5 phan 5 huong dan lay mau benh pham

CHƯƠNG TRÌNH CHỐNG LAO QUỐC GIA
BÖnh viÖn lao vµ bÖnh phæi
-------------------@--------------------

CÔNG TÁC XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN TRONG
CHƯƠNG TRÌNH CHỐNG LAO QUỐC GIA

NGHỆ AN NĂM 2016

Mục lục:

1. Xét nghiệm AFB nhuộm soi trực tiếp - phương pháp nhuộm ZN
2. Xét nghiệm AFB nhuộm soi trực tiếp – phương pháp nhuộm huỳnh quang
3. Nuôi cấy vi khuẩn lao trên môi trường đặc
1


4. Nuôi cấy vi khuẩn lao trên môi trường lỏng
5. Xét nghiệm sinh học phân tử Genexpert
6. Hướng dẫn lấy đờm làm xét nghiệm
7. Qui trình đóng gói ba lớp

2


XÉT NGHIỆM AFB NHUỘM SOI TRỰC TIẾP
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ZIEHL – NEELSEN

1. Mục đích
Mô tả kỹ thuật nhuộm soi trực tiếp tìm AFB (Acid –Fast- Bacilli) theo phương
pháp nhuộm Ziehl- Neelsen (ZN) sử dụng kính hiển vi quang học

2. Chuẩn bị
Bệnh phẩm
- Bệnh phẩm đờm đạt chất lượng: có nhày mủ, thể tích mẫu ít nhất 2 ml.

Đờm nhày

Đờm mủ

Có máu

Nước bọt

- Cặn bệnh phẩm sau ly tâm
- Khuẩn lạc mọc trên môi trường đặc
- Canh khuẩn từ tuýp MGIT (+)
Yêu cầu về hành chính
- Mẫu phải đựng trong cốc/tuýp theo qui định
- Mẫu phải đầy đủ thông tin trên thân dụng cụ chứa mẫu
- Phiếu XN phải đủ thông tin người bệnh
- Thông tin trên mẫu và phiếu xét nghiệm phải phù hợp.
Trang thiết bị dụng cụ
Chuẩn bị hóa chất nhuộm ZN
- Dung dịch nhuộm màu Ziehl’s Carbol Fuchsin 0,3%
- Dung dịch tẩy màu cồn acid HCl 3%
- Dung dịch nhuộm nền xanh Methylen 0,3%

3


3. Nguyên lý

Mycobacteria (trong đó có vi khuẩn lao) có lớp vách sáp dày nên khó bắt
màu với thuốc nhuộm thông thường và có tính kháng cồn - acid. Phương
pháp nhuộm Ziehl do thuốc nhuộm có chứa phenol và hơ nóng khi nhuộm
nên fuchsin ngấm qua lớp vách của vi khuẩn, khi tẩy màu bằng dung dịch
cồn-acid 3%, AFB vẫn giữ được màu đỏ Fuchsin trong khi các tế bào và vi
khuẩn khác bị tẩy mất màu đỏ, bước nhuộm nền tạo sự tương phản giữa AFB
màu đỏ trên màu nền xanh sáng.
4. Các bước thực hiện
4.1Chuẩn bị
- Sử dụng lam kính mới, không có vết xước hoặc mốc, đã lau cồn 950 và
làm khô
- Cập nhật thông tin bệnh nhân vào sổ xét nghiệm trước khi thực hiện kỹ
thuật
- Số xét nghiệm thống nhất từ sổ xét nghiệm, phiếu xét nghiệm, cốc đờm
và lam kính. Số xét nghiệm gồm 2 phần: tử số là số thứ tự trong sổ xét
nghiệm, mẫu số là số thứ tự của mẫu (Ví dụ: 120/1, 120/2). Đối chiếu và
kiểm tra các thông tin cẩn thận tránh nhầm lẫn. Số xét nghiệm theo thứ tự
từ đầu năm đến cuối năm.
- Dùng bút chì đen HB viết số xét nghiệm lên đầu mờ của lam kính. Không
chạm tay vào phần lam kính còn lại.
- Sắp xếp cốc đờm và lam kính theo thứ tự tránh nhầm lẫn .
- Khởi động tủ ATSH trước khi sử dụng ít nhất 15 phút để thanh lọc khí.
- Sắp xếp dụng cụ/vật liệu cần thiết vào tủ ATSH: máy sấy tiêu bản (bật
máy ở 50-600C), que dàn tiêu bản, bô can chứa chất sát khuẩn, giá đựng
tiêu bản, khay có lót khăn, giấy thấm dung dịch sát khuẩn, lam kính và
cốc đờm.
4.2

