Xây dựng phương pháp định lượng polydatin trong rễ cây cốt khí củ bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ NGỌC DUY
Mã sinh viên: 1201083

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG POLYDATIN TRONG RỄ CÂY
CỐT KHÍ CỦ BẰNG SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ NGỌC DUY
1201083

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG POLYDATIN TRONG RỄ CÂY
CỐT KHÍ CỦ BẰNG SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. Ths. Phạm Lê Minh
2. ThS. Nguyễn Thị Hà Ly
Nơi thực hiện:
Khoa Hóa Phân Tich- Tiêu Chuẩn Viện Dược Liệu

HÀ NỘI – 2017


LỜI CẢM ƠN
Bản khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại Viện Dược Liệu
với sự hướng dẫn của ThS. Phạm Lê Minh và ThS. Nguyễn Thị Hà Ly
Em xin chân thành cảm ơn ThS. Phạm Lê Minh đã định hướng
nghiên cứu và góp ý giúp em hoàn thành khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Nguyễn Thị Hà Ly đã hướng dẫn và
giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin cảm ơn ThS. Nguyễn Thị Thùy
Linh đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong quá trình làm khóa luận.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Dược Liệu,
PGS.TS. Phương Thiện Thương, TS. Nguyễn Thị Phương, Ds. Hoàng
Đình Quân, Ds. Vũ Ngọc Khánh, Ds Bùi Thị Khánh Linh, chị Hoàng
Thị Tuyết và các cán bộ khoa Hóa phân tích và tiêu chuẩn, Viện Viện Dược
Liệu đã tạo điều kiện giúp em hoàn thành đề tài.
Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn
bên em, chia sẻ khó khăn, động viên và giúp đỡ em trong thời gian em thực
hiện khóa luận.
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không tránh những thiếu sót.
Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2017
Sinh viên

Lê Ngọc Duy

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ..................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN...................................................................... 3
1.1. Tổng quan về cốt khí củ (Reynoutria Japonica Houtt.) ....................... 3
1.1.1. Vị trí phân loại ........................................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố..................................................... 3
1.1.3. Bộ phận dùng............................................................................. 4
1.1.4. Ứng dụng trong y học cổ truyền.................................................. 4
1.1.5. Thành phần hóa học ................................................................... 5
1.1.6. Tác dụng sinh học .................................................................... 10
1.2. Tổng quan về polydatin .................................................................. 11
1.2.1. Nguồn gốc ............................................................................... 11
1.2.2. Công thức cấu tạo .................................................................... 11
1.2.3. Tính chất hóa lý ....................................................................... 11
1.2.4. Tác dụng sinh học .................................................................... 11
1.2.5. Các phương pháp phân tích PD trong rễ cốt khí củ .................... 13
1.3. Tổng quan về phương pháp HPLC .................................................. 16
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 17
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu ................................................ 17
2.1.1. Nguyên vật liệu........................................................................ 17
2.1.2. Hóa chất và dung môi .............................................................. 17
2.1.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu ................................................. 17


2.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................... 18
2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng polydatin bằng HPLC ......... 18
2.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích ............................................ 18

2.2.3. Phân tích mẫu thực................................................................... 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................ 18
2.3.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn, dung dịch thử.................................. 18
2.3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký ......................................................... 19
2.3.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu. ................................................... 19
2.3.4. Thẩm định phương pháp phân tích ............................................ 19
2.3.5. Phân tích mẫu thực................................................................... 23
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................. 24
3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký................................................................ 24
3.1.1. Lựa chọn bước sóng phân tích .................................................. 24
3.1.2. Khảo sát dung môi pha động .................................................... 24
3.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu .......................................................... 26
3.2.1. Khảo sát phương pháp chiết ..................................................... 26
3.2.2. Khảo sát dung môi chiết ........................................................... 27
3.2.3. Khảo sát số lần chiết ................................................................ 28
3.2.4. Quy trình xử lý mẫu được lựa chọn........................................... 29
3.3. Thẩm định phương pháp phân tích .................................................. 30
3.3.1. Tính chọn lọc của phương pháp ................................................ 30
3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)........... 30
3.3.3. Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn .............. 31
3.3.4. Tính thích hợp hệ thống ........................................................... 33
3.3.5. Độ lặp lại ................................................................................. 33


