Đánh giá mức độ tồn dư kháng sinh nhóm macrolid và sulfonamid trong một số nguồn nước thải nhà máy dược phẩm trên địa bàn hà nội

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ QUANG HIẾU
Mã sinh viên : 1201203

ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ TỒN DƯ
KHÁNG SINH NHÓM MACROLID VÀ
SULFONAMID TRONG MỘT SỐ
NGUỒN NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC
PHẨM TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI- 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ QUANG HIẾU
Mã sinh viên: 1201203

ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ TỒN DƯ
KHÁNG SINH NHÓM MACROLID VÀ
SULFONAMID TRONG MỘT SỐ
NGUỒN NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC
PHẨM TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:

1. PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh

2. DS. Lê Xuân Kỳ
Nơi thực hiện:
1. Bộ Môn Vật lý- Hóa lý
2. Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia

HÀ NỘI- 2017


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này, tôi đã
nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên,
bạn bè và gia đình.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành
đến: PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, DS. Lê Xuân Kỳ là những người
thầy, cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học
tập và nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo, các anh chị kỹ
thuật viên bộ môn Vật lý- Hóa lý và Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia
đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời
gian làm thực nghiệm tại bộ môn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, cùng toàn
thể các thầy cô các bộ môn Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ
và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên,
quan tâm và tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Hà Nội, ngày 11 tháng 5 năm 2017
Ngô Quang Hiếu

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN........................................................................... 3
1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu .................................................. 3
1.1.1. Clarithromycin, Azithromycin............................................ 3
1.1.2. Sulfamethoxazol, Trimethoprim......................................... 5
1.2. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu............................................. 8
1.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao .................................................. 8
1.2.2. Phương pháp chiết pha rắn ............................................... 13
1.3. Tổng quan về sản xuất kháng sinh tại Việt Nam ............................. 15
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 18
2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu ............................................. 18
2.1.1. Hoá chất - chất chuẩn ....................................................... 18
2.1.2. Máy móc - trang thiết bị ................................................... 19
2.1.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc, dung dịch chuẩn làm việc
..................................................................................................... 19
2.1.4. Đối tượng nghiên cứu ....................................................... 20
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................. 21
2.2.1. Khảo sát thực địa và lấy mẫu............................................ 21
2.2.2. Phương pháp xử lý mẫu.................................................... 22
2.2.3. Điều kiện phân tích bằng LC- MS/MS............................. 22


2.2.4. Đánh giá sự phù hợp của phương pháp phân tích đã lựa
chọn............................................................................................. 24
2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu ................................................ 24

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN ................... 25
3.1. Đánh giá sự phù hợp của phương pháp phân tích đã xây dựng....... 25
3.1.1. Độ phù hợp hệ thống ........................................................ 25
3.1.2. Tỷ lệ cường độ ion............................................................ 26
3.1.3. Xây dựng đường chuẩn để định lượng ............................. 26
3.2. Dư lượng các kháng sinh trong mẫu nước thải từ nhà máy sản xuất
dược phẩm............................................................................................... 28
3.2.1. Kết quả các mẫu thực........................................................ 28
3.2.2. Nhận xét kết quả thu được................................................ 32
3.3. Bàn luận ........................................................................................... 37
3.3.1. Về thời điểm và vị trí lấy mẫu .......................................... 37
3.3.2. Kĩ thuật xử lý mẫu ............................................................ 37
3.3.3. Về phương pháp phân tích................................................ 38
3.3.4. Kết quả phân tích .............................................................. 39
3.3.5. So sánh với các nghiên cứu khác đã được thực hiện ở Việt
Nam............................................................................................. 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
AOAC

: Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thống

AZI

: Azithromycin

AR

: Thuốc thử phân tích

CLA

: Clarithromycin

CTPT

: Công thức phân tử

HPLC

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LC – MS/MS : Sắc ký lỏng khối phổ hai lần
LOD

: Giới hạn phát hiện

m/z

: Khối lượng/ điện tích

MeOH

: Methanol

MeCN

: Acetonitril

HLNT

: Hàm lượng nguyên trạng

HLK

: Hàm lượng khan

KLPT

: Khối lượng phân tử

PA

: Tinh khiết phân tích

RSD

: Độ lệch chuẩn tương đối

SMX

: Sulfamethoxazol

SPE

: Chiết pha rắn

TB

: Trung bình

TMP

: Trimethoprim


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1.

Cấu trúc vòng lacton các phân nhóm macrolid

3

Bảng 1.2.