Dàn tiêu bản

4.3

Cố định tiêu bản
- Hơ nóng tiêu bản qua ngọn lửa gaz (đèn cồn) 3 lần mỗi lần khoảng 3 giây
(mặt tiêu bản ngửa lên trên)

4


4.4 Nhuộm tiêu bản:

3 bước

Bước 1: Nhuộm màu
cm
-

Xếp tiêu bản theo thứ tự trên giá nhuộm, mỗi tiêu bản cách nhau ít nhất 1
Phủ dung dịch Fuchsin 0,3% kín toàn bộ bề mặt tiêu bản
Hơ nóng tiêu bản từ phía dưới đến khi Fuchsin bốc hơi
Để ít nhất 5 phút.
Nếu Fuchsin tràn ra ngoài, bổ sung thêm Fuchsin và hơ nóng lại.
Rửa tiêu bản nhẹ nhàng cho trôi hết thuốc nhuộm.
Nghiêng tiêu bản cho ráo nước.

Bước 2: Tẩy màu
-

Phủ đầy dung dịch acid - cồn lên tiêu bản, để 3 phút.
Rửa nước. Nghiêng tiêu bản cho ráo nước.

Sau khi rửa, các tiêu bản không còn màu hồng
Nếu tiêu bản vẫn còn màu hồng, tẩy lại lần 2, thời gian từ 1 – 3 phút cho
đến khi hết màu hồng, rửa lại nước.

Bước 3: Nhuộm nền
-

Phủ đầy dung dịch xanh Methylene 0,3% lên tiêu bản .
Để 30 giây - 1 phút.
Rửa nước, nghiêng tiêu bản cho ráo nước.

Chú ý: cho vòi nước chảy nhẹ nhàng từ đầu tiêu bản. KHÔNG xối vòi nước
thẳng vào vết dàn.
4.5 Làm khô tiêu bản
-

Xếp tiêu bản lên giá để khô tự nhiên, hoặc bằng máy sấy tiêu bản

Chú ý: KHÔNG làm khô tiêu bản bằng cách hơ tiêu bản qua ngọn lửa hay
dùng khăn hoặc giấy để thấm khô.

5


4.6 Đọc tiêu bản

4.7 Nhận định kết quả
Hình ảnh AFB từ bệnh phẩm: AFB có hình que mảnh, hơi cong, bắt màu đỏ,
đứng riêng biệt hay xếp thành từng cụm, dễ nhận biết trền xanh. Đếm số lượng
AFB và ghi kết quả theo qui định như Bảng 1.