3.3.6. Độ đúng .................................................................................. 34
3.4. Kết quả định lượng polydatin trong một số mẫu rễ cốt khí củ ........... 36
3.5. Bàn luận ........................................................................................ 37
3.5.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................... 37
3.5.2. Quy trình xử lý mẫu ................................................................. 37
3.5.3. Phương pháp định lượng .......................................................... 38

3.5.4. Kết quả phân tích mẫu cốt khí củ thực ...................................... 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học

Tiếng Việt

ACN

Acetonitrile

Acetonitril

Adr

Adramicin

Adramicin

ALT

Alanine amiontransferase

AOAC

AST
DĐHK

Association of Official Analytical

Hiệp hội các nhà hóa

Communities

phân tích chính thống

Aspartate aminotransferase
Hong Kong Chinese Materia
Medica Standards

Dược điển Hồng Kông

DĐTQ

Chinese pharmacopoeia

Dược diển Trung Quốc

DMSO

Dimethyl sulfoxide

Dimethyl sulfoxid

EtOH

Ethanol

Ethanol

GSH

Glutathione

Glutathion

GST

Glutathiol S- transferases

HPLC

HPLCFLD

HPLCPDA

HPTLC

High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng

chromatography

cao

High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng

chromatography fluorescence

cao ghép nối detector

detection

huỳnh quang

High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng

chromatography photodiode array

cao ghép nối detector

detetion

mảng iod

High performance thin layer

Săc ký lớp mỏng hiệu

chromatography

năng cao


IL

Interleukin

Interleukin

LC-

Liquid chromatography tandem

Sắc ký lỏng ghép khối

MS/MS

mass spectrometry

phổ 2 lần

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lượng

mARN

Messenger acid ribonucleic

ARN thông tin

MDA

Malondialdehyde

MeOH

Methanol

MPO

Myeloperoxidase

PD

Polydatin

Polydatin

R(%)

Recovery

Hiệu suất thu hồi

RSD(%)

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

Sterol regulartory element-binding

Yếu tố phiên mã điều hòa

protein-1c

sterol

TC

Total cholesterol

Cholesterol toàn phần

TG

Triglyceride

Triglycerid

TNF-α

Tumor necrosic factor alpha

SREBP-1c

Methanol

Yếu tố hoại tử khối u alpha


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Mẫu cốt khí củ ........................................................................... 17
Bảng 3.1 Các cực đại hấp thụ của polydatin ............................................... 24
Bảng 3.2 Chương trình dung môi............................................................... 25
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát phương pháp chiết ............................................ 26
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát dung môi chiết ................................................. 27
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi .................................................. 28
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát số lần chiết ....................................................... 28
Bảng 3.7 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích của pic PD............. 32
Bảng 3.8 Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống..................................... 33
Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ lặp lại.......................................................... 34
Bảng 3.10 Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp ............................ 35
Bảng 3.11 Kết quả định lượng PD trên một số mẫu cốt khí củ .................... 36

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Cành và rễ cốt khí củ .................................................................... 4
Hình 1.2 Khung mạch cacbon cơ bản của nhóm chất stilben ......................... 6
Hình 1.3 CTCT một số hợp chất stilben có trong cốt khí củ .......................... 7
Hình 1.4 Khung mạch cacbon cơ bản của hợp chất anthranoid ...................... 8
Hình 1.5 CTCT của một số hợp chất anthranoid trong rễ cốt khí củ............... 9
Hình 1.6 CTCT một số hợp chất phenolic và flavonoid trong rễ cốt khí củ .. 10
Hình 1.7 CTCT của polydatin ................................................................... 11
Hình 3.1 Phổ hấp thụ UV-VIS của polydatin............................................. 24
Hình 3.2 Sắc kí đồ PD và mẫu thử tại 2 chương trình dung môi 1 và 2 ........ 25
Hình 3.3 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu được lựa chọn..................................... 29
Hình 3.4 Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc của phương pháp HPLC-UV...... 30
Hình 3.5 Sắc ký đồ xác định LOD, LOQ.................................................... 31
Hình 3.6 Đường chuẩn của PD .................................................................. 32


