Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Ketoprofen trong huyết tương

đặt vấn đề
Hiện nay ở nớc ta, việc nghiên cứu sinh dợc học và dợc động học của thuốc
là một lĩnh vực tơng đối mới, đang ngày càng đợc quan tâm. Trong khi đó, ở
các nớc khác, đây là một tiêu chí bắt buộc các hãng Dợc phẩm phải làm nếu
muốn đa thuốc ra thị trờng. Một trong những vấn đề đánh giá sinh dợc học của
thuốc là mức độ hấp thu thuốc và nồng độ thuốc đạt đợc trong huyết tơng.
Các phơng pháp phân tích hay dùng để xác định nồng độ thuốc trong huyết
tơng (dịch sinh vật) là sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ), sắc ký khí (GC), sắc
ký khí gắn với máy khối phổ (GC - MS ), phóng xạ miễn dịch, điện di mao
quản.... Trong đó, HPLC đặc biệt là HPLC pha đảo với detector UV là phơng
pháp hayđợc dùng hơn cả, do tinh u việt nổi trội về độ nhạy, tính chính xác, độ
chọn lọc, tính kinh tế.
Để có một qui trình dùng HPLC đảm bảo độ tin cậy để phân tích thuốc trong
dịch sinh vật, chúng ta khảo sát các điều kiện sắc ký thích hợp nh cột; dung môi
pha động; lu lợng dòng; bớc sóng.... quy trình xử lý mẫu, khoản nồng độ khảo
sát.
Ketoprofen- acid -2 (- benzoyl phenyl ) propionic - là thuốc chống viêm phi
steroid; có tác dụng giảm đau, chống viêm, ức chế quá trình tổng hợp
prostaglandin và leukotrien; ức chế sự kết dính tiểu cầu đợc dùng nhiều trong
điều trị thấp khớp mãn tính, đặc biệt viêm đa khớp dạng thấp, thoái hoá khớp
nặng. Ketoprofen là thuốc mới đợc đa vào sản xuất ở nớc ta và cha có tài liệu
trong nớc nào đánh giá định lợng ketoprofen trong huyết tơng. Do đó
chúng tôi thực hiện đề tài Nghiên cứu xây dựng phơng pháp định lợng
ketoprofen trong huyết tơng với mục tiêu:
-Khảo sát và lựa chọn dung môi chiết ketoprofen trong huyết tơng cho
hiệu xuất chiết cao.
-Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký thích hợp để định lợng ketoprofen
trong huyết tơng .
-Xây dựng phơng pháp định lợng ketoprofen trong huyết tơng bằng
HPLC.
1

-áp dụng định lợng ketoprofen trong huyết tơng ngời sau khi uống thuốc
và theo dõi độ ổn định của ketoprofen theo thời gian bảo quản.
2
Phần i: tổng quan.
1.1 Đại cơng về Ketoprofen.
1.1.1 Công thức và tính chất lý hoá[1] [ 5].




- Phân tử lợng : 254.29
- Tên khoa học :acid 2 ( - benzoyl phenyl ) propionic
- Tính chất: Bột kết tinh trắng, không mùi. Thực tế không tan trong nớc ở
20
0
C, tan hoàn toàn trong kiềm mạnh, ethanol 96
0
, aceton cloroform và ether.
pKa =5,94 trong hỗn hợp methanol - nớc (3 : 1). Cực đại hấp thụ trong
methanol ở bớc sóng 255 nm. Nhiệt độ nóng chảy khoảng 95
0
C.
1.1.2 Tác dụng dợc lý và dợc động học [5] [6].
Ketoprofen là thuốc chống viêm phi steroid, thuộc dẫn chất của acid aryl
propionic, có tác dụng giảm đau, hạ sốt, chống viêm. Ketoprofen ức chế quá
trình tổng hợp prostaglandin và ức chế sự kết tập tiểu cầu.
Ketoprofen đợc hấp thu rất nhanh vào máu , đạt nồng độ tối đa sau
45 - 60 phút nếu đặt hậu môn và 60- 90 phút sau khi uống. Liên kết với protein
huyết tơng 99%, thời gian bán thải là 1,5-2,5 giờ. Sau khi uống 4 giờ nồng độ
ketoprofen trong bao hoạt dịch cao hơn trong máu. Thuốc qua đợc hàng rào

