi hỏi nhiều trang thiết bị phòng thí nghiệm. Đặc biệt là
cần một lượng lớn DNA.
1.2.1.2. Chỉ thị phân tử dựa trên kĩ thuật phản ứng chuỗi trùng phân (Polymerase
Chain Reaction - PCR)
Kỹ thuật PCR được Kary Mullis phát minh ra năm 1985 và đã nhanh chóng
được sử dụng hầu hết ở các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới. Phản ứng dựa trên
nguyên tắc tổng hợp DNA nhờ enzym DNA Polymerase chịu nhiệt (Taq, Pfu…) với
sự có mặt của đoạn DNA khuôn mẫu, DNA mồi, các nucleotit (dNTP) gồm 4 loại:
dATP, dCTP, dGTP, dTTP và ion Mg2+ hoạt động như một chất xúc tác (Saiki and
Gelfand, 1989). Tuỳ theo bản chất của những đoạn mồi sử dụng mà có những hệ
thống chỉ thị đặc trưng gồm chỉ thị STS, RAPD, SSR, AFLP, SNP, cụ thể như sau:
Chỉ thị STS (Sequence Tagged Sites): Chỉ thị STS dựa trên phản ứng PCR,
được đưa ra nhờ việc xác định trình tự 2 đầu mỗi đoạn của mẫu dò dùng trong RFLP
phát hiện được đa hình liên kết gen, chọn một đoạn đặc hiệu để thiết kế mồi dùng
cho phản ứng PCR. Đây là loại chỉ thị đồng trội có thể phân biệt được gen ở trạng
thái đồng hợp tự và dị hợp tử. Mỗi đoạn gen khác nhau sẽ có trình tự nucleotide
khác nhau, tùy từng vị trí mà mồi có thể gắn vào những đoạn khác nhau, nếu ghép 2
đầu của một đoạn DNA nhất định thì sẽ được nhân lên đa hình thể hiện qua chiều
dài đoạn được xác định qua điện di. Trong nhiều trường hợp, đoạn nhân lên có kích
thước bằng nhau nhưng có trình tự nucleotide khác nhau, muốn phát hiện phải dùng
đến enzyme cắt giới hạn. Enzyme này nhận biết được các trình tự khác nhau đó và
cắt ở những vị trí nhất định sẽ tạo ra được các đoạn khác nhau, điện di sẽ xác định
được đa hình. Trình tự mồi STS phát hiện sự biến đổi ở mức allen của gen trong

10


phân tử DNA. Nhược điểm chỉ thị STS là đòi hỏi phải biết trước được một vài trình
tự DNA của gen (Olson et al., 1989).
Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA): Loại chỉ thị này dựa
trên phản ứng PCR, nhân bội những đoạn DNA trong hệ gen, sử dụng đoạn mồi đơn
lẻ, ngẫu nhiên (random primers) dài khoảng 9-10 nucleotit ở nhiệt độ bắt cặp thấp
(khoảng 370C) (Williams et al., 1990). RAPD sinh ra những chỉ thị trội bởi sự có
mặt hay vắng mặt những băng DNA đặc trưng, vì vậy không phân biệt được thể dị
hợp tử. Đây là hạn chế của loại chỉ thị này so với chỉ thị đồng trội RFLP. Mặc dù
vậy, chỉ thị này vẫn là một công cụ hữu hiệu trong việc lập bản đồ di truyền ở những
dòng nhị bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai trở lại. Lợi thế của loại chỉ
thị này là không cần biết những thông tin về trình tự (William et al., 1993). Do chỉ
thị RAPD có hạn chế là độ nhạy bị phụ thuộc vào điều kiện của phản ứng, đôi khi
kết quả không lặp lại được, nên người ta đã khắc phục bằng cách nhân dòng những
băng RAPD đặc hiệu, xác định trình tự của chúng rồi thiết kế những đoạn mồi dài
khoảng 20bp từ cả hai đầu và gọi là chỉ thị SCARs (Sequence - Characterized
Amplified Region).
Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism): Loại chỉ thị này
được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu lập bản đồ gen và xác định chỉ thị phân tử
liên kết gen. Kĩ thuật tạo ra các loại chỉ thị này được gọi là nhân chọn lọc những
đoạn cắt giới hạn (Selective Restriction Fragment Amplication - SRFA). Phương
pháp này có thể phát hiện được sự có mặt của những đoạn cắt giới hạn bất kỳ (Vos
et al., 1995). Kĩ thuật AFLP có thể tạo ra số lượng chỉ thị di truyền nhiều nhất so với
các kĩ thuật khác đối với mỗi tổ hợp mồi. Lượng DNA tổng số tiêu tốn cho kĩ thuật
này lại rất ít. Đây là một phương pháp có hiệu quả cả trong nghiên cứu đa dạng di
truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ di truyền. Tuy nhiên, chỉ thị AFLP chỉ có
thể phát hiện được một trạng thái alen của gen, do đó không thể phân biệt giữa thể

đồng hợp tử và dị hợp tử và giá thành cho nghiên cứu là tương đối cao.
Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeates hay Microsatellite): là chỉ thị nghiên
cứu đa hình những đoạn DNA lặp lại đơn giản, đơn vị lặp từ 1 – 6 nucleotide. Bản
chất đa hình của SSR được sinh ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của hệ gen nhờ
sử dụng 2 đoạn mồi chặn biên 2 đầu với trình tự của vùng lặp lại. Giá trị của SSR là
11


