Xây dựng phương pháp định lượng vitamin b5 trong viên nang mềm carmanus

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ MINH HẬU
Mã sinh viên: 1201183

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG VITAMIN B5 TRONG VIÊN
NANG MỀM CARMANUS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ MINH HẬU
Mã sinh viên: 1201183

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG VITAMIN B5 TRONG VIÊN
NANG MỀM CARMANUS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. NGUYỄN THỊ KIỀU ANH
2. ThS. NGÔ MINH THÚY
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Hóa phân tích-Độc chất
2.Viện Công nghệ Dược phẩm quốc gia

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc nhất đến
PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh – Phó viện trưởng Viện Công nghệ Dược
phẩm Quốc gia, Ths. Ngô Minh Thúy – Giảng viên bộ môn Hóa phân tích –
Độc chất đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em thực hiện khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia,
bộ môn Hóa phân tích – Độc chất và bộ môn Vật lý – Hóa lý trường Đại học
Dược Hà Nội, thầy cô và các anh chị đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt
thời gian thực hiện khóa luận.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô, các cán bộ Trường Đại học
Dược Hà Nội, những người đã trang bị cho em rất nhiều kiến thức trong suốt
quá trình học tập để em có thành quả như này hôm nay.
Em xin cảm ơn gia đình, bạn bè – những người đã luôn ở bên giúp đỡ em
trong cuộc sống.
Em xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Đỗ Minh Hậu


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1. Tổng quan về vitamin B5 ......................................................................... 3
1.1.1. Công thức hóa học ................................................................................. 3
1.1.2. Nguồn gốc ............................................................................................... 3
1.1.3. Tính chất lý hóa...................................................................................... 3
1.1.4. Tác dụng và cơ chế tác dụng ................................................................. 3
1.1.5. Một số phương pháp định lượng vitamin B5 ........................................ 4
1.1.6. Một số chế phẩm chứa vitamin B5lưu hành trên thị trường ............... 5
1.2. Vài nét về viên nang mềm Carmanus ................................................... 6
1.3. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao........................ 9
1.3.1. Khái niệm sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................................... 9
1.3.2. Cấu tạo hệ thống HPLC ........................................................................ 9
1.3.3. Các thông số đặc trưng trong HPLC .................................................. 11
1.3.4. Pha tĩnh trong HPLC ........................................................................... 13
1.3.5. Pha động trong HPLC ......................................................................... 14
1.3.6. Một số phương pháp định lượng trong HPLC ................................... 15
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 17
2.1. Điều kiện thực nghiệm ........................................................................... 17
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 17
2.1.2. Hóa chất, dung môi .............................................................................. 17
2.1.3. Dụng cụ thiết bị .................................................................................... 17
2.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 18


2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 18
2.3.1. Chuẩn bị dung dịch pha mẫu và dung dịch chuẩn ............................ 18
2.3.2. Xây dựng phương pháp phân tích....................................................... 18
2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích .................................................... 19
2.3.4. Ứng dụng định lượng vitamin B5 trong viên nang mềm Carmanus . 20
2.4. Phương pháp xử lí kết quả .................................................................... 21

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................. 23
3.1. Kết quả xây dựng phương pháp phân tích .......................................... 23
3.1.1. Xác định điều kiện sắc ký .................................................................... 23
3.1.2. Xây dựng qui trình xử lí mẫu .............................................................. 26
3.2. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích ........................................ 27
3.2.1. Độ phù hợp hệ thống ........................................................................... 27
3.2.2. Độchọn lọc ............................................................................................ 28
3.2.3. Khoảng tuyến tính ................................................................................ 30
3.2.4. Độ đúng................................................................................................. 32
3.2.5. Độ lặp lại............................................................................................... 33
3.2.6. Độ chính xác trung gian ...................................................................... 34
3.3. Kết quả định lượng vitamin B5 trong viên nang mềm Carmanus .... 35
3.4. Bàn luận .................................................................................................. 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ KIỆU VIẾT TẮT
Ký hiệu