nhau thai. Một phần nhỏ chuyển hoá bằng cách hydroxyl hoá, còn phần lớn liên
hợp với acid glucuronic. Thải trừ chủ yếu qua nớc tiểu (75- 90%), một ít qua
3
CH COOH
C
O
CH
3
phân( 1-8% ). ở nớc tiểu ( 65-75%) là dạng glucuronyl, 1% là dạng cha biến
đổi. Sau khi uống 6 giờ ketoprofen sẽ bị thải trừ 50% qua thận.
1.1.3 Chỉ định [5] [6]:
Ketoprofen đợc chỉ định điều trị dài hạn các triệu chứng trong:
- Viêm thấp khớp mãn tính, đặc biệt là viêm đa khớp dạng thấp, viêm
cứng khớp cột sống.
- Bệnh cứng khớp gây đau và tàn phế.
Điều trị ngắn hạn các triệu chứng trong các cơn cấp tính của các bệnh:
- Bệnh thấp khớp ngoài khớp (đau vai cấp tính, viêm gân ... ).
- Viêm khớp vi tinh thể.
- Thoái hoá khớp.
- Dạng viên nang còn dùng để giảm đau: đau lng, đau rễ thần kinh...
1.1.4 Chống chỉ định [6]:
- Dị ứng với ketoprofen, aspirin, và các thuốc chống viêm phi steroid
cùng loại.
- Loét dạ dày-tá tràng tiến triển.
- Suy thận nặng, suy gan tế bào nặng.
- Phụ nữ có thai( 3 tháng cuối) và cho con bú.
1.1.5 Tác dụng không mong muốn [6]
- Tác dụng phụ ở đờng tiêu hoá: khó chịu vùng dạ dày-ruột, đau dạ dày,
buồn nôn, nôn mửa, táo bón, tiêu chảy, nặng thì loét dạ dày, xuất huyết tiêu
hoá, thủng ruột.

- Nhức đầu, chóng mặt, buồn ngủ.
- Phản ứng quá mẫn ở da( nổi ban, mề đay, ngứa) và đờng hô hấp (suyễn,
nhất là những ngời dị ứng với aspirin và các kháng viêm không steroid khác).
- Giảm nhẹ hồng cầu ở ngời bị thiếu máu, một vài trờng hợp giảm bạch
cầu nhẹ đã đợc ghi nhận.
4
1.1.6 Liều dùng:
Liều khởi đầu: 300 mg chia làm 3 lần, uống khi no.
Liều duy trì: 150-200mg hoặc nạp ngày 1-2 viên thuốc đạn.
Tiêm bắp ngày100-200mg chia 2 lần.
Không nên phối hợp Ketoprofen với thuốc chống đông máu đờng uống
và các kháng viêm không steroid khác (kể cả salicylat liều cao) do làm tăng
nguy cơ loét và xuất huyết tiêu hoá.
1.1.7 Dạng bào chế [5] [6].
- Viên nang 25mg, 50mg, 75mg.
- Viên nén 100mg, 150mg.
- Viến bao tan ở ruột 50mg.
- Viên bao tác dụng kéo dài 200mg, viên nang tác dụng kéo dài 100mg,
150mg, 200mg.
- Thuốc tiêm 100mg.
- Thuốc mỡ 2,5%.
Biệt dợc: Biprofenid, Profenid, Kefenid, Fastum, Ketum,
Ketopron.
1.1.8 Các phơng pháp định lợng.
A. Phơng pháp acid- bazơ:
Định lợng ketoprofen nguyên liệu, xác định điểm tơng đơng bằng chỉ thị
đỏ phenol [18] hoặc bằng phơng pháp đo điện thế [ 10] [18].
Tiến hành:
Hoà tan khoảng 200mg Ketoprofen (cân chính xác) vào 25ml alcol.
Thêm 25ml nớc và vài giọt đỏ phenol. Chuẩn độ với NaOH 0,1N.

