Tổng quan về sắc ký lỏng tương tác thân nước HILIC

BỘ Y TẾ
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
TRƯỜNG
ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----------

ĐINH THÙY LINH
1201319

TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG
TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC-HILIC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

----------

ĐINH THÙY LINH
1201319

TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG
TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC-HILIC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà
2. ThS. Vũ Ngân Bình

Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được khoá luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ
thầy cô, gia đình cũng như bạn bè. Cho đến nay khi khoá luận đã hoàn thiện, tôi xin
phép được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến họ.
Đầu tiên, tôi xin phép được được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới PGS.TS
Phạm Thị Thanh Hà và ThS. Vũ Ngân Bình- Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất Trường Đại học Dược Hà Nội, là những người cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, và
động viên tôi trong suốt chặng đường khó khăn khi thực hiện khóa luận này. Tôi cũng
xin cảm ơn PGS.TS Vũ Đặng Hoàng - Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất vì thầy đã
dành thời gian tra cứu và giúp đỡ tôi trong quá trình tìm tài liệu.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất đã tạo điều kiện
cung cấp cho tôi các tài liệu cần thiết để giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin được cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và
các cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội-những người đã dạy bảo và
trang bị cho tôi những kiến thức khoa học nền tảng trong suốt 5 năm học qua dưới
mái trường.
Và cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn thân thương đến ba mẹ, gia đình, bạn bè
cũng như cảm ơn tập thể lớp M1K67 đã quan tâm, giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời
gian học tập và thực hiện khóa luận.
Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất cả những tình cảm và sự giúp đỡ mà
thầy cô, gia đình, bạn bè đã dành tặng cho tôi trong suốt thời gian khó khăn vừa qua.

Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2017
Sinh viên
Đinh Thùy Linh

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC 3
1.1. Giới thiệu về sắc ký lỏng tương tác thân nước .................................................3
1.2. Nguyên lý cơ bản của sắc ký lỏng tương tác thân nước ...................................5
1.2.1. Pha động .................................................................................................5
1.2.2. Pha tĩnh ...................................................................................................6
1.2.3. Cơ chế tách và các yếu tố ảnh hưởng .......................................................15
1.2.4. Hệ thống phát hiện (Detector)...............................................................20
1.3. Ưu nhược điểm của HILIC .............................................................................22
1.3.1. Ưu điểm ....................................................................................................22
1.3.2. Nhược điểm. .............................................................................................24
CHƯƠNG 2: ỨNG DỤNG THỰC TẾ CỦA SẮC KÝ HILIC .............................25
2.1. Ứng dụng HILIC trong phân tích các acid amin, peptid và protein ...............25
2.2. Ứng dụng của HILIC trong phân tích kháng sinh ..........................................27
2.3. Ứng dụng của HILIC trong phân tích các nucleotid, nucleosid, nucleobase .28
2.4. Ứng dụng của HILIC trong phân tích phospholipid .......................................29
2.5. Ứng dụng của HILIC trong phân tích carbohydrat.........................................30
2.6. Ứng dụng của HILIC trong phân tích các chất dẫn truyền thần kinh.............31
2.7. Ứng dụng của HILIC trên các đối tượng phân tích khác ...............................32
2.8. Thực tế ứng dụng HILIC ở Việt Nam ............................................................32


Chương 3. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ....................................................................34
1. Kết luận. .........................................................................................................34

2. Đề xuất............................................................................................................34
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên tiếng Anh

Tên tiếng Việt

ACN

Acetonitrile

Acetonitril

APCI

Atmospheric Pressure

Ion hóa tại áp suất khí quyển

Chemical Ionization
CAD

Charged Aerosol Detector

Detector Aerosol tích điện

DMF

Dimethyl Formamide

Dimethyl Formamid

ELSD

Evaporative Light Scattering

Detector tán xạ ánh sáng bay hơi

Detector
ESI

Electrospray Ionization

Ion hóa phun điện tử

HILIC

Hydrophilic Interaction

Sắc ký lỏng tương tác thân nước

Chromatgraphy
HPLC

High Performance Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography
LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantitation

Giới hạn định lượng

MP

Mobile Phase

Pha động

MS

Mass Spectrometry

Khối phổ

NPLC

Normal Phase Liquid

Sắc ký lỏng pha thuận

Chromatography
RID

Refrective Index Detector

Detector chỉ số khúc xạ

RPLC

Reversed Phase Liquid

Sắc ký lỏng pha đảo

Chromatography
TFA

Trifluoroacetic acid

Acid triflouroacetic

THF

Tetrahydrofurane

Tetrahydrofuran

SPE

Solid Phase Extraction

Chiết pha rắn

UHPLC

Utra-High Performance Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng siêu cao

Chromatography


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các cấu trúc khác nhau của các pha tĩnh được áp dụng cho việc phân tách
trong HILIC ................................................................................................................. 8
Bảng 1.2. Các loại tương tác giữa chất phân tích, pha tĩnh và pha động .................. 16


