Xác định hỗn hợp Cafein và Paracetamol trong mẫu dược phẩm bằng HPLC

TH Phân tích dụng cụ 1 -Nhóm 3

1.Kháiniệm
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên
cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một
phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột
là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên
một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với
các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và
phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách
các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp
chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia th c ph m trong lĩnh v c
th c ph m, dượcph m, môitrường…
2. Phân loại và định nghĩa
Trong HPLC tùy thuộc vào bản chất của quá trình sắc ký của pha tĩnh
trong cột tách mà có thể phân thành các loại sắc ký.
- Sắc ký pha thuận ( Normal phase : NP-HPLC) :là Sắc ký có thành phần
pha tĩnh phân c c và pha dộng mang tính không phân c c.
- Sắc ký pha đảo ( Reversae phase : RP- HPLC) Sắc ký có thành phân pha
tĩnh không phân c c và thành phần pha động phân c c.
GVHD : Ths. Võ Thúy VI

1


TH Phân tích dụng cụ 1 -Nhóm 3
- Sắc ký trao đổi ion ( Ion exchange: IE-HPLC) :
Sắc ký trao đổi ion d a trên hiện tượng trao đổi thuận nghịch giữa các ion
linh động của pha tĩnh rắn với các ion trong DD phân tích, khi cho DD này đi
qua cột được nạp đầy pha tĩnh. Các pha tĩnh trong trường hợp này được gọi là

chất trao đổi ion
- Sắc ký ghép cặp Ion (Ion Pair: IP-HPLC) :
Sắc ký ghép cặp ion là một biên thể của sắc ký pha đảo trong đó pha tĩnh
và pha động như sắc ký pha đảo . Điều khác biệt là trong sắc ký ghép cặp ion
phải tạo điều kiện để chất phân tích phải ở dạng ion hóa hoàn toàn (bằng cách
điều chỉnh pH)
- Sắc ký rây phân tử( Size exclution chromatography SEC-HPLC) :
Sắc ký rây phân tử là phương pháp chia tách các phân tử trong dung dịch
d a trên kích thước của chúng. Trong trường hợp pha động là một dung môi hữu
cơ, kỹ thuật được gọi là sắc ký thấm qua gel, còn trường hợp pha động là nước
thì kỹ thuật được gọi là sắc ký lọc trên gel.
- Sắc ký tách đồng phân quang học (Chiral separation) :
Phương pháp này d a trên một phản ứng hóa học giữa hai đồng phân đối
quang với một hợp chất bất đối tạo thành hỗn hợp hai đồng phân lập thể nhưng
không đối quang trước khi được phân tách bằng điện di.
3. Quá trình tách :
Do s tương tác khác nhau giữa các chất phân tích và vật liệu nhồi cột mà quá
trình tách xảy ra.

Hình 1 : Quá trình phân tách chất trong sắc ký cột
GVHD : Ths. Võ Thúy VI

2


TH Phân tích dụng cụ 1 -Nhóm 3
Một số ưu điểm của HPLC:
- Điều kiện phân tích khá dễ dàng:
+ Không cần bay hơi mẫu như GC, do đó phân tích được các chất kém bên
nhiệt.

- Dễ dàng thu hồi chất phân tích với độ tinh khiết cao nếu gắn bộ thu hồi phân
đoạn (fraction collector) , thường dùng trong điều chế, tách tinh dầu, dược
ph m…
- Độ lặp lại cao
- Thường không phân hủy mẫu.
Cách lựa chọn sắc ký:
Loại sắc ký
Dung môi sử dụng
Chất phân tích

Sắc ký pha đảo

Sắc ký ghép cặp ion
Sắc ký pha thuận

Sắc ký trao đổi ion
Sắc ký rây phân tử
Sắc ký Chiral

H2O/Đệm , ACN, MeOH

Các chất trung hòa hoặc
không ion hóa, tan trong
hỗn hợp nước/dung môi
hữu cơ
Giống RP nhưng thêm Các chất dạng ion hoặc có
chất tạo cặp ion
thể ion hóa
Hexane, CH 2 Cl 2
Hỗn hợp các chất không

tan trong hỗn hợp dung
môi hữu cơ – nước
H2O/Đệm
Các ion vô cơ, protein,
axit nucleic
H2O, THF, DMF….
Các chất có phân tử lượng
lớn
Hỗn hợp dung môi
Các đồng phân quang học
hữu cơ – nước

- Ở bài th c hành này ta sử dụng sắc ký pha đảo để phân tách hỗn hợp
Paracetamol, Cafein trong dược ph m.