Chú thích

AOAC

Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thống

CV

Hệ số biến thiên

C18

Cột Octadecylsilan

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HL

Hàm lượng

MeCN

Acetonitril

MeOH

Methanol

RP

Pha đảo

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Độ lệch chuẩn

SKĐ

Sắc ký đồ

STT

Số thứ tự

Spic

Diện tích pic

tR

Thời gian lưu

TB

Trung bình

USP – NF

Dược điển Mỹ

UV

Tử ngoại

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số chế phẩm chứa vitamin B5 lưu hành trên thị trường ............ 6
Bảng 3.1. Kết quả độ phù hợp hệ thống.......................................................... 28
Bảng 3.2. Cách pha dãy dung dịch chuẩn ...................................................... 30
Bảng 3.3. Kết quả xác định khoảng tuyến tính ............................................... 31
Bảng 3.4. Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp ............................... 32
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp ............................... 34
Bảng 3.6. Kết quả đánh giá độ chính xác trung gian ..................................... 35
Bảng 3.7. Kết quả định lượng ......................................................................... 36


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của vitamin B5 (Calci pantothenat) .................... 3
Hình 1.2. Sơ đồhệ thống HPLC ........................................................................ 9
Hình 3.1.SKĐ vitamin B5 chuẩn khảo sát tỉ lệ thành phần pha động............. 25
Hình 3.2. SKĐ phân tích viên nang mềm Carmanus với hệ pha động MeOH dung dịch KH2PO4 0,05M pH 2,5 (10 : 90) .................................................... 25
Hình 3.3. Kết quảđánh giá độchọn lọc của phương pháp .............................. 29
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn mỗi quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng
độ vitamin B5 ................................................................................................... 31


ĐẶT VẤN ĐỀ
Vitamin là những chất không thể thiếu trong cuộc sống hàng ngày của
mỗi con người. Vitamin đóng vai trò là các chất xúc tác trong các phản ứng
sinh hóa, từ quá trình trao đổi chất đến xây dựng hệ thống miễn dịch của cơ
thể.Vitamin có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc sản sinh năng lượng, duy
trì các hoạt động sống của cơ thể.Chính bởi vậy, đã từ lâu vitamin có mặt rất
nhiều trong các chế phẩm đa sinh tố, các sản phẩm dinh dưỡng[3].Hiện nay,

sự có mặt của vitamin trong các sản phẩm thuốc chữa bệnh ngày càng nhiều
nhằm tác dụng hỗ trợ điều trị hoặc phối hợp với các hoạt chất chính để tạo ra
tác dụng hiệp đồng.Carmanus - viên nang mềm của công ty cổ phần
Traphaco là một trong những sản phẩm đó.
Carmanus có thành phần chính là các hoạt chất chiết từ cây Carduus
marianuskết hợp với các vitamin nhóm B (B1, B2, B3, B5, B6) được bào chế
dưới dạng viên nang mềm giúp cho việc điều trị và dự phòng gan nhiễm mỡ
đạt hiệu quả cao.Các vitamin nhóm B đóng một vai trò quan trọng trong
chuyển hóa trung gian, phục hồi các nhu mô gan tổn thương, hiệp đồng tác
dụng với các hoạt chất chính có trong cây Carduus marianus[21].
Hiện nay, một số kết quả phân tích cho thấy có sự sụt giảm hàm lượng
vitamin B5 trong một số sản phẩm thuốc nang mềm trong đó có Carmanus
ngay cả khi sản xuất mới được ít tháng.Vì vậy, cần có phương pháp định
lượng vitamin B5một cách khách quan hơn.Một trong những phương pháp
phổ biến, có độ chính xác cao và được các nhà sản xuất ứng dụng nhiều đó là
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.Tuy vậy đối với các dạng bào chế
khác nhau chứa vitamin B5 cần có những cách xử lí mẫu khác nhau trước khi
tiến hành định lượng mà ở đây là dạng bào chế viên nang mềm.Trong khi
đó,các nghiên cứu đã công bố về định lượng vitamin B5 trong các sản phẩm
thuốc dưới dạng bào chế viên nang mềm bằng HPLC còn ít.Dược điển

