Nghiên cứu chiết xuất naringin từ cùi bưởi ( citrus grandis l)

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRỊNH QUỐC TUẤN
Mã sinh viên: 1201674

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT NARINGIN
TỪ CÙI BƢỞI (Citrus grandis L.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRỊNH QUỐC TUẤN
Mã sinh viên: 1201674

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT NARINGIN
TỪ CÙI BƢỞI (Citrus grandis L.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:
TS. Nguyễn Văn Hân
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp dƣợc

HÀ NỘI - 2017

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng và sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn
Hân, tổ Chiết xuất- bộ môn Công nghiệp dược- Trường đại học Dược Hà Nội đã
tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn DS. Trần Trọng Biên và tập thể cán bộ, giảng viên
của bộ môn Công nghiệp dược Trường đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ
và tạo điều kiện giúp em hoàn thành đề tài này.
Trong quá trình học tập, triền khai làm đề tài và những gì đạt được hôm nay,
em xin cảm ơn công lao giảng dạy và hướng dẫn của thầy cô giáo trường đại học
Dược Hà Nội.
Và em cũng cũng xin cảm ơn gia đình, bạn bè, anh chị những người luôn bên
em, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập, nghiên cứu, hoàn thành đề tài
tại Trường đại học Dược Hà Nội này.
Dù đã có nhiều cố gắng, song đề tài còn có thể có những thiếu sót. Kính mong
nhận được sự chia sẻ và nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của các thầy cô
giáo.
Em xin trân trọng cảm ơn.
Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2017
Sinh viên
Trịnh Quốc Tuấn



MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN ............................................................................ 2
1.1. Vài nét về cây Bưởi.................................................................................. 2
1.1.1. Tên gọi, vị trí phân loại ...................................................................... 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật .............................................................................. 2
1.1.3. Bộ phận dùng, trồng trọt -thu hái ..................................................... 2
1.1.4. Thành phần hóa học ......................................................................... 3
1.1.5. Công dụng ......................................................................................... 3
1.2. Đại cương về hoạt chất naringin ............................................................. 3
1.2.1. Công thức, tên khoa học ................................................................... 3
1.2.2. Tính chất vật lý ................................................................................. 4
1.2.3. Tính chất hóa học ............................................................................. 4
1.2.4. Tác dụng dược lý............................................................................... 5
1.3. Một số nghiên cứu về chiết xuất naringin............................................... 5
CHƢƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 8
2.1. Nguyên vật liệu ....................................................................................... 8
2.1.1. Nguyên liệu ....................................................................................... 8


2.1.2. Hóa chất, thiết bị .............................................................................. 8
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 9
2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 9
2.3.1. Phương pháp xác định hàm ẩm ...................................................... 9
2.3.2. Phương pháp định tính naringin trong nguyên liệu cùi bưởi ........ 9
2.3.3. Phương pháp định lượng naringin ............................................... 10
2.3.4. Phương pháp chiết xuất ................................................................. 13
2.3.5.Xác định cấu trúc sản phẩm ........................................................... 13
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN ............... 14
3.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn biểu thị mối liên hệ giữa mật độ quang
và nồng độ naringin...................................................................................... 14
3.2. Kết quả định tính và định lượng citroflavonoid trong nguyên liệu ...... 15

3.2.1. Kết quả định tính citroflavoid trong nguyên liệu ........................... 15
3.2.2. Kết quả định lượng citroflavonoid trong nguyên liệu .................... 16
3.3. Kết quả nghiên cứu chiết xuất citroflavonoid từ cùi bưởi ................... 17
3.3.1. Lựa chọn dung môi chiết xuất......................................................... 17
3.3.2.Lựa chọn phương pháp chiết xuất ................................................... 18
3.3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quy trình chiết xuất ................. 19
3.4. Quy trình chiết xuất và tinh chế naringin từ cùi bưởi .......................... 24
3.5.1. Tiến hành chiết xuất........................................................................ 24
3.5.2. Tinh chế naringin từ sản phẩm chiết xuất. ..................................... 25
3.5. Xác định cấu trúc sản phẩm .................................................................. 26
CHƢƠNG IV: BÀN LUẬN………………………………………………..30


CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………..32
TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………33


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Phần viết tắt

Phần viết đầy đủ

DĐVN IV

Dược Điển Việt Nam IV

EtOH 96%

Ethanol 96%

IR

Phổ hồng ngoại (Infra-red)

LDL

Lipoprotein tỷ trọng thấp

NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

STT

Số thứ tự

UV-VIS

Phổ tử ngoại - khả kiến (Ultraviolet Visible)


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Danh mục hóa chất sử dụng

8

Bảng 3.1. Mối liên quan giữa mật độ quang và nồng độ naringin (µg/ml)

14

Bảng 3.2. Kết quả định lượng citroflavonoid trong nguyên liệu cùi bưởi

16

Bảng 3.3. Kết quả ảnh hưởng của dung môi chiết xuất

17

Bảng 3.4. Kết quả ảnh hưởng của phương pháp chiết xuất

18

Bảng 3.5. Kết quả ảnh hưởng của thể tích dung môi ngâm nguyên liệu

20

Bảng 3.6. Kết quả ảnh hưởng của thời gian ngâm nguyên liệu

21

Bảng 3.7. Kết quả ảnh hưởng của số lần ngâm nguyên liệu

23

Bảng 3.8. Kết quả ảnh hưởng của pH tới quá trình kết tinh sản phẩm

24

Bảng 3.9. Phổ 1H-NMR

28

Bảng 3.10. Phổ 13C-NMR

29


DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình 1.1. Công thức naringin
Hình 3.1. Phổ UV-VIS của naringin chuẩn nồng độ 11,71 µg/ml trong

2
14

ethanol 96%
Hình 3.2. Đường chuẩn biếu thị mối liên quan giữa mật độ quang và

15

nồng độ naringin
Hình 3.3. Kết quả định tính hóa học nguyên liệu

15

Hình 3.4. Sắc ký đồ của dịch chiết nguyên liệu

16

Hình 3.5. Ảnh hưởng của thời gian ngâm tới khối lượng sản phẩm và

21

hiệu suất chiết
Hình 3.6. Sản phẩm chiết naringin từ cùi bưởi

26

Hình 3.7. Sắc ký đồ của sản phẩm

26

Hình 3.8. Phổ UV-VIS của naringin sản phẩm nồng độ 12 µg/ml trong

27

ethanol 96%
Hình 3.9. Cấu tạo của naringin

27

Sơ đồ 3.1. Sơ đồ quy trình chiết naringin từ cùi bưởi bằng aceton

25


ĐẶT VẤN ĐỀ
Chi Citrus là một chi lớn thuộc họ Cam. Các cây thuộc chi này phần lớn

là các cây ăn quả cung cấp các chất dinh dưỡng như vitamin C, acid citric
[3]...Ngoài ra, vỏ quả Citrus còn là nguyên liệu cho dược học cổ truyền với
các vị thuốc dân gian quen thuộc như: chỉ thực, chỉ xác, trần bì, thanh bì.
Ngày nay, nhiều nghiên cứu trong nước và thế giới đã chứng minh tác
dụng chữa bệnh của các flavonoid có trong vỏ quả Citrus. Các nghiên cứu đã
tìm thấy sự có mặt của hơn 60 flavonoid trong vỏ của các loài trên, trong đó
có naringin [11]. Naringin là một flavonoid tìm thấy hàm lượng cao trong vỏ
quả loài bưởi với tác dụng như chống lão hóa, làm giảm cholesterol, ngăn
ngừa cao huyết áp, giảm tai biến tim mạch, làm lành vết loét dạ dày, phòng
chống ung thư và làm đẹp da [15], [20], [21] .
Hiện nay, nước ta vẫn phải nhập khẩu nhiều thuốc mà thành phần có chứa
naringin với giá cao. Với công nghệ trong nước hiện nay thì hoàn toàn có khả
năng sản xuất được những thuốc đó từ nguồn nguyên liệu có sẵn. Như vậy,
nếu khai thác tốt nguồn nguyên liệu này, sẽ phục vụ tốt được nhu cầu trong
nước về thuốc có chứa hoạt chất naringin. Để cung cấp naringin nguyên liệu
đầu vào cho quá trình sản xuất thuốc đó, chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên
cứu chiết xuất naringin từ cùi bưởi (Citrus grandis L.)” với mục tiêu:
1- Chiết xuất naringin từ cùi bưởi Citrus grandis L.
2- Tinh chế, nhận dạng naringin có trong cùi bưởi.