Số SĐK kháng sinh từ 01/2010 đến 12/2015 ở Việt Nam

16

Bảng 2.1.

Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

18

Bảng 2.2.

Chương trình gradient

23

Bảng 2.3.

Các điều kiện khối phổ để phân tích các kháng sinh

23

nghiên cứu
Bảng 2.4.

Các chỉ tiêu tiến hành thẩm định (theo AOAC)

24

Bảng 3.1.

Kết quá đánh giá độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS

25

Bảng 3.2.

Tỷ lệ cường độ ion định tính/ ion định lượng của mẫu

26

trắng thêm chuẩn- (RSD)
Bảng 3.3.

Kết quả xây dựng đường chuẩn các kháng sinh nghiên

27

cứu
Bảng 3.4.

Kết quả xác định dư lượng kháng sinh của cơ sở 1 và 2

29

Bảng 3.5.

Kết quả xác định dư lượng kháng sinh của cơ sở 3 và 4

30


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1.

Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS

Hình 1.2.

Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI

Hình 3.1.

Sắc ký đồ phân tích mẫu B.010317.1

Hình 3.2.

Một số sắc ký đồ mẫu âm tính

Hình 3.3.

So sánh nồng độ (ng/l) của bốn kháng sinh tại 3 vị trí của

9
11
31
32
33

cơ sở 1
Hình 3.4.

So sánh dư lượng kháng sinh (ng/l) tại bốn vị trí của cơ

35

sở 2
Hình 3.5.

So sánh dư lượng kháng sinh (ng/l) tại vị trí 1 và 2 của cơ

36

sở 4
Hình 3.6.

Cấu trúc phân tử nằm trên bề mặt hạt trong cột HLB

38

Hình 3.7.

Vị trí lấy mẫu của cơ sở 1

39


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay thực trạng vi khuẩn kháng kháng sinh đang là vấn đề thời sự
toàn cầu và đặc biệt nghiêm trọng ở các nước đang phát triển, với gánh nặng
của các bệnh nhiễm khuẩn và những chi phí bắt buộc cho việc thay thế các
kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới, đắt tiền. Các bệnh nhiễm khuẩn
đường tiêu hoá, đường hô hấp, các bệnh lây truyền qua đường tình dục và
nhiễm khuẩn bệnh viện là các bệnh hàng đầu có tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong cao
ở các nước đang phát triển [9]. Việc kiểm soát các loại bệnh này đã và đang
chịu sự tác động bất lợi của sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng kháng
sinh của vi khuẩn.
Nguyên nhân bên cạnh việc sử dụng kháng sinh không theo hướng dẫn
của bác sĩ kê đơn, còn là do sự tích lũy kháng sinh trong môi trường tự nhiên,

tích tụ dần sẽ dẫn tới việc phơi nhiễm của vi khuẩn với kháng sinh đó. Nhiều
nghiên cứu đã cho thấy rằng sự tồn tại của các kháng sinh và sự đề kháng
kháng sinh trong môi trường nước đã trở nên phổ biến [17]. Như vậy ngoài
việc kiểm soát kê đơn và sử dụng kháng sinh không hợp lý thì lượng kháng
sinh thải ra môi trường từ các nguồn nước thải cũng phải được kiểm soát và
xử lý. Đặc biệt là từ những nhà máy sản xuất dược phẩm.
Trong những năm gần đây tại Việt Nam số lượng và chủng loại thuốc
sản xuất từ nguyên liệu kháng sinh được sản xuất ngày càng nhiều trong đó
bốn kháng sinh clarithromycin, azithromycin, trimethoprim, sulfamethoxazol
cũng đã và đang được sản xuất và sử dụng rộng rãi, có nhiều nhà máy, xí
nghiệp dược đang sản xuất nhóm kháng sinh này với các dạng bào chế khác
nhau như: viên nén, viên nang,… Các nhà máy sản xuất các kháng sinh này
đều đạt tiêu chuẩn GMP và có quy trình, hệ thống xử lý nước thải sau sản
xuất. Tuy nhiên, việc kiểm soát tồn dư bốn kháng sinh trên trong nước thải ở
các cơ sở này vẫn chưa được quan tâm đúng mức và chưa có yêu cầu của cơ