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cơ chế phân tách trong một hệ thống HILIC ............................................ 18
Hình 1.2. Lớp điện tích kép trên bề mặt pha tĩnh liên kết......................................... 20


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong nhiều năm gần đây, kỹ thuật sắc ký nói chung và sắc ký lỏng nói riêng
được áp dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như hóa sinh, sinh học, phân tích môi
trường, phân tích thuốc, lâm sàng. Trong số các kỹ thuật sắc ký lỏng, sắc ký phân
bố là kỹ thuật thông dụng hơn cả và được chia làm hai loại dựa trên độ phân cực
tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thuận - NPLC (normal phase liquid

chromatography) và sắc ký pha đảo - RPLC (reverse phase chromatography) . Tuy
nhiên hiện nay đã có thêm nhiều kỹ thuật sắc ký lỏng khác được nghiên cứu, sử
dụng để mở rộng ứng dụng trên nhiều đối tượng phân tích và khắc phục những
nhược điểm của các kỹ thuật sắc ký truyền thống. Một trong số những kỹ thuật đó là
sắc ký lỏng tương tác thân nước - HILIC (hydrophilic interaction liquid
chromatography). HILIC lần đầu tiên được đề xuất bởi Alpert vào năm 1990. Kỹ
thuật sắc kí này sử dụng pha tĩnh phân cực cùng với dung môi pha động phân cực.
So với NPLC, HILIC cải thiện khả năng hòa tan của chất phân tích nhờ sử dụng pha
động chứa nước so với pha động hữu cơ của sắc ký pha thuận. So với RPLC, HILIC
phân tích được các chất phân cực, ít hoặc không lưu giữ trên các cột sắc ký pha đảo.
Nhờ những ưu điểm này mà HILIC đang ngày càng nhận được nhiều sự quan tâm
và dần trở nên phổ biến trên thế giới. Tuy nhiên đây là một kĩ thuật mới và số lượng
nghiên cứu ở trong nước còn ít. Vì vậy, việc có những hiểu biết đầy đủ về kỹ thuật
này là cần thiết để có thể áp dụng được kĩ thuật HILIC một cách phù hợp và hiệu
quả hơn.
Vậy nên, khóa luận này được thực hiện với mong muốn đem đến một cái nhìn
tổng quan về HILIC, cung cấp những hiểu biết cơ bản cũng như khả năng ứng dụng
của nó trong phân tích và đặc biệt là trong nghành Dược, nhằm tạo một nền tảng cơ
bản cho việc ứng dụng kỹ thuật sắc ký HILIC trong điều kiện thực tế của Việt Nam.
Khóa luận được thực hiên với ba mục tiêu sau:
1. Tìm hiểu nguyên lý, cơ chế tách của sắc ký HILIC.

1


2. Phân tích ưu và nhược điểm của phương pháp HILIC so với các phương pháp sắc
ký khác.
3. Tổng quan về các nghiên cứu ứng dụng HILIC trong ngành Dược.

2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC
1.1. Giới thiệu về sắc ký lỏng tương tác thân nước
Kể từ khi ra đời sắc ký là một công cụ không thể thiếu trong phân tích. Dựa vào
sự khác nhau về cơ chế tách người ta chia sắc ký lỏng thành nhiều loại như sắc ký
phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký ion, sắc ký rây phân tử, sắc ký ái lực-miễn dịch.
Trong đó, phổ biến nhất là sắc ký phân bố do khả năng ứng dụng rộng rãi trên nhiều
đối tượng phân tích. Sắc ký phân bố được chia làm hai loại dựa trên sự phân cực
tương đối giữa pha động và pha tĩnh là sắc ký pha thuận (NPLC) và sắc ký pha đảo
(RPLC). RPLC sử dụng các dung môi pha động phân cực như nước, đệm trong
nước an toàn và rẻ tiền nên được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn so với NPLC.
Tuy nhiên, một trong những vấn đề gặp phải đối với RPLC là sự kém lưu giữ đối
với các hợp chất phân tích rất phân cực. [17].
Với các chất thân nước và tích điện có thể sử dụng sắc ký trao đổi ion với cơ chế
lưu giữ dựa vào tương tác Coulomb. Sắc ký trao đổi ion có thể được sử dụng cho
hầu hết các chất tan tích điện, từ các ion vô cơ nhỏ đến các protein hay các đại phân
tử sinh học khác. Tuy nhiên, việc sử dụng sắc ký trao đổi ion cần dùng đến các cột
trao đổi ion khá đắt tiền. Một lựa chọn khác là sắc ký tạo cặp ion, các chất phân tích
được tạo cặp ion với tác nhân trong pha động giúp giảm độ phân cực của chất phân
tích, do đó tăng lưu trên cột pha đảo. Phương pháp này sử dụng pha động chứa chất
tạo cặp ion và sử dụng các cột RP ít tốn kém hơn và thường có hiệu quả tách tốt hơn
so với trao đổi ion. Tuy nhiên, khi thêm các thuốc thử ghép cặp ion ví dụ như TFA
hoặc natri heptansulfonat vào pha động thường làm giảm cường độ tín hiệu trong hệ
thống phát hiện bằng khối phổ chế độ phun điện tử (MS-ESI).
Với các chất thân nước và không tích điện, để tăng lưu giữ trong RPLC, người ta
biến đổi một hoặc nhiều nhóm chức phân cực của chất phân tích thành các nhóm ít
phân cực hơn bằng phản ứng hóa học, được gọi là kỹ thuật tạo dẫn xuất. Dẫn xuất
hoá làm tăng khả năng lưu giữ chất phân tích trên cột pha đảo và đôi khi cải thiện