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cốt khí củ là một dược liệu quý mà dân gian đã lưu truyền từ lâu đời, được
xem như là phương thuốc hữu hiệu cho những bệnh về xương khớp. Theo y
học cổ truyền cốt khí củ có công dụng để chữa tê thấp, tổn thương đau đớn do
bị ngã, bị thương, là một vị thuốc thu liễm cầm máu. Kết quả nghên cứu hiện
đại cho thấy tác dụng dược lý của cốt khí củ cũng như các hoạt chất có trong
cốt khí củ rất phong phú, một số tác dụng đầy tiềm năng đã được chứng minh
như chống oxy hóa, điều hòa rối loạn lipid máu, bảo vệ gan, kháng viêm , kháng
khuẩn, và đặc biệt là kháng tế bào ung thư…
Với nhiều công dụng quý như vậy, cốt khí củ ngày càng được sử dụng
rộng rãi trên thị trường. Nguồn nguyên liệu cốt khí củ một phần được trồng tại
Việt Nam, phần lớn được nhập từ Trung Quốc với chất lượng chưa được kiểm

soát. Do đó xuất hiện tình trạng dược liệu cốt khí củ lưu thông trên thị trường
thường bị giả mạo hoặc không đạt yêu cầu về chất lượng. Điều này dẫn tới hậu
quả là ảnh hưởng đến sức khỏe của người bệnh, ảnh hưởng đến quyền lợi người
tiêu dùng, và lâu ngày dẫn tới sự mất niềm tin của người dân vào thuốc y học
cổ truyền. Vì vậy, công tác kiểm tra, đánh giá chất lượng dược liệu cốt khí củ
là rất quan trọng.
Ở Việt Nam, việc đánh giá chất lượng dược liệu cốt khí củ thường được
thực hiện theo Dược điển Việt Nam IV, tuy nhiên các quy định còn rất sơ sài,
không đáp ứng được yêu cầu kiểm tra đánh giá chất lượng cốt khí củ trên thị
trường. Các nghiên cứu về phân tích thành phần hóa học đều sử dụng
resveratrol làm tiêu chí đánh giá chất lượng dược liệu cốt khí củ. Tuy nhiên
trong cốt khí củ ngoài resveratrol thì các hợp chất dạng glycoside của hợp chất
này cũng chiếm hàm lượng lớn. Trong đó đặc biệt là hợp chất polydatin, hợp
chất này được chứng minh có nhiều tác dụng quý như tác dụng chống viêm,
chống oxi hóa, kháng u… Vì vậy chúng tôi nhận thấy polydatin cũng là một
1


thành phần quan trọng, cần được sử dụng làm “maker” trong kiểm nghiệm chất
lượng dược liệu cốt khí củ.
Từ những thực tiễn trên, nhằm xây dựng một phương pháp đánh giá
chính xác hàm lượng polydatin trong cốt khí củ, phù hợp để áp dụng rộng rãi ở
các đơn vị kiểm nghiệm và sản xuất, gợi ý cho việc nâng cấp chuyên luận cốt
khí củ trong DĐVN. chúng tôi thực hiện đề tài “XÂY DỰNG PHƯƠNG
PHÁP ĐỊNH LƯỢNG POLYDATIN TRONG RỄ CÂY CỐT KHÍ CỦ
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO” với hai mục tiêu sau:
- Xây dựng phương pháp định lượng polydatin trong rễ cốt khí củ bằng
HPLC.
- Áp dụng phương pháp phân tích cho một số mẫu cốt khí củ trên thị
trường.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cốt khí củ (Reynoutria Japonica Houtt.)
1.1.1. Vị trí phân loại
Cốt khí củ có tên gọi khác là hoạt huyết đan, điền thất, hổ trượng căn, phù
linh, nam hoàng cầm, co hớ hườn (Thái), mèng kẻng (Tày), hồng lìu (Dao) [2].
Tên khoa học: Reynoutria Japonica Houtt., tên đồng nghĩa là Reynoutria
Mak., Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc, Reynoutria elata Nak [2].
Theo phân loại thực vật học cốt khí củ thuộc: Giới: Thực vật; Ngành:
Magnoliophyta; Lớp: Magnoliopsida; Bộ: Polygonales; Họ: Polygonaceae;
Phân họ: Polygonoideae; Chi: Reynoutria.
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
Cốt khí củ là loại cây nhỏ, sống lâu năm. Rễ phình thành củ cứng, mọc bò
nghiêng dưới đất, vỏ ngoài màu nâu đen, ruột màu vàng. Thân hình trụ, nhẵn,
mọc thẳng đứng, cao 0,5-1 m, thường có những đốm màu tía hồng. Lá mọc so
le, cuống ngắn, hình trứng, đầu tù, hơi nhọn, mép nguyên, dài 5-12 cm, rộng
3,5-8 cm, mặt trên màu lục sẫm, có khi nâu đen; bẹ chìa ngắn. Cụm hoa ngắn
hơn lá, mọc thành chùm ở kẽ lá; hoa nhỏ màu trắng, hoa đực và hoa cái riêng;
bao hoa có 5 phiến; hoa đực có 8 nhị; hoa cái có bầu 3 góc. Quả 3 cạnh màu
nâu đỏ, mùa hoa quả vào tháng 10-11.
Cốt khí củ có nguồn gốc ở vùng Đông Á, sau lan xuống khắp các vùng
cận nhiệt đới và nhiệt đới, bao gồm Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Việt
Nam, Lào và một vài nơi khác. Ở Việt Nam, cây mọc hoang dại ở vùng núi cao,
từ 1000 -1600 m và được trồng rải rác trong nhân dân ở vùng trung du và đồng
bằng Bắc Bộ.
Cốt khí củ ưa sáng, ưa ẩm, nhưng ráo nước (úng ngập dễ làm thối củ)
thường mọc thành khóm trong các thung lũng, nơi gần nguồn nước. Cây rụng

