Xây dựng phương pháp định lượng xylometazolin HPLC trong thuốc nhỏ mũi nostravin của công ty cổ phần dược phẩm traphaco bằng HPLC

b ọ Y t ễ
TRƯ Ờ N G ĐẠI H Ọ C Dược HÀ N Ộ I

» D c a

NG Ô ANH NG Ọ C
XfìV DỰNG PHƯƠNG PHRP Đ.ÌNH LƯỢNG
• • •
XVLOM€TnZOLIN.Ha TRONG THUỐC NHỎ MŨI NOSTRRVIN
củn CÔNG TV CỔ PHẦN Dược PHẨM TRRPHRCO
BÀNG HPLC
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ược SỸ KHOÁ 2001-2006)
Người hướng dãn; PGS.TS Trần Đức Hậu
Nơi thực hiện: Bộ môn Hoá Dược
Thời gian thực hiện: tháng 06 - 12/2005
Hà nội, tháng 05 - 2006
Lời cảm ơn
Nhân dịp hoàn thành khoá luận tốt nghiệp, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn
và cám ơn chân thành lới:
P Q § . T S T r ầ n Đ ứ c l ị ậ u
Người thầy kính mến đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo, giúp đỡ
tôi hoàn thành khoá luận.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến:
- Các thầy cô, các cán bộ trong bộ môn Hoá Dược đã tạo điều kiện
về cơ sở vật chất, đồng thời đã giúp đỡ, động viên tôi.
- Phòng KTCL - CTCPDP Traphaco đã có sự hợp tác và cung cấp
nguyên liệu cho đề tài.
- Bộ môn Hoá vô cơ và bộ môn Bào chế.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bè bạn đã động viên, giúp đỡ tôi trong
thời gian qua.
H à nội, tháng 05 - 2006

Sinh viên
N gô A n h N gọc
MỤC LỤC
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
ĐẬT VẤN Đ Ể
.

I
PHẦN I: TỔNG QUAN 3
1.1. Tổng quan về thuốc nhỏ mũi Nostravin 3
1.1.1. Hình ảnh sản phẩm 3
1.1.2. Công thức bào chế 3
1.1.3. Tác dụng 4
1.1.4. Chỉ định 5
1.1.5. Tác dụng không mong m uốn 5
1.1.6 . Thận trọng 5
1.1.7. Tương tác thuốc 5
1.1.8. M ột số thuốc nhỏ mũi chứa Xylometazolin.HC l

5
1.2. Tổng quan về HPLC 6
1.2.1. Khái niệm về sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao
6
1.2.2. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC 6
1.2.3. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh hưởng 10
1.2.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký 15
1.2.5. Định lượng bằng phương pháp HPLC 18
PHẦN II: ĐỐI TƯỢNG, THIẾT BỊ, HOÁ CHẤT, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u 20
2.1. Đới tượng 20

2.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất 20
2.2.1. Thiết bị, dụng cụ 20
2.2.2. Hoá chất 20
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

.

21
2.3.1. Nghiên cứu, xây dựng phương pháp định lượng Xylom etazolin.HCl bằng
HPLC (sắc ký pha đảo) 21
2.3.2. Đánh giá phương pháp vừa xây dựng về các mặt: tính chính xác, tính tuyến
tính, tính đặc hiệu và tính đúng 22
2.3.3. Áp dụng phương pháp để xác định hàm lượng Xylom etazolin.HCl cho một
lô sản phẩm Nostravin 23
2.3.4. M ột số công thức toán thống kê được sử dụng để đánh giá kết quả

23
PHẦN III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QU Ả

.