3


khả năng phát hiện. Ví dụ formaldehyd, trong dung dịch nước chủ yếu tồn tại dạng
hydrat dihydroxymethan rất thân nước và khó phân tích bằng sắc ký pha đảo.
Formaldehyd phản ứng với 2,4-phenyl hydrazin trong môi trường acid chuyển
thành hydrazon, kém phân cực hơn thuận tiện cho phân tích bằng RPLC. Dẫn xuất
hóa thường là lựa chọn tốt khi phản ứng tạo dẫn xuất đơn giản và chỉ tạo thành một
sản phẩm duy nhất. Đối với các chất có chứa nhiều nhóm chức phân cực, các phản
ứng thường tạo các sản phẩm phụ, có khuynh hướng khó tách được sau khi tạo dẫn
xuất do các sản phẩm tạo thành có thể khó tách ra khỏi nhau. Tạo dẫn xuất cũng tốn
nhiều thời gian và làm tăng độ không đảm bảo đo trong phân tích định lượng [17].
Một hướng giải quyết khác để phân tích các chất phân cực mạnh và không tích
điện là dùng cách “đảo ngược RP”, một chế độ tách có pha tĩnh phân cực được làm
giàu bởi một phần pha động phân cực. Sắc ký tương tác thân nước (HILIC) là một
kỹ thuật như vậy. HILIC đã được biết đến vào những năm 1970 và được định nghĩa
bởi Alpert vào năm 1990 [53]. HILIC là một biến thể của sắc ký thông thường, sử
dụng pha tĩnh phân cực, pha động phân cực với các thành phần chính thường là 540% nước hoặc đệm trong acetonitril (ACN). Các chất phân tích được lưu giữ và
tách bằng cách tạo cân bằng tại phân vùng giữa pha động và lớp nước hấp phụ trên
bề mặt pha tĩnh. Việc sử dụng nước trong pha động mang lại cho HILIC một số lợi
thế so với NPLC. Với NPLC, việc chuẩn bị mẫu phức tạp hơn vì yêu cầu kiểm soát
hoàn toàn lượng dung môi nước. Dung môi dùng trong NPLC không phân cực và
các chất phân tích phân cực thường có độ hòa tan thấp trong dung môi này. Khi
phân tích bằng NPLC ta còn gặp khó khăn khi kết nối với detector MS-ESI vì dung
môi kém phân cực của NPLC làm giảm hiệu suất ion hóa. Trình tự rửa giải trong
HILIC ngược lại với sắc ký pha đảo, thứ tự rửa giải từ kém phân cực nhất đến rất
phân cực, điều này giúp HILIC trở thành kỹ thuật bổ sung và giải quyết các vấn đề
của RP trong phân tích các chất phân cực. Khi HILIC được sử dụng kết hợp với RPSPE, dung môi dùng để rửa giải các chất phân tích từ thiết bị SPE có thể được tiêm
trực tiếp lên cột HILIC giúp tiết kiệm thời gian và ngăn ngừa sự mất mẫu. Nồng độ
ACN cao cũng mang lại cho HILIC hai ưu điểm khác là: độ nhạy cao trong ESI-MS

4


và tách nhanh hơn do độ nhớt thấp của các chất rửa giải HILIC so với RPLC. Như
vậy, HILIC khắc phục tốt các nhược điểm của các kỹ thuật sắc ký trước đó nên
ngày càng thu hút được nhiều sự chú ý và được áp dụng rộng rãi trong những năm
gần đây.
1.2. Nguyên lý cơ bản của sắc ký lỏng tương tác thân nước
1.2.1. Pha động
Trong HILIC, pha động trở thành một phần không thể thiếu của pha tĩnh, tạo một
lớp giàu nước trên bề mặt của pha tĩnh phân cực so với pha động thiếu hụt nước, tạo
ra một hệ giống như chiết lỏng/lỏng. Các chất phân tích được phân bố giữa hai lớp
chất lỏng này.
HILIC sử dụng pha động là các dung môi hữu cơ thân nước như acetonitril cùng
với một lượng nhỏ nước. Hỗn hợp 40-97% ACN trong nước hoặc đệm dễ bay hơi
thường được sử dụng. Lượng nước yêu cầu ít nhất là 3% đủ để hydrat hóa các hạt
pha tĩnh. Tuy nhiên, bất kỳ một dung môi không proton đồng tan với nước nào cũng
có thể được sử dụng làm pha động cho HILIC (ví dụ tetrahydrofuran-THF hay
dioxan). Alcol cũng có thể được sử dụng tuy nhiên cần dùng ở nồng độ cao để đạt
được cùng một mức độ lưu giữ các chất phân tích so với các dung môi khác [88].
Dưới đây là danh sách các dung môi theo chiều tăng lực rửa giải:
Aceton < isopropanol ~ propanol formamid (DMF) ~ methanol[4].
Một số đệm như amoni acetat và amoni format thường được sử dụng để kiểm
soát pH pha động và lực ion. Trong HILIC, chúng làm thay đổi sự phân cực của
chất phân tích, dẫn đến những thay đổi khác biệt trong việc lưu giữ, thay đổi thời
gian lưu. Đối với chất phân tích ion, như thuốc kháng sinh aminoglycosid, pH phải
được điều chỉnh để đảm bảo rằng các chất phân tích chỉ tồn tại một dạng ion duy
nhất. Nếu trong cơ chế kiểm soát việc lưu giữ có sự đóng góp của tương tác ion,