1


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về cây Bƣởi
1.1.1. Tên gọi, vị trí phân loại
Citrus grandis (L.) Osbeck
Tên gọi khác: Citrus maxima ( Burm.) và Citrus decumana L.
Họ Cam (Rutacea), Chi Citrus [2], [3], [4].
1.1.2. Đặc điểm thực vật

Bưởi là loại cây ăn quả. Cây nhỡ cao từ 5-15 m, gai nhỏ mọc ở kẽ lá. Lá
có hình trứng hoặc bầu dục đấy tròn hoặc hình tim, mép lá nguyên hoặc xẻ
thùy nông, lấm tấm nhiều túi tinh dầu, cuống là có hình cánh tim ngược, rộng
cỡ 7 cm.
Hoa mọc đơn độc ở nách lá hoặc từng chùm vài bông hoa, hoa mẫu 5,
cánh hoa trắng, nhị 25- 30, bầu noãn có 11-16 noãn. Quả mọng hình cầu hay
hình lê, đường kính 10-30 cm, màu vàng xanh nhiều túi tinh dầu, vỏ dày 1- 4
cm, múi to màu hồng hoặc vàng nhạt. Hạt vàng nhạt hoặc trắng, dẹt và có 1
phôi.
Bưởi được trồng ở khu vực Đông Nam Á, Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ,
các nước vùng Địa Trung Hải. Ở Việt Nam bưởi được trồng ở hầu hết các
tỉnh. Những nơi nổi tiếng bưởi ngon: Đoan Hùng (Phú Thọ), Mê Linh (Vĩnh
Phúc), Phúc Trạch, Hương Khê (Hà Tĩnh), Thanh Trà (Huế), Biên Hòa (Đồng
Nai), Diễn (Hà Nội) [3], [4].
1.1.3. Bộ phận dùng, trồng trọt -thu hái
Hầu hết các bộ phận của cây bưởi ( quả, hoa, lá) đều có nhiều ứng dụng
trong thực phẩm, y học...Trong đề tài này sẽ tiến hành nhiên cứu với cùi bưởi
( phần trắng của vỏ bưởi) – chứa lượng lớn hoạt chất naringin.
Bưởi được nhân giống bằng hạt, ghép mắt và chiết cành. Ở Đông Nam Á
và Việt Nam chủ yếu là phương pháp chiết cành [4].

2


1.1.4. Thành phần hóa học
Trong phần ăn được (các tép bưởi) có chứa: nước (89%), protein(0,5%),
lipid (0,4%), đường (9,3%), vitamin B1 (0,07%), viatmin B2 (0,01%) và
vitamin C (44%).
Vỏ có chứa tinh dầu 15%, pectin và các hợp chất flavonoid (4,67%). Trong
đó naringin có hàm lượng cao. Flavonoid : Naringin (2,39%), hesperidin