1


quan nhà nước về giới hạn nồng độ của các kháng sinh trong nước thải của
các nhà máy sản xuất.
Xuất phát từ thực trạng trên kết hợp với phương pháp đã được xây dựng
[10] chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài “Đánh giá mức độ tồn dư kháng
sinh nhóm macrolid và sulfonamid trong một số nguồn nước thải nhà máy
dược phẩm trên địa bàn Hà Nội”, với các mục tiêu là:
1. Đánh giá sự phù hợp của phương pháp phân tích bằng LC- MS/MS đã
được xây dựng để xác định dư lượng kháng sinh clarithromycin,
azithromycin, trimethoprim và sulfamethoxazol trong các mẫu nước thải công
nghiệp dược.
2. Xác định và sơ bộ đánh giá dư lượng các kháng sinh clarithromycin,

azithromycin, sulfamethoxazol và trimethoprim trong nước thải nhà máy
dược phẩm bằng LC-MS/MS.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
1.1.1. Clarithromycin, Azithromycin
1.1.1.1. Cấu trúc và tính chất
Clarithromycin, azithromycin đều là kháng sinh nhóm macrolid có cấu
trúc hóa học cơ bản là vòng lacton (chứa từ 12-17 nguyên tử carbon - còn gọi
là vòng ester) có chứa 1 hay nhiều đường (deoxy sugar) (thường là cladinose
và desosamin). Dựa trên số nguyên tử carbon trên vòng, macrolid được chia
làm nhóm vòng lacton 14C, 15C, 16C [19].
Bảng 1.1. Cấu trúc vòng lacton các phân nhóm macrolid

Vòng lacton 14C
(erythromycin,
roxithromycin,
clarithromycin)

Vòng lacton 15C
(Azithromycin)

Vòng lacton 16C
(midecamycin,
spiramycin, josamycin)

Azithromycin

- CTPT: C38H72N2O12
- KLPT: 748,984
- Tên khoa học: Methyl-aza-11-desoxo-10homoerythromycin A [6].
- Độ tan: Không tan trong nước, dễ tan trong dung dịch HCl loãng và các
dung môi hữu cơ như: Ethanol, methanol, aceton, cloroform, diethyl
ether [4].

3


Clarithromycin
- CTPT: C38H69NO13
- KLPT: 747,953
- Tên khoa học: 6-O-methylerythromycin A [6].
- Độ tan: Không tan trong nước, tan trong aceton
và methylen clorid, khó tan trong methanol [4].
1.1.1.2. Đặc điểm lý hóa
- Dạng base không thân nước, dễ tan trong nhiều dung môi hữu cơ. Muối
với các acid tan trong nước nhưng dung dịch không bền, dễ tủa ở dạng base.
- Đều ở dạng bột màu trắng, vị rất đắng.
- Vòng lacton dễ bị mở trong môi trường pH kiềm hoặc acid.
- Macrolid tạo màu với một số thuốc thử: Acid HCl, acid sulfuric đặc,
xanthydrol, p-dimethylamino benzaldehyd. Đây là những phản ứng để nhận
biết sơ bộ macrolid [4], [5].
1.1.1.3. Cơ chế tác dụng
Nhóm Macrolid: Tác dụng kìm khuẩn do ức chế tổng hợp protein của tế
bào vi khuẩn do gắn với tiểu phân 50S của ribosom, ngăn cản sự chuyển vị
peptidyl-ARNt từ vị trí tiếp nhận sang vị trí cho nên các aminoacyl-ARNt mới
không thể gắn vào vị trí tiếp nhận, làm cho các aminoacid không gắn được
vào chuỗi peptid đang thành lập [5].

1.1.1.4. Phổ tác dụng
Macrolid có phổ kháng khuẩn hẹp, chủ yếu tập trung vào một số chủng
vi khuẩn gram dương và một số vi khuẩn không điển hình.
Macrolid có hoạt tính trên cầu khuẩn gram dương (liên cầu, tụ cầu), trực
khuẩn gram dương (Clostridium perfringens, Corynebacterium diphtheriae,
Listeria monocytogenes). Thuốc không có tác dụng trên phần lớn các chủng
trực khuẩn gram âm đường ruột và chỉ có tác dụng yếu trên một số chủng vi
4