nồng độ đệm tăng làm giảm thời gian lưu. Trong trường hợp tương tác ion không

5


ảnh hưởng đến việc lưu giữ, tăng nồng độ đệm sẽ làm tăng thời gian lưu, ảnh hưởng
đến solvat hóa cũng như hình dạng pic sắc ký (pic kéo đuôi, khả năng phục hồi pha
tĩnh kém). Đối với các chất phân tích trung tính (ví dụ carbohydrat) không cần sử
dụng đệm trong pha động. Việc sử dụng các muối khác (chẳng hạn như 100-300
mM natri perclorat) được hòa tan trong hỗn hợp dung môi hữu cơ cao (khoảng 70%
acetonitril) có thể được sử dụng để tăng sự phân cực của pha động nhằm đạt được
rửa giải mong muốn. Tuy nhiên do muối không dễ bay hơi nên việc này không
thuận lợi để sử dụng cùng một detector khối phổ.
HILIC có thể được thực hiện ở chế độ đẳng dòng hoặc chế độ gradient. HILIC có
điểm tương đồng với NPLC là lưu giữ tăng lên khi độ phân cực của pha động giảm,
do đó các hợp chất giữ lại trên cột HILIC có thể được tách rửa bằng cách tăng sự
phân cực của pha động, nghĩa là tăng tỷ lệ nước hay tăng nồng độ muối trong pha
động, hai lựa chọn này được áp dụng trong chế độ rửa giải gradient.
1.2.2. Pha tĩnh
Pha tĩnh sử dụng trong phân tích HILIC là những bề mặt phân cực, phổ biến nhất
là silica không dẫn xuất hoặc silica gel cổ điển được thay đổi với nhiều nhóm chức
phân cực khác nhau. Ngoài ra, các pha tĩnh polyme cũng có thể được sử dụng trong
HILIC. Tuy nhiên, có thể do giá thành đắt và độ phân giải thấp hơn so với các cột
silica nên số lượng các cột trên thị trường cũng như các ứng dụng HILIC được tìm
thấy sử dụng cột polymer là không nhiều.
Thế hệ đầu tiên của pha tĩnh HILIC bắt đầu vào năm 1975. Linden và Lawhead
tách carbohydrat bằng việc sử dụng pha tĩnh amino-silica, Bondapak (Waters,
Milford, MA, USA) sử dụng pha động là hỗn hợp acetonitril và nước (75:25 tt/tt).
Thế hệ tiếp theo của pha tĩnh HILIC sử dụng silica diol và silica amid. Cột silica
diol chủ yếu được sử dụng để tách các protein. Theo Tosoh, nhà sản xuất TSKgel

Amide-80, các cột amid silica có sẵn từ ít nhất năm 1985. Pha tĩnh này có các nhóm
carbamoyl không ion được liên kết hóa học với silica gel. Sau đó các pha này được
Yoshida áp dụng để tách các peptid. Các pha tĩnh liên kết hóa học với các đặc tính

6


cấu trúc đặc trưng đã được chuẩn bị bởi Buszewski và các cộng sự. Một trong số
chúng chứa các phối tử aminopropyl liên kết với silica; một số khác là pha
alkylamid và pha hỗn hợp có chứa nhiều loại phối tử liên kết [88].
Trong 15 năm qua, HILIC đã phát triển các pha tĩnh thế hệ thứ hai và thứ ba. Một
số vật liệu tách mới cho HILIC thu hút ngày càng nhiều sự chú ý trong những năm
gần đây. Những biến đổi cấu trúc của pha tĩnh dành cho HILIC rộng hơn so với pha
tĩnh sử dụng trong sắc ký pha đảo. Những pha tĩnh này cho thấy tính chọn lọc tốt và
khả năng lặp lại cao của việc tách các hợp chất phân cực. Mặc dù số lượng cột
thương mại có sẵn cho HILIC chưa có nhiều và đang phát triển, chưa có những pha
tĩnh linh hoạt, đa năng như C18 trong RP-LC nhưng các loại vật liệu tách khác nhau
cho HILIC cũng có những đặc điểm lưu giữ và phân tách chọn lọc khác nhau và rất
đa dạng [88].
Số lượng các cột trên thị trường cũng như các ứng dụng được tìm thấy chủ yếu
sử dụng silica không dẫn xuất và silica pha liên kết. Dưới đây là bảng cấu trúc một
số pha tĩnh thường gặp (bảng 1.1).