(0,03%), neohesperindin (0,03%), diosmin (0,01%),rutin (0,02%).
Hạt có chứa pectin. Hoa có chứa tinh dầu (0,01%).
Tinh dầu vỏ quả bưởi là chất lỏng màu vàng nhạt, mùi thơm, có hằng số:
d30: 0,8417, aD30: +103,62o, nD30: 1,4702. Thành phần chính là limonen (90
%), terpenalcol (2,5%), sesquiterpenalcol (3%).
Tinh dầu vỏ bưởi Việt Nam có thành phần chính là limonen (41,45 - 84,62
%), myrcen (8,28 - 50,66%). Các thành phần terpenalcol và aldehyd tồn tại ở
hàm lượng rất thấp (<1%).
Hoa bưởi Việt Nam điều chế bằng phương pháp cất kéo hơi nước có thành
phần chính là nerolidol (30,91 - 40,04%), farnesol (14,30 - 23,47%), linalol
(9,22 - 23,76%) [4].
1.1.5. Công dụng
Ngoài công dụng là quả dùng để ăn tươi, vỏ quả và hạt bưởi là nguyên
liệu để điều chế pectin, các hợp chất flavonoid.
Hoa là nguồn khai thác tinh dầu đáng lưu ý ở Việt Nam, tinh dầu hoa bưởi
dùng làm thơm bánh kẹo, nước giải khát, dùng trong kỹ nghệ sản xuất mỹ
phẩm. Lá bưởi dùng làm thuốc xông, nước thơm gội đầu [4].
1.2. Đại cƣơng về hoạt chất naringin
1.2.1. Công thức, tên khoa học

3


OH

OH

HO
O

O

O

HO
O
H3C

O
OH
OH

HO

O

OH

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của naringin


Tên

khoa

học:

7-((2-O-(6-Deoxy-α-L-mannopyranosyl)-β-D-

glucopyranosyl)oxy)-2,3- dihydro-5-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H1-benzopyran-4-on



Công thức phân tử: C27H32O14



Phân tử gam: 580,54 g/mol

1.2.2. Tính chất vật lý


Bột kết tinh không màu hoặc hơi vàng, không mùi, vị rất đắng.



Nhiệt độ nóng chảy: 171℃ [11], [14], [15].



Độ tan: Naringin không tan trong ether, benzen, cloroform. Tan
tốt trong các dung môi phân cực như ethanol, ethylacetat, aceton, nước
nóng, nhưng chỉ tan rất ít trong nước lạnh (1/2000 ở nhiệt độ 20 ℃ )
[10], [14], [16].

1.2.3. Tính chất hóa học


Tính acid yếu: Trong dung dịch kiềm loãng, naringin tạo muối phenolat
tan trong nước.



Phản ứng cyanidin: Phản ứng khử nhóm carbonyl của nhân ɣ-pyron tạo
anthocyan có màu.



Phản ứng với muối diazo: Phản ứng của hydro linh động với muối
diazo tạo sản phẩm azoic màu đỏ.



Phản ứng tạo phức: Phản ứng tạo phức chelat với muối kim loại nặng
của nhóm carbonyl ở C4 và hydroxy ở C5 .

4




Dễ bị oxy hóa: dễ bị oxy hóa bởi các tác nhân khử do có chứa 2 nhóm
–OH gắn với nhân thơm [1].

1.2.4. Tác dụng dược lý


Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng naringin có tác dụng làm giảm
cholesterol, làm giảm LDL oxidation và có thể giúp ngăn ngừa tăng
cholesterol máu, làm giảm nguy cơ xơ vữa động mạch.



Chống oxy hóa, chống ung thư ác tính.



Ức chế virus Sindbis neurovirulent .



Được sử dụng trong điều trị các tổn thương dạ dày.



Giảm độc tế bào.



Tăng cường quá trình trao đổi chất ethanol, giảm tác động tiêu cực của
ethanol, tăng cường chuyển hóa lipid.



Là một chất ức chế aldose reductase có nghĩa là nó có thể giúp chống
bệnh võng mạc liên quan đến bệnh nhân tiểu đường.



Naringin có thể gây trở ngại cho một số loại thuốc như thuốc chẹn kênh
canxi, thuốc an thần, thuốc làm giảm cholesterol và estrogen [15], [20],

[21].