1


Mỹ[18] cũng đưa ra một số phương pháp định lượng vitamin B5 trong viên
nang mềm bằng HPLC nhưng trong các chế phẩm đa vitamin và khoáng chất,
chưa có thành phần dược liệu.Thông thường cách định lượng hoạt chất trong
chế phẩm thuốc nang mềm trải qua các giai đoạn: lấy thuốc trong nang, làm
đồng nhất, cân thuốc, sau đó xử lí với qui trình thích hợp rồi tiến hành định
lượng. Tuy nhiên với viên nang mềm Carmanus dự đoán vitamin B5 có thể

đọng vào thành vỏ nang vì vậy cần có cách xử lí phù hợp để có thể chiết được
hoàn toàn vitamin B5.
Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xây dựng
phương pháp định lượngvitamin B5 trong viên nang mềm Carmanus” bằng
sắc ký lỏng hiệu năng caovới 2 mục tiêu chính:
1. Xây dựng phương pháp định lượng vitamin B5 trong viên nang
mềm Carmanus.
2. Ứng dụng định lượng vitamin B5 trong viên nang mềm Carmanus
bằng phương pháp đã xây dựng.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.TỔNG QUAN VỀ VITAMIN B5
1.1.1. Công thức hóa học
Vitamin B5 trong dược phẩm thường tồn tại ở dạng muối Calci pantothenat:

Hình 1.1.Công thức cấu tạo của vitamin B5 (Calci pantothenat) [2], [18].
Công thức phân tử:C18H32CaN2O10 [2], [18].
Khối lượng phân tử: 476,5 [2], [18].
Tên khoa học:
Calci bis[(R)-3-(2,4-hydroxy-3,3-dimethylbutyramido)propionate] [2].
1.1.2. Nguồn gốc
Nguồn gốc của vitamin B5 chủ yếu ở trong tự nhiên.Nó có ở trong 1 loạt
các loại thực phẩm. Các nguồn tốt nhất là bia men, pho mát, bắp, súp lơ, cải
xoăn, cà chua, bơ, các loại đậu, thịt bò, lòng đỏ trứng, thận, gan, tôm hùm,
mầm lúa mì, cá hồi, bánh mỳ làm từ ngũ cốc và các loại ngũ cốc…[3].
1.1.3. Tính chất lý hóa
Bột kết tinh màu trắng, hơi hút ẩm.Dễ tan trong nước, khó tan trong

ethanol 96%, thực tế không tan trong cloroform, ether[2], [18].
Góc quay cực riêng từ+25,5o đến +27,5o (dung dịch Calci pantothenat 5%
trong nước không có CO2) [2].
1.1.4. Tác dụng và cơ chế tác dụng
Vitamin B5 là tiền chất của coenzyme A cần cho phản ứng acetyl hóa
trong tân tạo glucose, giải phóng năng lượng từ carbohydrat, tổng hợp và
giáng hóa acid béo, tổng hợp sterol, nội tiết tố steroid, porphyrin, acetylcholin

3


và những hợp chất khác. Vitamin B5 còn có vai trò trong định vị tế bào, sự ổn
định và hoạt tính của protein [3].
Vitamin B5 ở người cần thiết phải lấy từ thức ăn, hoặc các thực phẩm bổ
sung khác.Vì sự phổ biến của vitamin B5 trong tự nhiên nên rất hiếm khi cơ
thể người thiếu hụt vitamin B5. Tuy nhiên nếu thiếu hụt vitamin B5 sẽ kéo
theo thiếu hụt coenzym A, lúc đó sẽ xuất hiện các triệu chứng như thoái hóa
thần kinh, thiểu năng tuyến thượng thận với các triệu chứng mệt mỏi, nhức
đầu, rối loạn giấc ngủ, đau bụng, đầy hơi, dị cảm tay chân, co thắt cơ [3].
1.1.5. Một số phương pháp định lượng vitamin B5
1.1.5.1. Phương pháp chuẩn độ đo thế
Hòa tan 0,18g chế phẩm Calci pantothenat trong 50 ml acid acetic khan.
Chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,1M. Xác định điểm kết thúc bằng
chuẩn độ đo thế[2].
1 ml dung dịch acid percloric 0,1M tương đương với 23,83mg
C18H32CaN2O10.
1.1.5.2. Phương pháp HPLC
Dược điển Mỹ (USP) [18] đã đưa ra một số phương pháp định lượng
vitamin B5 bằng HPLC như sau:
a. Phương pháp 1