XÉT NGHIỆM AFB NHUỘM SOI TRỰC TIẾP
6


PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HUỲNH QUANG ĐÈN LED
Mô tả kỹ thuật nhuộm soi trực tiếp tìm AFB (Acid –Fast- Bacilli) theo phương
pháp nhuộm huỳnh quang sử dụng kính huỳnh quang đèn LED.
Bệnh phẩm
Đờm và cặn bệnh phẩm sau li tâm (không nhuộm huỳnh quang chủng vi khuẩn).
Trang thiết bị và vật liệu
Giống phương pháp nhuộm Ziehl – Neelsen. Thay thế KHV quang học bằng
KHV huỳnh quang đèn LED
Nguyên lý
Mycobacteria có lớp vách sáp dày, khi nhuộm Auramine thấm vào vi
khuẩn do có phenol trong dung dịch nhuộm, khi tẩy màu bằng dung dịch acidcồn AFB vẫn giữ được màu vàng của auramine do có tính kháng acid, nhuộm
nền bằng xanh methylene để tạo màu nền tối, thuần nhất cho ánh sáng phát
quang. Khi soi bằng ánh sáng huỳnh quang AFB phát quang màu vàng sáng
tương phản rõ ràng trên nền tối.
Kính hiển vi huỳnh quang có ưu điểm là soi nhanh hơn KHV quang học
(ánh sáng trắng) với nhuộm Ziehl – Neelsen và đặc biệt có giá trị ở những
phòng xét nghiệm có khối lượng công việc lớn. Kĩ thuật này cũng có độ nhạy
cao hơn ở những mẫu bệnh phẩm ít vi khuẩn vì số vi trường được quan sát
nhiều hơn.

7


Hình ảnh AFB trên tiêu bản nhuộm huỳnh quang

NUÔI CẤY VI KHUẨN LAO TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC
8


Vi khuẩn lao có khả năng phát triển trên môi trường đặc tạo thành khuẩn lạc
có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Dựa vào thời gian mọc, hình thể, tính chất
khuẩn lạc, tính kháng acid và tính chất sinh vật hóa học để định danh
M.tuberculosis.
Tính chất khuẩn lạc
- Khuẩn lạc M.tu berculisis điển hình dạng khô sù xì giống xúp lơ,màu trắng
ngà,mọc chậm sau 07 ngày
-

Khuẩn lạc nhóm Mycobacteria không phải lao (NTM) dạng S trơn bóng,
nhày, có (hoặc không) sắc tố, có thể mọc nhanh trong vòng 7 ngày.
Hình ảnh khuẩn lạc MTB

Hình ảnh khuẩn lạc của một số loài NTM

NUÔI CẤY VI KHUẨN LAO TRÊN MÔI TRƯỜNG LỎNG

9


Vi khuẩn lao có khả năng phát triển trên môi trường lỏng tạo thành hạt
vụn có thể nhìn thấy bằng mắt thường hoặc phát hiện bằng hệ thống máy nuôi
cấy tự động. Thời gian cho kết quả dương tính từ 4 – 14 ngày tùy thuộc số
lượng vi khuẩn có trong mẫu lâm sàng.
Nguyên lý:
Một hợp chất phát quang nhạy cảm với oxy được gắn vào lớp silicon ở đáy

tuýp môi trường. Lượng oxy hòa tan trong môi trường làm mờ đi sự phát
quang hoặc phát quang rất ít. Khi vi khuẩn sinh trưởng sẽ tiêu thụ oxy, hợp chất
phát quang thoát ức chế sẽ phát quang, mức độ phát quang tương ứng với mật
độ vi khuẩn có trong môi trường, máy báo dương khi mật độ vi khuẩn trong
tuýp khoảng 105 đến 106 / 1ml.
Máy BATEC báo kết quả tự động 60 phút /lần bằng bằng tín hiệu đèn sáng
và âm thanh:
Hình ảnh tuýp MGIT dương

Hình ảnh tiêu bản nhuộm ZN từ tuýp MGIT (+)

AFB cuộn thừng

AFB vụn

Nhiễm vi khuẩn

AFB kết thành đám

10


XÉT NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ
QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN NHANH VI KHUẨN LAO VÀ ĐỘT BIẾN
KHÁNG RIFAMPICIN TRÊN GENEXPERT MTB/RIF
GeneXpert MTB/RIF (Cepheid, Sunnyvale, California) là một hệ thống
đóng, tự động hoàn toàn nhằm xác định vi khuẩn lao và gen kháng Rifampicin
trực tiếp từ bệnh phẩm. Trong đó có một bộ phận (Cartridge) chứa tất cả các
bước từ tách chiết DNA, chạy phản ứng nhân gen đặc hiệu (PCR) của vi khuẩn
lao và đột biến kháng thuốc rifampicin từ mẫu bệnh phẩm sau thời gian 2 tiếng.