24
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng Xyiometazolin.HCl trong thuốc nhỏ
mũi Nostravin bằng H PLC 24
3.1.1. Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc k ý 24
3.1.2. Tiến hành khảo sát và lựa chọn các điều kiện sắc ký cho phương pháp định
lượng 24
3.1.3. Thử tính thích hợp của hệ thống 27
3.2. Đánh giá phương pháp 29
3.2.1. Tính chính xác 29

3.2.2. Tính tuyến tính

29
3.2.3. Tính đặc hiệu 31
3.2.4. Tính đúng 34
3.3. Áp dụng phưong pháp đê xác định hàm lượng Xylometazolin.HCl trong

một lô sản phẩm Nostravin 36
3.4. Kết quả và bàn luận 37
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XưẤT 40
4.1. Kết luận

40
4.2. Đề xuất 40
TÀI LIÊU THAM KHẢO
PHU LUC
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
CTCPDP
Công ty cổ phần dược phẩm
HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
NXB
Nhà xuất bản
PA
Tinh khiết phân tích
KTCL
Kiểm tra chất lượng
TKH
Tên khoa học
VKN

Viện kiểm nghiệm
ĐẬT VÂN ĐỂ
Cảm lạnh là một bệnh thường gặp ở nhiều quốc gia trên thế giới, trong
đó có Việt Nam. Bệnh do nhiều loại virus khác nhau gây ra, bao gồm;
rhinovirus, Coronavirus, RSV, parainfluenza virus, adenovirus, enterovirus,
influenza A virus, và influenza B virus. Triệu chứng thường gặp của bệnh;
nghẹt mũi, tắc mũi. đau họng, hắt hơi, đau đầu. khó chịu, chảy nước mắt, ho,
khản giọng, Tác nhân là virus nên chưa có liệu pháp điều trị đặc hiệu, chủ
yếu là điều trị triệu chứng [12].
Thuốc nhỏ mũi chứa Xylometazolin.HCl là một trong những thuốc điều
trị có hiệu quả đối với bệnh trên; làm giảm xung huyết mũi và dùng dưới dạng
nhỏ mũi nên tác dụng nhanh, ít tác dụng phụ (chủ yếu là tác dụng khư trú).
Sản phẩm thuốc nhỏ mũi chứa hoạt chất này được nhiều công ty trong nước và
ngoài nước sản xuất; Otrivin (Novartis - Mỹ), Nostravin (Traphaco - Việt
Nam), Có một số phương pháp được dùng để định lượng
Xylometazolin.HCl trong thuốc nhỏ mũi như sau:
<♦ Trong các Dược điển:
- Trong Dược điển Anh BP2003 và Dược điển Mỹ USP28 ¡phụ lục I ỉ:
Nguyên tắc: Dùng phương pháp đo quang trong vùng khả kiến với quá
trình tạo màu sau nhiều giai đoạn chiết tách với dung môi hữu cơ.
Đặc điểm: Phương pháp này có quá nhiều công đoạn, mất nhiều thời
gian để thực hiện. Đặc biệt là phải qua giai đoạn chiết tách, đây là giai đoạn
dễ làm hao hụt lượng Xylometazolin.HCl.
- Còn trong Dược điển Việt Nam ỉlỉ và Dược điên quốc fế (third
edition): chưa có chuyên luận về Xylometazolin.HCl và thuốc nhỏ mũi chứa
Xylometazolin.HCl.
<♦ Tại CTCPDP Traphaco đã áp dụng hai phương pháp định lượng
Xylometazolin.HCl trong thuốc nhỏ mũi Nostravin:
- Phương pháp đo quang:
Nguyên tắc: thực hiện tương tự phương pháp định lượng có trong