lá vào mùa đông, ra hoa quả nhiều hàng năm, có khả năng mọc chồi từ thân rễ.
3


Cây sinh trưởng mạnh từ mùa xuân đến mùa thu, bắt đầu cho thu hoạch củ từ
tháng 9 trở đi, nên thu hoạch vào những ngày nắng ráo trong mùa đông, khi
phần thân lá bắt đầu héo hoặc cũng có thể thu hoạch vào đầu mùa xuân, trước
khi cây tái sinh.
1.1.3. Bộ phận dùng
Dược liệu cốt khí củ (radix Polygoni cuspidati) là rễ phơi hay sấy khô của
cây cốt khí củ, rễ cốt khí củ thu hái quanh năm, tốt nhất vào thu đông, rửa sạch
đất cát, cắt bỏ rễ con, thái thành miếng nhỏ dày chừng 1-2 cm, phơi hoặc sấy
khô. Dược liệu có mặt ngoài nâu xám, sần sùi, nhăn nheo theo chiều dọc, có
các mấu đốt và gióng, mặt cắt ngang màu vàng bẩn, lõi gần như rỗng, phần
không rỗng có màu nâu sẫm. Chất nhẹ,hơi cứng, mùi không rõ, vị hơi đắng [2].

Hình 1.1 Cành và rễ cốt khí củ
1.1.4. Ứng dụng trong y học cổ truyền
Theo y học cổ truyền, rễ cốt khí củ có vị đắng, tính ấm. Quy kinh can, tâm
bào với công năng hoạt huyết thông kinh, chỉ thống, trừ phong thấp, thanh thấp
nhiệt, tiêu viêm, sát khuẩn. Ở Việt Nam rễ cốt khí củ thường được dùng để
chữa tê thấp, tổn thương đau đớn do bị ngã, bị thương, là một vị thuốc thu liễm
cầm máu.

4


Trong bộ Bản thảo cương mục của Lý Thời Trân (Trung Quốc - thế kỷ
16), vị thuốc này có tác dụng lợi tiểu, thông kinh, giảm đau, giảm độc, dùng
cho những người bị kinh nguyệt bế tắc, kinh nguyệt khó khăn đau đớn, đẻ xong