7


Bảng 1.1. Các cấuu trúc khác nhau của
c các pha tĩnh đượcc áp ddụng cho việc
phân tách trong HILIC
Vật liệu

Cấu trúc của pha tĩnh

Pha tĩnh silica
chưa qua xử lý
chứa các nhóm
chức như
siloxan, silanol,
có thể có một
lượng nhỏ các
kim loại

Ứng dụng
[17],[130]

[124]
Pha liên kết diol

[87]
Pha liên kết
cyano
[130],[98]
Pha liên kết
amino
[56]
Alkylamid

[130],[144
]

Pha liên kết
amid

8


[23]

Phối hợp

[130]
Cấu trúc polyme
của các dẫn xuất
poly(succinimid
)

[123]
Polyethylen
glycol/silica
(HS PEG)
[76]
“click” βcyclodextrin

[69]

“click”
saccharid
(“click”
maltose)

[142]
“click” dipeptid

9


[113]

Pha liên kết
zwitterionic
sulfobetain
(ZIC-HILIC)

[65]
Pha liên kết
ZIC-cHILIC
[99]
Pha trao đổi
cation
[113],[25]
Phối hợp
RP/trao đổi
anion

H
N

S

N

O

1.2.2.1. Silica không dẫn xuất
Trên cột silica không dẫn xuất, chất phân tích được giữ lại mạnh mẽ bởi liên kết
hydro và tương tác trao đổi với nhóm silanol. Trong đó nhóm silanol (-SiOH) đóng
vai trò thiết yếu tạo nên bề mặt phân cực của silica.
Sử dụng pha tĩnh là silica không dẫn xuất có nhiều ưu điểm: pha tĩnh này không bị
pha động pH thấp thủy phân, cắt các liên kết và rửa trôi như các pha tĩnh pha liên kết. Về
độ nhạy các pha tĩnh silica không dẫn xuất cải thiện độ nhạy 2 đến 10 lần so với RPLC
khi tách các hợp chất phân cực [8].
Tuy nhiên, nhược điểm của pha tĩnh này là có thể xảy ra sự quá tải của cột silica
không dẫn xuất. Quá tải có thể dễ dàng xảy ra khi cơ chế tách chủ yếu dựa trên sự
hấp phụ hơn là trên sự phân bố. Cơ chế này xảy ra khi sử dụng pha động có hàm
lượng nước thấp. Ngoài ra, có thể xảy ra sự hấp phụ không thuận nghịch trên các
pha này. Hấp phụ không thuận nghịch phụ thuộc rất nhiều vào pH pha động và xảy

10


ra khi sử dụng các pha động trung tính hoặc tính acid yếu. Tăng lực ion không khắc
phục được nhược điểm này. Thay ACN bằng nước hoặc methanol (MeOH) có thể
làm giảm sự hấp phụ không thuận nghịch [8].
Silica bao gồm loại silica gel A, được kết tủa từ các dung dịch silicat, có tính
acid. Do bị nhiễm các kim loại nên khi sử dụng pha tĩnh này có thể tạo phức chelat
với mẫu phân tích, gây lưu giữ mạnh hoặc pic không đối xứng. Loại silica gel B
chứa ít kim loại hơn loại A, ổn định ở giá trị pH trung bình và cao (ít nhất là pH
9). Vật liệu này cho thấy sự phân tách tốt đặc biệt là đối với các mẫu base do sự tinh
khiết. Tại giá trị pH cao hơn, nhóm silanol được ion hóa và sự trao đổi ion đóng
một vai trò quan trọng trong việc lưu giữ, đặc biệt là đối với các hợp chất base tích
điện dương. Bổ sung TFA có thể hạn chế được hiện tượng ion hóa các nhóm

silanol. Silica gel loại C là loại pha tĩnh có bề mặt được dehydroxyl hóa. Các nhóm
silanol Si-OH được thay thế bằng các nhóm Si-H không phân cực. Có thể có đến
95% silanol ban đầu bị loại bỏ, làm cho chúng ít phân cực hơn các silica có mật độ
các nhóm silanol cao. Nó có thể được sử dụng để tách acid hoặc các chất base sử
dụng pha động đệm có chứa hơn 50-70% dung môi hữu cơ.
Pha tĩnh silica có thể là dạng hạt hoàn toàn xốp, bề ngoài xốp, hoặc cột silica
nguyên khối [17]. Các hạt silica hoàn toàn xốp (totally porous particles - TPP) có
đường kính 1,5-5,0 μm được sử dụng rộng rãi nhờ dung tích cột lớn do đó cho phép
tiêm khối lượng mẫu lớn hơn và có nhiều lựa chọn có sẵn. Các hạt xốp bề mặt
(superficially porous particles - SPP) bao gồm một lõi rắn (1,5-5 μm) tráng lớp vỏ
silica ngoài có lỗ xốp (0,25-0,5 μm). Các pha này đặc trưng bởi giá trị số đĩa lý
thuyết cao. Diện tích bề mặt của SPP bằng khoảng 3/4 so với TPP, nhưng lớn hơn
nhiều so với silica nguyên khối. Silica nguyên khối (monolithic) có độ xốp và độ
thấm cao, do đó có thể phân tích ở tốc độ cao và áp suất thấp, cho phép tách nhanh
các chất phân tích. Tuy nhiên, các cột này có hệ số phân bố pha thấp, tức là dung
lượng mẫu thấp hơn và do đó độ lưu giữ thấp hơn các cột dạng hạt. Mặc dù đã có
nhiều nghiên cứu trên cột silica nguyên khối nhưng các ứng dụng HILIC sử dụng
cột này không nhiều.