Áp dụng đối với viên nang, viên nénchứa các vitamin tan trong nước (có
hoặc không chứa các vitamin tan trong dầu, khoáng chất).
Điều kiện sắc ký gồm:
- Chuẩn nội: acid p-hydroxybenzoic.
- Cột: C18 (3,9 mm× 15 cm; 5 µm).
- Pha động: acid phosphoric – nước tỉ lệ1:1000.
- Bước sóng phát hiện:210 nm.
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.

4


- Thể tích tiêm: 10 µl.
b. Phương pháp 2
Áp dụng đối vớiviên nang, viên nén chứa các vitamin tan trong nước (có
hoặc không chứa các vitamin tan trong dầu, khoáng chất).
Điều kiện sắc kí gồm:
- Cột: C18(3,9 mm× 30 cm; 5 µm), nhiệt độ cột: 50oC.
- Pha động:MeOH –dung dịch đệm tỉ lệ1 :9(dung dịch đệm được pha
bằng cách hòa tan 10g KH2PO4 trong 2000 ml nước điều chỉnh đến pH
3,5 bằng acid phosphoric).
- Bước sóng phát hiện:205 nm.
- Tốc độ dòng: 2 ml/phút.
- Thể tích tiêm: 25 µl.
c.Phương pháp 3
Áp dụng đối với dung dịch uống chứa các vitamin tan trong nước (có hoặc
không chứa các vitamin tan trong dầu, khoáng chất).
Điều kiện sắc kí gồm:
- Cột: C18 (4 mm× 10 cm; 3 µm).
- Pha động: MeOH – dung dịch đệm tỉ lệ3 : 97 (dung dịch đệm sử dụng

là dung dịch NaH2PO4 0,2M được điều chỉnh đến pH 3,2 ± 0,1 bằng
acid phosphoric 1,7M).
- Bước sóng phát hiện: 210 nm.
- Tốc độ dòng: 1ml/phút.
- Thể tích tiêm: 20µl.
1.1.6. Một số chế phẩmchứa vitamin B5 lưu hành trên thị trường
Vitamin B5 trên thị trường chủ yếu có mặt trong các chế phẩm đa sinh tố,
các sản phẩm dinh dưỡng hoặc phối hợp với một số hoạt chất để tạo ra tác
dụng hiệp đồng trong các sản phẩm thuốc[3].Các sản phẩm chứa vitamin

5


B5được bào chế dưới nhiều dạng khác nhau: viên nén (bao phim, bao đường),
viên nang mềm, viên sủi bọt, dung dịch uống, kem… nhằm đáp ứng nhu cầu
đa dạng của người sử dụng. Một số sản phẩm chứa vitamin B5 được trình bày
cụ thể tại bảng 1.1.
Bảng 1.1.Một số chế phẩm chứa vitamin B5 lưu hành trên thị trường
STT

Dạng bào

Tên biệt dược

Hàm

chế
1

2

Nhà sản xuất

lượng B5

Viên nang

Forceval capsules

4 mg

Alliance Pharma

mềm

Carmanus

16 mg

Traphaco

Vitamin 5B

50 mg

Hatechpharma

Anti Gray Hair

300 mg

Best Naturals

Viên nén

Vita - apha

6 mg

Armephaco

bao phim

Glotamin - C

20 mg

Glomed

Nature’s own

250 mg

Australian Made

10 mg

US Pharma USA

Multivitamin

1 mg

TV.Pharm

Viên nén sủi

Bicimax

23 mg

STADA - VN

bọt

Berocca

23 mg

BAYER

Viên nang
cứng

3

vitamin B5
Cystamin Plus –
US
4

Viên nén
bao đường

5

Như vậy rất nhiều các sản phẩm thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe có
chứa vitamin B5 đang lưu hành trên thị trường.
1.2. Vài nét về viên nang mềm Carmanus
Carmanuslà một sản phẩm thuốc của công ty cổ phần Traphaco.Carmanus
có thành phần chính là các hoạt chất chiết từ cây Kế sữa (Carduus marianus)
6