huyết ứ, bụng trướng, tiểu tiện khó khăn [3].
Trong y học cổ truyền Trung Quốc cốt khí củ được gọi là Zhang Hu, được
sử dụng để điều trị các tổn thương viêm, viêm gan, các khối u, tiêu chảy, hạ
sốt, giảm đau, lợi tiểu, tiêu đờm và được liệt kê chính thức trong Dược điển
Trung Hoa [13]. Sử dụng trong các phương pháp điều trị đau khớp, viêm phế
quản mãn tính, vàng da, vô kinh và huyết áp cao [17].
1.1.5. Thành phần hóa học
Trong thành phần hóa học nổi bật của rễ cốt khí củ, hai nhóm chất chính
chiếm hàm lượng lớn là các stilbenoid và các anthranoid. Đây là các thành phần
hóa học quyết định cho nhiều hoạt tính có giá trị của cốt khí củ như kháng
khuẩn, kháng u, chống ung thư, chống oxy hóa, phòng ngừa bệnh tim mạch…
Bên cạnh đó còn có nhiều nhóm hợp chất khác như flavonoid, phenylpropanoid,
phenolic, alcaloid, quinon, acid amin… với nhiều tác dụng sinh học đáng chú
ý tương hỗ, bổ trợ với hai nhóm hợp chất chính làm cho cốt khí củ có hoạt tính
sinh dược học cao.
1.1.5.1. Thành phần stilben và dẫn xuất
Stilbenoid là là một nhóm chất có chug một cấu trúc mạch cacbon là C6C2-C6 (xem hình 1.2). Stilbenoid thuộc nhóm các hợp chất phenylpropanoids.
Một số stilbenoid đã được tìm thấy trong thực vật và khẳng định về hoạt tính
đặc trưng của chúng như piceatannolin có trong rễ của cây vân sam Na Uy. Hay
pinosylvin là một độc tố nấm bảo vệ gỗ khỏi bị nhiễm trùng nấm, được tìm thấy
trong cây họ thông. Pterostilben có trong hạnh nhân, cây thông và quả mọng.

5


Hình 1.2 Khung mạch cacbon cơ bản của nhóm chất stilben
Trong rễ cây cốt khí củ, nhiều nghiên cứu trong nước và trên thế giới
đã nghiên cứu và xác định sự có mặt của nhóm stilbenoid. Trong đó đặc biệt
quan trong là hai stilbenoid chính là resveratrol (1) và dẫn xuất của nó là
polydatin (2) [5], [7], [15], hai hoạt chất này đã được chứng minh rằng có những

tác dụng tích cực đến sức khỏe con người như: tác dụng kháng khuẩn [40], tác
dụng chống oxi hóa, tác dụng trên tim mạch [11], [18], tác dụng kháng viêm
[16]. Ngoài ra còn có tác dụng chống khối u, đặc biệt là ngăn chặn sự sinh
trưởng của một loạt các tế bào khối u, bao gồm ung thư máu, đa u tủy, ung thư
vú, tuyến tiền liệt, dạ dày, đại tràng, tuyến tụy, tuyến giáp, u ác tính đầu, ung
thư biểu mô tế bào vảy cổ, ung thư biểu mô buồng trứng và ung thư biểu mô
cổ tử cung [9]. Ngoài ra trong rễ cốt khí củ còn có một số stilbenoid khác với
hàm lượng thấp hơn đã được phân lập như: 1-(3’,5’-dihydroxyphenyl)-2-(4’’hydroxyphenyl)-etan-1,2-diol

(3)

[44],

piceatannol

glucosid

resveratrolosid (5), piceid gallate A (6), picied gallate B (7) [37].

6

(4),


(1)

(2)

(3)

(4) R = H
(5) R = OH

R1

R2

(6)

galloyl

H

(7)

H

galloyl

Hình 1.3 CTCT một số hợp chất stilben có trong cốt khí củ
1.1.5.2. Thành phần anthranoid
Những hợp chất anthranoid nằm trong nhóm lớn hydroxyquinon (xem
hình 1.4). Anthranoid khi tồn tại dưới dạng glycosid thì được gọi là
anthraglycosid hay anthracenosid. Cũng như các loại glycosid khác,
anthraglycosid là những glycosid khi bị thuỷ phân sẽ cho phần đường và phần
aglycon (genin). Đa số các anthraglycosid là các polyoxy anthraquinon. Gắn
vào nhân thường có các nhóm chức -OH, -OCH3, -CH3, -COOH... Những dẫn
chất anthranoid đều có màu từ vàng, vàng cam đến đỏ [13].
7

Hình 1.4 Khung mạch cacbon cơ bản của hợp chất anthranoid
Trong dược liệu cốt khí củ, anthranoid là thành phần đặc trưng được
chứng minh có nhiều tác dụng dược lý như: bảo vệ gan, nhuận tràng [2]. Một
số anthranoid đã được tìm thấy trong cốt khí củ gồm: emodin (8), physcion (9),
anthraglycosid A (10), anthraglycosid B (11) [5], [7], [15], [33] , emodin-8-O(6’-O-malonyl)-glucosid (12) , emodin-1-O-glucosid (13) [40], citreorosein
(14) [46], Falacinol (15), questinol (16) [38], Questin (tức emodin-8-methyl
ether) (17) [45], polyganins
glucopyranosid)

(18)

và

A (emodin-8-O-β-D-(6’-methylmalonyl)polyganins

methylmalonyl)glucopyranosid) (19) [20].