11


Mặc dù vật liệu silica ổn định cơ học và có hiệu quả sắc ký tốt nhưng các pha
tĩnh silica không dẫn xuất không ổn định về mặt hóa học ở giá trị pH cao hơn 8 (do
sự hòa tan của silica). Điều này làm giảm hiệu lực cột, tăng áp suất cột và làm hỏng
lớp vật liệu silica. Ngoài ra, nhóm silanol tự do gây ra hiện tượng kéo đuôi, đặc biệt
là khi phân tích các chất phân tích có tính base. Một trong những cách khắc phục
những vấn đề này là việc phát minh cột silica không dẫn xuất có chứa các cầu liên
kết ethylen (Ethylene Bridged Hybrids - BEH), giảm lượng silanol tự do và giảm
tính acid của nhóm silanol. Các hạt nhồi này có kích thước từ 1,7 đến 10 μm, ổn

định ở các giá trị pH cao (đến pH 10). Vật liệu này có hình cầu và độ bền cơ học
cao nên thường được sử dụng trong sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UHPLC). Ngoài ra,
do làm giảm tính acid của silanol nên pha tĩnh này đã hạn chế hiện tượng kéo đuôi
cho các chất phân tích base. Neue và các đồng nghiệp đã nghiên cứu cơ chế HILIC
của BEH 1,7 μm không dẫn xuất và so sánh với các pha silica không dẫn xuất khác.
Họ kết luận rằng cơ chế lưu giữ của BEH bao gồm phân bố, hấp phụ và các tương
tác tương tự như các cột silica không dẫn xuất [34].
1.2.2.2. Silica pha liên kết
Các pha tĩnh pha liên kết thu được thông qua việc biến đổi hóa học bề mặt silica.
Các pha liên kết hóa học đã được áp dụng trong HILIC có thể chia thành các nhóm
theo trạng thái tích điện của chúng, bao gồm: các pha trung tính (amid, diol,
cyanopropyl, cyclodextrin silica); các pha tích điện dương (như amino silica); các
pha tích điện âm (như poly(succinimid) silica) và các pha lưỡng cực như
zwitterionic (ZIC-HILIC) [34]. Một số pha liên kết thường gặp trong thực tế được
trình bày dưới đây.
a. Amid silica
Amid silica là pha liên kết thân nước có chứa nhóm carbomoyl (amid). Nhóm
amid ít phản ứng hơn amin và thiếu tính base do đó sự lưu giữ trên các cột này ít
nhạy cảm hơn với pH và ít xảy ra sự hấp phụ không thuận nghịch. Đồng thời sự

12


vắng mặt của các nhóm amin cũng giúp loại trừ sự hình thành của base Schiff. Cột
amid cũng có khả năng phục hồi và ổn định tốt [8].
b. Pha liên kết diol
Pha diol là một trong số các pha liên kết đầu tiên được phát triển, mục đích là để
giải quyết vấn đề hấp phụ của silica không dẫn xuất. Các pha diol liên kết hóa học
có chứa nhóm dihydroxypropyl liên kết với silica, thể hiện tính phân cực cao và đặc
tính liên kết hydro, không chứa các nhóm ion khác ngoài các silanol còn lại chưa

phản ứng [17]. Vì vậy, chúng gần như là lý tưởng cho các ứng dụng HILIC.
e. Cyanopropyl silica
Cyano propyl silica đã có từ những ngày đầu tiên của sắc ký pha thuận, tuy nhiên
số lượng các ứng dụng của nó trong HILIC được tìm thấy là rất ít. Mặc dù chúng
được xem là pha phân cực nhưng do không có liên kết hydro nên sự lưu giữ chất
phân tích trên pha này rất thấp khi áp dụng trong sắc ký pha thuận cũng như HILIC.
Một hạn chế khác của pha tĩnh này là sự mất ổn định cơ học khi hoạt động trong
điều kiện dung môi phân cực hoặc rất phân cực.
d. Cột cyclodextrin
Pha liên kết cyclodextrin (CD) dựa trên silica chứa vòng oligosaccharid gồm năm
hoặc nhiều cạnh liên kết với các đơn vị α-D-glucopyranosid. Vì được hình thành từ
các đường có hoạt tính quang học, nên đặc điểm nổi bật của pha CD là có khả năng
tách các đồng phân đối quang. Và do đó được sử dụng hữu ích cho việc tách các
đồng phân quang học trong HILIC.
e. Amino silica
Các cột amino silica có chứa các aminopropyl liên kết với silica là pha liên kết đầu
tiên được sử dụng để tách carbohydrat trong kỹ thuật HILIC. Lợi thế của nó so với các
pha silica không dẫn xuất là ngăn sự chẻ pic do sự phân hủy anome. Các chất phân tích
được lưu giữ bởi liên kết hydro và tương tác trao đổi ion với các nhóm silanol. Các hợp
chất có tính acid cho thấy ái lực tăng mạnh với các cột amino silica, đôi khi có thể dẫn