BP2003 nhưng bỏ qua giai đoạn chiết tách để rút ngắn thời gian định lượng.
Đây là sự vận dụng của phòng KTCL - CTCPDP Traphaco để đáp ứng
nhu cầu kiểm nghiệm nhanh sản phẩm sau khi sản xuất ra.
- Phương pháp HPLC [phụ lục 21: phương pháp này được sử dụng gần
đây tại phòng KTCL - CTCPDP Traphaco để kiểm tra hàm lượng
Xylometazolin.HCl cho sản phẩm Nostravin.
Nguyên tắc: sử dụng sắc ký pha thuận với cột Si 60.
Cả hai phương pháp định lượng trên đều có chung hạn chế: độ ổn định
của phương pháp không cao.
Trước thực tế đó, các cán bộ phòng KTCL - CTCPDP Traphaco mong
muốn xây dựng một phương pháp định lượng cho kết quả ổn định hơn. Theo
đề nghị của phòng KTCL - CTCPDP Traphaco, chúng tôi đã tiến hành nghiên
cứu đề tài “X«J dựng phương pháp định lượng Xylometazolin.HCl trong
thuốc nhỏ mũi Nostravin'" với những muc tiêu:
7. Xầy dựng phương pháp định lượng Xyỉometaiolin.HCÌ trong thuốc nhỏ
mũi Nostravin do CTCPDP Traphaco sản xuất hằng HPLC đáp ứng đầy đủ
các chỉ tiêu của một phương pháp cíịnli lượng.
2. Áp dụng phương pháp trên đê' xác định hàm lượng Xylometazolin.HCỉ
cho một lô sản phẩm Nostravin.
PHẦN I: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỂ THƯỐC NHỞ MŨI NOSTRAVIN [8], [11], [16
[17], [18].
1.1.1. Hình ảnh sản phẩm
1.1.2. Công thức bào chế
- Dạng dùng: dung dịch Xylometazolin.HCl 0,05%. Dung tích: lOml
- Thành phần;
+Xylometazolin.HCl 5 mg
+Thiomersal 2,25 mg
+Một số thành phần khác
*x* Xylometazolin.HCl:

- Công thức;
• HCI
Công thức phân tử: C,f,H24N2.HCl
Phân tử lượng; 280.84
TKH: 2-(4-tert-butyl-2,6-dimethylbenzyl)-2-imidazoline hydrochloride.
- Tính chất vật lý:
Bột tinh thể màu trắng hoặc gần như trắng.
Tan nhiều trong nước, tới 3 %; cũng tan trong methanol, ethanol; thực
tế không tan trong ether, benzene.
pH = 5,0->6,6 (dung dịch 5%).
- Tác dụng:
Chất chủ vận bộ phận tại receptor a l và a2 - adrenergic.
❖ Thiomersal:
- Công thức:
Công thức phân tử: CụHyHgNaOìS
Phân tử lượng: 404.8
TKH: Na ethyl [2 -sulphanyl benzoato(2-)-ơ,5'] Hg (1-).
- Tính chất vật lý:
+ Bột tinh thê màu trắng hoặc gần như trắng.
+ Dễ tan trong nước, tan trong cồn, không tan trong methylen clorid.
- Tác dụng: Sát khuẩn
Được dùng làm chất bảo quản.
1.1.3. Tác dụng
Thuốc nhỏ mũi chứa Xyỉometazolin.HCl là một thuốc làm thông mũi
do: làm co các mạch máu, đặc biệt có tác dụng trực tiếp trên các mạch máu
của mô mũi. Sự co các mạch máu ở mũi và xoang làm giảm xung huyết mũi.
1.1.4. Chỉ định
Điều trị xung huyết do các bệnh: dị ứng, sốt phát ban, kích ứng mũi và
đặc biệt trong bệnh cảm lạnh.
1.1.5. Tác dụng không mong muôn