khuẩn gram âm khác như H. influenzae và N. meningitidis, tuy nhiên lại có
tác dụng khá tốt trên các chủng N. gonorrhoeae. Kháng sinh nhóm macrolid
tác dụng tốt trên các vi khuẩn nội bào như Campylobacter jejuni, M.
pneumoniae, Legionella pneumophila, C. trachomatis, Mycobacteria (bao
gồm M. scrofulaceum, M. kansasii, M. avium-intracellulare – nhưng không
tác dụng trên M. fortuitum). Một số chủng liên cầu huyết tán bêta nhóm A và
tụ cầu kháng lại macrolid [5].
1.1.2. Sulfamethoxazol, Trimethoprim
1.1.2.1. Cấu trúc và tính chất
Sulfamethoxazol (SMX)
Sulfamethoxazol là thuốc thuộc nhóm sulfonamid.
- CTPT: C10H11N3O3S
- KLPT: 253,279
- Tên khoa học: N1-(5-methyl-3-isoxazolyl)
sulfanilami [6].
- Độ tan: SMX không tan trong nước, dễ tan trong aceton, hơi tan trong
ethanol 96%, tan trong dung dịch natri hydroxyd loãng và dung dịch acid
loãng [4].
Trimethoprim (TMP)
Trimethoprim là kháng sinh tổng hợp dẫn xuất pyrimidin.

- CTPT: C14H18N4O3
- KLPT: 290,32
- Tên khoa học: 2,4-diamino-5-(3’,4’,5’-trimethoxybenzyl) pyrimidin
[6].
- Độ tan: Ít tan trong cloroform, ethanol hoặc aceton, tan nhẹ, gần như
không hòa tan trong nước, tan trong acid acetic băng [4].
1.1.2.2. Đặc điểm lý hóa
5


Sulfamid ở dạng tinh thể màu trắng hoặc màu vàng nhạt (trừ prontosil),
không mùi, thường ít tan trong nước, benzen, chloroform. Sulfamid tan trong
dung dịch acid vô cơ loãng và hydroxyd kiềm (trừ sulfaguanidin) [11].
- Hầu hết các Sulfamid đều có tính chất lưỡng tính [11].
- Tính acid: Do có H ở N-amid linh động (trừ sulfaguanidin).
- Tính base: Do có nhóm amin thơm tự do.
- Tham gia phản ứng diazo hóa: Do có nhóm amin thơm tự do.
1.1.2.3. Cơ chế tác dụng
- Cơ chế tác dụng: SMX có cấu trúc tương tự acid para aminobenzoic
(PABA). Nó cạnh tranh với PABA nhờ có ái lực cao với dihydropteroat
synthease (ức chế giai đoạn I của quá trình tổng hợp acid folic của vi khuẩn)
[5].
- TMP có tác dụng kìm khuẩn, ức chế enzym dihydrofolate - reductase
của vi khuẩn [5].
- Trimethoprim thường được sử dụng phối hợp với sulfamethoxazol
nhằm mở rộng phổ và tăng tác dụng điều trị, chế phẩm là Cotrimoxazol (tỷ lệ
sulfamethoxazol: trimethoprim là 5:1).
1.1.2.4. Phổ tác dụng
Phổ tác dụng: SMX có phổ kháng khuẩn rộng, tác dụng lên nhiều vi
khuẩn ưa khí gram âm và dương bao gồm: Staphylococcus, Streptococcus,

Legionella pneumophilia, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria menigitidis, E.
coli, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Proteus mirabilis, Proteus indol,
Klebsiella, Haemophilus influenzae… [5].
TMP chống lại tác nhân gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu như: E.coli,
Proteus,

Klebsiella,

Enterobacter,

Staphylococcus

saprophyticus,

Streptococcus faecalis và chống lại nhiều vi khuẩn dạng coli [5].
1.1.3. Tình trạng đề kháng của vi khuẩn tại Việt Nam
6


Vấn đề vi khuẩn kháng kháng sinh là một vấn đề nóng tại Việt Nam và
đương ở mức độ cao. Trong số các nước thuộc mạng lưới giám sát các căn
nguyên kháng thuốc châu Á (ANSORP), Việt Nam có mức độ kháng
penicillin ở mức 71,4% và kháng erythromycin ở mức 92,1%. 75% các chủng
pneumococci kháng với 3 loại kháng sinh trở lên [9].
Tình

trạng

kháng

phổ

biến

của

các

vi

khuẩn

gram

âm

(Enterobacteriaceae). Theo kết quả nghiên cứu công bố năm 2009 cho thấy
42% các chủng enterobacteriaceae kháng với ceftazidime, 63% kháng với
gentamycin và 74% kháng với acid nalidixic. Tỷ lệ kháng cao gặp ở người
khỏe mạnh trong cộng đồng [9].
57% Haemophilus influenzae (một căn nguyên vi khuẩn khác) được
phân lập từ bệnh nhi ở Hà Nội (2000-2002) kháng với ampicillin. Tỷ lệ tương
tự cũng được báo cáo tại Nha Trang.
Xu hướng gia tăng của tình trạng kháng kháng sinh cũng thể hiện rõ rệt.
những năm 1990, tại TP Hồ Chí Minh chỉ có 8% các chủng pneumococcus
kháng penicillin. Đến năm 1999-2000, tỉ lệ tăng lên 56%. Xu hướng cũng
được cảnh bảo tương tự tại các tỉnh phía Bắc.
Riêng đối với các kháng sinh nhóm macrolid và sulfamethoxazol, tình
trạng đề kháng với vi khuẩn cũng không phải ngoại lệ
Trong nghiên cứu “Cơ chế của sự đề kháng thuốc với nhóm kháng sinh