1.3. Một số nghiên cứu về chiết xuất naringin
Vỏ bưởi được chiết bằng ethanol 96% theo phương pháp ngấm kiệt , dịch
chiết bao gồm cả chất phân cực và ít phân cực, sau đó được cô tới cao đặc và
loại tạp chất béo và chất ít phân cực bằng ether hoặc xăng vài lần, sau đó sản
phẩm điều chỉnh pH trong môi trường nước acid chlohydric tới pH = 1 - 2,
kết tinh lại trong dung môi ethanol, sấy và kiểm nghiệm thành phẩm. Hiệu
suất 2,3%. Với quy trình này thì có sử dụng tới ether hoặc xăng là dung môi
hữu cơ độc với môi trường nên gặp vấn đề kiểm soát dung môi hữu cơ khi
áp dụng qui mô lớn [6], [7 ], [14].

5


Với quy trình chiết xuất bằng nước nóng. Nguyên liệu sau khi chia nhỏ tới
kích thước xác định, được ngâm với nước nóng, chiết 2 lần mỗi lần trong 30
phút, vắt và ép dịch chiết qua vải lọc, dịch chiết được gộp lại sau đó đem cô
tới dịch. Hòa tan dịch thu được với ethanol 96% để sản phẩm pectin, dịch còn
lại đem cô tới cắn, sau đó hòa tan trong dung môi ethanol 96% - nước (1: 3),
sản phẩm sau đó kết tinh đem lọc và sấy khô. Hiệu suất 1,7%. Quy trình này
dung môi rẻ tiền, không độc hại nhưng có nhược điểm là dịch chiết rất nhớt,
rất khó lọc để thu sản phẩm pectin, bên cạnh đó để bay hơi hết dung môi nước
cần có lượng nhiệt lớn khá tốn kém [7], [9], [12].
Với phương pháp chiết bằng methanol. Nguyên liệu đã chia nhỏ tới kích
thước xác định được ngâm trong methanol sau đó thu lấy dịch chiết. Dịch
chiết được cô tới cắn sệt, sau đó đem hòa tan trong nước nóng, đun cách thủy
15 phút , lắc với diclomethan gạn lấy lớp nước, cuối cùng để lạnh kết tinh, lọc
và thu sản phẩm. Hiệu suất 2,4%. Quy trình này cho sản phẩm sạch,hiệu suất
cao, tuy nhiên trong quy trình sử dụng nhiều dung môi độc hại, dễ cháy nổ,

khả năng bay hơi rất cao nên khó áp dụng trong quy mô lớn, chủ yếu sử dụng
trong quy mô phòng thí nghiệm [23].
Quy trình chiết vỏ bưởi bằng dung môi kiềm. Nguyên liệu sau khi xử lý,
được ngâm với vôi sữa (CaO trong nước), hoạt chất có tính acid yếu nên dễ
tan trong kiềm. Thu dịch chiết điều chỉnh về pH tới 2 bằng acid chlohydric,
khi pH acid thì hoạt chất sẽ nằm dạng phân tử khó tan nên dễ kết tinh. Sau đó
sản phẩm được lọc và tiếp tục hòa tan trong dung dịch ethanol 96% ( tỷ lệ
ethanol: nước= 1: 3) để kết tinh và thu sản phẩm.Hiệu suất 0,6%. Quy trình
này, có ưu điểm không dung dung môi hữu cơ độc hại, dung môi rẻ tiền, tuy
nhiên quy trình này cho hiệu suất chiết rất thấp [5], [13].
Một số sản phẩm chứa naringin trên thị trường kết hợp với vitamin C và
hesperidin như: Swanson Naringin 500 mg, Hi-Potency Vitamin C &

6


Bioflavonoids Complex, NOW Citrus Bioflavonoid, Vitamin C and
Bioflavonoid Hypoallergenic Dietary Supplement… Các sản phẩm trong 1
viên chứa ≤ 150 mg naringin.