- Hiếm gặp: dị ứng (khó thở, đau họng, sưng môi, lưỡi hay mặt); động
kinh, ảo giác; nhịp tim nhanh hoặc không bình thường.
- Hay gập: hắt hơi, nóng mũi, đau mũi, khô mũi, kích ứng mũi.
1.1.6. Thận trọng
- Phụ nữ có thai hoặc phụ nữ cho con bú.
- Bệnh nhân mắc một số bệnh: tâng huyết áp, tim mạch, tuyến giáp,
đái tháo đường, tâng nhãn áp, gan, thận, phì đại tuyến tiền liệt hoặc đi tiểu
khó.
1.1.7. Tương tác thuốc
Chất ức chế monoamine oxidase (MAO): isocarboxarid (Marplan),
phenelzine (Nardil), tranylcypromine (Parnate).
1.1.8. Một sô thuốc nhỏ mũi khác chứa Xylometazolin.HCI có mặt trên
thị trưòng
OtrtvMỠM vlrt
Thuốc nhỏ mũi Otrivin của Novartis là một thuốc nổi tiếng trên thế giới.
Thuốc có mặt tại nhiều nước, trong đó có Việt Nam.
Ngoài Otrivin, còn có một số thuốc nhỏ mũi khác chứa
Xylometazoline.HCl với các tên biệt dược: Neo-Rinoleina; Novorin; Olynth;
Otriven; Xymelin.
1.2. TỔNG QUAN VỂ HPLC [4], [5], [6], [14], [15], [19], [20]
1.2.1. Khái niệm về sác ký và sác ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
a. Khái niệm về sắc ký
Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần
của một hỗn hợp. Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các
chất giữa hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau: một pha tĩnh và
một pha động
b. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phương pháp HPLC là phương pháp sắc ký được xác định dựa trên sự
phân tách của các chất giữa hai pha: pha động và pha tĩnh.
HPLC sử dụng pha động là chất lỏng để tách các chất trong hỗn hợp.

Những chất này đầu tiên được hoà tan trong một dung môi, sau đó được chảy
qua cột dưới áp suất cao. Trong cột, hỗn hợp được rửa giải thành nhiều thành
phần. Mức độ rửa giải là quan trọng, và nó phụ thuộc vào mức độ tương tác
giữa các thành phần chất tan với pha tĩnh và pha động. Sự tương tác của chất
tan vói pha tĩnh và pha động có thể thay đổi thông qua sự lựa chọn hai pha
này. Kết quả, HPLC tạo ra một sự phân tách cao mà không tìm thấy trong các
hệ thống sắc ký khác và nó có khả năng phân tách dễ dàng một hỗn hợp gồm
nhiều chất hoá học.
1.2.2. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC
a. Nguyên tắc chung
Hệ thống HPLC bao gồm: hệ thống bơm, hệ tiêm mẫu, cột, detector và hệ
thống ghi và phân tích dữ liệu.
Cột là bộ phận quan trọng nhất - nơi xảy ra sự tách các chất. Cộl chứa các
tiểu phân xốp của pha tĩnh. Các tiểu phân này có kích thước nhỏ. Người ta
dùng một bơm cao áp để đẩy pha động chảy qua cột. Quá trình sắc ký bắt đầu
khi tiêm chất tan lên một đầu của cột. Khi chất tan và pha động được đẩy
xuyên qua cột thì sự phân tách các chất xảy ra. Mỗi chất tan được rửa giải từ
cột được detector ghi lại dưới dạng một pic.
b. Các bộ phận
Sơ đồ hệ thông:
Các bộ phận:
1. Bình, thiết bị lọc pha động:
Bình đựng dung môi thường dùng chai thuỷ tinh. Hầu hết các nhà sản xuất
cung cấp những nắp chai đặc biệt đi cùng những chai này. Dây dẫn và thiết bị
lọc được nối với bơm và sử dụng khí trơ (helium) đê loại các khí hoà tan.
2. Hệ thống b(ửn:
Bcím cao áp dùng để đẩy pha động đi qua cột.
Các tiểu phân pha tĩnh càng nhỏ thì yêu cầu áp suất càng cao. ưu điểm của
dùng bơm cao áp: phân tích nhanh, hệ số rửa giải cao, và tăng khả năng nạp
mẫu.