Macrolid và Lincosamid- Bản chất của các yếu tố kháng thuốc và ý nghĩa lâm
sàng của chúng” của Roland Leclercq, việc kháng kháng sinh nhóm macrolid
và lincosamid đang gia tăng nhanh chóng trong các báo cáo về các ca lâm
sàng được phân lập có chứa vi khuẩn gram dương, với các cơ chế kháng
kháng sinh đa dạng bao gồm thay đổi cấu trúc ribosom, bất hoạt thuốc và kết
quả là tạo ra rất nhiều phenotype kháng thuốc. Sự kháng thuốc không chỉ xuất
hiện đối với chủng Staphylococci mà còn xuất hiện trên Streptococci [16].
7


Vi khuẩn kháng Sulfonamid có thể xảy ra thông qua đột biến gen DHPS
(folP) hoặc thay thế gen DHPS (sul), tạo ra sản phẩm có ái lực thấp với
sulfonamid [18]. Trong hai cơ chế trên thì gen sul là phổ biến nhất.
1.2. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu
1.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.2.1.1. Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở
của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh rắn chứa trong cột, nhờ dòng di
chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp
thụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [2]
[3].
1.2.1.2. Nguyên tắc
Mẫu phân tích được hòa tan trong dung môi và được cho qua cột bằng
một dòng chất lỏng liên tục (pha động). Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ
di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số
phân bố của chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Nhờ tốc độ di chuyển qua cột
khác nhau, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành píc, làm cơ sở cho
phân tích định tính và định lượng.
1.2.1.3. Sắc ký lỏng khối phổ
Khái niệm

Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân
tách các chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao (High
performance liquid chromatography – HPLC) và khả năng phân tích số khối
(m/z) của bộ phận khối phổ (Mass spectrometry – MS).

8


Hình 1.1. Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS
Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên
cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất
đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một
điện trường hoặc từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z)
có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết được điện
tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó.
Trong phân tích khối phổ của bất kì chất nào, trước tiên nó phải được
chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hóa bằng các phương pháp
thích hợp. Các ion tạo thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phân tích khối
phổ. Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét
ion dương hay ion âm. Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin hơn
về ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến hơn [1], [8], [12].
Thiết bị khối phổ (Đầu dò khối phổ)
Bộ nạp mẫu: Chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ion hoá của thiết
bị khối phổ. Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của
cột sắc ký.
Bộ phận chuyển (interface) từ hệ thống sắc ký lỏng (LC) vào khối phổ
(MS): Bộ phận chuyển có nhiệm vụ chuyển các thành phần phân tích từ cột
LC vào nguồn MS ion. Bộ phận chuyển thực sự cần thiết vì các thiết bị LC và
MS về cơ bản không tương thích. Trong khi pha động trong hệ thống LC là
chất lỏng có áp suất cao, máy phân tích của MS thường hoạt động dưới chân