GVHD : Ths. Võ Thúy VI

3


TH Phân tích dụng cụ 1 -Nhóm 3
II. Câu hỏi chuẩn bị :
Câu 1: Cấu tạo một hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao.
Cấu tạo một hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao gồm: Bình chứa pha động,
bộ phận khử khí, bơm cao áp, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký (pha tĩnh), đầu dò ,
hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ
thống, in dữ liệu.
Bình chứa pha động :
- Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép
chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong

muốn và tổng tỉ lệ của 4 đường là 100%.
-Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một
lúc mà thường sử dụng 2 hoặc 3 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn
đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn giúp ổn định quá trình rửa giải.
- Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết sử dụng
cho HPLC. Tất cả các hóa chất dùng để chu n bị mẫu và pha hệ đệm đều phải là
hóa chất tích khiết dùng cho phân tích.
- Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu
đường nền, tạo nên các peak tạp trong quá trình phân tích.
Bộ khử khí Degases
Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm lọai trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong
dung môi pha động, tránh xảy ra một số hiện tượng có thể có như sau:
-Tỷ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thời gian lưu
của peak thay đổi.
- Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể lọai trừ hết được
thì bơm cao áp có thể không hút được dung môi, khi đó ảnh hưởng đến áp suất
và hoạt động của cả hệ thống HPLC.
Trong các trường hợp trên đều dẫn đến sai kết quả phân tích.
Bơm cao áp
Mục đích để bơm pha động vào cột th c hiện quá trình chia tách sắc ký .
Bơm phải đạt được áp suất cao khoảng 250-600bar và tạo dòng liên tục. Lưu
lượng bơm từ 0.1 đến 10ml/phút.
Bộ phận tiêm mẫu
Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đồi.
Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu t động
(autosamper).

GVHD : Ths. Võ Thúy VI

4

TH Phân tích dụng cụ 1 -Nhóm 3
Cột sắc ký
Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của của hệ thống sắc ký lỏng hiệu
năng cao. Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay
đổi từ 5-25cm đường kính trong 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0.3-5µm,…Chất nhồi cột
phụ thuộc vào lọai cột và kiểu sắc ký.
Đầu dò.
- Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu
ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các
chất phân tích mà người ta l a chọn lọai đầu dò phù hợp
- Tín hiệu đầu dò thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ,
cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…
- Trên cơ sở đó, người ta sản xuất các lọai đầu dò sau:
+Đầu dò quang phổ tử ngọai 190-360nm để phát hiện UV
+ Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để phát hiện
các chất hấp thụ quang. Đây là lọai đầu dò thông dụng nhất.
+Đầu dò huỳnh quang (RF) để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang
t nhiên và các dẫn suất có huỳnh quang.
+Đầu dò DAD (Detector Diod Array) có khả năng quét chồng phổ để định
tính các chất theo độ hấp thụ c c đại của các chất.
+ Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng đo các loại đường.
+ Đầu dò điện hóa: đo dòng, c c phổ, độ dẫn.
+ Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,…
Bộ phận ghi nhận tín hiệu
Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện.
Đối với các hệ thống HPLC hiện đại, phần này được phần mềm trong hệ
thống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan đến peak
như tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính toán, xử lý các thông số liên

quan đến kết quả phân tích.
In dữ liệu
Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy
tính có cài phần mềm điều khiển.
Câu 2: Cơ chế hoạt động của van tiêm mẫu trong sắc kí lỏng
Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu
cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm 6 cổng có vòng chứa mẫu
(sample loop). Vòng chứa mẫu có dung tích khác nhau.