Bơm hiện đại thường có các thông số:
+ Khoảng tốc độ chảy: 0,01 - 10
ml/phút.
+ Độ ổn định của tốc độ chảy:
không thấp hơn 99 %.
+ Áp suất tối đa; 5000 psi.
3. Cột:
Cột HPLC thường có các thông số:
- Chiều dài 10, 15, hoặc 25 cm và
thích hợp với những tiểu phân pha
tĩnh có đường kính rất nhỏ (3, 5, 10 -
ịim).
- Chiều rộng: 4 hoặc 4,6 mm. '•?
Nói chung, cột HPLC có tuổi thọ khá dài nếu chúng ta sử dụng đúng cách.
Nếu sử dụng không đúng tuổi thọ của cột sẽ giảm, ví dụ; dung môi có tính
acid mạnh hoặc base mạnh, hoặc tiêm liên tiếp các mẫu sinh học hay nguyên
liệu bẩn.
4. Detectoy:
Khi hệ pha động rửa giải các chất ra khỏi cột chúng được ghi bởi
detector và chuyển thành tín hiệu trên sắc ký đồ.
Quá trình xảy ra trong detector: khi detector hoạt động, có một chùm
sáng được phát ra xuyên dòng pha động đang chạy (cell). Sự biến đổi trong
cường độ sáng do: sự hấp thụ tử ngoại, sự phát huỳnh quang, hay thay đổi
trong chỉ số khúc xạ (tuỳ thuộc vào loại detector) từ các thành phần trong mẫu
đi qua tế bào (cell), được chuyển thành sự thay đổi điện thế. Sự thay đổi điện
thế được ghi lại trong thiết bị ghi kiểu đổ thị và thường xuyên được chuyên
vào máy tích phân hay máy vi tính đế cung cấp thời gian luxi và diện tích hay
chiều cao pic.
Detector hay dùng nhất là detector hấp thụ tử ngoại.
NguoJi AS TT\

Detector
TỂ BÀO DETE( TOR in ( Hõ HPL(
5. Hệ tiêm mầu:
Có nhiều phương pháp tiêm mẫu. Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng
một van tiêm. Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động.
Trong sắc ký lỏng, mẫu lỏng
có thể được tiêm ngay sau khi đã
lọc loại tạp qua màng lọc 0,43
|im, còn mẫu rắn cần hoà tan
trong một dung môi thích hợp.
Dung môi không nhất thiết phải
là pha động, nhimg nó thường
xuyên được chọn để tránh làm
nhiễu detector, hoặc làm giảm
hiệu lực của cột.
f:>ĩJON<'ỳ Rr\NH

fT:TA
So’ dồ của mộí hệ tiêm mẫu
6. Hệ thống gỉii và phân tích dữ liệu:
Tín hiệu detector là tín hiệu điện và sử dụng thiết bị hiện đại có thể giúp
cho việc phân tích dữ liệu. Thêm nữa, vài hệ thống có thể luii giữ dữ liệu và có
thể lấy ra cho phân tích phức tạp hơn về sau.
Mục tiêu chính của việc sử dụng hệ thống lưii và phân tích dữ liệu trên là
tăng tính chính xác và tính đúng, trong khi người sử dụng lại giảm được thời
gian phải trực máy. Có vài loại hệ thống dữ liệu. Trong phân tích thông
thường (quá trình quản lý dữ liệu và điều khiển quá trình là không tự động),
một chương trình tích phân có thể thích hợp. Nếu yêu cầu mức độ kiểm tra cao
hơn, một thiết bị thông minh hơn là cần thiết: giống như một máy vi tính loại
nhỏ. ưu điểm của thiết bị thông minh này trong sắc ký thể hiện trong một sô