9


không (khoảng 6-10 torr). Vì vậy, không thể trực tiếp bơm từ cột LC vào
nguồn MS. Nhìn chung, bộ phần chuyển là một phần cơ học đơn giản của hệ
thống LC-MS/MS chuyển lượng chất phân tích cực đại, loại bỏ một phần của
pha động được sử dụng trong LC và bảo vệ bản chất hóa học của các chất
phân tích. Theo yêu cầu, bộ phận chuyển không nên can thiệp vào hiệu quả
ion hóa và điều kiện chân không của hệ thống MS. Ngày nay, bộ phận chuyển
được áp dụng rộng rãi dựa trên các phương pháp ion hoá áp suất khí quyển
(API) như ion hoá bằng phun điện tử (ESI), ion hoá hóa học áp suất khí quyển
(APCI) và ion hoá bằng photon tại áp suất khí quyển (APPI).
Bộ nguồn ion hóa: Có nhiệm vụ ion hoá phân tử trung hoà thành các ion
phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân mảnh phân tử trung hoà thành
các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phần tử mang năng lượng cao.
Ion phân tử và các mảnh ion là các phân tử có khối lượng từ đó người ta
tính được tỷ số khối lượng ion/ điện tích (m/z).
Có ba kiểu ion: Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionizaton – ESI), Ion
hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization
– APCI), Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure
Photonization – APPI).
Trong đó, kiểu Ion hóa phun điện tử (ESI) được thực hiện ở áp suất khí
quyển. Các mẫu thử trong dung dịch được đưa vào nguồn ion qua một ống
mao quản mà ở đầu ống này có một điện thế có thể lên đến 5000V. Đồng thời,
các dung dịch mẫu này được phun sương dưới tác động của một dòng khí. Kết
quả là tạo ra các hạt mang điện tích và được gia tốc đến điện cực. Kỹ thuật
này phù hợp cho các chất phân cực, không bền với nhiệt và nghiên cứu các
phân tử sinh học có khối lượng tới 100 000 Da.

10

Hình 1.2. Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI
Ngoài ra, còn có nguồn ion hóa đa phương thức (MMI, Multimode
ionization) có thể vận hành, thao tác ở hai chế độ ion hóa ESI và APCI.
Bộ phận phân tích khối (mass analyzer): Sau khi được tạo thành thì các
ion sẽ được gia tốc và tách riêng theo tỷ số m/z nhờ tác dụng của điện trường
và từ trường để đi đến bộ phận phát hiện.
Một số bộ phân tích khối thường dùng: Tứ cực (Quadrupole), Bẫy ion
(Ion trap), Ống đo thời gian bay (Time-of-flight tube)
Trong đó, bộ phân tích khối Tứ cực (Quadrupole): Có 4 thanh tích điện
đặt song song, 2 thanh đối nhau có điện tích bằng nhau. Các ion phù hợp với
tần số quét sẽ đi thẳng tới detectơ, những ion khác bị phá hủy do bị va đập
vào tứ cực.
Hiện nay, có loại dùng bộ phân tích gồm ba tứ cực xếp nối tiếp nhau
Q1, Q2, Q3 (gọi là bộ tứ cực chập ba) để ghi phổ. Tứ cực Q1, Q3 làm nhiệm
vụ phân tích khối, tứ cực Q2 là ngăn để cho các ion va chạm, tạo ra các ion
mảnh nhỏ hơn, khí dùng cho va chạm thường là khí trơ argon. Kỹ thuật phân
tích khối phổ kiểu này được gọi là khối phổ hai lần MS/MS và thường được
dùng để khẳng định cấu trúc các chất hữu cơ và phân tích hỗn hợp nhiều
thành phần .

11


Bộ phận phát hiện ion (detector): Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến,
khuếch đại thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.
Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system)
Là một hệ thống bao gồm hệ thống kết nối và thu nhận dữ liệu thô
và phần mềm kiểm soát, điều khiển thiết bị, quá trình phân tích và tính

toán, xử lý, báo cáo, kết xuất dữ liệu thô vừa thu được. Một số kỹ thuật ghi
phổ trong đầu dò khối phổ bao gồm :
Quét toàn phổ (SCAN)
Khi xử lý số liệu với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh
ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân
tích. Thường dùng để định danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ
đủ lớn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ Full scan MS thường được
lựa chọn để khảo sát ion mẹ, chế độ Full scan MS/MS quét tất cả các ion con
tạo thành thường được sử dụng để xác định ion con cho tín hiệu ổn định và
bền nhất
Selected Ion Monitoring (SIM)
Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc
trưng cho chất cần xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã
được lựa chọn trước đó, do vậy không thể dùng để định danh hay so sánh với
các thư viện có sẵn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường
được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.
SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction
Monitoring)
Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS-MS), 2
kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM.