7


CHƢƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu
2.1.1. Nguyên liệu
Vỏ Bưởi được thu gom tại khu vực Bắc Từ Liêm - Hà Nội, vào tháng 12.
Vỏ quả Bưởi sau khi mua về được loại bỏ mốc, bỏ phần chứa tinh dầu (vỏ
ngoài), sấy ở nhiệt độ 60 – 70℃ trong 24 giờ, xay thành bột thô. Đóng túi kín

bảo quản ở điều kiện phòng để nghiên cứu.
2.1.2. Hóa chất, thiết bị


Naringin chuẩn (Viện nguyên liệu): Số lô 77162, số kiểm soát VDLCC-Naringin-11, hàm lượng: 95%.



Hóa chất
ảng 2.1. Danh mục hóa chất sử dụng

STT

Tên hóa chất

Nơi sản xuất

Tiêu chuẩn

1

n-butanol

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

2

Acid acetic

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

3

Nước cất

Việt Nam

DĐVN IV

4

Dung dịch sắt (III) chlorid

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

5

Ethanol 96%

Việt Nam

DĐVN IV

6

Aceton

Việt Nam

DĐVN IV

7

Acid chlohydric

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

8

Ethyl acetat

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

9

Than hoạt

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

10

Chloroform

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

11

Acid sunfuric đậm đặc

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

12

Natri hidroxyd

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

8




Thiết bị:



Cân phân tích Sartorius TE 214S (Anh)



Máy xác định hàm ẩm Sartorius, MA – 45 (Anh)



Tủ sấy Memmert (Đức)



Máy quang phổ UV-VIS Hitachi (Nhật Bản)



Máy đo nhiệt độ nóng chảy



Máy cô quay chân không Buchi (Thụy Sĩ)



Máy đo phổ hồng ngoại Impact 410 nicolet



Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Avance 500 - Bruker



Máy soi UV Speccord 40 (Đức)



Máy đo pH Mettler Toledo (Thụy Sỹ)



Các dụng cụ phòng thí nghiệm khác.

2.2. Nội dung nghiên cứu


Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quy trình chiết xuất citroflavoid từ cùi
bưởi: dung môi chiết xuất, phương pháp chiết xuất, thể tích dung môi
chiết, thời gian chiết, số lần chiết, pH của dung dịch kết tinh.



Xây dựng quy trình chiết naringin từ cùi bưởi mẻ 100 g.



Kiểm nghiệm chất lượng sản phẩm.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp xác định hàm ẩm
Xác định bằng máy xác định hàm ẩm
Chuẩn bị khoảng 1 g mẫu thử xác định hàm ẩm.
2.3.2. Phương pháp định tính naringin trong nguyên liệu cùi bưởi
Định tính naringin trong nguyên liệu cùi bưởi sơ bộ bằng phản ứng hóa học
và sắc ký lớp mỏng.

9




Phản ứng hóa học:

Tiến hành: cân 1 g nguyên liệu, đun cách thủy với 5 ml ethanol 96% trong
15 phút, lọc dịch chiết chia vào 5 ống nghiệm để làm các phản ứng sau.


Phản ứng cyanidin: thêm ít bột Mg vào, sau đó tiếp tục thêm 2 ml
acid HCl 5% vào. Quan sát hiện tượng.



Phản ứng với FeCl3: cho thêm vào ống nghiệm vài giọt FeCl 3. Quan
sát hiện tượng.



Phán ứng H2SO4 đậm đặc: thêm vào ống nhiệm vài giọt H 2SO4 đậm
đặc. Quan sát hiện tượng.



Phản ứng với NaOH: thêm vào ống nghiệm vài giọt NaOH 1N. Quan
sát hiện tượng [2], [22].



Sắc ký lớp mỏng:


Pha động: n-butanol: acid acetic: nước = 4: 1: 5 (tl/tl).



Pha tĩnh: Bản mỏng silica gel 60 F254 hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút.



Dung dịch đối chiếu: Dung dịch chuẩn naringin có nồng độ khoảng
0,2 mg/ml pha trong ethanol 96%.



Dung dịch mẫu thử: lấy khoảng 0,5 g mẫu thử đun với 4ml ethanol
96% trong 15 phút, lọc, thu được dung dịch chấm sắc ký.



Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 10 µl dịch chiết dịch chiết mỗi
mẫu. Tiến hành triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra khi chạy 8cm, để
khô. Soi bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm [5], [8], [16].

2.3.3. Phương pháp định lượng naringin
Định lượng bằng phương pháp đo quang phổ UV-VIS, xác định sơ bộ
hàm lượng citroflavonoid có trong mẫu thử [8].


Nguyên tắc:
Naringin hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 283-284 nm [2].

Do vậy, có thể xác định hàm lượng của citroflavonoid toàn phần trong

10


nguyên liệu và sản phẩm tính theo chất chuẩn naringin bằng phương pháp đo
quang phổ UV-VIS.


Tiến hành:



Chuẩn bị mẫu chuẩn
Cân chính xác khoảng 15 mg naringin đối chiếu vào bình định mức 25

ml, thêm khoảng 15 ml ethanol 96% hòa tan, sau đó bổ sung ethanol 96%

vừa đủ tới vạch thu được dung dịch chuẩn gốc.
Từ dung dịch chuẩn gốc pha dung dịch có nồng độ tương ứng 8, 10, 12,
16, 20, 24 (µg/ml) xây dựng đường chuẩn. Đo độ hấp thụ tại bước sóng 283
nm, mẫu trắng là ethanol 96%.


Chuẩn bị mẫu thử

* Chuẩn bị mẫu thử chiết từ nguyên liệu cùi bưởi
Cân 2,5 g bột nguyên liệu cho vào giấy lọc, gấp lại, rồi cho vào bình
Soxhlet. Chiết với n-hexan trong 3 giờ, lấy túi lọc nguyên liệu ra để bay hơi
hết n-hexan ở nhiệt độ phòng rồi cho vào bình Shoxlet chiết tiếp với ethanol
96% trong 3 giờ. Dịch chiết thu được chuyển vào bình cất quay và đem cô
dưới áp suất giảm đến cắn. Hòa cắn trong 50 ml ethanol 96% rồi chuyển
sang bình định mức 100 ml. Rửa bình cầu 2-3 lần, mỗi lần khoảng 10 ml
ethanol 96%, sau đó thêm vừa đủ ethanol 96% tới vạch. Hút chính xác
khoảng 1ml dịch thu được cho vào bình định mức 50 ml. Thêm ethanol 96%
vừa đủ tới vạch và lắc đều thu được dung dịch thử. Đo độ hấp thụ tại bước
sóng 283 nm, mẫu trắng là ethannol 96%.
* Chuẩn bị mẫu thử từ sản phẩm của quá trình chiết xuất
Cân chính xác 1 lượng sản phẩm tương đương khoảng 15 mg naringin
vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 15 ml ethanol 96% để hòa tan, sau
đó thêm ethanol 96% vừa đủ tới vạch. Hút chính xác khoảng 2 ml dung dịch

11


thu được vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol 96% vừa đủ tới vạch, lắc
đều. Đo độ hấp thụ tại bước sóng 283 nm, mẫu trắng ethanol 96%.
- Công thức tính toán:



Hàm lượng citroflavonoid toàn phần trong mẫu thử:

Trong đó:
X%: hàm lượng phần trăm citroflavonoid toàn phần trong mẫu thử.
CT: nồng độ mẫu thử tính theo phương trình đường chuẩn (µg/ml).
a: hàm lượng naringin chuẩn (%).
b: hàm ẩm của mẫu thử (%).
mT: khối lượng mẫu thử (g).
VT: thể tích của dung dịch thử (ml).
AT: mật độ quang của dung dịch thử và chuẩn.
fT: hệ số pha loãng của dung dịch thử và chuẩn.


Hiệu suất chiết citroflavonoid toàn phần

Trong đó:
C: nồng độ mẫu thử tính theo phương trình đường chuẩn (µg/ml).
a: hàm lượng chuẩn naringin (%).
V: thể tích dung dịch mẫu thử (ml).
f: độ pha loãng mẫu thử.
m: khối lượng vỏ bưởi đem chiết (g)
c: hàm ẩm nguyên liệu khi đem chiết (%).
X: hàm lượng citroflavonoid toàn phần (%).