phần. Đầu tiên, sự lựa chọn tự động bổ sung trở nên dễ dàng hơn. Thứ hai.
phân tích dữ liệu phức tạp trở nên khả thi hơn. Những sự lựa chọn phân tích
này bao gồm những đặc trưng như: sự tối lai thông số chạy và sự phân tách
của những pic chồng lên nhau. Cuối cùng, bảo vệ bằng phần mềm có thê được
thiết kế để giảm các lỗi sử dụng hệ thống một cách ngẫu nhiên. Ví dụ, người
thực hiện có thể thiết lập giới hạn tỷ lệ của sự thay đổi dung môi. Điều này sẽ
kéo dài tuổi thọ của cột bởi giảm nhiệt độ và các ảnh hưởng hoá học. Nói
chung, chương trình do ngưòi sử dụng thiết lập rẻ hơn và có tính thực tế hơn.
1.2.3. Các thông sỏ đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tô ảnh
hưỏng:
a. Tốc độ di chuyển của các chất
Sư phân bố chất tan siữa hai pha:
Sự phân bố của chất tan giữa các pha có thể miêu tả khá đơn giản. Chất tan
tồn tại trong một trạng thái cân bằng giữa hai pha: pha động và pha tĩnh.
A -7—^ Á
^pỉìii cỉộììsị " ^pỉia íĩiìli
Hê số phân bố, K, có giá trị bằng tỷ số nồng độ mol của chất tan trong pha
tĩnh trên nồng độ mol của chất tan trong pha động.
Cs và Cm là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh và pha động.
Vói một chất ,nếu K lớn thì chất đó sẽ phân bố nhiều vào pha tĩnh và sẽ di
chuyển chậm, nếu K nhỏ thì nó sẽ di chuyển nhanh.
10
‘ M
A
\
Thời sign lưu, tp (phút), là thời gian
cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm
mẫu qua cột sắc ký, tói detector và cho g
pic trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm đến I
xuất hiện đỉnh của pic). I

là thời gian lưu của một chất H
không bị lim giữ, nghĩa là tốc độ di jiiY^g
chuyển của nó bằng tốc độ di chuyển
trung bình của các phân tử dung mồi.
Thừa sốdiinỊi ÌKơrìịì, K \ thường dùng để mô tả tốc độ di chuyến của chất
tan trên cột. Thừa số dung lượng cho chất tan A được xác định;
k ' = h ^
Ir, được xác định từ sắc đồ.
Khi K’<1: quá trình rửa giải diễn ra rất nhanh. Do đó, thời gian km của
chất tan được ghi lại có độ chính xác không cao.
Khi K ’>20: quá trình rửa giải diễn ra quá dài.
Tốt nhất: K K ’<5.
Hê số hất dối (Asymmetry
factor), có 2 cách xác định:
+ Cách 1: A F= —
CA
Chiều rộng pic được đo ở 1/10
chiều cao pic.
Yêu cầu; AF = 0,9 - 2,0.
Yếu tố ảnh hưởng: Cột, pH,
thể tích tiêm.
w
10 %
cua vlucu
c ao pK
+ Cách 2: AF=-
¿a
ở đây: w là độ rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.
a là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường
cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.

Số đĩa lý thuyết N :
+Mẫu dĩa lý thuyết: mẫu đĩa cho rằng cột sắc ký chứa đựng một số lớn các
lớp phân biệt, gọi là đĩa lý thuyết.
^

Côt sắc kv ___________________________^
Đ ĩa lý
thuyết
Thực tế: đĩa không tồn tại, chúng là sự liên tưởng về hình ảnh giúp chúng
ta hiểu quá trình xảy ra ở trong cột.
Số đĩa lý thuyết của một cột thật có thể được tìm thấy bởi sự phân tích pic
sau quá trình rửa giải:
2 2
N = 1 6 ; ^ hay N = 5 . 5 4 ^
Wb'. chiều rộng đo ở đáy pic
W|/2: chiều rộng đo ở nửa chiều cao pic.
Ta thấy khi cột có hiệu lực cao (N lớn) thì Wg nhỏ.
b. Sự chọn lọc và sự phân giải
Xét sự tách hai chất A và B trên cột. Lúc đầu, cho hỗn hợp hai chất A, B
lên đầu cột, ở đó A và B tự phân bố vào hai pha (một cách khác nhau). Thêm
dung môi mới vào cột, phần dung môi mới sẽ đẩy dung môi có hoà tan A, B
xuống phần cột bên dưới. Tiếp tục thêm dung môi mới, A và B bị kéo dần
xuống. Tại một thời điểm nào đó hai dải A và B tách riêng ra khỏi nhau ỏ’ trên
cột. Nếu ngừng tại đây ta có sắc ký khai triển.
12
Nếu tiếp tục thêm dung môi mới, thì tại một thời điểm nào đó lần lượt dải
chất A, rồi đến dải chất B ra khỏi cột. gặp detector và cho ta tín hiệu dưới
dạng một pic. sắc đồ thu được gọi là sắc đổ rửa giải.
QUA IJRINH SAC K ¥
lUA