12


SRM: Cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các
mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để
phát hiện.
MRM: Trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi
lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi
phổ MRM thông dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ

cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va
chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ
cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện.
Do tính đặc hiệu và độ nhạy rất cao của hệ LC- MS/MS nên phương
pháp này được sử dụng chủ yếu khi phân tích dư lượng, chất cấm với nền
mẫu phức tạp.
1.2.2. Phương pháp chiết pha rắn
Do các công ty sản xuất đồng thời nhiều dược phẩm và nguồn nước thải
đã được xử lý nên mẫu môi trường thường có thành phần rất phức tạp, hàm
lượng chất cần phân tích khá thấp, không tương thích cho việc phân tích trực
tiếp trên hệ sắc ký. Vì vậy, trước khi phân tích mẫu cần phải tách, làm giàu
các hợp phần của mẫu cần phân tích.
Dựa trên các mối liên hệ giữa độ chọn lọc, độc tính dung môi, giá thành,
thời gian...Để chọn phương pháp chiết mẫu sao cho hiệu quả nhất.
Các phương pháp chiết mẫu dùng trong nước thải thông thường là: Chiết
lỏng – lỏng và chiết pha rắn (SPE), trong đó chiết pha rắn được lựa chọn phổ
biến hơn do những ưu điểm của nó.
Chiết pha rắn (SPE) là phương pháp chiết dựa vào sự phân tán của chất
phân tích giữa hai pha lỏng và rắn, trong đó các chất được chiết từ pha lỏng
vào pha rắn. Pha rắn thường là các hạt nhỏ, xốp được nhồi vào các ống nhỏ.
Pha lỏng chảy qua ống, các chất phân tích tương tác với pha rắn sẽ được giữ
13


lại trên ống. Các chất này được rửa giải khỏi pha rắn bằng một dung môi khác
phù hợp. Thông thường thể tích dung môi rửa giải nhỏ hơn nhiều so với thể
tích dịch ban đầu. Vì thế qua chiết pha rắn, ngoài tác dụng làm sạch có thể
thực hiện thêm bước làm giàu mẫu. Nguyên liệu tạo pha rắn trong SPE tương
tự như trong sắc ký lỏng, có thể là dẫn chất polysiloxan, polymer tạo pha liên
kết, ngoài ra còn có cả pha không liên kết. Tùy theo đặc tính của pha rắn mà

có thể chia thành các loại cột có bản chất khác nhau, bao gồm: pha thuận, pha
đảo hay trao đổi ion.
Có 2 cơ chế tách chất phân tích khỏi mẫu nhờ chiết pha rắn:
Các chất tạp, nhiễu được rửa giải khỏi cột, chỉ có chất phân tích được lưu
giữ lại sao cho lượng tạp chất trong chất phân tích được giảm thiểu tối đa,
chất phân tích sau đó được rửa giải bằng một dung môi rửa giải mạnh, bay hơi
tới cắn hoặc trực tiếp đem đi phân tích.
Tạp chất, chất nhiễu được giữ lại trên cột, chất phân tích đi ra theo pha
lỏng được thu hồi.
Để xây dựng quy trình chiết pha rắn, cần tiến hành các bước như sau:
- Chọn pha rắn: tuỳ theo bản chất của chất phân tích mà lựa chọn pha rắn
có bản chất thích hợp. Mặt khác, tuỳ thuộc vào lượng chất phân tích trong
mẫu mà lựa chọn cột có lượng pha rắn và thể tích rửa giải khác nhau. Lượng
pha rắn dao động từ 50 mg đến 10 g, ứng với thể tích nền từ 125 µL đến 20
ml.
- Qui trình chiết (SPE cột pha đảo): gồm 4 giai đoạn
1. Hoạt hóa cột chiết: Cho dung môi phù hợp đi qua pha rắn để hoạt hóa
các nhóm hoạt động, đồng thời loại bỏ các khí trong cột và thay thế vào đó là
dung môi.
2. Nạp mẫu: Trước khi nạp mẫu vào cột, nếu cần phải xử lý mẫu sơ bộ
để đưa mẫu vào môi trường phù hợp sao cho giai đoạn này phải lưu giữ được
14


toàn bộ chất phân tích trên cột. Chất phân tích cùng một số chất khác được
giữ lại trên cột, các tạp chất đi ra khỏi cột càng nhiều càng tốt để tránh cạnh
tranh và ảnh hưởng đến quá trình tương tác của chất phân tích với pha tĩnh.
3. Rửa tạp chất: Sau khi nạp mẫu, trên cột vẫn còn nhiều tạp chất khác
có liên kết với pha tĩnh. Phải chọn được dung môi rửa tạp sao cho có thể hòa
tan và kéo được các tạp chất mà không kéo theo chất phân tích.