hiệp đồng tác dụng với các vitamin nhóm B, được bào chế dưới dạng viên
nang mềmgiúp cho việc điều trị và dự phòng gan nhiễm mỡ đạt hiệu quả cao
[21].
Cây Kế sữa là thảo dược đã được sử dụng hàng ngàn năm nay ở các nước
châu Âu để điều trị các bệnh về gan mật, bảo vệ gan khỏi các chất độc.Ngày
nay ở Mỹ có đến 1/3 dân số trưởng thành sử dụng các sản phẩm từ Kế sữa
một cách thường xuyên để chăm sóc sức khỏe và phòng ngừa bệnh tật [21].
Thành phần trong 1 viên:
- Cao Carduus marianus 200mg (silymarin 140 mg, silybin 60 mg).
- Vitamin B1 8mg.
- Vitamin B2 8 mg.
- Vitamin B3 24 mg.
- Vitamin B5 16 mg.
- Vitamin B6 8mg.
Các thành phần tá dược khác gồm: gelatin, glycerin, nipagin, nipasol, dầu
cọ, dầu đậu nành, ethyl vanillin, sáp ong trắng, aerosol, sorbitol special,

lecithin, oxyd sắt đỏ, oxyd sắt nâu, ethanol 96%.
Các thành phần trong công thức có tác dụng sau:
Cao Carduus marianus(silymarin, silybin): thúc đẩy sự phát triển của tế
bào gan và ngăn chất độc thấm qua tế bào, làm gia tăng khối lượng gan và
protein của microsom, tăng cường giải độc gan do làm tăng sự tạo thành các
cytochrom P-450 trong lưới nội bào, làm giảm những tổn thương do thiếu
máu cục bộ trên các tế bào không phải mô mềm của gan[6].
Vitamin B1: tham gia vào quá trình chuyển hóa glucid, ngăn chặn sự ứ
đọng các thể cetonic trong máu, bảo vệ gan[3].
Vitamin B2: tham gia vào quá trình chuyển hóa glucid, lipid, protid góp
phần bảo vệ và tăng sức đề kháng cho gan [3].

7


Vitamin B3: có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa cholesterol,
acid béo và tạo năng lượng ATP cung cấp cho chuỗi hô hấp tế bào, tăng
cường bảo vệ gan, chống lại những độc tố và hóa chất gây hại [3].
Vitamin B5: tham gia vào quá trình tái tạo glucose, phân hủy acid béo,
tổng hợp sterol, hormon steroid, porphyrin, hỗ trợ hoạt động chức năng gan
[3].
Vitamin B6: tham gia vào chuyển hóa lipid, glucid và chuyển protid thành
glucid và lipid, tăng cường hỗ trợ và bảo vệ gan [3].
Tác dụng của chế phẩm:
Bảo vệ gan duy trì ổn định màng tế bào gan.
Tăng khả năng oxy hóa các acid béo ở gan.
Chống hủy hoại tế bào gan, kích thích tái tạo các nhu mô gan.
Chỉ định:
Gan nhiễm mỡ, mỡ máu cao.
Rối loạn chức năng gan mãn tính, suy gan ở người nghiện rượu bia, bảo

vệ nhu mô gan khi dùng các thuốc có độc tính với gan.
Viêm gan cấp và mãn tính, hỗ trợ điều trị suy gan.
Liều dùng và cách dùng:
Người lớn: 1 viên/lần × 3 lần/ngày.
Trẻ em 6 – 12 tuổi: 1 viên/lần × 1 – 2 lần/ngày.
Liệu trình điều trị thông thường từ 4 – 6 tuần.
Chống chỉ định:
Mẫn cảm với các thành phần của thuốc.
Bệnh nhân đang bị loét dạ dày tiến triển, xuất huyết động mạch, hạ huyết
áp nặng.