13


đến sự hấp phụ không thuận nghịch. Một điều đáng lưu ý nữa đối với aminopropyl
silica là nó kém ổn định khi dung môi rửa giải là nước, dẫn đến tốc độ giải phóng
nhanh các phối tử và hình dáng pic bị xấu đi [17].
f. Silica liên kết poly(succinimid) và dẫn xuất
Một số pha tĩnh silica liên kết phân cực được tạo thành dựa trên phản ứng cộng
hoá trị của poly (succinimid) với aminopropyl silica. Phản ứng tạo ra một lớp bề

mặt polyamid/imid liên kết ở nhiều vị trí. Một phần vòng poly (succinimid) được
mở ra để tạo thành các liên kết amid với aminopropyl. Phần còn lại của vòng dễ
phản ứng với tác nhân ái nhân và được sử dụng để sản xuất một loạt các pha tĩnh
silica khác nhau. Ví dụ, pha tĩnh tích điện âm poly(acid aspartic) hình thành bằng
quá trình thủy phân kiềm, pha tĩnh poly (2-sulfoethyl aspartamid) được hình thành
bằng phản ứng với taurin. Nhiều pha tĩnh poly (succinimid) đã được ứng dụng trong
phân tách HILIC nhưng ngày càng ít được sử dụng do hiệu quả tách thấp hơn nhiều
so với các pha tĩnh HILIC gần đây [17].
g. Sulfoalkylbetain silica
Một loại pha liên kết đáng chú ý trong HILIC là pha lưỡng cực sulfoalkylbetain
zwitterionic. Trong pha tĩnh này nhóm chức sulfobetain được cố định lên silica gel
xốp hoặc giá đỡ polymer, chứa cả acid sulfonic mạnh và các nhóm amoni bậc bốn
được phân cách bởi một đoạn alkyl ngắn. Pha liên kết này có khả năng hấp phụ
nước mạnh bằng liên kết hydro tạo một lớp nước trên bề mặt pha tĩnh, kiểm soát cơ
chế lưu giữ tương tự cơ chế chung của HILIC. Các cột zwitterionic được thương
mại hóa dưới tên thương mại ZIC-HILIC (liên kết trên silica gel) và ZIC-pHILIC
(gắn trên chất mang polyme). Tính chọn lọc phân tách của cột ZIC-HILIC thu được
do sự cân bằng điện tích lưỡng cực 1:1, làm cho cột trung tính và có tương tác ion
yếu. Tính thân nước mạnh của cấu trúc sufobetain rất thích hợp cho việc tạo lớp
nước vô hình trên pha tĩnh. ZIC-HILIC cho thấy hiệu quả tách cao và phù hợp với
hầu hết các ứng dụng HILIC. Cột ZIC-pHILIC dựa trên polymer chứa nhóm chức
lưỡng cực sulfobetain giống như ZIC-HILIC và cung cấp các kết quả chọn lọc

14


tương tự các cột ZIC-HILIC. Một pha liên kết lưỡng cực nữa được biết đến là ZICcHILIC chứa nhóm phosphorylcholin liên kết với silica. Cột ZIC-cHILIC được thiết
kế cho HPLC và LC-MS của các hợp chất thân nước phân cực và có tính chọn lọc
bổ sung cho RPLC và các cột HILIC khác. Sự chọn lọc của ZIC-cHILIC so với
ZIC-HILIC: ZIC-cHILIC và ZIC-HILIC có các nhóm chức lưỡng cực định hướng

khác nhau, cho thấy sự chọn lọc khác nhau đối với các hợp chất thân nước phân
cực. Các hợp chất trung tính thường cho thấy sự lưu giữ tương tự trên hai cột.
1.2.3. Cơ chế tách và các yếu tố ảnh hưởng
1.2.3.1. Cơ chế tách
Về cơ bản có ba cách để mô phỏng các cơ chế tách. Đầu tiên là sự phân bố chất
phân tích giữa pha động và pha tĩnh; thứ hai là sự hấp phụ của chất phân tích lên bề
mặt của chất hấp phụ là pha tĩnh; thứ ba sự hấp phụ ưu tiên của pha động hữu cơ lên
bề mặt chất hấp phụ, tiếp theo các chất phân tích phân bố lên lớp hấp phụ này [4].
Hiện tượng lưu giữ trong HPLC đồng thời phụ thuộc vào các loại tương tác khác
nhau giữa phân tử các chất tan với pha tĩnh, chất tan với pha động và pha động với
pha tĩnh. Các loại tương tác giữa các phân tử đã được biết đến được cho trong
bảng 1.2.