GVHD : Ths. Võ Thúy VI

5


TH Phân tích dụng cụ 1 -Nhóm 3
Có 2 cách tiêm mẫu:
•Tiêm bằng tay với vòng mẫu có thể tích xác định hoặc dùng micro xilanh
•Hệ bơm mẫu t động theo chương trình định sẵn
Tiêm bằng tay
-Cắm xilanh vào cổng tiêm ở vị trí inject
-Vặn van về vị trí load. Lúc này pha động vãn đang được bơm vào cột.
Tiêm mẫu này giúp thể tích mẫu tiêm luôn luôn giống nhau
-Vặn về inject, lúc này nhờ s di chuyển của van 6 cổng pha động được nối
với mẫu vừa tiêm vào loop và đ y mẫu vào cột. Bắt đầu quá trình chạy sắc ký
-Rút xilanh khỏi cổng tiêm, rửa cổng tiêm
Tiêm t động: Mẫu được chu n bị sẵn và chứa trong bình chứa, bằng phần
mềm cài đặt sẵn, hệ thống sẽ t tiêm mẫu và chạy sắc ký.
Câu 3. Nguyên tắc hoạt động của đầu dò UV:
Khi không có mẫu qua detector ánh sáng đi qua dòng pin và phát ra tín hiệu
lớn nhất tại dòng cảm biến, nếu một mẫu có bước sóng đi qua detector, mẫu này

làm giảm lượng ánh sáng ở dòng cảm biến và là nguyên nhân làm thay đổi tín
hiệu ở detector. Tín hiệu này chuyển một dòng electron và xuất hiện sắc phổ
trên máy tính. Tín hiệu hiển thị tăng lên tập trung ở mẫu của dòng pin. Detector
cũng phản ứng lại để thay đổi theo dòng pin.
Câu 4. Cách xác định LOD, LOQ trong bài
Bước 1: Xác định phương trình hồi quy tuyến tính
Bước 2: LOD =
LOQ =

hoặc LOQ =

LOD

Câu 5. Cách xác đinh phương trình hồi quy tuyến tính trong bài
D a vào sắc ký đồ tìm ra giá trị diện tích peak tương ứng với nồng độ
Caffein có trong từng bình chu n. Rồi từ đó ta lập bảng chứa giá trị: nồng độ
Caffein (ppm) và Speak.
Bấm máy tính: Mode  3: Stat  2: A+BX  nhập giá trị cột X là nồng
độ Caffein và cột Y là Speak , khi nhập tới giá trị cuối cùng của cột Y nhấn =
nhấn AC. Để tìm giá trị của A ta nhấn Shief 1 rồi chọn 5: Reg  chọn 1: A
 nhấn = ta được giá trị của A. Để tìm giá trị của B ta nhấn Shief 1 rồi chọn 5:
Reg  chọn 2: B  nhấn = ta được giá trị của B.
Phương trình hồi quy tuyến tính của paracetamol có dạng Y = A + BX: làm
tương t Caffein.