8

B

(physcion-8-O-β-D-(6’-


R1

R2

(8)

H

H

(9)

H

(10) Glu

R1

R2

Glu

H

Me (12)

-malonyl)-Glu

H

Me (17)

Me

H

(11)

(13)

(14)

(15)

(16)
R
(18)

H

(19)

CH3

Hình 1.5 CTCT của một số hợp chất anthranoid trong rễ cốt khí củ
1.1.5.3. Các thành phần khác
Ngoài hai nhóm chất chính trên, rễ cốt khí củ còn chứa một số nhóm hợp
chất khác như phenol và flavonoid với hàm lượng thấp hơn.
Hợp chất phenol trong cốt khí củ gồm: 5,7-dimethoxyphthalid (20) [19],
1-(3-O-β-D-glucopyranosyl-4,5-dihydroxyphenyl)-etanon (21) [27].
9


Flavonoid trong cốt khí củ được xác định gồm: catechin (22), (+)–
catechin-5-O-β-D-glucopyranosid (23) [44], epicatechin (24) [37].

(20)

(21)

R
(22) H
(23) Glu
(24) H

Hình 1.6 CTCT một số hợp chất phenolic và flavonoid trong rễ cốt khí củ
1.1.6. Tác dụng sinh học
Sự phong phú về thành phần hoá học và các nhóm chất có hoạt tính sinh
học cao làm cho cốt khí củ có nhiều tác dụng sinh học quý giá. Trên thế giới có
rất nhiều nghiên cứu về tác dụng sinh học của cốt khí củ với các định hướng
sinh học khác nhau như: tác dụng kháng khuẩn [22], [23], [28], [39], [40]; tác
dụng chống viêm [25], [29]; tác dụng chống oxi hóa [12]; tác dụng hạ lipid
[36]; tác dụng kháng u, chống ung thư [9] và tiềm năng điều trị đái tháo đường
[26].

10


1.2. Tổng quan về polydatin
1.2.1. Nguồn gốc
Polydatin còn được gọi là piceid (3,4’,5-trihydroxystilbene-3-β-Dglucoside, PD), là một dẫn xuất stilben được phân lập từ Polygonum
cuspidatum Sieb. Et Zucc. (Polygonaceae). Ngoài ra polydatin cũng được phát
hiện trong nho, đậu phộng, rượu vang đỏ…
1.2.2. Công thức cấu tạo

Hình 1.7 CTCT của polydatin
- Công thức phân tử: C20H22O8
- Khối lượng phân tử: 390,384 g/mol.
-Tên khoa học:
2-[3-hydroxy-5-[(E)-2-(4-hydroxyphenyl)ethenyl]phenoxy]-6(hydorxymethyl)oxane-3,4,5-triol.
1.2.3. Tính chất hóa lý
Ở điều kiện nhiệt độ phòng, PD có dạng tinh thể hình kim màu trắng,
nhiệt độ nóng chảy 236ºC, tan tốt trong DMSO và nước.
1.2.4. Tác dụng sinh học
1.2.4.1. Tác dụng trên tế bào cơ tim
Trong một nghiên cứu tiến hành trên chuột, Zhao SK và cộng sự đã chứng
minh được tác dụng bảo vệ cơ tim của polydatin trên chuột nhắt trưởng thành
với tổn thương cơ tim được gây ra bởi adriamicin (adr). Những con chuột dùng