4. Rửa giải: Chất phân tích lưu giữ trên cột được hòa tan và kéo ra khỏi
cột bằng một dung môi phù hợp. Cần phải tối ưu loại dung môi rửa giải, thể
tích dung môi rửa giải, pH dung môi rửa giải, tốc độ rửa giải…để có thể rửa
giải được tối đa chất phân tích nhưng rửa giải tối thiểu các tạp chất còn trên
cột [3].
Chiết pha rắn là kỹ thuật có thể khắc phục được các nhược điểm của
chiết lỏng- lỏng: Khả năng chiết chất phân tích hiệu quả hơn, dung môi sử
dụng ít, dễ dàng tập trung chất phân tích, kỹ thuật tiến hành thuận tiện, khả
năng làm giàu mẫu tốt, đặc biệt có ưu điểm là cơ chế chiết đa dạng phù hợp
với chất phân tích, tính chọn lọc tốt hơn. Tuy nhiên có nhược điểm là giá
thành của phương pháp còn cao, khó áp dụng ở quy mô rộng.
1.3. Tổng quan về sản xuất kháng sinh tại Việt Nam
Ngành dược phẩm ở Việt Nam đang phát triển với khoảng 200 nhà sản
xuất kháng sinh. Năm 2015, sản xuất thuốc, hóa dược, dược liệu tăng 3,6% so
với năm 2014 [22]. Trong thời hạn 5 năm, từ năm 2010 đến năm 2015, đa số
các nhóm thuốc kháng sinh sản xuất trong nước đã đăng ký là β-lactam
(amoxicillin, cefuroxim...), quinolon (ciprofloxacin, ofloxacin...), và macrolid
(neomycin, clarithromycin, azithromycin...) (Bảng 1.5) [23].

15


Bảng 1.2. Số SĐK kháng sinh từ 01/2010 đến 12/2015 ở Việt Nam
Số
SĐK

Tên kháng sinh

Amoxicillin

291

Erythromycin

75

Penicillin

35

Cefuroxim

198

Cefoperazon

71

Lincomycin

34

Cephalexin

184

Neomycin

71

Roxithromycin

34

Spiramycin

167

Cefotaxim

68

Cefepim

29

Cefixim

147

Ofloxacin

66

Cefazolin

27

Metronidazol

148

Ceftazidim

61

Gentamycin

25

Cefaclor

129

Levofloxacin

60

Doxycyclin

21

Cefadroxil

113

Ampicillin

57

Cloramphenicol

20

Ciprofloxacin

99

Azithromycin

52

Moxifloxacin

19

Clarithromycin

95

Ceftriaxon

48

Amikacin

13

Trimethoprim

94

Tetracyclin

40

Rifampicin

11

Sulfamethoxazol

90

Clindamycin

39

Vankomycin

9

Cedinir

77

Tobramycin

35

Norfloxacin

8

Tên kháng sinh

Số
SĐK

Tên kháng sinh

Số
SĐK

(Nguồn: Cục Quản lý dược Việt Nam 12/2015)
Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu về dư lượng kháng
sinh trong nước thải từ các nhà máy dược phẩm một cách cụ thể. Một nghiên
cứu sơ bộ gần đây cho thấy nồng độ cao của một số cephalosporin trong nước
thải từ các nhà máy dược phẩm dao động từ 19,24 ppb đến 43,33 ppb cho
thấy cần có một nghiên cứu hệ thống hơn trong lĩnh vực này [7].
Với tình hình đó cũng đã có một số tác giả quan tâm tới vấn đề này như:
Nghiên cứu của Trần Thị Thanh Huế nhằm xây dựng phương pháp xác định
dư lượng kháng sinh cefixim trong nước thải nhà máy dược phẩm áp dụng kỹ
thuật chiết lỏng – lỏng bằng cloroform, phân tích bằng HPLC detectơ DAD
16


[7]. Còn lại đa phần các nghiên cứu đều lựa chọn phương pháp chiết pha rắn
và phân tích bằng LC-MS để tiến hành định lượng. Lê Xuân Kỳ và nhóm
nghiên cứu [10] đã xây dựng phát triển phương pháp xác định dư lượng

azithromycin, clarithromycin, sulfamethoxazol, trimethoprim trong nước thải
nhà máy sản xuất dược phẩm. Do vậy đề tài này được thực hiện tiếp tục theo
hướng nghiên cứu này, ứng dụng phương pháp để xác định dư lượng kháng
sinh trong mẫu nước thải của một số nhà máy sản xuất dược phẩm trên địa
bàn Hà Nội nhằm cung cấp số liệu thực tế về tình trạng dư lượng
azithromycin, clarithromycin, sulfamethoxazol, trimethoprim trong nước thải
công nghiệp dược, từ đó tiến tới bước đầu xác định ảnh hưởng đến hệ vi sinh
vật dẫn tới tình trạng kháng kháng sinh.

17