8


1.3. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.3.1. Khái niệm sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – High Performance Liquid
Chromatography) là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển
qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ
số phân bố của chúng giữa 2 pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các
chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy
phụ thuộc vào các yếu tố đó. Thành phần pha động đưa chất phân tích di
chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời
gian hợp lí [1].
1.3.2.Cấu tạo hệ thống HPLC
Hệ thống cấp
pha động
Hệ thống thu
nhận, xử lí dữ
liệu (máy tính)

Bơm

Bộ phận
tiêm mẫu

Detectơ

Cột sắc
ký

Hình 1.2.Sơ đồhệ thống HPLC [1]
Do bản chất các chất phân tích khác nhau vì vậy có nhiều kĩ thuật để định
lượng bằng sắc ký lỏng. Tuy vậy cấu tạo của một máy sắc ký lỏng đều giống
nhau và có cùng 1 số bộ phận như sau:
1.3.2.1.Hệ thống cấp pha động
Pha động trong HPLC thường chứa trong bình thủy tinh, đôi khi bằng
thép không gỉ. Trước khi sử dụng cần lọc qua màng 0,45 µm và siêu âm để
đuổi khí hòa tan.Có 2 cách dùng pha động rửa giải:
Đẳng dòng: thành phần pha động không thay đổi trong qua trình sắc kí.

9


Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2-4 dung
môi đựng trong các bình khác nhau. Tỉ lệ các thành phần thay đổi trong quá
trình sắc kí theo chương trình đã định (chương trình dung môi)[1].
1.3.2.2.Hệ thống bơm
Để bơm pha động vào cột sắc ký. Yêu cầu chung của hệ thống bơm trong
sắc ký lỏng:

- Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên (1 psi
= 0,068 atm, 1atm = 1,01 bar)[1].
- Đảm bảo bơm lưu lượng lặp lại trong khoảng 0,01-5 ml/phút [1].
1.3.2.3.Hệ tiêm mẫu
Dùng để bơm mẫu phân tích vào cột sắc ký. Có thể tiêm bằng tay hoặc
tiêm bằng hệ thống tiêm tự động.
1.3.2.4.Cột sắc ký
Quá trình tách các chất diễn ra trong cột.Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao
thường được chế tạo bằng thép không gỉ, trơ với hóa chất, chịu được áp suất
cao tới vài trăm bar.Cột nhồi thường có hạt cỡ 5 hoặc 10 µm, số đĩa lý thuyết
dao động từ 40000 đến 60000/m [1].
Cột HPLC có nhiều cỡ khác nhau tùy thuộc vào mức độ và mục đích của
quá trình sắc ký.Một số cột còn có đầu bảo vệ.
Các máy sắc ký lỏng hiện đại còn trang bị thêm hệ thống điều nhiệt cột.
1.3.2.5.Detectơ
Chất phân tích được rửa giải trong cột và được phát hiện bởi detectơ. Tùy
theo bản chất của chất phân tích mà sử dụng các detectơ thích hợp bao gồm
các loại sau: UV-VIS, Huỳnh quang, Chỉ số khúc xạ, Tán xạ bay hơi, Điện
hóa…[1], [4].

10


1.3.3.Các thông số đặc trưng trong HPLC
1.3.3.1.Hệ số phân bố K
Đặc trưng cho tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định
bởi hệ số phân bố K:
K=

(Cs là nồng độ mol chất tan trong pha tĩnh và CM là nồng độ mol

chất tan trong pha động).
K càng lớn chất phân tích di chuyển qua pha tĩnh càng chậm [1].
1.3.3.2.Thời gian lưu tR
Là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột tới khi được phát hiện bởi
detectơ.Thời gian lưu càng lớn chất phân tích càng bị lưu giữu mạnh, thời
gian phân tích sẽ kéo dài.Thời gian lưu quá ngắn thì khả năng tách kém.
Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là xác
định.Vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện, định tính các chất.
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:
- Bản chất sắc ký của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc của hạt nhồi.
- Bản chất, thành phần, tốc độ pha động.
- Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế.
- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc pH của pha động, nồng độ chất
tạo phức, nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các cân bằng động trong
quá trình sắc ký [1], [8].
1.3.3.3.Hệ số dung lượng k’
Mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích qua cột hay còn được gọi là hệ
số phân bố khối lượng giữa hai pha.
k ’=

.
.