11


PD+adr tế bào cơ tim gần như giữ cấu trúc bình thường, trong khi con chuột
chỉ dùng adr có hoại tử từng phần [50].
PD cũng được Zhao SK và cộng sự chứng minh có tác dụng gây tăng Ca
huyết và tăng cường co bóp cơ tim [51]. Với liều PD (20 mg/kg) có tác dụng
giảm đáng kể creatine phosphokinase và lactate dehydrogenase từ cơ tim bị hư
hỏng do kích hoạt protein kinase C-ATP nhạy cảm phụ thuộc kênh K [35], [34]
1.2.4.2. Tác dụng bảo vệ gan
Năm 1999 Huang và cộng sự thử nghiệm và chứng minh được PD ở nồng
độ 10-7 mol/l -10-4 mol/l có tác dụng bảo vệ tế bào gan được nuôi cấy của chuột
chống lại thương tổn do CCl4 gây ra [21]. Năm 2012 Zhang và cộng sự tiến
hành thí nghiệm: gây tổn thương gan chuột bằng cách tiêm trong lồng ngực
chuột CCl4 và dùng PD trong 5 ngày liên tiếp cho kết quả PD làm giảm đáng
kể sự tăng các yếu tố gây hoại tử gan AST, ALT, MDA, IL-1β, đồng thời tăng

hàm lượng của GSH và GST [47].
Thử nghiệm trên chuột có chế độ ăn kiêng cao, PD có tác dụng giảm nồng
độ TC, TG huyết tương và lipid gan bằng cơ chế giảm yếu tố hoại tử khối u gan
(TNF-α) và biểu hiện gen SREBP-1c, tác dụng này cho thấy PD có khả năng
làm giảm gan nhiễm mỡ ở chuột [48].
1.2.4.3. Tác dụng chống oxy hóa
PD có đặc tính chống oxy hóa đáng kể do cấu trúc phân tử chứa hệ nối đôi
liên hợp, nó liên quan chặt chẽ tới các tác dụng dược lý như bảo vệ chống lại
thương tích, cải thiện học tập và trí nhớ, giảm lipid và kéo dài tuổi thọ… PD
kháng lại quá trình oxy hóa enzyme hơn resveratrol do sự thay đổi cấu trúc
phân tử [18].

12


1.2.4.4. Tác dụng chống viêm
Nhiều nghiên cứu báo cáo rằng PD điều chỉnh sự sản sinh các cytokin
viêm và các phân tử kết dính tế bào trong các thử nghiệm invitro và invivo. PD
làm giảm sản xuất IL-17 trong các tế bào đơn nhân máu ngoại vi hoạt tính của
con người thông qua sự điều chỉnh làm giảm biểu hiện mRNA IL-17 trong tế
bào [31].
PD giảm hoạt động và biểu hiện NF-kB p65, ngăn chặn sự sản sinh của
TNF-a, IL-6 và IL-1b ở mRNA và protein, làm giảm hoạt động của MPO và
giảm bớt các tổn thương viêm đại tràng ở chuột bị viêm đại tràng [43].
1.2.4.5. Các tác dụng khác
PD đã được chứng minh có nhiều tác dụng khác như tác dụng bảo vệ hệ
thần kinh [24], [32], tác dụng chống sốc [41], tác dụng chống khối u [30]…
1.2.5. Các phương pháp phân tích PD trong rễ cốt khí củ
Có nhiều phương pháp đã được sử dụng để phân tích các thành phần hóa
học chính trong cốt khí củ như các phương pháp sắc ký (TLC, LC, HPLC), các

phương pháp quang phổ (UV-VIS, huỳnh quang), điển hình là các kỹ thuật sắc
ký lỏng như HPLC-UV; HPLC-PDA; HPLC-FLD; LC-MS; LC-MS/MS. Các
kỹ thuật này đều đã được áp dụng rộng rãi trên thế giới trong phân tích định
tính, định lượng các thành phần hóa học trong cốt khí củ nhằm đánh giá chất
lượng các vị thuốc này.
1.2.5.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Dược điển Trung Quốc (2010) quy định sử dụng HPLC để định lượng
emodin và polydatin trong rễ cốt khí củ. Đối với chỉ tiêu định lượng polydatin,
quy trình được xử lý mẫu như sau: 0,1 g mẫu dược liệu được chiết hồi lưu với
25 ml EtOH trong 30 phút. Hệ dung môi pha động sử dụng là acetonitril : nước