B
H£ 50 Í‘]BL-U'Ỉ BO;
K = Cì/Cn
A
SỊl RT!a «-íĩa iọ u a cot
A
B
Sơ đồ minh hoạ quá tyình rách hai chất A vù B trên cột sắc ký.
Sư chon ỉoc: (miêu tả sự tách của hai chất A và B trên cột)
k'
*-R A ■
+ Thông số này độc lập vói hiệu lực của cột. Nó chỉ phụ thuộc vào loại
chất tan, loại và thành phần pha động, và bề mặt hoá học của chất hấp phụ.
+ Để tách riêng hai chất thường chọn a =1,5 - 2,0. Nếu a càng lớn hai
chất tách nhau càng tốt, a nhỏ hai chất khó tách. Nhưng a quá lớn thì thời
gian phân tích sẽ quá dài, còn a =1 thì không có cách nào tách hai chất.



Đô phân siải:
'■ư . |:,Ị'-
+ Độ phân giải cơ bản đạt được khi R = 1,5.
+ Ngoài ra còn tính R dựa trên:
.Œ/ r / - ì ['^^'"1
-4 , ư l '
Muốn đạt được độ phân giải cao thì có 3 cách:
+ Tăng N (tãng số lượng đĩa lý thuyết):
Tăng chiều dài cột dẫn đến tăng thời gian lưu và tâng sự doãng pic - đó
không phải là điều mong muốn.
Giảm chiều cao của một đĩa lý thuyết bằng cách giảm kích cỡ của các

tiểu phân nhồi pha tĩnh.
+ Kiểm soát thừa số dung lượng k ’; thay đổi thành phần pha động.
+ Hệ số chọn lọc a, có một số cách để thay đổi:
Thay đổi thành phần pha động
Thay đối nhiệt độ của cột
Thay đổi thành phần của pha tĩnh
Sử dụng liên kết hoá học đặc biệt: kết hợp một chất trong dạng
phức hợp với một chất tan vào trong pha tĩnh.
14
1.2.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký
So sánh sắc kỷ pha thuận và sắc ký pha đảo
Sắc ký pha thuận
STT
Nội dung
so sánh
Sác ký pha đảo
Chất tan
Thân dầu: dầu,
chất béo, lipid.
Thân nước: hầu hết các hoạt chất làm
thuốc.
Pha tĩnh
Silica trung tính,
trên bề mặt có các
nhóm OH phân
cực (thân nước).
Loại này sử dụng
làm pha tĩnh cho
sắc ký pha thuận
đê phân tích các

chất ít hoặc không
phân cực.
Silica đã alkyl hoá, được điều chế bằng
cách alkyl hoá các nhóm OH trên bề
mặt Silica bằng các gốc alkyl: R của
mạch carbon (C2, C
8, C18) hay các
gốc carbon vòng. Do các nhóm OH
thân nước được thay bằng các gốc R kỵ
nước nên bề mặt trở nên ít phân cực
hơn. Silica đã alkyl hoá được sử dụng
cho sắc ký pha đảo để phân tích các
chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký
cặp ion.
Pha động
Dung môi hữu cơ:
n-hexane, heptane,
chloroform,
alcohol.
Hỗn hợp nước với methanol, acetonitril
và một số chất thêm vào (đệm. cặp
ion).
15
- Sơ đồ minh hoạ thứ tự rửa giải của các thành phần trong sắc ký pha thuận
và pha đảo:
Pha tĩnh:
+ Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định sự tách của một hỗn hợp
nhiều chất.
+ Pha tĩnh được chế tạo trên các nền: Silica (SÌO
2), oxyd nhôm