=K

=

Trong đó: CS, CM lần lượt là nồng độ mol chất tan trong pha tĩnh và pha
động.

11


VS, VM lần lượt là thể tích của pha tĩnh và pha động tương ứng.
tR là thời gian lưu của chất phân tích, tM là thời gian chết tức thời gian của
chất không lưu trữ.
Hệ số k’ không chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích, bản chất 2
pha mà còn phụ thuộc vào tỉ lệ VS/VM.
k’ quá lớn thời gian phân tích sẽ kéo dài. Thường chọn điều kiện sắc kí để
k’dao dộng từ 1 đến 5 [1], [4].
1.3.3.4.Hệ số chọn lọc α
Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỉ đối của 2 chất A và B người ta dùng hệ
số chọn lọc α:
α = KB/KA = k’B/k’A =

(

)

(

)

Qui ước: KB > KA nên hệ số chọn lọc α > 1.
Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05≤ α ≤ 2 [1], [4].
1.3.3.5.Số đĩa lí thuyết và hiệu lực cột N
N= 16

2

= 5,54(

)

2

Trong đó W là chiều rộng của pic sắc ký.W1/2 là chiều rộng pictại một nửa
chiều cao pic[1], [4], [8].
1.3.3.6.Hệ số đối xứng F
Để đánh giá tính đối xứng của pic ta dùng hệ số đối xứng:
F=
Trong đó:
W: chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.
a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong
phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.
Yêu cầu: F khi chuẩn hóa cột từ 0,9 – 2,0.
12


Hệ số đối xứng thấp do hiện tượng mở rộng dải (doãng pic), nguyên nhân
có thể do quá trình khuếch tán xoáy, khuếch tán dọc, hoặc quá trình chuyển
khối không cân bằng [1], [4], [8].
1.3.3.7.Độ phân giải RS
Là đại lượng đo mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và
B)
RS =

á
Đ

ì

=

(

)

(

(

)
)

=

,

[(
/

)

(

) ]
/

Trong đó (tR)A và (tR)B là thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (A và B).

WA và WB: độ rộng pic đo ở các đáy pic.
W1/2A, W1/2B: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
Yêu cầu: RS> 1, Giá trị tối ưu RS = 1,5[1], [4], [8].
1.3.4. Pha tĩnh trong HPLC
Pha tĩnh HPLC là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ phân tách một hỗn hợp
chất phân tích.Đó là những chất rắn xốp, kích thước hạt rất nhỏ, đường kính
hạt thường dao động từ 3 - 10 µm. Kích thước hạt càng nhỏ chiều cao đĩa lý
thuyết càng giảm nên số đĩa lý thuyết càng tăng. Tuy nhiên khi kích thước hạt
càng nhỏ áp lực đối với pha động càng lớn khi đó cột phải chịu được áp suất
đầu vào cao.
Chất nhồi cột cho sắc ký lỏng thường chế tạo từ silica (silic oxyd) bằng
cách làm kết tụ các hạt silica để tạo ra các hạt có kích thước lớn hơn và đường
kính đều nhau [1].
Điều kiện đối với một pha tĩnh:
- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký.
- Có khả năng tách chọn lọc.
- Tính chất bề mặt phải ổn định.
- Cỡ hạt tương đối đồng nhất.

13


- Cân bằng động học của quá trình tách phải xảy ra nhanh và lặp lại.
1.3.5.Pha động trong HPLC
Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột. Là một
yếu tố linh động và dễ dàng thay đổi. Nó có thể là một dung môi hoặc hỗn
hợp nhiều dung môi được trộn lẫn với nhau theo tỉ lệ nhất định.
Pha động là một trong những yếu tố quyết định khả năng tách của các chất
phân tích trong một hỗn hợp mẫu. Nó ảnh hưởng trực tiếp đến thời gian lưu
của các chất phân tích và hiệu quả của quá trình sắc ký.Pha động có thể ảnh

hưởng đến:
- Độ chọn lọc của hệ pha.
- Thời gian lưu trữ chất tan.
- Hiệu lực tách của cột.
- Độ phân giải các chất trong pha tĩnh.
- Độ rộng và sự cân đối của pic sắc ký.
Điều kiện đối với pha động:
- Phải trơ với pha tĩnh.
- Hòa tan được các chất phân tích.
- Bền vững theo thời gian.
- Có độ tinh khiết cao.
- Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
- Phù hợp với các loại detectơdùng để phát hiện các chất phân tích.
- Có tính kinh tế và không quá nguy hiểm.
Các yếu tố cần chú ý trong lựa chọn pha động:
- Bản chất, thành phần dung môi lựa chọn làm pha động.
- Tốc độ dòng pha động.
- pH của pha động.