13


( 23:77, v/v), detector UV ở bước sóng 306 nm, cột C18 và quy định hàm
lượng polydatin không được thấp hơn 0,15% [14].
Dược Điển Hồng Kông cũng quy định hàm lượng polydatin và resveratrol
là tiêu chí định lượng để đánh giá chất lượng các mẫu dược liệu cốt khí củ (yêu
cầu đối với dược liệu khô, tổng hàm lượng polydatin và resveratrol không ít
hơn 1,1%). 0,1 g dược liệu được chiết siêu âm 3 lần mỗi lần 30 phút với lần
lượt 10 ml, 10 ml, 5 ml ethanol. Định mức bằng ethanol vừa đủ 25 ml. Phương
pháp sử dụng là HPLC-UV với hệ dung môi gồm kênh A là nước kênh B là
acetonitril, cột C18 (4,6 × 250 mm; 5 µm ), tốc độ dòng v = 1ml/phút [42].
Chương trình rửa giải gradient:
Thời gian ( phút)

0-12

12-13

13-30

% ACN

20

20-30

30

Avula B và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu với mục tiêu xây dựng
phương pháp định tính và định lượng đồng thời 8 chất bao gồm polydatin,
resveratrol, và 6 anthraquinon là aloe-emodin rhein, emodin, danthron,
chrysophanol, physcion trong cốt khí củ và 5 loài polygonum khác. Quy trình
xử lý mẫu như sau: 0,5 g bột dược liệu khô chiết siêu âm với dung môi
methanol. Điều kiện sắc ký tối ưu được lựa chọn: cột C18 (150 × 4,6 mm; 5
μm), detector DAD, nhiệt độ cột 30 ºC, pha động là nước (A) và acetonitril (B),
cả hai đều có chứa 0,1% axit acetic, chương trình rửa giải trong 35 phút: 80%
A + 20% B. Bước sóng phát hiện là 280 nm đối với các anthraquinon và 320
nm đối với polydatin và resveratrol. Phương pháp đã được thẩm định theo các
hướng dẫn của USP và ICH [10].
Zhang Wenting và cộng sự đã phát triển một phương pháp định lượng
đồng thời 5 hợp chất chính có trong rễ cốt khí củ bao gồm: polydatin,

14


resveratrol, anthraglycosid B, emodin và physcion. Bước sóng phát hiện 306
nm. Sử dụng cột Agilent Zorbax SB-C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm), tốc độ dòng
v = 1ml/phút pha động được chọn là acetonitril (A) : nước ( chứa 0,1% acid

fomic-B) với chương trình rửa giải
Thời gian(phút)

0-15

15-60

% kênh B

15%-20%

20%-80%

Phương pháp này đã được thẩm định độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính
xác và độ đúng. Các phương trình hồi quy tuyến tính thu được với kết quả R 2 >
0,999. Độ chính xác lặp lại trong ngày và giữa các ngày tốt với RSD nhỏ hơn
5% và hiệu suất thu hồi nằm trong phạm vi từ 96,0 – 106,5 %. Ưu điểm của
phương pháp này là độ nhạy cao, giúp phát hiện được và phân tích tốt đối với
những mẫu cốt khí củ có hàm lượng hoạt chất thấp[49].
Trong một nghiên cứu nhằm định lượng lượng đồng thời emodin,
resveratrol và polydatin trong rễ cốt khí củ Trung Quốc, Zhao Rui-zhi và cộng
sự đã tiến hành xây dựng một phương pháp nhanh và đơn giản bằng sắc ký lớp
mỏng hiệu năng cao (HPTLC). Quy trình xử lý mẫu như sau: 0,2g bột dược
liệu được chiết siêu âm bằng ethanol 3 lần, mỗi lần 5 phút tương ứng với 50
ml, 25 ml, 25 ml, cô cắn và hòa tan trong 5 ml ethanol, bản mỏng silica gel (0,2
mm; Merck). Hai chương trình pha động được lựa chọn là: petroleum–butyl
acetat – methanol – acetic acid tỷ lệ 4: 1: 0,7: 0,02 (hệ dung môi I) và petroleum
– butyl acetat – methanol – acetic acid tỷ lệ 4: 2: 2: 0,1 (hệ dung môi II). Phương
pháp đã được thẩm định cho phương trình hồi quy rất tuyến tính với hệ số tương
quan R = 0,998; độ thu hồi 100,2%

Phương pháp này có ưu điểm nhanh chóng và khá chính xác, định lượng
được nhiều mẫu trong thời gian ngắn mà lại ít tốn kém để kiểm soát chất lượng
dược liệu cốt khí củ [52].

15