GVHD : Ths. Võ Thúy VI

6

TH Phân tích dụng cụ 1 -Nhóm 3
Câu 6. Tại sao trong sắc ký khí thì thường sử dụng phương pháp nội
chuẩn còn trong sắc ký lỏng dùng phương pháp ngoại chuẩn?
Trong sắc ký khí để có độ chính xác cao khi sử dụng kỹ thuật đường chu n,
thì chúng ta phải xử lý tương t nhau đối với tất cả mẫu và chu n và cần tiêm
vào máy sắc ký các thể tích mẫu như nhau. Điều đó rất khó và không thể, cũng
như độ đúng và độ chính xác có ảnh hưởng khi sử dụng kỹ thuật tiêm mẫu bằng
tay Vì thế để khắc phục hạn chế đó, kỹ thuật nội chu n được sử dụng cho sắc ký
khí.
Sử dụng phương pháp nội chu n trong sắc ký khí là phương pháp cho phép
ta xác định chính xác nồng độ của chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng
đáng kể bởi thể tích tiêm mẫu giữa các lần tiêm.
Ngoài ra, chất nội chu n dùng trong sắc ký khí với mục đích để loại bỏ sai
số do tiêm mẫu bằng tay. Chất nội chu n được dùng phải tương t về mặt hóa
học với chất phân tích và có nồng độ tương t nồng độ chất phân tích.
Mặt khác, so với phương pháp ngoại chu n thì phương pháp nội chu n cho
kết quả với độ sai số ít hơn nhiều.
Trong sắc ký khí thường sử dụng phương pháp nội chu n còn trong sắc ký
lỏng dùng phương pháp ngoại chu n.
Câu 7: Quá trình tối ưu tách sắc ký dựa trên các thông số của sắc ký
đồ
Mục đích của quá trình tối ưu hóa là có được s tách hoàn toàn các chất
cần phân tích trong thời gian ngắn nhất khi đi qua cột
Để có được tối ưu quá trình sắc ký người ta phải sử dụng những nguồn sẵn
về thiết bị, phần mềm để mô phỏng được những kết quả thu được từ s thay đổi
các thông số vật lí khác
Quá trình tối ưu hóa đồng nghĩa với việc chọn l a: cột, chiều dài cột,
đường kính cột, thành phần pha tĩnh trong cột, độ phân giải, tốc độ dòng và
thành phần pha động. Tất cả những yếu tố này lại tương tác với nhau. Ví dụ
phân giải R và thời gian chu kỳ tỷ lệ nghịch với nhau.

Nhưng trên th c tế việc thay đổi các thông số cố định (như cột ,chiều dài
cột , , đường kính cột , pha tĩnh nhồi cột …) như vậy rất khó khăn và tổn phí lớn
vì vậy khi cần tối ưu hóa ta ưu tiên đến các thông số có thể thay đổi như (thành
phân pha động, độ phân giải hay nồng độ…. ).

GVHD : Ths. Võ Thúy VI

7


TH Phân tích dụng cụ 1 -Nhóm 3
III Tiến Hành Thí nghiệm và xử lý kết quả đo.
Chuẩn bị dung dich chuẩn:
Pha chu n hỗn hợp 25ml *CAF 10ppm và *PAR 2ppm từ chất gốc 100ppm
và 118ppm
Cách pha d a vào CT : NV1=NV2
Vậy cần hút 2,5ml CAF 100ppm và hút 0,42 mL PAR 118ppm định mứt
trong binh 25mL
Pha chu n đơn: cung tương t ta cũng rút từng chất cho vào binh định mức
25ml đinh mức tới vạch .
Lọc qua màng lọc 0.45 µm
Khảo sát thành phần pha động:
Khi cho dung dịch chu n hỗn hợp PAR, CAF vào HPLC tiến hành chạy lần
lượt với các tỉ lệ pha động khác nhau. Từ 3 sắc ký đồ ta thấy đươc giữa các tỷ lệ
thanh phân pha động thi tỉ lệ 50:50 cho 2 sắc ký đồ của PAR, CAF là gần nhau
nhất nghĩa là thời gian lưu TR là ngắn nhất. Vậy phân tách hỗn hợp ở tỷ lệ trên
là có độ tối ưu hóa cao.
Pha các hỗn hợp chuẩn ở các nồng độ khác nhau từ dung dịch chuẩn
gốc 100ppm, 118ppm.
Ký hiệu bình

1
2
3
4
5
Nồng độ CAF sau
định mức (ppm)
Thể tích dung dịch
CAF gốc 100ppm
(mL)
Nồng độ PAR sau
đinh mức (ppm )
Thể tích dung dịch
PAR gốc 118ppm
(mL)

1

2

5

10

20

0,25

0,5

1,25

2,5

5

1

2

3

5

10

0,212

0,423

0,635

1,06

2,12

Xử lí các hỗn hợp chu n tiến hành đo trong hệ thông HPLC.
Phân tích mẫu thuốc.
Tiến hành xử lí mẫu thuốc Padadol Extra (1 viên thuốc có khối lượng
khoảng 0,6g) . Sau đó lấy 0,255 g mẫu thuốc tiến hành định mức lấy dung dich

mẫu xử lí lọc đánh siêu âm sau đó tiêm vào HPLC.
CAF: CAFFEIN –*PAR : PARACETAMOL