Song song làm một mẫu trắng trong cùng điều kiện.
1ml NaOH 0,1N tơng đơng với 25,43mg C
16
H
14
O
3
.
5
- Hoặc: Hoà tan khoảng 200mg Ketoprofen (cân chính xác) vào 25ml
alcol. Thêm 25ml nớc Chuẩn độ với NaOH 0,1N, xác định điểm tơng đơng
bằng bớc nhảy điện thế.
1ml NaOH 0,1N tơng đơng với 25,43mg C
16
H
14
O
3
.
B. Phơng pháp quang phổ [7] [8][10]:
Dùng để định lợng ketoprofen trong chế phẩm.
Hoà một lợng chế phẩm có chứa khoảng 50 mg ketoprofen (cân chính
xác) trong 300 ml methanol 75 %, lắc trong 10 phút, thêm methanol 75 % vừa
đủ 500 ml. Lọc. Lấy 5 ml dịch lọc pha loãng thành 100 ml với methanol 75 %
và đem đo độ hấp thụ của dung dich này ở bớc sóng 258nm; cuvet thạch anh có
chiều dày 1 cm với mẫu trắng là methanol 75%.
Tính kết quả dựa vào A (1%, 1cm) ở bớc sóng 258 nm là 662.
C. Phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ).
Dùng để định lợng ketoprofen trong huyết tơng và xác định tạp chất
trong nguyên liệu.

stt tài liệu pha động cột mẫu thử
1 [10] [18] Đệm phosphat pH 3,5 - ACN
- H
2
O (2:43:55)
C
18
5àm
150*4,6 mm
Nguyên liệu
2 [10] NH
4
CH
3
COO 1% - MeOH -
ACN (55:30:15)
C
18
5àm
200*4,6 mm
Nguyên liệu
3 [13] Đệm phosphat pH 3,2 - ACN
(60:40)
C
18
2àm
250*4,6 mm
Huyết tơng
4 [12] NH
4

CH
3
COO 20 mM -
MeOH; điều chỉnh pH 7,0.
C
18
4 àm
Huyết tơng
5 [11] ACN : AcOH 1%
( 38 : 62 ).
C
18
10àm
3,9*300 mm
Huyết tơng
6 [16] Đệm Phosphat 0,05M pH 7 :
ACN (90 : 10 ).
C
18
5 àm
4,6*250mm
Huyết tơng
D. Phơng pháp điện di mao quản: Định lợng ketoprofen trong huyết tơng [14]
và tách đồng phân của ketoprofen [17].
1.2 Phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ).
6
Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography )
còn gọi là sắc ký lỏng cao áp hay sắc ký lỏng hiện đại ra đời vào những năm
cuối 1960. Nó đợc xây dựng và phát triển không ngừng và ngày càng thể hiện
rõ tính u việt, đặc biệt là trong lĩnh vực nghiên cứu sinh dợc học của thuốc.

Phân loại các phơng pháp sắc ký [ 2]:
- Sắc ký phân bố : + sắc ký lỏng- lỏng.
+sắc ký phân bố pha liên kết.
- Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao.
- Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao.
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên gel ( sắc ký theo loại cỡ ).
Trong phân tích sinh dợc học và kiểm nghiệm, ngời ta hay sử dụng phơng
pháp sắc ký lỏng phân bố pha liên kết (Bonded Phase Chromatography ).
Đặc điểm phơng pháp [2]:
Trong sắc ký lỏng phân bố pha liên kết, pha tĩnh đợc gắn hoá học (liên
kết ) với chất mang ( Silicagel ) tạo nên hợp chất cơ Siloxan