ở chỗ nó sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và
phân biệt được trạng thái alen khác nhau của gen (chỉ thị đồng trội), có thể phân biệt
được đồng hợp tử và dị hợp tử, dễ dàng phát hiện bằng PCR. Ở thực vật, tần số và
số lượng SSR đã được xác định trên các cây rừng nhiệt đới, cây bắp cải (Lagercrantz
et al., 1993), lúa mì và 34 giống cây trồng khác (Morgante and Oliveri, 1993). Hiện
nay, nghiên cứu sàng lọc (screening) thư viện genome của lúa cho thấy có khoảng
25.000 chỉ thị SSR. Chỉ thị này được sử dụng nhiều trong nghiên cứu da dạng di
truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ gen với độ chính xác cao, đơn giản và rẻ
tiền (McCouch et al., 2002; Liu et al., 2002...)
Chỉ thị SNP (Single Nucleotide Polymorphisms): Chỉ thị đa hình nucleotide
đơn (Single Nucleotide Polymorphisms - SNP) có thể phân biệt sự khác nhau trong
phân tử DNA ở mức độ từng nucleotit trong cấu trúc di truyền giữa các cá thể hoặc
NST. Chỉ thị SNP được tìm ra đầu tiên trong bộ gen người, khoảng 1.250 bp là sàng
lọc được 1 SNP (Liu, 2007) và ở lúa thì cứ khoảng 200 - 700bp xuất hiện 1 SNP
(Kenneth, 2009). Hiện nay, ứng dụng của chỉ thị SNP đang rất phổ biết trong lĩnh
vực nghiên cứu về di truyền, lập bản đồ gen và xem xét tương quan của các gen liên
kết trên toàn bộ genome tới các tính trạng nghiên cứu (Jin et al., 2010). Những bộ
chỉ thị SNP với mật độ phân bố trên toàn bộ genome này được rất nhiều viện nghiên
cứu và công ty trên thế giới thiết kế và ứng dụng tiến hành hoàn toàn tự động và đạt
thông hiệu rất cao (Shen et al., 2004). Trong những năm gần đây những nghiên cứu
về di truyền thông qua các công nghệ genotyping ứng dụng chỉ thị SNP đã được tiến
hành trên rất nhiều loài như là ở nho (Lijavetzky et al., 2007), ở lúa (Caicedo et al.,

2009; Elizabeth et al., 2009), ở đậu tương (Hyten et al., 2009), ở lúa mạch (Close et
al., 2009), ở ngô (Yan et al., 2009), ở lúa mì (Akhunov et al., 2009).
Trong ứng dụng chỉ thị DNA liên kết để chọn gen qui định một tính trạng nào
đó thì việc lựa chọn chỉ thị là quan trọng quyết định đến sự thành công. Sự lựa chọn
này dựa trên một số đặc điểm ưu tiên chính như: độ chính xác của chỉ thị (liên kết
chặt với gen mục tiêu), dễ sử dụng, tuân thủ tự động hóa cao, khả năng lặp lại cao,
chi phí thấp. Bên cạnh đó, sự lựa chọn chỉ thị còn phải phụ thuộc vào thiết bị máy
móc của phòng thí nghiệm và trình độ của cán bộ nghiên cứu. Một số loại chỉ thị
phân tử DNA được đưa ra với các đặc điểm như sau:
12


RFLP

RADP

AFLP

SSR

SNP

10

0,2

0,5-1,0

0,5

0,5

Cao

cao

T. bình

T. bình

cao

1,0 –3,0

1,5-50

Sử dụng (Easy of use)

Khó

Dễ

Dễ

Dễ

Dễ

Khả năng tự động hóa (Amenable

Thấp

T. bình

T. bình

Cao

Cao

Khả năng lặp lại (Reproducibility)

Cao

không

Cao

Cao

Cao

Chi phí (Cost per analysis)

Cao

Thấp

T. bình

Thấp

Thấp

Đặc điểm
DNA yêu cầu (µg) (DNA
required)

Chất lượng DNA (DNA quality)
Số locus đa hình phân tích

20 - 100 1,0 – 3,0

1,0

(Number of polymorph loci
analysed)

to automation)

Nguồn: Korzun (2009)
1.2.2. Một số kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa
Hiện nay, một số gen kiểm soát một số tính trạng chính trong cây lúa như
thời gian sinh trưởng, năng suất, chất lượng, khả năng chống chịu sâu bệnh hại
(biotic stress) và các điều kiện bất thuận (abiotic stress)... đã được định vị trên NST
bằng các chỉ thị phân tử ADN. Các chỉ thị phân tử ADN này được sử dụng như là
một công cụ hỗ trợ đắc lực trong công tác lai tạo và chọn lọc giống lúa mới.
Những năm gần đây, các nhà nghiên cứu thuộc IRRI đã thành công trong việc
chuyển gen quý vào các giống lúa trồng bằng phương pháp lai trở lại và chọn lọc
nhờ chỉ thị phân tử (MABC). Kết quả của những nghiên cứu này đã tạo ra được các

giống lúa vừa có năng suất cao, vừa có khả năng chống chịu với các điều kiện môi
trường bất thuận, đặc biệt là trong việc quy tụ nhiều gen kháng bệnh bạc lá vào cùng
một giống như dòng IRBB64 mang bốn gen kháng Xa4, xa5, Xa7 và Xa21, dòng
IRBB63 mang các gen xa5, Xa7, xa13 (Le et al., 2006).
Tại Trung Quốc, các nhà chọn giống đã sử dụng phương pháp MABC để
chuyển thành công hai gen Xa21 và Xa4 vào dòng phục hồi Mianhui 725 cho tổ hợp
lúa lai Shuhui 207. Sử dụng MABC với các chỉ thị phân tử liên kết pTA21 và AB9,
nhóm tác giả này cũng đã chuyển thành công gen Xa21 vào dòng Minghui63. Tương
tự, các tác giả cũng đã thu được dòng phục hồi Minghui 63 mang tổ hợp gen kháng

13