12


2.3.4. Phương pháp chiết xuất

Cân khoảng 50 g nguyên liệu, cho vào bình chiết, thêm dung môi. Sau
thời gian thu dịch chiết, sau đó cô thu hồi dung môi đến cắn, hòa tan cắn
trong 50 ml ethanol 96%, lọc. Dịch lọc ethanol tiếp tục cô đến cắn, hòa tan
cắn trong 30 ml nước nóng, lọc, thêm 10 ml ethanol 96% . Để kết tinh lạnh,
lọc, sấy được sản phẩm.
2.3.5. Xác định cấu trúc sản phẩm
 Phản ứng định tính hóa học: xác định sự có mặt của flavonoid trong sản
phẩm thu được sau khi chiết xuất (tương tự phần định tính trong
nguyên liệu 2.3.1).
 Sắc ký lớp mỏng: xác định sơ bộ tính tinh khiết của flavonoid thu được,
kết luận sơ bộ về flavonoid có thể là naringin hay không so với vết
chuẩn naringin về Rf (tương tự phần định tính nguyên liệu 2.3.1).
 Đo phổ UV-VIS, IR, NMR để chứng minh cấu trúc naringin.

13


CHƢƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
3.1. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn biểu thị mối liên hệ giữa mật độ
quang và nồng độ naringin
-Chuẩn bị nồng độ chuẩn naringin như mục 2.3.3. Kết quả quét phổ UV-VIS:

Hình 3.1. Phổ UV- VIS naringin chuẩn nồng độ 11,71 (µg/ml)
trong ethanol 96%
Nhận xét: Quét phổ naringin chuẩn thấy có 2 cực đại hấp thụ ở bước sóng
283,0 nm và 320,0 nm. Chọn bước sóng 283,0 nm để đo mật độ quang cho
bước sau.
-Xác định sự phụ thuộc giữa mật độ quang và nồng độ naringin: Tiến hành
pha các dung dịch chuẩn như mục 2.3.3. Kết quả mật độ quang ở mỗi nồng
độ được ghi ở bảng 3.1.

ảng3.1. Mối liên quan giữa mật độ quang và nồng độ naringin (µg/ml)
Nồng độ
naringin (µg/ml)

7,32

Mật độ quang

0,218 0,290 0,338 0,444 0,576 0,732

9,37

14

11,71 14,64 18,30 23,42


Mật độ quang

0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0

y = 0,0322x - 0,0215

R² = 0,9972

0

5

10

15

20

25

Nồng độ dung dịch chuẩn (µg/ml)
Hình 3.2. Đường chuẩn biểu thị mối liên quan giữa mật độ quang và nồng độ
naringin
Phương trình biểu thị mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ
naringin: y = 0,3218x - 0,0215 (trong đó : y là mật độ quang, x là nồng độ
dung dịch naringin (µg/ml)).
Nhận thấy phương trình có R2 = 0,9972 (R2 > 0,99) . Nên có sự tương
quan tuyến tính giữa mật độ quang và nồng độ naringin trong khoảng 7,3223,42 µg/ml.
3.2. Kết quả định tính và định lƣợng citroflavonoid trong nguyên liệu
3.2.1. Kết quả định tính citroflavoid trong nguyên liệu
-Định tính citroflavonoid bằng phản ứng hóa học: chuẩn bị 5 mẫu dịch chiết
nguyên liệu bằng dung môi ethanol 96%. Tiến hành như mục 2.3.2. Kết quả:
A: Dịch chiết nguyên liệu
B: Phản ứng với NaOH
C: Phản ứng với cyanidin
D: Phản ứng với FeCl3

E: Phản ứng với H2SO4
Hình 3.3. Kết quả định tính hóa học nguyên liệu cùi bưởi

15