Nhóm
Silanol
Dẫn chất Dẫn chất Siloxan
của Silicagel clorosilan
- Nếu R là một nhóm ít phân cực nh octyl (C
8
), octadecyl (C
18
) hay
phenyl và dung môi phân cực nh methanol, acetonitril thì có sắc ký pha đảo
(sắc ký pha ngợc ).
7
Si
CH
3
CH
3

CH
3
Cl
CH
3
OH
Si R
SiSi O
CH
3
CH
3
R +
H
3
C
H
3
C
- Nếu R là nhóm khá phân cực nh: alkylamin - ( - CH
2
- )
n
-NH
2
hay alkyl
nitril -( - CH
2
- )
n

- CN và dung môi ít phân cực nh hexan thì ta có sắc ký pha
thuận.
- Cách chọn pha: thờng chọn pha tĩnh có tính chất phân cực giống các
chất cần tách và khác với pha động.
Nguyên tắc của phơng pháp [2] [3]:
Các chất trong hỗn hợp đợc tách dựa trên khả năng phân bố khác nhau
của chúng vào hai pha không hoà lẫn vào nhau, luôn tiếp xúc nhau: một pha
tĩnh và một pha động.
Dung dịch mẫu thử đợc đa vào hệ thống sắc ký qua van tiêm mẫu và đợc
dung môi pha động kéo tới cột phân tích nhờ một bơm cao áp. Tại cột xảy ra
quá trình tách, những phân tử nào có ái lực thấp với pha tĩnh thì đợc rửa giải ra
trớc, còn những phân tử nào có ái lực mạnh với pha tĩnh thì đợc rửa giải ra sau.
Chất ra khỏi cột đợc phát hiện bằng detector gắn với máy ghi, máy tính hay
máy tích phân. Thời gian lu t
R
là đặc trng định tính của chất, chiều cao hay diện
tích pic là đặc trng định lợng của chất. Sắc ký đợc tiến hành so với chuẩn.
Một số thông số đặc trng của HPLC [2]:
Ví dụ: Ta có 1 sắc đồ sau:
- Thời gian lu t
R
( phút ) là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống
sắc ký đến lúc xuất hiện đỉnh của pic. So sánh thời gian lu của mẫu thử và mẫu
chuẩn làm trong cùng điều kiện ta sẽ định tính đợc chất đó.
- Thời gian chết t
M
( phút ) là thời gian của một chất không bị lu giữ tức
là bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử dung môi.
- Thời gian lu hiệu chính t
R

,
đợc tính theo công thức:
8
t
R
= t
R
,
+ t
M
( hay t
R
,
= t
R
- t
M
).
- Thừa số dung lợng k

dùng để mô tả tốc độ di chuyển của một chất
Qs t
R
t
R
- t
M
V
R
-V

M
k

= = = =
Q
M
t
M
t
M
V
M
- Thừa số chọn lọc : Mô tả tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất.
k
B
k
B
t
R,B
= = =
k
A
k
A
t
R,A
Qui ớc B là chất bị lu giữ mạnh hơn A nên 1. Để tách riêng 2 chất thì
> 1, thờng từ 1,05 2,00.
- Số đĩa lý thuyết N: Biểu thị hiệu lực cột sắc ký.
N =

2
b
w
r
t
x 16








hoặc N =
2
2/1
w
r
t
x 54,5








Trong đó: W

B
chiều rộng pic ở đáy pic.
W
1/2
chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh.
- Độ phân giải R
S
là đại lợng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký.
t
R,B
t
R,A
R
s
=
1/2( W
B
+ W
A
)
Để tách riêng hai chất, R
s
1,5 ( khi 2 sắc đồ có độ lớn cùng cỡ ).
- Chiều cao pic hay diện tích pic là đặc trng định lợng của chất. Khi so
sánh chiều cao pic hay diện tích pic của mẫu thử và chuẩn trong cùng điều kiện
làm ta tính đợc hàm lợng hoạt chất trong mẫu thử.
Pha tĩnh và pha động trong HPLC [3].
*Pha tĩnh trong HPLC chính là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một
hỗn hợp chất phân tích. Nó là những chất rắn, xốp và kích thớc hạt rất nhỏ, đ-
ờng kính cỡ hạt từ 3-10àm, diện tích bề mặt riêng thờng từ 50-500 m