Máy trả kết quả kép: cùng một kết quả cho biết bệnh phẩm có vi khuẩn lao hay
không và vi khuẩn lao có kháng thuốc rifampicin hay không.
Quy định về loại bệnh phẩm
Thực hiện thường quy xét nghiệm Xpert MTB/RIF chỉ áp dụng với bệnh
phẩm đờm. Các loại bệnh phẩm khác có thể áp dụng trong nghiên cứu đánh giá.
Quy định về chất lượng và số lượng bệnh phẩm
- Bệnh phẩm đờm có thể tích tối thiểu là 1ml, tối đa 3ml và có chất nhầy mủ,
không được lẫn các dị vật (máu, mảnh vụn thức ăn, đất,...)
- Bệnh phẩm được chứa trong tuýp 50ml, vặn chặt nắp.
- Tuýp bệnh phẩm được ghi đầy đủ thông tin theo quy định lấy mẫu (sổ tay
lấy mẫu)

11


HƯỚNG DẪN LẤY ĐỜM LÀM XÉT NGHIỆM
Vật liệu:
- Xét nghiệm trực tiếp: Cốc nhựa sạch, miệng rộng, nắp xoáy, nhựa trong dẻo,
cứng, khó vỡ, dễ thiêu hủy.- Bút dạ (loại chịu nước)
Nơi lấy đờm:
- Có khu vực riêng cho người bệnh lấy đờm:
+ Lấy ngoài trời nơi thoáng khí, ít người qua lại
+ Hoặc xây buồng lấy đờm đảm bảo thông khí và tính riêng tư cho người
bệnh
- Có bảng hướng dẫn lấy đờm và hình ảnh minh họa
- Có bồn rửa tay.
Số lượng mẫu và thời điểm lấy đờm
- Xét nghiệm phát hiện: Để chẩn đoán bệnh lao phổi cần lấy 2 mẫu đờm tại
chỗ: mẫu 1 lấy ngay sau khi khám bệnh, mẫu 2 sau mẫu 1 khoảng 2 giờ. Nếu
người bệnh có điều kiện thuận lợi lấy mẫu đờm buổi sáng để xét nghiệm là

tốt nhất.
- Xét nghiệm theo dõi: Mỗi lần xét nghiệm theo dõi lấy 1 mẫu đờm buổi sáng.
thời điểm xét nghiệm đờm theo dõi tuỳ thuộc vào công thức điều trị và chỉ
định của thầy thuốc.
Hướng dẫn lấy đờm
- Phát cho người bệnh cốc đựng đờm đã ghi đủ thông tin vào thân cốc đờm.
- Giải thích cho người bệnh về mục đích lấy đờm, lấy đờm trước khi điều trị là
tốt nhất
-

Hướng dẫn cách khạc đờm đạt chất lượng, cách mở và đậy nắp cốc đờm và
chỉ dẫn người bệnh tới nơi qui định lấy đờm.

- Hướng dẫn người bệnh cách lấy đờm:
+ Súc miệng sạch bằng nước thường trước khi lấy đờm
+ Hít vào thật sâu, thở ra thật mạnh. Làm 2 – 3 lần.
+ Ho khạc đờm sâu từ trong lồng ngực.
+ Mở nắp cốc đờm đưa lại gần miệng, nhổ đờm vào trong cốc.
12


+ Đậy nắp cốc đờm, xoáy chặt nắp
-

Trường hợp khó khạc đờm hỗ trợ bằng cách vỗ rung, uống thuốc long
đờm hoặc khí dung nước muối ấm.