(AI2O3), cao phân tử hữu cơ (cellulose), mạch carbon. Trong đó. pha
tĩnh trên nền silica có nhiều LIII việt và được sử dụng nhiều nhất.
+ Chất nhồi cột cho pha tĩnh trên nền silica (SÌO2):
CH-,

o

Si
R
CH3
+Một số nhóm thế trong sắc ký pha thuận và pha đảo:
Pha thuận: nhóm thế làm tăng độ phân cực:
cyano: -C
2
H
4
CN
diol: -C^H.OCH.CHOHCHPH
amino: -QHftNHo
16
dimethylamino; -C,Hf,N(CH3)2
Pha đảo: nhóm thê làm giảm độ phân cực:
PHA ĐÀO
Octadecyl
Octyl -
Dimethyl -
ĩ C H ,
+ Một SỐ loại cột thường dùng trong sắc ký pha thuận và pha đảo:
Loại sắc ký
Nhóm th ếR

Tên thương mại
Pha thuận
(Silica trung tính)
-OH
Lichiosorb Si 60
Pha đảo
(Silica đã alkyl hoá)
Octyl (-Q H p)
Nucleosil C8
Lichj'osord RP8
Octadecyl (-C,x]-Ỉ37)
NucleosilClS
Lichrosord RP18
+ Yêu cầu pha tĩnh trong HPLC:
Phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký.
Có khả năng tách một hỗn hợp chất tan nhất định.
Tính chất bề mặt ổn định.
Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt.
Cỡ hạt phải tương đối đổng nhất.
- Pha động:
+ Pha động quyết định thời gian lull của chất tan và hiệu quả tách của quá
trình sắc ký.
+ Yêu cầu đối với pha động:
Phải trơ đối với pha tĩnh.
h -ri
17
Phải hoà tan được chất phân tích.
Phải bền vững theo thời gian.
Phải có độ tinh khiết cao.
Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.

Phù hợp với loại detector.
Phải có tính kinh tế và không ảnh hưởng nhiều đến môi trường.
+ Các yếu tố của pha động ảnh hưởng đến kết quả tách của một hỗn hợp
chất:
Thành phần của các chất tạo ra pha động
Tốc độ của pha động
pH của đệm trong pha động.
1.2.5. Định lượng bằng phương pháp HPLC
a. Quá trình định lượng
1. Lấy mẫu thử.
2. Tiến hành sắc ký:
Chuẩn bị mẫu thử
Tiêm mẫu
3. Đo tín hiệu detector.
b. Các phương pháp định lượng
1. Phương pháp chuẩn ngoại: là phương pháp định lượng cơ bản. trong đó
cả hai mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện.
So sánh diện tích hoặc chiều cao pic của mẫu thử với diện tích hoặc chiều cao
pic của mẫu chuẩn đã biết nồng độ sẽ tính được nồng độ của các chất có trong
mẫu thử.
2. Phương pháp chuẩn nội:
- Nguyên tắc: Thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai vào
cả chuẩn ngoại lẫn mẫu thử rồi tiến hành sắc ký. Chất chuấn thứ hai này được
gọi là chuẩn nội.
- ưu điểm: giúp cực tiểu hoá các sai số có thể nảy sinh do quá trình xử lý
mẫu (chiết xuất, tinh chế), do máy móc và kỹ thuật tiến hành,
- Phương pháp chi dùng khi không lạo được mẫu placebo.
3. Phương pháp chuẩn hoú diện tích pic:
- Nguyên tắc; Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều
thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng

diện tích của tất ca các pic thành phần Irên sác đổ.
Phương pháp này yêu cầu tất cả các thành phần đều được rửa giải và
được phát hiện, và tất cả các thành phần đều có đáp ứng detector như nhau.
- Áp dụng: ít dùng, chỉ dùng trong xác định hàm lượng tạp chất khi coi
đáp ứng của các tạp là như nhau.
19