2
/g.Căn cứ
theo bản chất chính của quá trình sắc ký trên cột tách, ngời ta chia nó thành
nhiều loại nh hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử. Tơng ứng với loại
chất nhồi nh thế ngời ta có một loại sắc ký riêng trong kỹ thuật HPLC.
9
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng phơng pháp sắc ký phân bố pha liên
kết. Bản chất chính của sự tách trong loại sắc ký này là dựa trên khả năng tách
của các chất trong hai pha không hoà lẫn vào nhau.
Các yêu cầu chung của pha tĩnh trong kỹ thuật HPLC:
+ Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trờng sắc ký, không
có các phản ứng hoá học phụ với dung môi rửa giải hay với chất phân tích.
+ Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong
điều kiện sắc ký.
+ Tính chất bề mặt phải ổn định.
+ Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt.
+ Cỡ hạt phải tơng đối dồng nhất.
Pha tĩnh thờng đợc chế tạo trên các chất nền sau:
+ Pha tĩnh trên nền Silicagel ( SiO
2
)
+ Pha tĩnh trên nền Oxid nhôm ( Al
2
O
3
)
+ Pha tĩnh trên nền cao phân tử hữu cơ ( polystyren, cellulo...)
+ Pha tĩnh trên nền mạch carbon.
Trong 4 loại này thì nền Silicagel đợc sử dụng nhiều nhất và pha tĩnh đợc
chế tạo trên nền này cũng có nhiều u việt hơn, nh khả năng chịu áp cao, độ tr-

ơng nở nhỏ khi thay đổi dung môi rửa giải, bền với nhiệt.
*Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan ( chất phân tích ) ra
khỏi cột tách để thực hiện một quá trính sắc ký. Pha động trong HPLC có thể
chỉ là một dung môi hữu cơ nh Metanol, Acetonitril, n-Hexan, hay cũng có thể
là hỗn hợp của hai hay nhiều dung môi trộn với nhau theo những tỷ lệ phù hợp.
Nó cũng có thể là dung dịch nớc của các muối có chứa chất đệm, chất tạo phức,
chất làm chậm. Nói chung mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung môi rửa giải riêng
cho nó, để có đợc hiệu quả tốt. Pha động là một trong những yếu tố quyết định
thời gian lu giữ của chất mẫu và hiệu quả sự tách sắc ký, ảnh hởng tới sự phân
giải của chất trong pha tĩnh.
Pha động trong kỹ thuật HPLC cần phải thoả mãn một số điều kiện sau:
+ Phải trơ đối với pha tĩnh.
+ Phải hoà tan đợc chất mẫu
10
+ Phải bền vững theo thời gian
+Phải có độ tinh khiết cao
+ Phải nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký
+ Phải phù hợp với loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích.
Trong sắc ký phân bố pha liên kết, pha động là hệ dung môi phân cực, nó
là những dung môi trộn lẫn đợcvới nớc và trong nhiều trờng hợp thì nớc lại là
một thành phần chính của pha động. Tiêu biểu và đợc dùng khá phổ biến trong
loại sắc ký phân bố pha liên kết là các dung môi methanol, tetrahydrofuran,
acetonitril, hay hỗn hợp của methanol, acetonitril với nớc, với đệm.
Sắc ký phân bố pha liên kết đợc sử dụng rất phổ biến để tách nhiều loại
hỗn hợp mẫu từ vô cơ đến hữu cơ, chất không phân cực đến phân cực.
Trong hệ pha này thì thành phần của pha động cũng ảnh hởng đến kết
quả tách sắc ký.
Cách tính kết quả trong phơng pháp HPLC.
- Phơng pháp đờng chuẩn
- Phơng pháp thêm