14


1.3.6. Một số phương pháp định lượng trong HPLC
Các phương pháp định lượng bằng HPLC đều dựa trên nguyên tắc: nồng
độ của chất phân tích tỉ lệvới chiều cao hoặc diện tích pic. Các phương pháp
thường được sử dụng trong sắc ký là:
- Phương pháp chuẩn ngoại.
- Phương pháp chuẩn nội.
- Phương pháp chuẩn hóa diện tích.
Trong khuôn khổ khóa luận, chúng tôi xin trình bày cụ thể về phương

pháp chuẩn ngoại.Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu
chuẩn và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện
tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu
chuẩn sẽ tính được nồng độ chất trong mẫu thử. Có thể sử dụng phương pháp
so sánh (chuẩn hóa 1 điểm) hoặc đường chuẩn (chuẩn hóa nhiều điểm).
- So sánh (chuẩn hóa 1 điểm): Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng
độ của mẫu thử. Tính nồng độ mẫu thử theo công thức: CX = CS ×
CX, CS: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn.
SX, SS: diện tích pic của chất phân tích trong SKĐ mẫu thử và mẫu chuẩn.
- Đường chuẩn (chuẩn hóa nhiều điểm):
Cách tiến hành: Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn
tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc
chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn. Vẽ đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa
diện tích S (hoặc chiều cao H) của pic với nồng độ của chất chuẩn.Sử dụng
khoảng tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác
định. Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích
(hoặc chiều cao) pic với nồng độ của chất cần xác định: y = ax + b
Trong đó:

15


y: diện tích pic (hoặc chiều cao).
a: độ dốc của đường chuẩn.
b: giao điểm của đường chuẩn với trục tung.
x: nồng độ của chất phân tích.
Chú ý: Độ lớn của diện tích hoặc chiều cao pic mẫu thử phải nằm trong
khoảng tuyến tính của đường chuẩn [1], [4], [8].

16

CHƯƠNG 2.NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 . Điều kiện thực nghiệm
2.1.1.Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: viên nang mềm Carmanus, số lô: 0217.
Mẫu placebo: thành phần như chế phẩm nhưng không có vitamin B5.
Vitamin B5 chuẩn (calci pantothenat) hàm lượng 99,0%.
2.1.2.Hóa chất, dung môi
- KH2PO4 tinh khiết phân tích (Merck – Đức).
- Dung dịch H3PO4 85 % tinh khiết phân tích (Scharlau – Tây Ban Nha).
- Cloroform tinh khiết phân tích (Việt Nam).
- MeOH tinh khiết HPLC (Merck – Đức).
- Nước cất 2 lần.
2.1.3.Dụng cụ thiết bị
-Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent Technologies 1200 series, tiêm
mẫu tự độngcủa Mỹ.
-Cột sắc ký pha đảo: Apollo C18 (4,6 mm × 25 cm; 5 µm)của Grace
Alltech, Mỹ.
-Cân phân tích: AB204 (d = 0,1 mg), XPE 105 (d = 0,01 mg) của Mettler
Toledo, Thụy sĩ.
-Tủ lạnh bảo quản: Haier HYC – 940của Trung Quốc.
-Tủ sấy: Memmert ULM – 500 của Đức.
-Máy lắc xoáy: Labinco L46của Hà Lan.
-Máy hút chân không: 22AN – 18 KNFcủa Đức.
-Máy siêu âm: WUC – A22Hcủa Hàn Quốc.
-Bình gạn 500ml, pipet thủy tinh, bình định mức, ống đong, cốc có mỏcủa
Đức.

17