Bảng 1.2. Các loại tương tác giữa chất phân tích, pha tĩnh và pha động
Mô tả

Năng lượng
[kJ.mol-1]

Liên kết hydro

Liên kết được hình thành giữa
hydro của nhóm cho proton và
nguyên tử nhận proton, liên kết
có thể hình thành giữa cùng
một phân tử cũng như giữa hai
phân tử khác nhau

- (4 – 17)

Liên kết cho-nhận

Xảy ra giữa cặp của electron
cho (dạng Lewis base) và nhận
(dạng Lewis acid)

- (4 – 17)

Loại tương tác

Tương tác
hóa học

15


Ion-lưỡng cực
Lưỡng cực-lưỡng
cực
Tương tác
vật lý

Lưỡng cực-lưỡng
cực cảm ứng
Lưỡng cực tạm
thời và lưỡng cực
cảm ứng

Tương tác trong phân tử
(Lực Van der Waals)

Tương tác kị nước

Ion hoạt động trên một phân tử
trung hòa điện, tạo ra đa dạng
các thành phần mạng điện
Lực xuất hiện giữa hai phân tử
trung hòa điện
Lực xuất hiện giữa một phân tử
phân cực hoàn toàn và một
phân tử không phân cực
Xuất hiện giữa hai phân tử
trung hòa điện, nếu đến gần
nhau sẽ tạo ra lực tĩnh điện
Lực tương tác yếu giữa các
phần của các phân tử riêng biệt,
giảm nhanh khi tăng khoảng
cách các phân tử, không tạo
liên kết bền vững
Lực tương tác xuất hiện trong
môi trường nước giữa các phân
tử sơ nước.

- (4 – 17)
- (4 – 17)
- (4 – 17)

- (4 – 17)

- (2 – 4)

-4

Lý thuyết hiện tại cho rằng HILIC lưu giữ do sự phân bố chất phân tích vào hai
lớp chất lỏng. Pha động là một phần không thể thiếu của pha tĩnh được hấp phụ và
tạo nên lớp chất lỏng giàu nước trên bề mặt pha tĩnh phân cực. Việc phân tách được
thực hiện thông qua việc phân bố các chất tan từ dung dịch rửa giải vào lớp chất
lỏng thân nước này. Dung môi thường được sử dụng trong pha động HILIC là
acetonitril. Cơ chế phân tách dựa vào sự phân bố khác nhau của các phân tử chất
phân tích giữa pha động acetonitril và một lớp giàu nước hấp phụ trên các pha tĩnh
thân nước (xem hình 1.1). Các chất phân tích càng thân nước, càng được phân bố
nhiều sang lớp nước cố định trên pha tĩnh và do đó càng có nhiều chất phân tích
được giữ lại, thời gian lưu càng dài. Nói cách khác, sự phân tách dựa trên sự phân
cực của các hợp chất và mức độ solvat hóa. Các chất càng phân cực sẽ có thời gian
lưu giữ trên cột càng lâu.
Khi nồng độ acetonitril (hoặc một số dung môi hữu cơ khác) tăng lên, nước
tương tác mạnh hơn với bề mặt của pha tĩnh phân cực (ví dụ, silica không dẫn

16


xuất). Trong trường hợp này, acetonitril không thể tương tác với silanol còn lại trên
các pha tĩnh, do đó, các nhóm silanol sẽ không được che chắn và các phân tử nước
có thể được hấp phụ lên chúng.
Khi phân tích với nồng độ acetonitril là từ 30 đến 70%, pha hấp phụ bao gồm ít
nhất ba lớp hấp phụ của acetonitril và hỗn hợp nước. Điều này tương đồng với các
nghiên cứu trước đây đã chứng minh sự hình thành của lớp đa hấp phụ nước trên
silica không dẫn xuất. Số lượng các đơn lớp hấp phụ của acetonitril tinh khiết là
khoảng 2, trong khi đó nước tinh khiết gần 3. Cơ chế tách trong một hệ thống
HILIC sử dụng pha tĩnh silica được mô tả trong hình 1.1.

Hình 1.1. Cơ chế tách trong một hệ thống HILIC
Tóm lại, khi nồng độ của nước trong pha động thấp hơn 20%, hấp phụ nước có
thể là nhiều lớp, và lượng nước hấp phụ có thể cao hơn nhiều so với lượng nước
trong dung môi. McCalley và Neue kết luận rằng khoảng 4-13% khối lượng lỗ trống
của silica được chiếm bởi một lớp giàu nước khi có 75-90% acetonitril trong dung
môi. Sự hấp phụ dung môi, khi chịu một số tương tác cụ thể, có thể ảnh hưởng lớn
đến khả năng chọn lọc của hệ thống HILIC.

17