- Phơng pháp so sánh
Đối với việc xác định nồng độ hoạt chất trong dịch sinh học, tính toán kết
quả dựa vào đờng chuẩn đợc xây dựng bằng cách chủ động cho chất chuẩn với
nồng độ khác nhau vào dịch sinh vật. Xử lý mẫu và đem chạy sắc ký.
Phần 2: thực nghiệm và kết quả
2.1 Nguyên vật liệu và phơng pháp nghiên cứu.
2.1.1 Nguyên vật liệu và hoá chất
*Nguyên vật liệu:
- Ketoprofen 99,3% (Đạt theo BP 2001).
- Ibuprofen 99,0 % (Đạt theo USP 24).
- Naproxen 99,6% (Đạt theo USP 24).
*Hoá chất:
- Acetonitril ( HPLC grade-Merck ).
11
- Methanol ( HPLC grade- Merck ).
- Acid acetic băng ( HPLC grade - Merck ).
- Triethylamin ( PA grade - Merck ).
*Dụng cụ:
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.
+ Bơm cao áp Merck- Hitachi L-6000.
+ Detector Merck-Hitachi L-4000 UV.
+ Máy tích phân Merck - Hitachi D-2500 chromato-integrator.
+ Van tiêm mẫu Rheohyne 1725 - USA.
- Máy quang phổ Beckman DU-640 spectrophotometer (Mỹ).
- Máy lọc nớc siêu sạch Elga (Anh).
- Cân phân tích Satorius (Đức).
- Ly tâm điện Jouan (Pháp).
- Máy siêu âm Branson (Mỹ).
- Máy lắc Labinco.
- Autopipet 10-100mcl, 100 - 1000mcl.

- Dụng cụ thuỷ tinh, bơm tiêm, ống nghiệm, bình định mức.
2.1.2 Phơng pháp thực nghiệm
a.Khảo sát điều kiện sắc ký
Khảo sát chọn dung môi chiết Ketoprofen trong huyết tơng
Khả năng chiết hoạt chất đợc biểu thị bằng hiệu suất chiết và khả năng
loại tạp cản trở sự phát hiện ketoprofen trong mẫu phân tích.
Mẫu thử đợc xử lý với các dung môi khác nhau theo sơ đồ sau:
12
Huyết tơng
Lắc 5 phút
Ly tâm 15phút(3000 vòng/phút)
Cắn
Lắc 1 phút
Dung môi hữu cơ



Để tăng hiệu suất chiết, nhằm mục đích chiết kiệt hết hoạt chất trong
huyết tơng, ta tiến hành chiết lặp (chiết 3 lần). Tiến hành nh sơ đồ 1 thực hiện
thêm hai lần từ lúc thêm dung môi hữu cơ đến khi thu đợc cắn. Tất cả các dịch
chiết của 3 lần đợc tập trung vào một ống nghiệm, đuổi dung môi thu đợc cắn
nh sơ đồ 1.
Tìm chất chuẩn nội.
Dùng những chất có công thức hoá học gần giống với ketoprofen cho vào
huyết tơng đã chứa ketoprofen, xử lý mẫu nh sơ đồ hình 1. Chạy sắc ký để xác
định thời gian lu của chất chuẩn nội và ketoprofen, tính thừa số chọn lọc ( tốc
độ di chuyển tỷ đối của hai chất ) xem mức độ tách của hai chất. Chất chuẩn nội
phải tách hẳn với ketoprofen , hiệu suất chiết ổn định, bền vững, phát hiện dễ
dàng ở điều kiện sắc ký trên.
Khảo sát chọn hệ dung môi ( pha động ) chạy sắc ký.

Trong sắc ký phân bố pha liên kết, pha động là một hệ dung môi phân
cực, hay dùng là các dung môi methanol, acetonitril, hay hỗn hợp của methanol,
acetonitril với nớc, với đệm.
13
Lọc
Dịch chiết
Ly tâm 15 phút(3000 vòng /phút)
Dịch lọc
Khí
Pha động
Hình 1: Sơ đồ xử lý mẫu huyết tơng ( chiết đơn )