*

GVHD : Ths. Võ Thúy VI

8


TH Phân tích dụng cụ 1 -Nhóm 3
Xử Lí Kết Quả Đo.
Từ các sắc ký đồ ta thu được các số liệu sau :
Khối lượng 1 viên thuốc m= 0.5967 (g)
C
Mẫu
Mẫu
Chuẩn 1 huẩn 2 Chuẩn 3 Chuẩn 4 Chuẩn 5 thuốc

Caffein (ppm)

Speak

Paracetamol

Speak

1

2

5

10

20

0,311

63,07

188,47

427,41

927,47

1564,26

58,82

1

2

3

5

10

5,56

39,82

58,14

95,13

154,55

253,55

153,24

Đồ thị tuyến tính Diện tích peak của CAF theo nồng độ: (ppm)

S

Đồ thị S-ppm của CAF
1800
1600
1400
1200

y = 78,938x + 34,209
R² = 0,9897

1000
800

600
400

Đồ thị tuyến tính Diện tích peak của PAR theo nồng độ (ppm)
200
0
0

GVHD : Ths. Võ Thúy VI

5

10

15

20

25
ppm

9


TH Phân tích dụng cụ 1 -Nhóm 3
Đồ thị tuyến tính Diện tích peak của PAR theo nồng độ: (ppm)

S

Đồ Thị S-ppm của PAR

300
y = 24,109x + 18,98
R² = 0,9874

250
200
150
100

50
0
0

2

4

6

8

10

12
ppm

Kết quả tính toán:
Khối lượng viên thuốc m=0,5976 trong đó: khối lượng PAR 500mg; khối
lượng CAF 65mg.
Lập luận : Khi xử lý mẫu viên thuốc và hòa tan trong 1 lit dung dịch thì nồng độ

ppm của PAR và CAF là 500ppm và 65ppm. Tương đương trong 250ml thi sẽ
có nông độ là CPAR=

CCAF =

-Nhận xét thấy rằng nồng độ ppm rất lớn và hệ số pha loãng cao dụng cụ
không thể hổ trợ được. nên th c hiện chia đôi khối lượng viên thuốc ra. Cho
khối lượng PAR, CAF là phân bố đông đều thì sẽ được 250mg PAR và 37,5mg
CAF.
Tính nồng độ ppm của CAF, PAR trong 250 ml dung dich
CPAR=

=1000ppm

và CCAF =

=130 ppm

Để được khoảng CPAR,CCAF trong vung tuyến tính thì
1ppm CPAR 10ppm
1ppm CCAF 20ppm
thì nồng độ pha loãng 100 lần

=100 vậy Vxd= 1ml (định mức ở 100ml)

Với nữa khối lượng viên thuốc thì hòa tan thành 250 ml dd thì sẽ có nồng độ.
CPAR=10ppm và CCAF=1,3ppm vậy ta có thể chon khối lượng viên thuốc nhỏ hơn
0,2988(g).

GVHD : Ths. Võ Thúy VI

10


TH Phân tích dụng cụ 1 -Nhóm 3
Cân 0,2565 g thuốc Panadol extra hòa tan vào bình định mức 250ml . Rút
1mL đinh mức thành 100mL. Xử lý mẫu đê tiêm vào HPLC phân tách.
Nồng độ của PAR và CAF trong mẫu
Thế S peak CAF đo được của mẫu vào pt đường tuyến tính giữa S-ppm
CAF
y = 78,938x + 34,209 => CCAF= 0,311 ppm
Thế S peak CAF đo được của mẫu vào pt đường tuyến tính giữa S-ppm
PAR
y = 24,109x + 18,98 => CPAR = 5,56 ppm
Hàm lượng PAR và CAF trong mẫu:
CAF= 0,311.
PAR=5,56.

GVHD : Ths. Võ Thúy VI

.10-6 = 0,015 (g)
.10-6 = 0,278 (g)

11