-

Xét nghiệm viên hoặc điều dưỡng viên phải kiểm tra chất lượng mẫu

đờm, nếu chỉ có nước bọt, hoặc số lượng quá ít, yêu cầu người bệnh ho
khạc thêm đến khi lấy được mẫu đảm bảo chất lượng.

Lưu ý: Tiêu chuẩn mẫu đờm đạt chất lượng
+ Số lượng đờm 3-5 ml
+ Có nhày mủ
+ Không lẫn thức

13


HƯỚNG DẪN LẤY ĐỜM LÀM XÉT NGHIỆM

Không khạc đờm từ mũi hoặc miệng

Vặn chặt nắp

1. Hít vào thật sâu
2. Thở ra thật mạnh
3. Hít vào thật sâu, thở ra thật mạnh (lần 2)
4. Hít sâu, thở mạnh lần 3, ho khạc thật sâu từ trong phổi
5. Đặt cốc đờm (đã mở nắp) vào sát miệng, nhổ đờm vào đáy cốc. Vặn chặt nắp.
6. Nộp cốc đờm và phiếu xét nghiệm cho người hướng dẫn (NVYT). Không đặt cốc
đờm lên phiếu xét nghiệm.
Lưu ý: Nếu lượng đờm quá ít (< 2ml) và không có chất nhày mủ, làm lại các
bước trên để có mẫu đờm đạt chất lượng.

Đờm tốt sẽ chẩn đoán bệnh chính xác!

14

QUI TRÌNH ĐÓNG GÓI BA LỚP
Thực hiện thao tác đóng gói trong tủ an toàn sinh học.
+ Lớp thứ nhất (tuýp chứa mẫu): tuýp nhựa loại 50ml chứa đờm hoặc tuýp
chủng vi khuẩn (nuôi cấy đặc hoặc lỏng)
+ Gói tuýp mẫu bằng giấy vệ sinh để làm lớp đệm và thấm hút nếu có rò rỉ
mẫu.
+ Gói tiếp bên ngoài bằng màng nilon mỏng.
+ Cho tiếp vào túi nilon dày có khóa (lớp thứ hai). Khóa chặt túi nilon và
buộc bên ngoài bằng chun vòng.
+ Cho gói mẫu vào hộp vận chuyển mẫu (lớp thứ ba). Hộp vận chuyển mẫu
có thể là hộp lạnh hoặc hộp xốp có túi đá lạnh (nếu vận chuyển mẫu bệnh
phẩm cho nuôi cấy).
+ Cho phiếu xét nghiệm và danh sách vận chuyển mẫu vào túi nilon kín và
đặt vào trong hộp vận chuyển mẫu, đóng kín hộp, dán băng dính kín.
+ Dán nhãn (ghi đủ thông tin nơi gửi và nhận). Dán nhãn cảnh báo cần thiết.

Sơ đồ đóng gói 3 lớp
Lớp thứ nhất: Tuýp đựng đờm hoặc
chủng nuôi cấy
Lớp vật liệu thấm hút
Màng nilon mỏng

Lớp thứ hai: Túi nilon dày loại có khóa

Lớp thứ ba: Hộp lạnh hoặc hộp xốp

15

Hình ảnh mô tả các bước đóng gói mẫu
Đóng gói tuýp đựng đờm

Đóng gói tuýp chủng nuôi cấy

Gói lớp thứ nhất bằng giấy vệ sinh

Bao gói bằng màng nilon mỏng

Cho vào túi nilon dày loại có khóa

16


Khóa chặt túi nilon và buộc bên ngoài bằng chun, vòng

Cho đứng mẫu vào hộp vận chuyển mẫu

Đặt Phiếu xét nghiệm và danh sách mẫu vào túi nilon có khóa, cho vào hộp vận chuyển mẫu, đóng kín
hộp

Dán nhãn ghi rõ địa chỉ nơi gửi, nơi nhận và nhãn cảnh báo cần thiết

17


18